Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
WO 94/10306 ~ 1 4 8 2 ~ 4 PCI`/FR93/01082
FRAGMENTS DE LA PROI'EINE p53 ET LEURS UIILISATIONS
DANS LA DETECTION ET LE SUIVI D ' ETATS PATHOLOGIQUES
La présente demande a pour objet des fragments
; de la protéine p~3 correspondants à des épitopes
immunodominants de la protéine p53 humaine.
Elle est d'autre part relative à leurs
utilisations dans la detection et le suivi d'etats
pathologiques et en particulier d'etats cancereux et
. pre-cancéreux.
- 10 Les mutations du gène p53 sont les alterations
geniques les plus souvent rencontrées dans les cancers
humains. La fréquence des mutations du gène p53 est
élevée pour le cancer du colon (1), du sein (2) et du
poumon (3) de même que dans les leucémies (4), les
ostéosarcomes (5)~ les cancers de l'ovaire (6), de
l'estomac (7), et du cerveau (8). Des mutations
héreditaires ont été récemment mises en évidence comme
support du syndrome du cancer familial de Li-Fraumeni
(9,10). Rapportées aux 10 cancers les plus fréquents
dans le monde, les altérations du gène p53 sont
retrouvées chez 40 à 45% des cancéreux. Les
altérations les plus frequentes sont des mutations
ponctuelles situées dans 4 des 5 régions
- phylogénétiquement conservées (HCD) de la protéine p53
(11,12).
En 1982, Benchimol et al. ont montré par une
technique radio-immunologique que la protéine p53 est
spécifiquement surexprimée dans les cellules
transformées et indecelable dans les cellules normales
(13). De nombreuses études ont confirmé depuis ces
résultats et montré que l'accumulation de la proteine
p53 est due à sa stabilisation. On sait maintenant que
cette stabilisation est due dans presque tous les cas
à une mutation ponctuelle qui modifie la conformation
35 - et la stabilite de la protéine. Ces observations
encouragent l'étude systémati~ue par immunohistologie
:.,
::,- ,.
~ v' ~;'
~.
......
WO9~/10306 ~ PCT/FR93/01082
D
de l'expression de la protéine p53 sur une large gamme
. de tumeurs car il semble y avoir une bonne corrélation
... entre la mutation du gène p53 et l'accumulation de la
proteine (14, 15).
.t, 5 En 1982, Crawford et al. ont détecté des
i anticorps anti-pS3 chez des patients présentant un
cancer du sein (16). Caron de Fromentel et al. ont
ensuite montré en 1987 que de tels anticorps étaient
. présents dans le sérum d'enfants présentant des
cancers très divers (17). La fréquence moyenne est de
12% avec une fréquence particulière de 20% dans le
lymphome de Burkitt (17). Plus récemment, Davidoff et
al. (18) ont montré que la présence d'anticorps anti-
p53 est associée avec des mutations spécif:iques des
exons 5 et 6 du gène. Ces pxotéines mutées sont
connues pour s'associer à la protéine hsp70 et sont
encore plus oncogéniques in vitro et in vivo.
L'importance de ces anticorps sériques a été
récemment soulevée par la découverte que leur présence
est généralement corrélée avec un mauvais pronostic
pour le patient.
La partie de la proteine p53 humaine présentant
le plus de mutations étant situee environ au milieu de
la séquence de la protéine p53, on aurait pu supposer
que les anticorps de patients atteints de cancer et
produisant une telle protéine mutee reconnaissent
. spécifiquement cette partie centrale de la proteine
- préserltant des mutations.. En effet, cette region de la
proteine p53 humaine etant differente chez des
patients atteints de cancers, il semblait logique de
conçevoi.r ~ue la réponse immunitaire de l'organisme
serait préférentiellement dirigée contre la region
modifiee.
;' ~ . Le demandeur a montre de manière surprenante
que les regions reconnues par les anticorps des
.;, .,
, . ..
... ..
.., .;
~1
- WO94/10306 ~1 4 ~ 2 7 4 PCT/FR93/01082
.
patients ne correspondent pas aux régions de la p53
' 3 modifiées dans les cancers mais a d'autres régions de
` la protéine p53 humaine qui sont situées dans les
extremités amino et carboxy-terminales de la p53. Ce
résultat original ne pouvait être prédit par aucune
étude antérieure.
On notera que dans les années 1980-1985, de
¦ nombreux anticorps monoclonaux murins ont été produits
3 soit contre la p53 murine, soit contre la p53 humaine.
! lo Deux études ont porté sur la caractérisation de ces
anticorps monoclonaux. Banks et al.(22) ont décrit la
production d'anticorps monoclonaux murins dirigés
contre la p53 humaine. L'un de ces anticorps (PAbl801)
est très utilisé dans divers laboratoires à l'heure
.; . .~ .
15 actuelle. En utilisant des protéines p53 tronquées,
ces auteurs ont montré que l'épitope reconnu par
pAbl801 ou Pabl803 est compris entre les acides aminés
32 et 79.
Dans un autre article, WADE-EVANS et JENKINS
20 (30) ont cartographié les épitopes de 4 anticorps
monoclonaux dirigés contre la p53 de souris. Pour
cette etude, ils ont utilisé des fragments de protéine
~~- p53 murine. Les résultats sont les suivants:
l'anticorps PAb242 reconnaît un épitope situé entre
25 les acides aminés 9 et 25, l'anticorps PAb246
reconnaît un épitope situé entre les acides aminés 88
et 109, l'anticorps PA~248 reconnaît un épitope situé
entre les acides aminés 157 et 192 et l'anticorps
PAb421 reconnaît un épitope situe entre les acides
30 aminés 370 et 378.
L'ensemble de ces études montre que les
' épitopes reconnus par ces anticorps monoclonaux sont
répartis sur tout le long de la protéine.
- : ! La présente invention a pour objet des peptides
~ 35 ou des fragments proteiques, à l'exclusion de la
`,"
,
,
WO94/10306 PCTtFR93/01082
'~14827~ 4
protéine p53, présentant une réaction specifique vis-
à-vis des anticorps anti-p53 présents dans les fluides ~::
biologiques de patients prPcancéreux ou atteints d'un
cancer quel que soit son origine . :~
Avantageusement , un tel peptide est compris
dans la sequence des acides aminés de la region amino .. :~
terminale (résidus 1 a 112) ou dans la region carboxy
terminale (résidus 350 à 393) de la proteine p53. La ;~
sequence de la proteine p53 humaine sauvage est `:.~-~
decrite par SOUSSI et al (26). :
Il comprend avantageusement en partie QU en
totalite l'une des sequences suivantes ~
Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu
Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro ~-
Leu ( SEQ ID N0:1) .:~
Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile ..
Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro (SEQ ID
N0:2). .
Preféxentiellement , un tel peptide comprend en ~ `"
partie ou en totalité l'une des séquences suivantes. : ;
Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser
Asp Leu Trp Lys Leu (SEQ ID N0:3)
Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu ~
Leu Pro Glu Asn Asn (SEQ ID NO:4) ~`.
Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn ~ .
Val Leu Ser Pro Leu(SEQ ID N0:5) `
Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile ~
Glu Gln Trp Phe Thr (SEQ ID NO 6) ~. .
Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr
Glu Asp Pro Gly Pro (SEQ ID N0:7).
Si un tel pepti.de est compris dans la séquence
des acides amines 350 à 393 de la proteine p53, il
comprend alors preferentiellement en partie ou en
totalité l'une des séquences suivantes :
Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala
WO94/10306 .~1 4 8 2 7 4 PCT/FR93/01082
- ~ly Lys Glu Pro Gly ~SEQ ID NO : 8) ~ :
Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly -~
Gly Ser Arg Ala His (SEQ ID NO:9) :::
Gly Lys &lu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His
Ser Ser His Leu Lys (SEQ ID NO:10) -.
Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys ~ :
Ser Lys Lys Gly Gln (SEQ ID NO:11) ~:-
Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln
Ser Thr Ser Arg His (SEQ ID NO: 12)
Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Ar~ His -~
Lys Lys Leu Met Phe (SEQ ID NO:13 ) ~.
Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe :
Lys Thr Glu Gly Pro (SEQ ID NO:14)
Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro
Asp Ser Asp (SEQ ID NO:15).
La determina ion des fragments de la proteine - :~
p53 presentant une reaction specifique vis-à-vis des
anticorps de patients atteints d'un cancer peut se
faire par les moyens mis à la disposition de l'homme .
du metier et en particulier par test
immunoenzymatîque, radio-immunologique, par immuno- ~
précipitation ou par immunoblot. .
De tels tests sont bien connus de l'homme du
métier et sont décrits dans des manuels generaux
(28,29). -
La présente invention est en outre relative à ~:
une séquence nucleotidique , ribonucleotidique (ARN)
ou désoxyribonucléotidique ~ADN), codant pour la
synthèse d'un des peptides objet de la presente
deman~e .
De tels peptides peuvent etre utilisés pour la
detection ou le suivi d'états pathologiques, et en
particulier pour la détection ou le suivi d'etats
~ cancereux et precancereux.
Un autre objet de la présente invention est un
WO94/10306 21 ~ ~ 2 ~ !~ PCT/FR93/01082 ;~
procédé pour la détermination de la présence
d'anticorps ou pour leur dosage dans un tissu ou un
fluide caractérisé en ce gue ~
- on met en présence le tissu ou le fluide et
S 1'un des peptides ob~et de 1'invention precedemment
décrits , et .
- on détermine la présence soit de l'anticorps,
soit du peptide soit du couple anticorps-peptide et on
effectue le dosage correspondant .
Le dosage des complexes anticorps-peptides peut
être effectué soit par dosage de la liaison anticorps
peptide, soit par d~sage du peptide ou de l'anticorps
capté èt rentrant dans le complexe anticorps-peptide.
Ce dosage peut être effectué par les méthodes
connues de 1'homme du métier et en particulier par des
méthodes physiques ou immunologiques telles que les
méthodes immunoenzymologiques, radioimmunologiques ou
chimioimmunologiques ou par des approches plus
récentes qui sont basées sur les nouvelles techniques
de biologie moléculaire telles que l'immuno-PCR. Selon
cette techni~ue, le complexe antigène-anticorps est
détecté par une réaction de PCR qui met en jeu un
oligonucléotide lié à l'anticorps de révélation. Le
complexe est ensuite visualisé par électrophorèse.
Avantageusement, les anticorps dont on
détermine la presence ou que l'on dose sont des
anticorps representatifs d'états pathologiques et en
particulier d'états cancéreux ou pré-cancéreux.
Afin de mettre en oeuvre le procédé, le peptide
peut être fixé sur une phase solide.
Les complexes formés peuvent être révélés à
l'aide d'un anticorps réagissant spêcifiquement avec
le peptide ou les anticorps à doser ou à détecter .
- Cet anticorps permettant la révélation des complexes
est avantageusement conjugué à un margueur afin de
WO94/10306 ~ ~ 3 ~ 7 Ll PCT/FR93/01082
mettre en évidence le complexe anticorps-peptide .
Un tel marqueur peut être un enzyme, une
molécule chimioluminescente, bioluminescente,
fluorescente ou radioactive.
Un tel procéde peut être avantageusement mis en
oeuvre à l'aide d'un coffret pour le dosage et à la
détermination d'anticorps comprenant au moins~
- une préparation d'un ou plusieurs des
peptides tels que précédemment décrits et
- un moyen permettant la révélation de la
réaction ou de l'absence de réaction entre l'un de ces
peptides et les.anticorps à doser .
Le complexe peptide anticorps formé lors de la
réaction est avantageusement révélé à l'aide d'un
lS anticorps conjugué à un marqueur tel que défini ci-
dessus ou à l'aide de toutes molécules capables de
détecter la présence d'un tel complexe.
Les peptides objets de la presente invention
sont préférentiellement obtenus par synthèse à partir
d'acides aminés par tous moyens connus de l'homme du
métier .
Ils peuvent aussi être obtenus par génie
génétique ou par découpage enzymatique ou chimique de
la protéine p53.
Les anticorps permettant la révélation du
complexe formé entre le peptide et les anticorps sont
avantageusement dirigés contre des déterminants
antigéniques spécifiques de l'espèce dont est
originaire le fluide ou le tissu . Ainsi, dans le
cadre de dosage d'anticorps d'origine humaine, les
anticorps permettant la révélation du complexe seront
des anticorps anti-humain.
La présente invention est illustree sans pour
autant etre limitee par les exemples qui suivent dans
lesquels :
WO94/10306 ~ t ~27 4 PCT/FR93/01082 ~;~
, ~
La figure 1 représente les profils
d'interaction entre les fragments de la proteine p53
et des anticorps présents dans lq sérum de différents
patients ayant un cancer. Les anticorps utilisés pour
les hybridations des figures lA à lF sont
respectivement un sérum de lapin CMl immunisé avec la
protéine p53, un sérum de souris immunisé avec la
proteine p53, trois sérums de patients dont il avait
eté détermine qu'ils possedaient des anticorps anti~
p53 et un temoin constitue par un anticorps anti-
phosphatase alcaline.
Les figures 2 à 7 representent la reactivite de
77 peptides correspondant à la protéine p53, vis-à-vis
de sérums de trois patients atteints de cancers du
poumon numérotés 84, 37, 109, et de trois patients
atteints de cancer du sein numérotés 57, 27 et 2~
Le complexe anticorps/peptides est révelee par
colorimétrie et la densité optique est mesurée par un
lecteur de microplaque.
La figure 8 illustre la fréquence de
reconnaissance ~en ordonnée) de 77 peptides ( en
abscisse) par différents sérums de patients atteints
de cancers.
Les abréviations suivantes sont utilisées dans
les exemples :
ER, récepteur oestrogène
HCD, Domaine Hautement Conserv0 (highly conserved
domain) de la protéine p53
hsp70, protéine du choc thermique de 70 kilodaltons
MAB, anticorps monoclonal
PBS, ~ampon phosphate
PBST, PBS avec 0,1 % Tween 20
PBSTM, PBS avec 0,1% Tween 20 et 3~ poudre de lait
~ écrémé
PCR, réaction de polymérisation en chaîne (polymerase
WO94/10306 ~ 2 7 ~ pcT/FRs3/o1o~2
~. ' ~ "' '.
.
- chain reaction).
PhoA, Phosphatase alcaline d'E.coli
- PR, récepteur progestéxone
SDS, sodium dodécyl sulfate
5 EXEMPLE 1 - '
Mise en_évidence_et sianification des anticorps
anti-~53 présents dans le sérum qe Datients atteints
de cancer et localisation des réqions de la Drotéine'
PS3 reconnues ~ar ces_anticorps.
1) MATERIELS ET METHoDEs
1.1 SERUMS.
Les sérums de 80 malades présentant un
carcinome invasif du sein et de 20 malades avec des
métastases ont été réunis après diagnostic
histopathologique et conservés a -20'C.
1.2 AnticorPs monoclonaux
Des souris BALB/c d'haplotype H-2d sont
immunisées par voies intrapéritonéale avec 100 ~g de
pS3 humaine normale. Une injection de rappel est
effectuée par voie intraveineuse avec 80~g de protéine
~e meme origine. Quatre jours apres le xappel, les
splénocytes sont prélevés et fusionnés avec des
cellules de myélome NS-l en présence de polyéthylene
glycol (PEG 1500 'Boehringer). Apres sélection en
milieu additionné de 1 % d'Hypoxanthine Aminopterine
Thymine ~HAT) (Gibco), la sécrétion d'anticorps par
les hybridomes a été recherchée par un test ELISA en
utilisant la p53 humaine comme antigène. Les
hybridomes secrétant des anticorps capables de
reconnaître la p53 ont été clonés par la technique de
dilution limite.
Pour la localisation des épitopes sur la p53
humaine, nous avons utilisé une série de peptides
chevauchants (longueur de 15 acides aminés (aa),
chevauchement de 10 aa) couvrant l'intégralité de la
WO94/10306 PCT/FR93/01U82
2l!~8~ o
protéine p53. On dispose d'une série de 77 peptides
biotinylés correspondant à la totalité de la p53. Les
76 premiers peptides à partir de l'extrémité N-
terminale ont une longueur de 15 acides aminés chacun
et le 77ème peptide ne comprend que 13 acides aminés.
L'anticorps H111 reconnaît un épitope compris
entre les acides aminés 291 et 300, l'anticorps HR231
reconnaît un épitope compris entre les acides aminés
371 et 380 et HT 21~ reconnaît un épitope compris
entre les acides aminés 1 a 64.
1.3 EXPRESSION DE FRAGMENT DE ~
Le vecteur pLip4 a été utilisé pour la
production des protéines hybrides. Ce plasmide est
dérivé de pLipl (21) dans lequel deux sites de
restriction Sac I et Sal I sont introduits entre les
codons +6 et +7 du gene E.coli PhOA. Apres clonage, la
protéine de fusion PhoA est exportée dans le
périplasme bactérien et peut en être extraite par choc
osmotique à froid (21).
~0 ~a protéine p53 a été découpée en 6 fragments
bien définis. Les fragments 2 (résidus 108 à 162), 3
(résidus 158 à 219), 4 (résidus 215 à 267) et 5
(résidus 263 à 310) contiennent respectivement les
régions HCD II à V et correspondent aux sites
privilégiés pour les mutations (régions HOT-SPOT) dans
les cancers humains (11,12).
Les fragments l (résidus l à 112) et 6 (résidus
306 à 393) correspondent aux régions amino- et
carboxy-terminales de la protéine et sont généralement
à l'écart des mutations.
Les fragment~, precis d'ADNc de la p53 humaine
(clone H8, Varda Rotter, Institut Weissman, Israël)
ont été amplifiés par PCR utilisant la Vent-~NA
~ polymérase pour réduire les erreurs d'incorporation
puis sous clonés dans un vecteur pLIP4. Les clones
W0~4/10306 ,7.1 4 ~ ~ 7 ~ PCT/FR93tO1082 -~
1 1 . -
positifs sont controlés pour l'activité phosphatase :~
alcaline et séquencés directement.
-Les six fragments fusionnés au gène PhoA
peuvent etre exprimés dans E,coli comme des protéines :
solubles. ~e rendement d'expression de protéine de
fusion avec le fragment 6 est plus bas (2 a 5 fois)
que pour les autres fragments .
L'antigenicité de la proteine exprimée est
établie par sa reactivité avec différents anticorps
monoclonaux . (voir tableau 2). PAbl801 (22) et HT 216
sont spécifiques du fragment 1; l'épitope PAb240 est
localisé sur le fragm~nt 3 (23). Hlll est sur le
fragment 5; HR 231 et PAbi22 (24) sont spécifiques de :
la région carboxy-terminale de la p53 (fragment 6).
Tous ces anticorps monoclonaux réagissent en -immunoblot et immunoprécipitation avec la protêine de ~:
fusion pLIP4 en accord avec la localisation de leur
épitope (voir tableau 2)~ :
1 . 4 METHODE D ' ANALYSE DES FRAGMENTS P5 3 PAR
2 0 I MMUNOBLOT . ~:
L'Immunoblot a été réalisé tel que décrit par .
Towbin et al. ( 20 ) . Les protéines sont séparées par
électrophorèse en gel de polyacrylamide (10%
acrylamide) en tampon Tris-Glycine contenant 0,1 % de
SDS, pH 8,3. Les protéines sont transférées sur une
membrane de nitrocellulose (2 heures, 40 voltsj; la ; :
membrane est immergée en tampon PBSTM pour saturer les
sites de fixation non spécifiques puis lavée 5 fois au
PBST.
30Pour le Western blot du sérum du patient et de
l'extrait d'E.coli, .plusieurs pre-incubations sont
nécessaires pour diminuer les liaisons non spécifiques
à la membrane de nitrocellulose et éliminer les
~ anticorps anti-phosphatase présents dans certains
35sérums. Les serums sont d'abord incubés avec l'extrait
W094/10306 PCT/FRg3/01082
., . : .::
~ 4 12
bactérien exprimant la phosphatase alcaline E.coli
pendant une heure à ~4'C puis sur une membrane de
nitrocellulose contenant un extrait bactérien (sans
protéine de fusion) 12 heures à +4 C.
La membrane de nitrocellulose avec les
protéines hybrides est incubée avec les sérums
préparés et dilués du 1/100 au 1/500 pendant 1 heure
en tampon PBSTM à température de la pièce . Après 5
lavages en PBSTM, les membranes sont incubées 1 heure
avec un antiCQrps de lapin anti-souris conjugué
peroxydase (dilué au 1/4000 en tampon PBSTM), lavées 5
fois en tampon PBS et revelees par le Luminol
(AmershamR).
Après lecture et interpretation , les filtres
sont contrôles par réaction immunologique (Immunoblot)
pour la quantité de protéine de fusion effectivement
déposée en incubant la membrane avec un anticorps
anti-phosphatase alcaline.
L'immunoprécipitation et l'électrophorèse en
gel de polyacrylamide-SDS ( SDS-PAGE) ont été réalisés
selon la technique décrite par Soussi et al. (19).
2) RESULTATS `
2.1 Anticor~s anti-~S3 et résultats cliniques.
Las sérums de 100 patients avec un cancer du
25sein sont testés pour la présence d'anticorps par
immunoprécipitation et Western blot (Tableau 1) . Les
anticorps circulant sont détectés chez 14% des
patients tous stades cliniques confondus.
La fréquence est légèrement plus élevée que
30celle rapportée par Crawford et al. (10~) (16), en
raison surement de l'utilisation de protéine purifiée
recombinante p53 à la place de lysat cellulaire.
Il n'y a pas de corrélation entre la présence
_ d'anticorps et le stade clinique de la maladie. Aucune
35différence de fréquence en fonction de la taille de la
WO94/10306 ~1 4 8 2 7 4 PCT/FR93/01082
13
tumeur ou de la dissémination ganglionnaire n'a été
montrée. Il n'y a pas de corrélation avec d'autres
paramètres cliniques tels que l'â~e , le statut
hormonal. Par contre une corrélation a eté établie
avec le stade histologique de la tumeur ~SBR stade 3),
un marqueur pronostic indépendant dans les cancers
primitifs du sein . Ceci est confirmé par
l'association entre la présence d'anticorps et
l'absence de récepteurs hormonaux ~ER-PR).
2.2 Analyse des réqions de la ~rotéine ~53
im~liauées dans la réPonse immune.
Pour déterminer si la réponse immunitaire est
dirigée contre la pS3 mutante ou sauvage, tous les
sérums positifs et plusieurs sérums négatifs sant
contrôlés par immunoprécipitation contre différents
mutants p53 (Hisl75, Val 143 et ProlS6). La
reconnaissance des types sauvages et mutants p~r les
sérums est identique.
Dans une seconde série d'expériences , le sérum
CMl t25) a été contrôlé . CM1 est un anticorps
polyclonal de lapin obtenu par immunisation avec la
p53 humaine hautement purifiée et fréquemment utilisée
en immunocytochimie (24). Les techniques de Western
blot ont montré que le serum CMl contient des
anticorps qui reconnaissent principalement les
fragments 1 et 6 et à un moindre degré le fragment 5.
Des résultats similaires sont obtenus par
immunoprécipitation . Une expérience de contrôle avec
un anticorps anti-phosphatase alcaline permet
d'établir que des quantités identiques des differentes
protéines de fusion sont bien présentes sur le gel
(figure 1). Pour éiargir des o~servations nous avons
contrôle le sérum d'une souris immunisee avec de la
p53 immunopurifiée. Le profil de reconnaissance est
3S quasiment identique à celui du sérum CMl. Des
. .
~;
'
wo g4/l0306 2'1~ 4~2~ 4 pcr/FR93/o1o8?
14
résultats identiques ont été obtenus avec trois autres
souris.
L'ensemble de ces résultats permet d'établir
que les parties amino et carboxy terminales de la
protéine p53 sont très immunogène~s chez l'animal
immunisé et correspondent à des xéponses préfé-
rentielles alors que le fragment 5 a une réponse plus
faible . Des temps d'exposition radiographique allon-
gés n'ont pas permis de mettre en évidence une recon-
naissance des fragments 2 à 4 tant par immunopré-
cipitation que par immunohybridation timmunoblot).
On a testé le profil de reconnaissance des
sérums de malades contenant des anticorps anti-p53
(figure l. et tableau 3).Les immuno hybridations
réalisées ont clairement montré que la réponse
immunitaire chez les patients est dirigée
principalement contre des epitopes localises dans les
fragments 1 et 6 de la p53. Le sérum de certains
patients reconnaît seulement le fragment 1 , mais
aucun ne reconnaît uniquement le fragment 6 ce qui
laisse supposer que la réponse primaire est dirigée
principalement cont e le fragment 1. Des résultats
semblables sont obtenus par immunoprécipitation. De
même que chez l'animal, il existe quelques variations
dans la reponse immunitaire et quelques patients ont
des anticorps diriges contre les fragments 4 et 5.
Aucun anticorps dirigé contre les fragments 2 et 3 n'a
pu être detecté. Ce phénomène n'est pas spécifique au
cancer du sein. Des résultats identiques ont éte
obtenus avec des serums de patients ayant des
carcinomes de l'ovaire ou du poumon (figure 1 et
exemple 2~.
Ces resultats etablissent clairement que la
partie amino terminale de la p53 contient un ou
3~ plusieurs épitopes dominants implique dans la reponse
WO94~l0306 ~14 ~ 2 7 4 PCTtFR93/01082
immunitaire cellule B chez des patients présentant des
cancers divers. La région carboxy terminale contient
aussi un ou plusieurs épitopes immunodominant mais
leur importance est moindre par rapport à la région
amino terminale.
EXEMPLE 2:
Mise en évidence des-PitoPes reconnus Par les
antic~orps anti-P53 ~résents dans le sérum de malades
atteints_de divers tYp-es de cancer : analvse avec des
peptides de sYnthèse .
1) MATERIELS ET METHODES
Les plaques de microtitration utilisées sont
des plaques en polychlorure de vinyle à fond pl,at, à
96 puits. Ref: M129B, Société Dynatech.
La streptav~dine en poudre, référence (S4762) ,
Société Sigma.
Peptides biotinilés synthétisés par la Société
CAT (Angleterre)
Une série de peptides chevauchants (longueur de
15 acides aminés (aa) , chevauchement de 10 aa)
couvrant llintégralité de la protéine p53. On dispose
actuellement d'une série de 77 peptides biotinylés
correspondant à la totalité de la p53. Les 76 premiers
peptides à partir de l'extrémité N-terminale ont une
longueur de 15 acides aminés chacun et le 77ème
peptide ne comprend que 13 acides aminés ( SEQ ID
NO:15).
2 peptides témoins ne correspondant pas à la
protéine p53 sont utilisés comme témoin négatif.
Tablette ABTS 50 mg; ref 1112422, Boehringer
Tampon ABTS ref 1112597, Boehringer
Anti human couplé à la peroxydase IgG-GAH;
P~SOF, Silenus
Lait en poudre
- 35 METHODES DU TEST ELISA
WO 94tlO306 PCT/FR93/01082
2i4827 4 16
, ~:
; `
PREPARATION DES PLAOUES DE MICROTITRATION.
100 yl de streptavidine ( concentration 5yg/ml
dans l'eau distillée ) sont déposés dans les puits de
la plaque.
Les plaques sont ensuite incubées à 37'C dans
une étuve sèche pendant 48 heures. Après cette étape
de déshydratation, elles peuvent être emballées
individuellement et stockées pendant plusieurs mois à
4 C. -
LAVAGE ~
Les plaques déshydratées sont lavées 5 fois -
avec du PBS ( phosphate buffer saline) contenant 0,05%
Tween 20. Ce tampon PBS avec du Tween (PBS-T) sera
utilisé tout le long de l'expérience comme solution de
lavage. Les 5 lavages se font de manière usuelle en
utilisant 200 ~l de tampon PBS-T par puits.
Après le dernier lavage, la plaque est séchee
sur un papier a~sorbant. Tous les lavages sont
effectués de cette façon.
SATURATION
100 yl de solution de saturation sont ajoutés
dans chaque puits.
solution de saturation: tampon PBS
O,2 % Tween 20
5% Lait
Les plaques sont ensuite incubées 1 heure à
37C avec une légère agitation puis sont ensuite
lavées comme indiqué précédemment.
ADDITION DES PEPTIDES BIOTYNILES
50 yl de solution de peptides (125 nanogrammes
de peptide dilué dans du tampon PBS contenant 0,1 % de
Serum Albumine Bovine et 0,02% d'azide de sodium) sont
ajoutés dans chaque puits.
Chaque puits reçoit un peptide différent
correspondant à une région précise de la p53.
.
WO94/10306 ~1 4 82 7 4 PCT/FR93~01082
17
;'
Les plaques sont incubees 1 heure à 20-C avec
une légère agitation et sont ensuite lavees comme
indiqué précédemment .
ADDITION DES SERUMS DES PATIENTS
Les sérums à tester sont dil~és au lJ50 dans
une solution de PBS contenant du lait à 5%.
50 ~l de sérum ainsi dilué sont ajoutés dans
chaque puits de la plaque.
Les plaques sont incubées l heure à 20 C avec
une légere agitation et sont ensuite lavées comme - -~
indiqué précédemment. ~`
INCUBATION AVEC L'ANTICORPS SECONDAIRE.
100 t~l d'anticorps monoclonal anti-
immunoglobuline humaine sont ajoutés dans chaque puits --
( commercialisé par Silenus, anticorps dilué au 1/2500
dans du PBS 5~1ait).
Les plaques sont incubées 30 minutes à 37 C
avec une legère agitation et sont ensuite lavées comme
indiqué pracedemment. ~
REVELATION. -
100 ~1 de substrat (ABTS 1 mM, commercialise
par Boerhinger) sont ajoutes dans chaque puits.
Les plaques sont incubees à 20-C avec une -
legère agitation. `~
Le résultat est lu dans un appareil de lecture
ELISA (405 nm) 15 minutes, 30 minutes et 60 minutes ;~
après addition du substrat .
2) RESULTATS OBTENUS
Dans l'exemple l deux phénomènes ont ete mis en
évidence.
i~ La presence d'anticorps anti-p53 est
retrouvee chez les patients ayant une forme agressive
de cancer du sein (mauvais pronostic ).
ii) Les anticorps anti-p53 reconnaissent
principalement une region de 112 acides amines situes
.
WO94/10306 ~ 1 4 ~ 2 7 4 PCT/FR93/01082
18
dans la partie amino terminale de la p53 ainsi qu~une
région carboxy terminale localisée entre les résidus
306-393. L'étude ne pouvait pas permettre de détailler
plus precisement la region reconnue par les anticorps
anti-p53.
L'étude decrite dans cet exemple presente une
etude très détaillée de ces régions.
Une analyse de plus de l 000 sérums de patients
atteints de divers types de cancers a éte faite. 47
serums positifs ont ete choisis pour une etude très
detaillee afin de determiner la nature exacte des
epitopes que reconnaissent les anticorps seriques.
Ces 47 serums contenant des anticorps anti-p53
ont ete testes sur une serie de 77 peptides couvrant
l'integralite de la proteine p53 humaine sauvage. La
methode utilisee est la detection ELISA .
Des exemples de resultats obtenus sont decrits
dans les figures 2 à 7.
L'ensemble des resultats est résume dans le
tableau 5.
Dans ce tableau, les peptides donnant une
reponse comprise entre 50 et lO0 % de la valeur
maximale de l'ELISA ont éte indiques en noir. Les
peptides donnant une réponse comprise entre 20 et 50 %
de la valeur maximale de l'ELISA ont ete indiques en
gris.
Les initiales des cancers etudiés sont les
suivantes :
LC: cancer du poumon
UC: cancer de la vessie
PA: cancer du pancréas
BC: cancer du sein
BL: lymphome de Burkitt
H : cancer du foie
OV: cancer de l'ovaire
WO94/10306 2 ~ 4 8 2 7 4 PCT/FR93/01082
1 9 :
L : leucemie
TY: ~ancer de la thyroïde
PR: cancer de la prostate.
La figure 8 illustre les frequences obtenues
pour chacun de ces peptides.
Cet histogramme montre la frequence de
reconnaissance de chaque peptide par les 47 serums
etudiés (voir tableau 5). Il montre, par exemple, que ~-
40% des sérums reconnaissent au moins le peptide 3 et
que 63% reconnaissent au moins le peptide 4. ~8% des
.
sérums reconnaissent au moins l'un des 5 peptides de
la région aminoterminale (N-ter) tandis que seulement ;~
47% reconnaissent l'un des peptides de la région
carboxy terminale (C-ter). Bien sur, 100% des sérums
reconnaissent l'un des 13 peptides décrits dans ce ~
tableau. -
L'ensemble de ces résultats montre que 98~ des
sérums de malades reconnaissent au moins l'un des
epitopes presents dans les 5 peptides de la region
amino terminale. 47% des serums reconnaissent au moins
un des peptides de la region carboxy terminale. `~
Il apparait donc que l'utilisation de ces ~
peptides, amino ou carboxy terminaux, sont d'une -
importance majeure ~ans la possibilite de mettre au ~;
point un test ELISA pour mesurer la presence de ces
anticorps dans le fluide biologique de patients
atteints de cancers ou d'etats precancereux. -
:
, ~...
WO9~/10306 21~ 8 2 7 ~ PCT/FR93/01082
TABLEAU 1 ~
Corrélation entre le taux d'anticorps anti-p53 ~:
dans le sérum et les paramètres cliniques et
histoloqiques de patients atteints d ' uh cancer du sein
Paramètres cliniques . N- P
_ _
Patients atteints par des 3/20
mét~stases ou ayant subi une
rechute
cancer primaire du sein 17~80
Taille de la tumeur
T -Tl 2/21
T2 7/33 NS
T3 2/19 :~.:--
T4 1~7
Etat des nodules lymphatiques :
No 4/32 NS
N- 7/43
Catégorie histologique
catégories 1 et 2 5/59 cO.05
catégorie 3 6/17
Etat des récepteurs
hormonaux
ER + PR +
ER- PR + 2/34 c0.05
ER+ PR-
ER- PR- 5/13
_
NS = non significatif .
......
~ 1 4 ~
WO 94/10306 21 PCr/FR93/OtO82
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219 ~ 2 7 4 PCT/FIR93/01082
WO 94/ 1 03~6 - -
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21 4 t~ 2 7 4 ; PCr/FR93/01082
- - WO 94/10306
2 ~
T A B L E A IJ 4 ~ ;
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2 7 4 PCI`/FR93/010~2 -`
WO 94/10306 2 1 4 ~
24
TABLEAU ~ ~ suite)
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TAEILEAU 4 ( sulte) -
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PCr/FR~3/01 082
WO94/10306 21 ~ Q2 ~ ~ 26
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TA9LEAU 4 ( suite)
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WO 94/10306
TABL~AIJ 4 tsuite)
I BC I BC I E~C BC ¦ BC ¦ BC ¦ BC BC ¦ BC ¦ BC ¦ E3C ¦~
5 17 1 ~8 29 77 r57 1 109 20 1103148 57 85 174
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2 ~ PCr/FR93/01082
WO 94/10306 2 1 4 8 2 7 ~
T A B L E A ll 4 ~ ~ U i t e )
I BL BL I BL BL I H OV L L TY I TY I TY IPR I
1 1 2 5 6 155I 801 48 12 23 1 24 1 108 151 1 --
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WO 94/10306 PCr/FR93/01082
TABLEAIJ 4 ( suite~ .
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214 8 2 ~ 4 Pcr/FRg3/01082
WO 94/10306
TABLEAll 4 ~ suite)
L~ I u-C I ~ I U~-~ U~ I PA I F~A I PA I PA -PA
19 2~3 ~,~ 101 10~ ~ ) E2 ¦ 111 1 / 123
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WO94/10306 ~1 4 3 2 7 4 PCT/FR93/01082
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WO94/10306 . PCl~/FR93/01082 ~ : ~
- ;
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENER~LE~
(i) DEPOSANT~
(A) NOM: LABORATOIRES EUROBIO ~.
(B) RUE: 7, Avenue de Scandinavie ---~
(C) VILLE: LES ULIS CEDEX ~ ~.
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 91953 :
(G) TELEPHONE: 69 07 94 77
(H) TELECOPIE: 69 07 95 34
(I) TELEX: 681 425 F
(ii) TITRE DE L' IN~ENTION: FRAGMENTS DE LA
PROTEINE P53 ET LEURS UTILISATIONS DANS LA DETECTION
ET LE SUIVI D'ETATS PATHOLOGIQUES
~iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 15
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: -
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR- IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release ~1.0, Version
~1.25 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE DEPOT: FR 9213110
(B) DATE DE DEPOT: 02-NOV-1992
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides aminés
(B) TYPE: acide amine
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire :
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide ;
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens I -
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp
1 5 10
Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu
WO94/1~306 21~ 8 2 7 4 PCT/FR93/01082 ~;
36 -
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2~
(i) CARAC~ERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé -
(C) NOMBRE DE BRINS: simple .
(D3 CONFIGURATION: linéaire
tii) TYPE DE MOLECULE: peptide
~vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: ;
Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln
1 5 10
Trp Phe~Thr Glu Asp Pro Gly Pro .
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: .
(A) LONGUEUR: 15 acides amines .
(B) TYPE: acide amine :.
(C) NOMBRE DE BRINS: simple ~-.
(D) CONFIGURATION: lineaire :.. `
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:: SEQ ID NO.: 3:
Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu
1 5 10
Trp Lys Leu
1~ -
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: ~.
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides amines
(B) TYPE: acide amine
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
WO44/10306 21 4 ~ 2 7 4 PCT/FR93/01082 . ~
37 ~:
:.
~vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro
1 5 10
Glu Asn Asn
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
ti) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: -~
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
~B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire . ~.
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
. - .- ~
tvi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu ~.
1 5 10
Ser Pro Leu .~
~ :
-: .
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
..-. . ~ .
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: : ::
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé . : .
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln
5 10 .,`
Trp Phe Thr
W094/10306 PCT/FR93/01082
2148274 38 ~
(2) INEORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7~
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acLde aminé
- (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire ~:
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide :~
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: . ~:~
Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp .:
1 5 10
Pro Gly Pro
.:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8: :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés ..
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple ::~
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide ; : :-
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
'
- (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys
1 5 10 --
Glu Pro Gly -`
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9: :~
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
~C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
WO94/103Q6 2 1 1 8 2 7 4 PCT/FR93/01082
39
'
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser
1 5 ~ 10
Arg Ala His
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10: : :~
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEVR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS~.simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE: . :
(A) ORGANISME: Homo sapiens ::
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: `;~
Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser
l 5 10
His Leu Lys
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide amine
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
~vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapien~
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys
l 5 10
Lys Gly Gln
_ 15
WO94/10306 214 8 2 7 ~ PCT~FR93/01082 ~ : S
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: .
(A) LONGUEUR: 15 acides amines
(B) TYPE: acide aminé ::
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D~ CONFIGURATION: linéaire , .
(ii~ TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE: :
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12~
Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr
1 5 10
Ser Arg His ~-
t2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARAC~ERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés :~E `:
~B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple :
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide ~ ;
(vi) ORIGINE: ; :
(A) ORGANISME: Homo sapiens ~. :
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys
1 5 10 ``
Leu Met Phe
1~ , .:
: ~ :
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14: :~
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides amines ::
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D~ CONFIGURATION: lineaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
WO94/10306 21 4 8 2 7 4 PCT~FR93/01082
41
(xi~ DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr
1 5 10
Glu Gly Pro
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: : ::
(A) LONGUEUR: 13 acides aminés :
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple .~ :
(D) CONFIGURATION: linéaire ~ :~
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide ~ :
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser :~
1 5 10
Asp
::
