Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
~ WO95N7361 2 ~ 714 ~ 9 PCTA~4/0l068
PROCEDE DE DETECTION DE MOLECULES CONTENANT DES
MESAPPARIEMENTS NUCLEOTIDIQUES ET DE LOCALISATION DE
CES MESAPPARIEMENTS, ET APPLICATION A LA DETECTION DE
SUBSTITUTIONS OU DE DELETIONS DE BASES DANS DES
SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES.
La présente invention a pour objet un procédé
de détection de molecules contenant des
mesappariements nucléotidiques et de localisation de
ces mésappariements, et son application à la détection
de substitutions ou de délétions de bases dans des
sequences nucleotidiques
La majorite des maladies liées à des
modifications du génome, soit des organismes hotes,
soit des organismes infectieux est très souvent due à
un simple changement d'un ou plusieurs nucléotides.
Aussi, des efforts considerables ont été entrepris
afin de développer des méthodes pour détecter non
seulement des mutations déjà connues mais aussi pour
mettre en évidence des mutations inconnues.
Cependant , les méthodes disponibles pour
rechercher des mutations ponctuelles inconnues dans
des régions d'ADN de taille importante ont toutes des
inconvénients qui rendent leurs utilisations
difficiles.
Par exemple , les gels d'électrophorese avec
gradient de denaturation necessitent des optimisations
a l'aide d'ordinateur de la region cible et des
conditions d'électrophorese adaptées à chaque fragment
d'ADN (Myers et al. (1987), Methods Enzymol, 155, 501-
527).
La technique de conformation polymorphique du
simple brin (SSCP ), (Orita et al. (1989) - Genomics,
5, 874), en dépit de sa simplicité experimentale , a
montre une sensibilite pour la detection de mutation
dans des fragments d'ADN d'environ 150 paires de
WO95/07361 PCT~R9~/01068
2~71469
bases.
Cependant , aucune de ces methodes ne donne
d'informations precises concernant la localisation de
la mutation dans le fragment d'ADN .
Les methodes de sequençage direct , bien que de
plus en plus rapides , restent coûteuses et longues à
mettre en oeuvre pour la recherche de mutations de
natures inconnues et ne se sont pas fiables dans le
cas de mutations ponctuelles heterozygotes .
Une autre methode mettant en oeuvre une coupure
chimique au niveau des mesappariements (CCM) telle que
decrite par Cotton et al.( Proc. Natl. Acad. Sci., USA
(1988) 85, 4397-4401) est en principe bien adaptee à
la mise en evidence de mutations, indepen~ nt de la
longueur et de la composition de la sequence de la
region à laquelle on s'interesse . Elle a ete utilisee
avec succès dans un grand nombre d'etudes et a fait
recemment l'objet d'une revue (Cotton (1993) Mutation
Research 285, 125-144) .
Cette methode a permis la detection de
mutations dans des fragments amplifies par voie
enzymatique d'une longueur d'un kilobase.
Aucune methode actuellement n'est susceptible
d'être utilisee de façon routiniere pour differentes
raisons : manque de fiabilite ( nombre important de
faux negatifs) et ensuite en raison de la complexite
des methodes qui font qu'elles ne se prêtent pas à une
execution automatisee.
Par exemple dans la methode CCM classique , les
heteroduplex, c'est-à-dire les ADN double brin , ou
bicatenaires , resultant d'un appariement entre deux
molecules d'ADN heterologues , sont formes entre l'ADN
amplifie par voie enzymatique du patient et un
fragment d'ADN representant la sequence de type
sauvage marque à une extrémite à l'aide d'un isotope
WO95/07361 2 1 7 ~ ~ 6 9 PCT~R94/01068
3
radioactif . Les molecules d'ADN hetéroduplex sont
formees avec l'ADN correspondant à la sequence de type
O sauvage marque à l'extremite de chacun des brins,
codant et non codant, puis sont traitees chimiquement
dans des reactions parallèles afin de revéler les
mesappariements .
En theorie , en utilisant deux sondes , toutes
les mutations devraient être detectees , après les
coupures spécifiques des cytosines et des thymines non
appariées respectivement induites ~ar l'hydroxylamine
et le tétroxyde d'osmium, puisqu'une cytosine ou une
thymine non appar oe doit être presente au site de la
mutation , soit sur le brin codant soit sur le brin
non codant de la sonde marquee par un isotope
radioactif .
En pratique , la coupure au niveau de certains
mesappariements peut se faire incorrectement , en
raison de la nature des bases non appariées et de
l'environnement de ces bases .
Ainsi, les sondes utilisees dans la methode CCM
classique ne permettent pas d~avoir simultan~.n~nt
quatre types d'hétéroduplex. Par exemple, Cotton et
al. (1993, precedemment cites) ne decrivent qu'un ou
deux types d'heteroduplex.
Un autre inconvenient de cette technique est la
necessite de repéter le marquage radioactif des
amorces pour la polymérisation en chaîne (PCR ) et des
marqueurs de tailles.
De plus, cette technique rend necessaire la
préparation d'une double serie d'heteroduplex , avec
marquage terminal du brin sens et du brin non-sens,
afin de detecter separement les bases modifiees sur
l'un ou l'autre brin .
Enfin, la methode CCM ne permet pas de detecter
tous les heteroduplex et donc ne permet pas de
WO9~/07361 2 ~ 71 4 ~ 9 PcT~/oln68
détecter certaines mutations.
On entend par sonde une séquence nucléotidique
marquée comportant un nombre de nucléotides suffisant
pour établir la complémentarité spécifique entre cette
séquence et la séquence présente dans l'échantillon.
A titre d'exemple, une sonde utilisée selon
l'invention peut comporter de 8 a 2.000 nucléotides.
On entend par hétéroduplex un brin d'ADN
amplifié avec un brin complémentaire contenant au
moins un mésappariement ou une délétion ou boucle de
non appariement.
Les demandeurs se sont donc attachés a la mise
en oeuvre d'une technique plus fiable, plus rapide et
automatisable, permettant une détermination sans
ambiguïté de la substitution de base , comprenant un
nombre réduit d'étapes, et utilisant des marqueurs non
radioactifs .
Les demandeurs ont donc montré de maniere
surprenante que l'on pouvait détecter et positionner
d'une maniere plus rapide et plus fiable les
substitutions de bases dans des séquences
nucléotidiques en marquant chacun des brins sens et
non-sens par un marqueur fluorescent ou enzymatique.
L'utilisation de marqueurs fluorescents est
aussi un avantage en ce qui concerne les conditions
générales de mise en oeuvre de la méthode tant du
point de vue sécurité que du point de vue appareillage
. Elle permet d'autre part d'utiliser des marqueurs
différents pour chaque brin , sans que ce double
marquage implique des difficultés techniques ou
matérielles , comme ce serait le cas si l'on devait
procéder a un double marquage radioactif .
Les demandeurs ont en outre montré que l'on
pouvait détecter de maniere rapide des délétions ou
substitutions de bases en criblant les hétéroduplex
WO95/07361 2 ~ 7 1 ~ ~ 9 PCT~4/01068
5
sur un support les retenant spécifiquement.
Les demandeurs ont aussi montré que , dans le
cas de mutations héterozygotes , on peut mettre en
evidence les substitutions de base à partir seulement
de l'ADN amplifie de l'echantillon à analyser , sans
qu'intervienne dans la reaction un ADN issu
d'individus homozygotes présentant l'allèle de type
sauvage .
Ce mode de mise en oeuvre particulier de
l'invention evite ainsi d'avoir à preparer un ADN de
type sauvage marque , ce qui elimine une etape dans la
reaction et en limite les coûts . Ainsi , la mise en
oeuvre de ce mode preferentiel necessite d'utiliser
seulement de l'ADN de l'echantillon à analyser .
L'invention a de manière generale pour objet la
detection et/ou la localisation de mutations ou de
delétions dans des sequences nucleotidiques par
creation d'heteroduplex entre deux types d'ADN double
brin susceptibles de former des mesappariements aux
sites desdites mutations et deletions.
Selon un premier mode de mise en oeuvre les
heteroduplex sont mis en evidence du fait du marquage
sur chaque type de brin , sens et non-sens, par des
molécules fluorescentes différentes .
Selon un second mode de mise en oeuvre les ADN
ne sont pas marques et les heteroduplex sont cribles
par passage sur un support les retenant
specifiquement.
La presente invention a donc pour objet, selon
le premier mode de mise en oeuvre un procedé de
détection de la présence et de la position de
substitutions ou de délétions de bases dans une
séquence nucléotidique comprise dans une preparation
d'ADN double brin à tester dans lequel :
- on amplifie de maniere specifique la region
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~ 1 7 ~ 6
contenant la séquence nucléotidique d'une part de
l'ADN à tester et d'autre part d'un ADN dont la
sequence est connue , et l'on marque les brins sens et
non sens de ces ADN a l'aide de marqueurs
fluorescents, ou de marqueurs non-isotopiques,
differents,
- on hybride les ADN amplifiés, et
- on met en évidence les hétéroduplex formés.
Avantageusement, l'ADN a tester et l'ADN connu
sont amplifies dans la même préparation.
Elle a d'autre part pour objet un procédé de
détection de la présence et de la position de
substitutions ou de délétions de bases d'une séquence
nucléotidique comprise dans une préparation d'ADN
double brin hétérozygote ou hétérogene à tester dans
lequel:
- on amplifie de manière spécifique la région
contenant la séquence nucléotidique de l'ADN à tester
et on marque les brins sens et non sens de cet ADN à
l'aide de marqueurs fluorescents, ou de marqueurs non-
isotopiques, différents,
- on hybride l'ADN amplifié, et
- on met en évidence les hétéroduplex formés.
Avantageusement, l'ADN hétérogene est constitué
d'un mélange d'ADN de deux variants d'une bactérie ou
d'ADN extrait de cellules mosaïque d'une tumeur.
Selon un mode particulier de mise en oeuvre ,
les échantillons d'ADN double brin comprenant la
séquence nucléotidique a déterminer sont amplifiés par
la méthode de polymérisation en chaîne a l'aide de
deux amorces situées aux deux extrémités de la
séquence que l'on veut amplifier .
Les deux amorces peuvent être marquées
respectivement à l'aide de marqueurs fluorescents
différents .
Wo9~/07361 ~ 71~ ~ g pcT~Rs4loln6s
7
La molecule d'ADN double brin à determiner
possède avantageusement une taille comprise entre 150
et 10.000 paires de bases.
Preferentiellement, les hetéroduplex sont mis
en evidence par clivage des parties des brins non-
appariees.
L'étape d'hybridation est effectuée, selon un
mode de mise en oeuvre connu de l'homme du métier, par
denaturation et renaturation de l'ADN amplifie, ce qui
permet de forme_ des molecules mesappariees si l'ADN
contient, à l'e~a~ hétérozygote ( maladies génétiques)
ou de manière heterogene a l'etat de mosaïque
cellulaire ( masse tumorale melangee avec des cellules
saines en diverses proportions) ou une plusieurs
mutations ( deletions ou substitutions).
Dans le cas ou l'ADN dans lequel on recherche
la mutation provient d'une cellule haploïde, les
molecules heteroduplex se forment si l'amplification
d'un melange d'ADN des deux types, sauvage et mute, a
ete effectuee.
Préférentiellement , le reactif coupant les
parties non appariees est un reactif chimique, tel ~ue
l~hydroxyl amine, le tetroxyde d'osmium ou le
permanganate de potassium ou une enzyme telle que la
MutY ( Lu et Chang, (1992), Genomics, 14, 249-255) ou
une des enzymes , endonucleases et glycosylases,
decrites par Chang et Lu en 1991 (Nucleic Acid Res.,
19, 4761-4766), par Chehabet et Kan en 1989 (Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 86, 9178-9182), par Hennecke et
al. en 1991 (Nature, 353, 776-778), par Nickerson et
al. en 1990 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8~, 8923-
8927), par Wieabauer et Jiricny en 1990 (PrG~. Natl.
Acad. Sci. USA, 87, 5842-5845) ou par Yeh et al. en
1991 (J. BIol. Chem., 266, 6480-6484).
Ils peuvent aussi être mis en evidence par une
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méthode biophysique permettant de les différencier des
homoduplex, telle que la chromatographie ou
l'électrophorese;
Avantageusement, les hétéroduplex sont,
préalablement a leur mise en évidence, concentrés par
passage sur un support les retenant spécifiquement.
Selon le second mode de mise en oeuvre,
l'invention a pour objet un procédé de détection de la
présence de substitutions ou de délétions de bases
dans une séquence nucléotidique comprise dans une
préparation d'ADN double brin a tester dans lequel :
- on amplifie de maniere spécifique la région
contenant la séquence nucléotidique d'une part de
l'ADN a tester et d'autre part d'un ADN dont la
séquence est connue,
- on hybride les ADN amplifiés , et
- on met en évidence les hétéroduplex formés
par passage sur un support les retenant
spécifiquement.
Elle a d'autre part pour objet un procédé de
détection de la présence de substitutions ou de
délétions de bases dans une séquence nucléotidique
comprise dans une préparation d'ADN double brin
hétérozygote ou hétérogene a tester dans lequel :
- on amplifie de maniere spécifique la région
contenant la séquence nucléotidique de l'ADN a tester,
- on hybride l'ADN amplifié, et
- on met en évidence les hétéroduplex formés
par passage sur un support les retenant
spécifiquement.
Préférentiellement, ledit support porte une
protéine liant de maniere spécifique les hétéroduplex
telle que la MutS. Les hétéroduplex retenus sont
révélés par une molécule se fixant spécifiquement sur
l'ADN, telle que le bromure d'éthidium ou par tout
WO9~/07361 ~ i 71 ~ ~ ~ PCT~R94/01068
autre moyen a la portée de l'homme du métier, tel que
la fluorescence ou la radioactivité.
Ledit support peut être constitué de billes,
sphères ou particules ou être la paroi d'un puits
d'une microplaque pour test biochimique, recouverts
d'un anticorps anti-MutS.
La présente invention est particulièrement
adaptée à la détection de substitutions de bases chez
des patients atteints de maladies héréditaires
telles l'angiodème , l'hémoglobinopathie, la
mucovicidose, la dyotrophie musculaire et chez des
patients atteints de maladies cancéreuses telles que
le cancer du sein, la leucémie, le cancer du colon et
les maladies liées à l'atteinte de séquences oncogenes
ou antioncogenes.
L'intérêt du second mode de mise en oeuvre de
l'invention réside dans le fait qu'il permet de
cribler rapidement un grand nombre de préparations
d'ADN, une population par exemple.
S'il permet une détection d'une mutation, il ne
permet pas sa localisation qui peut quant a elle être
effectuée par un procédé selon le premier mode de mise
en oeuvre.
La présente invention a en outre pour objet une
composition comportant au moins trois sondes
permettant de former des hétéroduplex avec des
séquences nucléiques dans lesquelles on recherche la
présence ou l'absence de mutations ponctuelles.
Elle a enfin pour objet, des hétéroduplex
associés a un complexe constitué par une molécule de
type MutS et un anticorps anti-MutS.
La présente invention peut être aisément mise
en oeuvre par l'homme du métier utilisant ses
connaissances générales dans le domaine de la
biologie, et en particulier dans le domaine de la
WO95/07361 ~1 71 ~ ~ 9 lo PCT~/01068
polymérisation en chaîne .
Des renseignements généraux plus particuliers
concernant les techniques nécessaires pour la mise en
oeuvre des méthodes objets de la présente invention
peuvent notamment être trouvés dans "PCR Protocols. A
guide to methods and applications" ( Innis et al.,
Academic Press Inc., Harcourt Brace Jovanovich
Publishers, 1990).
La présente invention est illustrée sans pour
autant être limitée par les exemples qui suivent dans
lesquels :
- la figure lA représente la structure de
l'exon 8 du gène C1-inhibiteur et de régions
environnantes ,
- la figure lB représente la séquence de l'exon
8. Cette séquence a été décrite par Tosi et
al.((1986), Gene, 42, 265-272) et Carter et al.
((1991), J. Biochem., 197, 301-308).
- la figure 2A schématise les différents
hétéroappariements pouvant avoir lieu dans les régions
des codons 452 et 459,
- les figures 2B et 2C représentent
respectivement l'intensité de fluorescence de
différents oligonucléotides obtenus après
respectivement traitement par l'hydroxylamine et le
tétroxyde d'osmium de produits d'hybridation entre les
alleles sauvages et mutants correspondant aux régions
comprenant les codons 452 et 459,
- la figure 3A schématise les
hétéroappariements pouvant avoir lieu dans la région
des codons 458 et 467 ,
- la figure 3B représente le profil de coupure
par le tétroxyde d'osmium de mesappariements d'ADN
d'un patient hétérozygote pour la mutation Val458Met,
- la figure 3C represente le même type de
W095/07361 2171~ PCT~4/01068
11
profil pour la mutation Pro467Arg ,
- la figure 3D est le profil obtenu par
traitement des mésappariements de la figure 3C par
l'hydroxylamine ,
- la figure 4A représente le fragment de 588
paires de base comprenant le site de restriction de
1'enzyme HgiAl,
- la fi~ure 4B est la photo d'un gel de
migration des produits du traitement par
l'hydroxylamine d'appariements entre l'allèle sauvage
et l'allele d'un patient présentant une double
mutation en cis dans le fragment illustré sur la
figure 4A , à différentes dilutions ,
- la figure 4C représente le profil après
traitement par l'hydroxylamine des produits de coupure
du ~rin non-codant dans une situation où l'ADN n'a pas
été dilué ,
- la figure 4D est un agrandissement de régions
contenant les pics en position 295 et 317 de la figure
4C , à différentes dilutions .
Matériels et méthodes .
Echantillons d'ADN
36 patients non liés atteints d'angioedeme dont
l'analyse par des techniques d'hybridations sur
membrane (blot) n'a pas révélé d'altérations géniques
ont été étudiés et les essais ont porté sur les
mutations ponctuelles dans l'exon 8 en utilisant la
méthode classique de CCM ( Cotton et al. (1988). Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397-4401) et la méthode de
séquençage de l'ADN .
Fabrication de sondes marquées par des
marqueurs fluorescents .
Des amorces oligonucléotidiques ont été
synthétisées sur un synthétiseur Beckman 200A DNA ou
un synthétiseur Applied Biosystem 392 ( ABI) DNA/~NA .
WO95/07361 PCT~R94/01068
21 7~ 12
Un microgramme d'ADN génomique isolé à partir
de leucocytes du sang périphérique a été amplifîé par
la technique de polymérisation en chaîne ( dite PCR )
dans un milieu réactionnel de 100 ~l , en utilisant
des amorces oligonucléotidiques El et E2 , comme
illustré sur la figure lA.
La réaction a été effectuée durant 30 à 35
cycles. La sonde marquée par fluorescence a été
obtenue par réamplification , durant 25 cycles , en
utilisant 2 ~1 du produit de la première réaction
d'amplification et en utilisant les mêmes amorces
rendues fluorescentes par couplage d'un ester d'un
colorant et du N-hydroxyl succinimide à un coupleur
aminohexyl lié à l'extrémité 5'selon le protocole ABI.
La séquence de l'oligonucléotide El, qui est
marquée avec le fluorophore JOE est : 5'-GTG AAC TTG
AAC TAG AGA AAG C-3
.
La séquence de l'oligonucléotide E2, qui est
marquée avec le fluorophore FAM , est : 5'- TGA GGA
TCC CAC GAA CTG CCA G-3'.
Formation d'hétéroduplex et clivaqe chimique
des mésaPpariements .
Des fragments amplifiés par polymérisation en
chalne et doublement marqués sont précipités à
l'éthanol . Les quantités d'ADN sont estimées sur un
gel d'agarose et 450 ng d'ADN sont utilisés afin de
former des hétéroduplex . Les echantillons sont portés
à ébullition durant 5 minutes dans 150 ~1 de NaCl 1,3
M/MgCl2 3,5 mM/ Tris-HCl 3 mM pH 7,7 , refroidis sur
de la glace durant 5 minutes puis incubés durant la
nuit à 42-C.
Après hybridation , les échantillons sont
précipités avec de l'éthanol et resuspendus dans 18 ~l
d'eau.
Le protocole de base pour effectuer la coupure
2171~9
wos5lo736l PCT~4/01068
13
chimique des mésappariements a été decrit par Cotton
et al. ((1988). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397-
4401) .
6 ~1 d'hetéroduplex d'ADN sont utilises pour
chaque modification chimique . Pour chaque experience
, 5 ml d'hydroxychlorure d'hydroxylamine 7M sont
prepares dans de l'eau distillee et 4 ml sont titres
~usqu'à un pH de 6 par addition de diéthylamine .
6 ~1 d'ADN sont traités par 20 J~l d'une
solution d'hydroxylamine à 37 C durant 45 minutes ou 1
heure . La concentration finale d'hydroxylamine est
approximativement de 3,8 M.
Le tetroxyde d'osmium ( 4 % en poids de la
solution dans l'eau ) est dilué dans de l'eau
d~stillée jusqu'à obtention d'une solution de base à 1
~ et des aliquotes sont stockés à - 80 C dans des
tubes siliconés .
6 ~1 d'ADN sont incubés durant 15 minutes à
température ambiante dans une solution de tétroxyde
d'osmium 0,4 ~ / pyridine 2 % / Hepes pH 8 0,5 mM /
Na2EDTA 0,5 mM dans un volume total de 25 ~1 dans des
tubes siliconés .
Les reactions sont arrêtées en transférant les
échantillons dans de la glace et en ajoutant 200 ~1
d'acétate de sodium 0,3 M pH 5,2/NA2EDTA O,1 mM/tRNA
de levure 50 ~g/ml. L'ADN est précipité a l'aide de
2,5 volumes d'ethanol dans de la glace carbonique .
Après centrifugation , les culots d'ADN sont laves
deux fois avec de l'ethanol à 70 %, resuspendus dans
200 ~1 d'acetate de sodium 0,3 M pH 5,2 et
reprécipites une nouvelle fois par de l'ethanol
Après deux lavages à l'ethanol , les culots séchés
sont resuspendus dans 50 ~1 de pipéridine 1 M et
incubes a 9O C durant vingt minutes. Apres la coupure
par la pipéridine , 5 ~g de tRNA de levure et 50 ~1
Wo95/07361 PCT~9~/01068
~1 71~5~ 14
d'acétate de sodium 0,6 M pH6 sont ajoutés et l'ADN
est précipité par l'éthanol . Les culots sont lavés
deux fois avec de l'éthanol a 70 % , resuspendus dans
100 ~l d'eau distillée, lyophilisés et resuspendus
dans 8 yl de formamide 83 %/Na2EDTA 8,3 mM. 4 ~l de
chaque échantillon , mélangés avec 0,5 ~l de marqueur
de poids moléculaire fluorescent ( GS2500P ROX, ABI )
sont chargés sur un gel de polyacrylamide dénaturant à
6 % dans un séquenceur d'ADN automatique commercialisé
par ABI . Les résultats sont rassemblés et analysés en
utilisant le logiciel GENESCAN 672 (ABI) .
EXEMPLE 1 :
Détection de mutations dans le qène C1-
inhibiteur de Patients atteints d'anqioedeme
héréditaire .
Des mutations dans le gene C1-inhibiteur de
patients atteints d'angioedeme héréditaire constituent
un modele d'étude de la méthode objet de la présente
invention .
Le gene C1-inhibiteur est long de 17 kb et est
composé de 8 exons . En choisissant les amorces
oligonucléotidiques dans des introns et a proximité de
l'extrémité 5' et 3' des exons , on peut facilement
obtenir par amplification par la méthode de
polymérisation en chaîne des fragments de longueurs
comprises entre 600 paires de base (pb) et lOOO pb
comprenant aussi bien des exons individuels que des
groupes d'exons et couvrant toutes les régions
frontieres intron-exon .
L'exon 8 a été amplifié a l'aide des amorces E1
et E2 comme illustré sur la figure lA qui représente
de maniere schématique l'organisation de la région
contenant l'exon 8 . Comme le montre cette figure ,
l'amorce E1 est située a l'intérieur de la région 3'
non transcrite , 211 paires de base en aval du codon
2171~9
Woss/07361 PCT~R9~/01068
stop . L'amorce E2 est située quant à elle à
l'interieur de l'intron 7 , 147 paires de base en
amont du premier nucleotide de l'exon 8. Les 84 codons
de cet exon sont reproduits sur la sequence de la
figure lB.
Huit mutations ponctuelles differentes , la
plupart se traduisant par une deterioration de la
production de la proteine C1-inhibiteur, ont ete
trouvees à l'aide de la technique conventionnelle CCM.
De plus , une permutation de G en A à l'interieur du
codon 458 induit un polymorphisme dejà connu pour le
site de l'enzyme de restriction Hgi AI (Bock et al.
1986, Biochemistry , 25, 4292-4301 ). Les mutations
Gln452Glu ( permutation de C en G ) et Pro459Arg
(permutation de T en G ) , qui sont reliées par la
ligne pointillée sur la figure lB, ont été trouvées
sur le même chromosome .
L'ADN du patient portant ces mutations a donc
été isolé pour rechercher les conditions de clivage
partiel qui permettent la détection de mésappariements
multiples sur le même brin d'ADN .
Comme le montre la figure 2B , le clivage par
l'hydroxylamine des résidus C non appariés sur le brin
non codant donne naissance à deux pics correspondant à
des tailles de 295 et 317 nucléotides respectivement ,
comme on pouvait le predire à partir des types de
molecules héteroduplex formes qui sont schématiquement
représentes sur la figure 2A . Sur la figure 2A, les
brins sens sont identifies par un carre representant
un marquage fluorescent particulier tandis que les
brins non-sens sont identifies par un rond
correspondant à un autre marquage.
Les deux pics obtenus presentent une intensite
importante , par rapport à l'intensite de la
fluorescence du materiel non clive. On note qu'en fait
WO9~/07361 2 ~ 71 4 ~ ~ pcTn~4loln68
16
seulement un quart des molécules d'ADN sont supposées
contenir le mésappariement qui rend les résidus C
facilement accessibles à l'hydroxylamine .
Tandis que l'intensité du pic en position 295
reflete directement la nature de la modification et du
clivage , l'intensité de fluorescence en position 317,
qui est la plus distante par rapport au site de
marquage fluorescent , est faible par rapport au
clivage supposé à ce site .
Ces resultats et des resultats similaires
obtenus avec le tetroxyde d'osmium indiquent que les
conditions utilisees permettent la detection de
clivages multiples sur le même brin. En fait des
conditions legerement plus douces de traitement par
l'hydroxylamine ont ete utilisees ulterieurement en
raison du faible clivage sur la position la plus
lointaine de coupure ( pic 317 ) et ont permis
d'obtenir des clivages de l'ordre de 100 %.
La figure 2 illustre aussi que l'on obtient des
informations redondantes en marquant les produits
correspondant aux deux types d'allele .
Sur la figure 2A , les brins derives d'allèle
de type sauvage sont representes en gras, et les
distances des bases interessantes sont indiquees à
partir du marquage fluorescent terminal .
La figure 2B est relative a la coupure par
l'hydroxylamine des residus C non apparies . L'axe
horizontal represente la taille des fragments simples
brins d'ADN derives des brins codants et non codants .
L'echelle de taille des nucleotides est obtenue a
l'aide du marqueur de taille , qui est marqué avec un
troisieme colorant fluorescent . L'échelle verticale
indique les intensites de fluorescence en unite
arbitraire .
La figure 2 C represente la detection de
WO9~/07361 21 7 1 4 ~ ~ pcT~4mlo6s
17
résidus T non apparies en utilisant le tetroxyde
d'osmium .
La fleche presente sur la figure indique un
residu T apparié , adjacent au mésappariement , qui a
subi neanmoins une coupure importante .
Dans cet exemple les de~1x mutations, situees
respectivement dans les codons 452 et 459 se sont
révelees par un total de six coupures distinctes .
Parmi celles-ci deux ont eu lieu sur des bases
appariees adjacentes aux mésappariements. Sur le brin
codant, les résidus C ont donné naissance à un pic
double faible mais significatif en présence
d'hydroxylamine autour de la position 362 . Sur le
brin non- codant le residu T a donne naissance apres
traitement par le tetroxyde d'osmium au pic en
position 316. On notera que les coupures sur des bases
appariées adjacentes, quoique habituellement plus
faibles que celles obtenues sur des résidus non
appariés , peuvent avoir lieu sur la moitié des
duplex, et non sur seulement un quart , comme le
montre de maniere typique le cas de mesappariements
contenant des T ou des C .
Le gain en sensibilité de la détection
resultant de l'utilisation de marquages differents des
deux brins d'ADN, combinee avec l'analyse par
ordinateur permet d'obtenir les résultats mentionnés
dans l'insert de la figure 2B, qui représente un
agrandissement du pic double autour de la mutation en
position 362 du brin codant , en surimpression sur les
traces du résultat obtenu sur un même brin pour trois
individus n'ayant pas cette mutation . On note que des
clivages ont lieu sur les cytosines en position 357 et
369.
EXEMPLE 2 :
Effet du tYPe de base non apPariee et de la
WO9~/07361 . PCT~R9~/01068
2171~69 18
composition en bases voisines , sur les coupures par
le tetroxYde d'osmium et l'hYdroxylamine .
Les neuf mutations representees sur la figure l
ont permis d'etudier l'effet quantitatif du type de
base non appariee et de la composition en bases
voisines , sur les coupures par les deux réactifs .
Le tableau illustre les comparaisons effectuées
à partir de deux expériences indépendantes . Tandis
que les efficacités de coupure obtenues avec
l'hydroxylamine sont substantiellement supérieures a
celles obtenues avec le tétroxyde d'osmium,
l'environnement nucléotidique des mésappariements
semble avoir un effet similaire sur les deux types de
clivage , puisqu'on retrouve la même hiérarchisation
des efficacités de coupure pour les deux réactifs .
Seulement quelques mutations ne répondent pas a
cette regle . Par exemple , les mutations Pro 476 Ser
et Leu 459 Pro sont plus sensibles aux modifications
par l'hydroxylamine , ce qui est dû à la présence dans
les deux cas de trois résidus cytosine consécutifs sur
le site de clivage . De manière similaire , le taux de
coupure relativement important par le tétroxyde
d'osmium des hétéroduplex sur le site Val45lMet est
probablement dû a la présence de deux résidus T
consécutifs adjacents au T mésapparié . Cependant des
mésappariements C.C se distinguent par leur
sensibilité importante aux modifications , bien que
placés au sein d'un environnement nucléotidique
différent . Ceci peut être dû non seulement a la
coupure forte par l'hydroxylamine mais aussi a la
coupure forte observée en présence de tétroxyde
d'osmium sur les résidus T immédiatement adjacents.
Dans le cas de la mutation Gln452 Glu,
l'asymétrie apparente de l'efficacité de coupure
dépendante du brin pris en compte , peut être aussi
WO95/07361 217 ~ ~ ~ 9 PCTA~4/01068
19
due à la presence sur le brin non codant d'un residu C
adjacent à un residu non apparie .
Le tableau permet aussi d'estimer le nombre de
produits de clivage qui peuvent être attendus en
général pour chaque mutation ainsi que l'indication
des limites de detection des produits dans le cas de
coupures faibles .
Chaque mutation donne naissance à au moins deux
pics fluorescents detectables resultant du clivage de
bases mesappariees , mais dans plusieurs cas , des
informations additionnelles ont ete obtenues à partir
du clivage de bases appariées adjacentes , indiquées
dans le tableau pa- des flèches .
La grande majorité des produits de coupure sont
facilement détectés , à cause de l'intensité de leur
signal fluorescent qui est très nettement supérieur au
bruit de fond. La surimpression de traces telle
qu'effectuee dans l'insert de la figure 2B est
necessaire seulement dans le cas de signaux
représentant moins de 10 % des double brins clivables,
tels que ceux obtenus avec le tétroxyde d'osmium sur
des mesappariements resultant des mutations Arg472
STOP et Val458Met (tableau ).
Le profil de coupure par le tetroxyde d'osmium
d'un patient heterozygote pour la mutation Val458Met ,
qui donne naissance à un polymorphisme sans effet , et
pour la mutation pathogène Pro467Arg est illustre sur
les figures 3B et 3C .
Le polymorphisme de la mutation Val458Met est
facilement detecté , par traitement par
l'hydroxylamine , et identifié par un pic à la
position 299 du brin non codant , comme indiqué sur la
figure 3A qui est un schema representant la partie du
gène contenant ces deux mutations .
Sur la figure 3A les brins d'ADN représentes
=
WO9S/07361 21 ~ 9 PCT~94tO1068
par des lignes epaisses sont ceux derives de l'allèle
presentant à son site polymorphique un residu G, ce
qui est le plus fréquent.
Ce pic n'est néanmoins pas discernable dans le
cas du traitement au tétroxyde d'osmium par mesure
directe de la fluorescence du brin non codant , qui
porte un T mésapparie au site correspondant a cette
mutation (figure 3B) . Cependant , le brin codant
presente une coupure beaucoup plus forte , à la
position 387, due à la presence d'un residu T
immediatement adjacent au mesappariement destabilisant
C.C et G.G. a la moitie des molecules appariees .
De plus , la comparaison des traces agrandis de
la même région dans le cas du traitement d'ADN
d'autres individus par le tétroxyde d'osmium , comme
represente dans l'insert de la figure 3B, montre que T
est en fait present à la position 299 du brin non
codant . La réact~vité avec le tétroxyde d'osmium de
ce mesappariement T-G est inhabituellement faible .
Ceci est dû au fait que l'intensite du pic résultant
est seulement legèrement superieure à celle des bases
T . A appariees environnantes , comme le montre l'insert
representant le brin non codant a partir de la
position 283 jus~u'a la position 316.
On notera neanmoins que ce mesappariement G.T
est present seulement dans un des quatre duplex . Le
profil temoin montre dans l'insert , dans lequel le
pic en position 299 n'est pas présent , est celui
d'individus homozygotes G.C a ce site polymorphique .
En fait , les variations entre individus , c'est-a-
dire entre homozygotes A.T et G.C à ce site
polymorphique peuvent être facilement detectees comme
le montrent les figures 3C et 3D , correspondant
respectivement à des traitements par le tetroxyde
d'osmium et l'hydroxylamine.
WO95/07361 ~ 1 7 ~ PCT~R94/01068
21
Le profil en tétroxyde d'osmium ( figure 3 C)
de l'homozygote en position 299 est de maniere
surprenante similaire a celui de l'hétérozygote dans
l'insert de la figure 3B , a l'exception du pic en
position 299 qui est faiblement inférieur a ce qui est
mis en évidence avec les mésappariements G.T. De plus,
les homozygotes C.G , utilisés comme témoins non
coupés dans les figures 3B et 3C , donnent naissance a
un pic distinct dans le profil obtenu apres réaction
avec l'hydroxylamine , contrairement au profil obtenu
avec des homozygotes A.T ( figure 3D). Bien que cet
exemple représente le cas particulier d'un site
polymorphique , qui donne naissance a des génotypes
appropriés pour faire la différence entre un clivage
de bases appariées et non appariées , l'apparition
d'un nouveau pic T ou C absent dans le profil d'autres
individus , est un indice suffisant même si
l'amplitude de ce pic est du même ordre que celui
résultant du clivage de paires de bases environnantes.
EXEMPLE 3 :
Détermination du seuil de détection de la
méthode .
Un patient avec une double mutation en cis ,
dont le profil de coupure est indiqué sur les figures
2B et 2C , donne naissance a un nombre important de
fragments d'intensités variables , ce qui permet de
tester facilement le seuil de détection de la méthode,
en diluant ce matériel avec différentes quantités du
matériel génétique sauvage . De plus, la région
amplifiée par voie enzymatique du chromosome affecté
de ce patient peut etre détaillée de maniere
quantitative dans des dilutions en série , car
Leu459Arg détruit le site de reconnaissance de
l'enzyme Hgi AI, souligné dans la figure 1.
L'ADN génomique de ce patient a été dilué avec
WO95/07361 PCT~ 1068
217~ ~6~ 22
des quantités croissantes d'ADN normal et amplifié par
la voie enzymatique . L'importance du chromosome
portant les mutations a ete verifiee , apres la
première amplification par polymerisation de chaîne
(PCR) en etudiant dans des dilutions en series la
disparition du fragment de 588 paires de bases
representé sur la figure 4A , qui est résistant a la
digestion par l'enzyme Hgi AI. Des aliquotes de chaque
dilution en series ont ete ensuite soumis aux
modifications chimiques par le tetroxyde d'osmium et
l'hydroxylamine .
La figure 4B montre que jusqu'a une dilution
d'un facteur cinq de l'ADN , c'est-a-dire un
chromosome portant la mutation pour dix chromosomes ,
les mesappariements sont facilement detectés .
Afin de simplifier les figures , on a fait
figurer simplement le résultat de la coupure par
l'hydroxylamine du brin non codant , pour de l'ADN non
dilue et dilue , puisque des diminutions similaires
d'intensite sont mesurees , apres dilution , dans les
autres profils de clivage de la figure 2.
La figure 4B est un gel sur lequel sont
representees les différentes dilutions de l'ADN ainsi
que de l'ADN témoin de type sauvage ( puits C) .
La figure 4 C représente le profil du brin non
codant , apres traitement de l'ADN par
l'hydroxylamine, pour le patient héterozygote et dans
une situation ou l'ADN n'a pas ete dilue.
La figure 4D est un agrandissement de la region
contenant les pics aux positions 295 et 317. Sur cette
figure, on a indique les intensites des pics a une
dilution de moitie ( l/2 ) du dixieme (l/lO) ainsi que
l'intensite du spectre obtenu avec l'ADN temoin d'un
individu de type sauvage .
Même le pic double obtenu avec l'hydroxylamine
WO95/07361 2 1 7 ~ ~ 6 ~ PCT~4101068
_ 23
pour le brin c~dant autour de la position 362 t cf.
insert de la figure 2A ) est detectable , a une
dilution d'l/l0 du chromosome .
CONCLUSION :
Les resultats de ces exemples de mise en oeuvre
de l'invention montrent de maniere claire que la
methode objet de la presente invention permet de
determiner, de maniere fiable et sensible , la
presence et la position de substitutions de bases dans
des sequences nucleot-.iiques .
Cette detecti~- est rendue possible du fait du
double marquage differentiel des deux brins , a l'aide
de marqueurs fluorescents .
La méthode objet de la presente invention est
en outre mise en oeuvre de maniere plus rapide que la
methode conventionnelle CCM , et presente de plus
l'avantage d'utiliser des produits de marquage
fluorescents stables .
La methode objet de la presente invention
differe en outre des methodes decrites dans l'etat de
la technique en ce que :
- elle permet d'obtenir de maniere optimale un
grand nombre de mesappariements et donc
d'informations, du fait du marquage de l'allele
mutant,
- les brins codant et non-codant sont marques
de manieres differentes , ce qui reduit ainsi au
minimum le nombre de reactions chimiques et permet une
localisation precise des mutations ,
- le bruit de fond specifique d'un brin donne
lors des coupures à une position donnee est très
reproductible et rend detectable des mesappariements
qui ordinairement sont peu coupes , tels que des
polymorphismes homozygotes , comme le montre la figure
3 . Ainsi , en utilisant le bruit de fond des coupures
L ~
Wos~/07361 2 ~ 7 ~ ~ ~ g 24 PCT~R9~/Oln68
comme séquence de référence , on peut séquencer la
mutation de manière précise , au nucléotide près .
La sensibilité particulièrement importante de
la méthode objet de la présente invention devrait
permettre de determiner la presence et la position de
substitutions de base chez des individus homozygotes
et heterozygotes , dans le cas de caractère
hereditairement transmis , mais aussi de detecter des
mutations somatiques dans lesquelles le chromosome sur
lequel a lieu la mutation est dilue dans un grand
nombre de chromosomes portant une allèle sauvage, ce
que ne permettent en aucune manière les methodes
decrites dans l'etat de la technique .
WO 95/07361 2 ~ 71 ~
6 9 PCT/FR94/01068
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WO 95/07361 21 71 '~ 6 ~ PCT/FR94/01068
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