Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
.....
W0 96/05312 PCT/FR95/01071
1
Nouvel antigène de Trypanosoma Cruzi, et gène codant pour
cette dernière ; leur app7.ication à la détection de la
maladie de Chagas
La présente invention a pour objet un nouveau
matériel génétique codant pour une protëine nouvelle
reconnue par des antisera anti-Trypanosoma cruzi, et
concerne l'utilisation desdits gène et protéine, notamment
à des fins diagnostique, pharmaceutique et thérapeutique.
Trypanosoma cruzi est un parasite protozoaire
l0 flagellé, membre de l'ordre: des Kinetoplastida et de la
famille des Trypanosomatidae:, responsable de la maladie de
Chagas qui affecte naturellement des millions de
personnes, principalement en Amérique Latine.
Chez l'hôte vertébré, Trypanosoma cruzi se
1s présente sous deux formes . l'une mobile gràce à son
flagelle ou trypomastigote, ne se divisant pas; l'autre
aflagellée, ou amastigote intracellulaire, se multipliant
par division binaire.
La transmission chez l'homme du protozoaire se
20 fait par l'intermédiaire d'insectes hématophages de la
famille des réduviidés, lors d'un repas sanguin suivi de
déjections à l'endroit de la piqQre. L'insecte vecteur
libère ainsi les formes trypomastigotes métacycliques
infectieuses qui, par la voie de la circulation sanguine,
25 vont coloniser de nombreux types cellulaires. Trypanosoma
cruzi infecte les cellulea musculaires cardiaques et
squelettiques, les cellules glialefs et celles du système
phagocytaire mononucléê. Après pénétration passive dans la
cellule hôte, la forme trypomastigote du parasite se
' 3o différencie en forme amast:igote, se divise activement,
puis il s'en suit u:ne libération des formes
trypomastigotes provoquant ainsi une nouvelle invasion
cellulaire.
Les insectes vont compléter le cycle du parasite
35 en ingérant, lors du repas sanguin, les formes
trypomastigotes de l'hôte. Ces dernières se différencient
WO 96105312 PCT/FR95101071
217397
2
en formes épimastigotes dans l'intestin moyen du vecteur
et enfin trypomastigotes métacycliques infectieuses dans
l'intestin postérieur.
On distingue deux phases dans la maladie de
Chagas: la phase aigüe et la phase chronique. La phase
aigüe survient après une contamination de type
transfusionnel, congénital ou vectoriel et dure quelques
semaines. Elle se caractérise par un nombre important de
parasites circulant dans le sang et correspond à une
division exponentielle du protozoaire. La phase aigüe est
le plus souvent asymptomatique. Toutefois, chez les
nourrissons contaminés par leur mère, la phase aigüe, qui
est marquée par une cardiopathie aigüe, peut être
critique. La phase chronique peut s'étendre sur de
nombreuses années. Chez certains individus cette phase est
asymptomatique. Par contre d'autres patients présentent
des lésions tissulaires au niveau du coeur ou des
manifestations de type digestif. En tout état de cause, le
diagnostic clinique doit toujours être confirmé par des
' 20 tests de mise en évidence soit d'anticorps dirigés contre
les antigènes parasitaires, soit du parasite lui-même.
Cette maladie devient un problème mondial en
raison de la contamination par transfusion sanguine. I1
devenait donc indispensable de disposer de tests de
diagnostic qui permettent de déterminer la présence du
parasite chez les individus. On dispose de différents
tests sérologiques, tels que l'agglutination directe,
l'immunofluorescence indirecte (IFI), les tests de
fixation du complément (RFC), les tests ELISA (Enzyme
Linked Immunosorbent Assay). Les antigènes de Trypanosoma
cruzi utilisés pour les tests sérologiques proviennent
d' un lysat total du stade non infectant du parasite ou de
fractions protéiques partiellement purifiées. Toutefois,
ces fractions ne permettent pas l'obtention d'antigènes en
quantité et qualité suffisantes pour l'élaboration d'un
test fiable de diagnostic sérologique. De plus, la
21'~~9~7
WU 96105312 PCT'/FR95101071
3
complexité du parasite et le polymorphisme antigénique
souche à souche introduisent une difficulté supplémentaire
dans la reproductibilité des différentes préparations.
Enfin, il existe de nombreux risques de réactivité croisée
avec d'autres protozoaires, plus particulièrement avec
Trypanosoma rangeli, parasite: non pathogène, et la famille
des Leishmanie. Un autre désavantage de ces techniques est
l'absence de détermination de la phase de la maladie qui
permettrait un traitement dès. la phase aigüe.
l0 Pour résoudre ces divers problèmes, il a été
envisagé d'élaborer un kit, de diagnostic sérologique
composé de protéines recombinantes qui seraient
spécifiques de Trypanosoma cr~uzi .
Différents groupes de recherche ont criblé des
banques d'expression d'ADN génomique ou d'ADN
complémentaire de Trypanosom~i cruzi dans le vecteur 1gt11,
par des sera de patients attcaints de la maladie de Chagas.
Le phage lgtii permet l'insertion d'ADN étranger d'une
taille maximale de ~7Kb dans :Le site EcoRi localisé dans le
gène lac Z, sous contrôle .du promoteur lac. Le produit
obtenu est une protéine recombinante en fusion avec la
bétagalactosidase, inductible par l'IPTG (isopropyl thio
béta D galactoside).
Divers gènes de Trypanosoma cruzi, codant pour des
protëines reconnues par les :sera chagasiques ont ainsi été
caractérisés. Parmi les antigènes recombinants décrits, on
peut citer l'antigène H49 (Paranhos et al., 1994 (1)).
Toutefois, cet antigëne ne permet pas une sensibilité de
détection sérologique de 100 % des malades en phase aigüe
ou chronique. I1 a donc été envisagé d'associer l'antigène
H49 à l'antigène CRA (Cytoplasmic Repetitive Antigen)
(Lafaille et al., (1989)(2)) sans pour autant résoudre ce
problème.
Les présents inventeurs ont identifié et obtenu
pour la premiére fois un mat~êriel génétique nouveau codant
pour une protéine nouvelle, reconnue par des anti-sera
WO 96105312 PCT/FR95/01071
4
anti-Trypanosoma cruzi, qui permet d'obvier les
désavantages précités. Le matériel génétique peut être
utilisé pour produire des protéines ou des polypeptides
pour la production de tests de diagnostic, ou pour la
préparation de compositions vaccinales ou pharmaceutiques,
ou être utilisé soit lui même comme sonde, soit pour la
détermination de sondes spécifiques utilisables dans des
essais d'hybridation d'acides nucléiques pour la détection
des infections par Trypanosoma cruzi. De même, la protéine
l0 ou tout polypeptide correspondant peuvent être utilisés
pour la production d'anticorps spécifiques du parasite, à
des fins de diagnostic ou de protection passive.
Ce gène a été dénommé Tc 10o par la Demanderesse.
Par conséquent, la présente invention a pour objet
une molécule d'ADN ou d'ARN, constituée par au moins un
brin comprenant une séquence nucléotidique représentée
dans l'identificateur SEQ ID NO1, ou une séquence
complémentaire, ou anti-sans, ou équivalente à ladite
séquence identifiée dans l'identificateur SEQ ID NO1, et
notamment une séquence présentant, pour toute suite de 100
monomères contigus, au moins 50 %, de préférence au moins
60 %, ou mieux encore, au moins 85 % d'homologie avec
ladite séquence.
Par séquence nucléotidique, on entend soit un brin
d'ADN ou son brin complémentaire, soit un brin d'ARN ou
son brin anti-sens ou leurs ADN complémentaires
correspondants. La séquence d'ADN telle que représentée
dans l'identificateur SEQ ID NO1 correspond à la séquence
de l'ARN messager, étant entendu que la thymine (T) dans
l'ADN est remplacée par l'uracile (U) dans l'ARN.
Selon l'invention, deux séquences nucléotidiques
sont dites équivalentes l'une par rapport à l'autre, ou
par rapport à une séquence de référence, si
fonctionnellement les biopolymères correspondants peuvent
jouer sensiblement le même rôle, sans être identiques,
vis-à-vis de l'application ou utilisation considérée, ou
r
WO 96105312 ' PCT/FR95/01071
2173957
dans la technique dans laquelle elles interviennent ; sont
notamment équivalentes deux séquences obtenues du fait de
la variabilité naturelle, notamment mutation spontanée de
l'espèce à partir de laquelle elles ont été identifiées,
ou induite, ainsi que des séquences homologues,
l'homologie étant définie ci--après.
Par variabilité, on entend toute modification,
spontanée ou induite d'u:ne séquence, notamment par
substitution, et/ou insertion, et/ou délétion de
nucléotides et/ou de fragments nucléotidiques, et/ou
extension et/ou racourcissement.de la séquence à l'une au
moins des extrémités ; une variabilité non naturelle peut
résulter des techniques de gënie génétique utilisées ;
cette variabilité peut se .traduire par des modifications
de toute séquence de départ, considérée comme réfërence,
et pouvant être exprimées ;par un degré d'homologie par
rapport à ladite séquence de référence.
L'homologie caractérise le degré d'identité de
deux fragments nuclêotidiques (ou peptidiques) comparés;
2o elle se mesure par le pourcentage ~d'identitê qui est
notamment déterminé par comparaison directe de séquences
nucléoditiques (ou peptidiqmes), par rapport à des
séquences nucléotidiques (ou peptidiques) de référence.
Tout fragment nuclêotidique est dit équivalent
d' un fragment de référence,, s' il présente une séquence
nucléotidique équivalente à la séquence de référence ;
selon la définition précédente, sont notamment équivalents
à un fragment nucléotidique de réfêrence .
a) tout fragment ~~usceptibie de s'hybrider au
moins partiellement avec le complément du fragment de
rëférence, .
b) tout fragment dont l'alignement avec le
fragment de référence conduit à mettre en évidence des
bases contigues identiques, en nombre plus important
qu'avec tout autre fragment: provenant d'un autre groupe
taxonomique,
WO 96105312
21 ~ ~ ~ ~ 7 PCT/FR95101071
6
c) tout fragment résultant ou pouvant résulter de
la variabilité naturelle de l'espèce, à partir de laquelle
il est obtenu,
d) tout fragment pouvant résulter des techniques
de génie génétique appliquées au fragment de référence,
e) tout fragment, comportant au moins 30
nucléotides contigus, codant pour un peptide homologue ou
identique au peptide codé par le fragment de référence,
f) tout fragment différent du fragment de
l0 référence, par insertion, délétion, substitution d'au
moins un monomère, extension, ou raccourcissement à l'une
au moins de ses extrémités; par exemple tout fragment
correspondant au fragment de référence flanqué à l'une au
moins de ses extrémités par une séquence nucléotidique ne
codant pas pour un polypeptide.
L'invention concerne par ailleurs des fragments
d'ADN ou d'ARN dont la séquence nucléotidique est
identique, complémentaire, anti-sens, ou équivalente à
l'une quelconque des séquences suivantes:
- celle commençant au nucléotide 1232 et se
terminant au nucléotide 2207 de SEQ ID NO1
- celle commençant au nucléotide 1232 et se
terminant au nucléotide 1825 de SEQ ID N01
- et celle commençant au nucléotide 1266 et se
terminant au nucléotide 2207,
et notamment les fragments d'ADN ou d'ARN dont la
séquence présente, pour toute suite de 30 monomères
contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, ou
mieux encore, au moins 85 % d'homologie avec l'une
quelconque desdites séquences.
,L!~pvention a aussi pour objet une protéine,
dénommée PTc100!~par la Demanderesse, présentant une masse
moléculaire apparente d'environ 100 kDa, reconnue par des
anti-sera anti-Trypanosoma cruzi, ou un équivalent
immunologique de cette protéine; et leurs fragments. La
W O 96105312 21 '~ 3 9 5 '~ pC IyFR95101071
7
, séquence en acides aminÉa de cette protéine est
représentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID N02.
Par équivalent immunologique, on entend tout
polypeptide ou peptide susceptible d'étre
immunologiquement reconnu par les anticorps dirigés contre
ladite protéine PTc100.
L'invention concerne aussi tout fragment de la
protéine PTc100. Un fragment protéique particulier
présente une séquence commençant à l'acide aminé 323 et se
terminant à l'acide aminé 520 de la séquence définie dans
l'identificateur SEQ ID N02, ledit fragment étant
spécifiquement reconnu par des antisera anti-Trypanosoma
cruzi; l'invention concerne aussi tout équivalent
immunologique dudit fragment..
La protéine PTcl00 ea lesdits fragments protéiques
peuvent comporter des modifications, notamment chimiques,
n'altérant pas leur immunogénicité.
Par ailleurs, la présente invention a également
pour objet une cassette d'expression fonctionnelle,
' 20 notamment dans une cellule issue d'un organisme procaryote
ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour la
totalité ou un fragment de la protéine PTc100, en
particulier d'un fragment d'ADN tel que défini
précédemment, placé sous le contrôle des éléments
nécessaires à son expression ; ladite protéine et lesdits
fragments protéiques étant reconnus par des antisera anti-
Trypanosoma cruzi.
D'une façon générale, toute cellule issue d'un
organisme procaryote ou eucaryote peut être utilisée dans
' 30 le cadre de la présente invention. De telles cellules sont
connues de l'homme de l'art. A titre d'exemples, on peut
'. citer les cellules issues d'un organisme eucaryote, telles
que les cellules issues d'un mammifère, notamment les
cellules CHO (Chinese Hamster Ovarian); les cellules
d'insectes; les cellules is~;ues d'un champignon, notamment
unicellulaire ou d'une lecture, notamment de la souche
WO 96/05312 PCT/FR95/01071
~l'~~~5'~
g
Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces et tout
particulièrement sélectionnée dans le groupe constitué de
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,
Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces
sloofiae, Schizosaccharomyces octosporus. De même, parmi
les cellules issues d'un organisme procaryote, on peut
avoir recours, sans que cela constitue une limitation, aux
cellules d'une souche de Escherichia coli (E coli) ou à
des cellules d'entérobactéries. Un grand nombre de ces
1o cellules sont disponibles commercialement dans les
collections, telles que l'ATCC (Rockville, MA, USA) et
l'AFRO (Agriculture & Food Research Council, Norfolk, UK).
La cellule peut être de type sauvage ou mutante. Les
mutations sont décrites dans la littérature accessible à
l'homme du métier.
Aux fins de la présente invention, on utilise une
cellule d'E. coli DHSa (commercialisée par la société
CLONTECH sous la référence . C2007-1). ,
La cassette d'expression de l'invention est
2o destinée à la production de la protéine PTcl00 ou à des
fragments de ladite protéine produits. par la cellule E.
coli précitée, et reconnus par des antiserà humains. De
tels antisera proviennent de patients ayant contracté une
infection récente ou ancienne par Trypanosoma cruzi, et
contiennent des immunoglobulines reconnaissant
spécifiquement la PTc100. Bien entendu, la protéine PTc100
peut également être reconnue par d'autres anticorps, comme
par exemple des anticorps monoclonaux ou polyclonaux
obtenus par immunisation d'espècès variées avec la
protéine précitée naturelle, la protéine recombinante,
leurs fragments ou peptides.
Par protéine PTc100 on entend l'antigène
cytoplasmique de Trypanosoma cruzi naturel, ou produit
notamment par les techniques de recombinaison génétique
décrites dans la présente demande, ou tout fragment ou
mutant de cet antigène à la condition qu'il soit
WO 96/05312 PCT/FR95101071
217~s9~'~
9
immunologiquement réactif avec des anticorps dirigés
contre la protéine PTc100 de ce parasite.
De manière avantageuse, une telle protéine possède
une séquence en acides aminés présentant un degré
d'homologie d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 85 %
et, de manière tout à fait préférée, d' au moins 95 % par
rapport â la séquence identifiée dans l'identificateur
SEQ ID N02. En pratique, un tel équivalent peut être
obtenu par délétion, substitution et/ou addition d'un ou
l0 plusieurs acides aminés de la protëine native ou
recombinante. I1 est à la portée de l'homme de l'art
d'effectuer par des techniques connues ces modifications
sans affecter la reconnaissance immunologique.
Dans le cadre de la présente invention, la
protéine PTc100 peut étre modifiée in vitro, notamment par
délétion ou addition de groupements chimiques, tels que
des phosphates, sucres ou acides myristiques, de manière à
améliorer sa stabilité ou la présentation d'un ou de
plusieurs épitoges.
La cassette d'expression selon l'invention permet
la production d'une protéine PTc100 (ayant une séquence en
acides aminés telle que spécifiée précédemment) et de
fragments de ladite protéine, fusionnês à un élément
exogène pouvant aider à sa stabilité, sa purification, sa
production ou sa reconnaissance. Le choix d'un tel élément
exogène est à la portée dle l'homme de l'art. Il peut
notamment s'agir d'un haptène, d'un peptide exogëne ou
d'une protéine.
La cassette d'e:~cpression selon l'invention
comprend les éléments nêceasaires à l'expression dudit
fragment d'ADN dans la cel7Lule considérée. Par "ëlêments
nécessaires à l'expression", on entend l'ensemble des
éléments qui permettent la transcription du fragment d'ADN
en ARN messager (ARNm) et 7_a traduction de ce dernier en
protéine.
WO 96105312 , PCT/FR95101071
21 ~39~'~
La présente invention s'étend également à un
vecteur comprenant une cassette d'expression selon
l'invention. I1 peut s'agir d'un vecteur viral et
notamment d'un vecteur dérivé d'un baculovirus, plus
particulièrement destiné à l'expression dans les cellules
d'insectes, ou d'un vecteur dérivé d'un adénovirus pour
l'expression dans les cellules de mammifères.
I1 peut également s'agir d'un vecteur plasmidique
à réplication autonome et en particulier d'un vecteur
multiplicateur.
La présente invention concerne également une
cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote,
comprenant une cassette d'expression, soit sous forme
intégrée dans le génome cellulaire, soit insérée dans un
vecteur. Une telle cellule a été définie précédemment.
La présente invention a également pour objet un
procédé de préparation d'une protéine PTc100, ou de
fragments de ladite protéine, selon lequel .
(i) on cultive dans des conditions appropriées une
cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote,
comprenant la cassette d'expression selon l'invention; et
(ii) on rêcupère la protéine exprimée issue de
l'organisme précité.
La présente invention concerne aussi un ou
plusieurs peptides, dont la séquence en acides aminés
correspond à une partie de la séquence de la protéine
PTc100, et présentant seuls ou en mélange une réactivité
avec la totalité des sera d'individus ou d'animaux
infectés par Trypanosoma cruzi.
Les peptides peuvent être obtenus par synthèse
chimique, lyse de la protéine PTc100, ou par des
techniques de recombinaison génétique.
L'invention concerne également des anticorps
monoclonaux ou polyclonaux obtenus par réaction
immunologique d'un organisme humain ou animal à un agent
immunogène constitué par la protéine PTcloo naturelle,
WO 96105312 ~ PCT/FR95I01071
recombinante et leurs fragments, ou par un peptide, tel
que défini précédemment.
La présente invention concerne aussi un réactif
pour la détection et/ou la surveillance d'une infection
par Trypanosoma cruzi, qui comprend à titre de substance
réactive une protéine l?Tc100 telle que définie
précédemment, ou ses fragments, un peptide ou un mélange
de peptides tels que dëfinis ci-dessus, ou au moins un
anticorps monoclonal ou polyclonal tel que dëcrit
l0 précédemment.
Le réactif ci-dessus peut étre fixé directement ou
indirectement sur un support solide approprié. Le support
solide peut être notamment Nous la forme d'un cône, d'un
tube, d'un puits, de bille, ou analogues.
Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici
inclut tous les matériaux sur lesquels peut être
immobilisé un rëactif pour une utilisation dans les tests
de diagnostic. Des matêriaux naturels, de synthëse,
modifiés chimiquement ou non peuvent être utilisés comme
2o supports solides, notamment des polysaccharides tels que
les matêriaux à base de cel7lulose, par exemple du papier,
des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose
et la nitrocellulose ; des polymères tels que chlorure de
vinyle, polyéthylène, polystyrènes, polyacrylate ou
copolymères tels que polymères de chlorure de vinyle et de
propylène, polymères de chlorure de vinyle et acêtate de
vinyle ; copolymères à base de styrène, des fibres
naturelles telles que le coi:on et les f fibres synthétiques
telles que le nylon.
' 30 De préférence, le support solide est un polymère
de polystyrène ou un copolymère de butadiëne-styrène.
Avantageusement, le support est un polystyrène ou un
copolymère a base de styrène comprenant entre environ 10
et 90 % en poids de motifs styrène.
La f fixation du réactif sur le support solide peut
être réalisée de manière directe ou indirecte.
W O 96/05312 PCT/FR95101071
2~.â3~~7
12
De manière directe, deux approches sont possibles:
soit par adsorption du réactif sur le support solide,
c'est à dire par des liaisons non covalentes
(principalement de type hydrogène, Van der Walls ou
ionique), soit par établissement de liaisons covalentes
entre le réactif et le support. De manière indirecte, on
peut fixer préalablement (par adsorption ou covalence) sur
le support solide un composé "anti-réactif" capable
d'interagir avec le rêactif de façon à immobiliser
l~nsemble sur le support solide. A titre d'exemple, on
peut citer un anticorps anti-PTc100, à la condition qu'il
soit immunologiquement réactif avec une partie de la
protéine différente de celle intervenant dans la réaction
de reconnaissance des anticorps des sera; un système
ligand-récepteur, par exemple en greffant sur la protéine
PTc100 une molécule telle qu'une vitamine, et en
immobilisant sur la phase solide le récepteur
correspondant (par exemple le système biotine-
streptavidine). Par manière indirecte, on entend également
le greffage au préalable ou fusion par recombinaison
génétique d'une protéine, ou un fragment de cette
protéine, ou d'un polypeptide, à une extrémité de la
protéine PTc100, et l'immobilisation de cette dernière sur
le support solide par adsorption passive ou covalence de
la protéine ou du polypeptide greffé ou fusionné.
L'invention concerne également un procédé pour la
détection et/ou la surveillance d'une infection par
Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, tel
qu'un échantillon de sang d'un individu ou d'un animal
susceptible d'avoir été infecté par Trypanosoma cruzi,
caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon
et ,un réactif tel que défini ci-dessus, dans des
conditions permettant une éventuelle réaction
immunologique, et on détecte ensuite la présence d'un
complexe immun avec ledit réactif.
WO 96!05312 PCT/FR95I01071
l3
A titre d'exemple non limitatif, on peut citer le
procédé de dêtection de type sandwich en une ou plusieurs
étapes, tel que notamment décrit dans les brevets FR 2 481
318 et FR 2 487 983, qui consiste à faire rëagir un
premier anticorps monoclonal ou polyclonal spêcifique d'un
antigëne recherché, fixê sur un support solide, avec
l'échantillon, et à mettre en évidence la présence
éventuelle d'un complexe immun ainsi formé par un second
anticorps marqué par tout marqueur approprië connu de
l'homme du métier, notamment un isotope radioactif, une
enzyme pax exemple la pÉ:roxydase ou la phosphatase
alcaline ou analogues; par les techniques dites de
compétition bien connues de !.'homme du métier.
L'invention a aussi. pour objet une composition
immunothérapeutique active, notamment une préparation
vaccinale, qui comprend à 'titre de principe actif, une
protéine PTc100 naturelle, recombinante ou leurs
fragments, ou les peptidea identifiés ci-dessus, le
principe actif étant éventuellement conjugué avec un
support pharmaceutiquement acceptable, et ëventuellement
un excipient et/ou un adjuvant approprié.
La présente invention couvre également une
composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la
prévention d'une infection épar Trypanosoma cruzi chez un
homme ou un animal, comprenant une quantité
thérapeutiquement efficace d'une cassette d'expression,
d'un vecteur, d'une cellule issue d'un organisme
procaryote ou eucaryote tel que défini précédemment, d'une
protéine PTc100 selon l'invention, ou de ses fragments, ou
d'un anticorps de l'inventio;n.
La présente invention a aussi pour objet des
sondes et amorces spécifiques de T. cruzi, et leurs
utilisations dans des tests ~de diagnostic.
Le terme sonde tel. qu'utilisé dans la présente
invention fait réfêrence à l'ADN ou l'ARN comportant au
moins un brin présentant une séquence nucléotidique
WO 96/05312 PCT/FR95101071
21 '~ ~~ .~ ~
permettant l'hybridation aux acides nuclëiques présentant
une séquence nucléotidique telle que représentée dans
l'identificateur SEQ ID N01, ou une séquence
complémentaire, ou anti-sens, ou équivalente à ladite
séquence, et notamment une séquence présentant, pour toute
suite de 5 à 100 monomères contigus, au moins 50 %, de
préférence au moins 60 %, ou mieux encore, au moins 85 %
d'homologie à SEQ ID NO1, à ses fragments, ou à un
oligonucléotide de synthèse permettant une telle
l0 hybridation, non modifié ou comprenant une ou plusieurs
bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-
désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-
désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-
désoxyuridine ou toute autre base modifiée. De même, ces
sondes peuvent être modifiées au niveau du sucre, à savoir
le remplacement d'au moins un désoxyribose par un
polyamide (P.E NIELSEN et a1.(1991) (13)), ou au niveau du
groupement phosphate, par exemple son remplacement par des
esters, notamment choisis parmi les esters de diphosphate,
d'alkyle et arylphosphonate et de phosphorothioate.
Les sondes peuvent être beaucoup plus courtes que
la séquence identifiée dans l'identificateur SEQ ID NO1.
En pratique, de telles sondes comprennent au moins 5
monomères, avantageusement de 8 à 50 monomères, possédant
une spécificité d'hybridation dans des conditions
déterminées pour former un complexe d'hybridation avec
l'ADN ou l'ARN ayant une séquence nucléotidique telle que
définie précédemment.
Une sonde selon l'invention peut être utilisée à
3o des fins de diagnostic, comme sonde de capture et/ou de
détection, ou à,des fins de thérapie.
La sonde de capture peut être immobilisée sur un
support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire
directement ou indirectement, par exemple par covalence ou
adsorption passive.
W O 96105312 217 3 9 5 '~ PCTIFR95/01071
La sonde de détection est marquée au moyen d'un
marqueur choisi parmi le;s isotopes radioactifs, des
enzymes notamment choisies parmi la peroxydase et la
phosphatase alcaline, et celles susceptibles d'hydrolyser
5 un substrat chromogène, fl.uorigène ou luminescent, des
composés chimiques chromophores, des composés chromogènes,
fluorigènes ou luminescents, des analogues de base
nucléotidique, et la biotine.
Les sondes de la présente invention utilisées à
l0 des fins de diagnostic peuvent être mises en oeuvre dans
toutes les techniques d'hybridation connues, et notamment
les techniques dites "Dot-Blot" (Maniatis et al. (1982)
(14) ) , Southern Blot (Southe:rn E.M. (1975) (15) ) , Northern
Blot, qui est une technique identique à la technique
15 Southern Blot mais qui utilise de l'ARN comme cible, la
technique sandwich (Dunn A.R. et al. (1977)(16)).
Avantageusement, on utilise la technique sandwich
comprenant une sonde de capi:ure spécifique et/ou une sonde
de détection spécifique, étant entendu que la sonde de
capture et la sonde de déaection doivent présenter une
séquence nucléotidique au moins partiellement différente.
Une autre application de l'invention est une sonde
de thérapie pour traiter le:~ infections dues à Trypanosoma
cruzi, ladite sonde étant susceptible de s'hybrider in
vivo sur l'ADN ou l'ARN du parasite pour bloquer les
phénomënes de traduction ei~/ou de transcription et/ou de
réplication.
Une amorce est une sonde comprenant de 5 à 30
monomères, possédant une ;spécificitë d'hybridation dans
des conditions prédéterminées, pour l'initiation d'une
polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique
d'amplification telle qusa la PCR (Polymerase Chain
Reaction), dans un procÉ:dé d'élongation tel que le
séquençage, dans une méthode de transcription inverse ou
analogue.
WO 96/05312 PCT/FR95/01071
21'~~95'~
16
Une sonde ou amorce préférentielle comportera une
séquence nucléotidique choisie parmi les séquences
SEQ ID N07, SEQ ID :J08, SEQ ID N09, SEQ ID NO10,
SEQ ID N012.
L'invention concerne aussi un réactif pour
détecter et/ou identifier Trypanosoma cruzi dans un
échantillon biologique, comprenant au moins une sonde
telle que définie précédemment, en particulier une sonde
de capture et une sonde de détection, l'une et/ou l'autre
répondant à la définition ci-dessus.
L' invention apporte donc un procédé pour détecter
sélectivement et/ou identifier Trypanosoma cruzi dans un
échantillon biologique, selon lequel on expose l'ARN,
extrait du parasite et éventuellement dénaturé, ou l'ADN,
extrait dénaturé, ou l'ADN obtenu à partir de la
transcription inverse de l'ARN, à au moins une sonde telle
que définie précédemment et on détecte l'hybridation de
ladite sonde.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la
description détaillée qui va suivre faite en référence aux
figures annexées dans lesquelles:
La figure 1, représente la carte de restriction du
gène Tc100, déduite par Southern blot de différents
fragments obtenus après digestion d'ADN de Trypanosoma
cruzi par des endonucléases de restriction.
La figure 2, est une représentation schématique
des trois régions chevauchantes de l'ADNc Tc100. Les
flèches numérotées représentent les oligonucléotides
utilisés comme amorces pour l'amplification PCR.
Exemple l:Isolement du clone Tc50
Une banque d'expression a été construite à partir
de fragments d'ADN génomique de Trypanosoma cruzi. L'ADN
de T. cruzi, souche G (YOSHIDA. N, (1983) (17)), isolé du
2173957
1~
stade trypomastigote métacyclique a été digéré par
l'enzyme DNase I. Après sële:ction des fragments suivant
leur taille, ceux-ci ont été ligués â des adaptateurs
synthétiques EcoRI et clonés dans le site EcoRI de l'ADN
du vecteur lambda gtll* (Young et Davis, 1983 (3) ; Cotrim
et al., 1990) (4).
Le clone, dënommë Tc50 par la Demanderesse, a été
isolé de la banque par crib:Lage immunologique, à l'aide
d'un mélange de sera de patients atteints de la maladie de
Chagas en phase chronique.
Le clone phagique Tc~~O a été purifié, amplifié et
l'insert a été mis en évidence par la technique PCR
("Polymerase Chain Reaction"), â l'aide des amorçes .
SEQ ID N03 5'(GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG)3' 24 , et
SEQ ID N04 5'(TTGACACCAGACCAACTGGTAATG)3' 24
correspondant, respectivement" à la séquence nucléotidique
des bras gauche et droit de l'ADN du phage lambda gtll*
Le fragment d'ADN Tc50 de 594 paires de bases
(pb) , après digestion par Eco~RI, a été sous-clonë dans le
vecteur d'expression pGEX* (Pharmacia) linéarisë par EcoRI.
Le séquençage de l'ADN du clone Tc50 a été réalisé dans ce
même vecteur, à l'aide d'amorces spécifiques situées en 3'
et 5! du site de clonage du pGE~, selon la technique de
terminaison des chaines (S.anger et al. , 1977 (5) ) et
suivant le protocole du fournisseur (USB-Amersham).
La séquence nucléotidique du fragment Tc50 de 594
pb, ainsi que sa séquence d~ëduite en acides aminés (198
aa) sont représentées dans lsa identificateurs SEQ ID NOI
et SEQ ID N02,respectivement. La séquence nuclêotidique du
fragment Tc50 de 594 pb commence au nucléotide (nt) 1232
et se termine au nucléotide 1825. La séquence en acides
aminés correspondante commence à l'acide aminé 323 et se
termine à l'acide aminé 520 d~e la SEQ ID N02.
* Marques de commerce
WO 96105312 PCTIF'R95I01071
2173957
18
Exemple 2: Expre:~sion du clone Tc50 chez
Escherichia coli
La construction pGIEX-Tc50 (198 aa) synthétise,
dans la bactérie DHSalpha, une protéine en fusion avec la
GST ("Glutathion S Transfé:rase"), de masse moléculaire
apparente de 50 kDa, mise en évidence par électrophorëse
sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE (SDS: Dodecyl Sulfate
de Sodium)(Laemmli, 1970(6)). La rêactivité de la protéine
vis à vis des sera humains chagasiques a été confirmée par
la technique de Western blo't (Towbin et al., 1979(7)), à
l'aide du même mêlange de: sera chagasiques de phase
chronique utilisé pour le criblage de la banque en lambda
gtll.
La fraction soluble: de la protêine recombinante
GST-Tc50 obtenue après lyse des extraits bactériens par
ultrasons a ëté purifiée par chromatographie d'affinité
sur colonne de glutathion agarose (Sigma),se7.on la méthode
de Smith et Johnson, (1988) (8).
Les propriétés ~antigéniques de l'antigène
recombinant GST-Tc50 ont ët~: testées par ELISA (Voiler et
al, 1975 (9)). Pour cela, des plaques de~ microtitrage
(Maxisorp (nom commercial), Nunc) ont été sensibilisées
avec 100 ng/ml de l'antigènes GST-Tc50 en 100mM NaHC03 (pH
9,6). Aprës incubation avec les sera de patients, les
immuncomplexes ont été dëte:ctés à l'aide d'un sérum de
chëvre anti IgG humaines, couplé à la péroxydase.
Les résultats sont. présentés dans le tableau
annexé et montrent que la totalité des sera humains
chagasiques testés réagis:~ent spécifiquement avec la
protéine recombinante. Aucune réactivité croisée n'a été
observée sur 7 sera de malades atteints de leishmaniose
cutanée ou viscérale.
~1'~39~~
WO 96105312 PCT/FR95101071
19
Exemple 3: Identification de la protéine native de
T cruzi présentant les déterminants antiaèniques du
clone Tc50
La mise en évidence de la protéine native de T.
cruzi a étë effectuée après immunopurification d'un
mélange de sera humains chagasiques sur la protéine
recombinante corespondante dénommée par la Demanderesse
PTc50.
1o L'éluat d'anticorps. polyclonaux monospécifiques
obtenu a été utilisé comme sonde, en Western blot, sur des
extraits protéiques totaux'. des différents stades du
parasite. Les anticorps sélectionnës ont spécifiquement
réagi avec une protéine de masse moléculaire apparente de
100 kDa, dénommée PTc100 par la Demanderesse, exprimée
dans toutes les souches testées du parasite.
Exemple 4: Analyse moléculaire du gêne Tc100
-Southern blots
Afin d'établir la carte de restriction du gène
Tc100 (figure 1), l'ADN nucléaire de T. cruzi, souche G, a
été digéré par différentes endonucléases de restriction
(BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, PvuII, SacI, BamHI/EcoRI,
BamHI/PvuII, EcoRI/HindIII, EcoRI/Pstl, EcoRI/PvuII,
EcoRI/SacI, PstI/SacI, PstI/PvuII, PvuII/SacI,
PvuII/HindIII), séparé sur gel d'agarose puis transféré
sur filtre de nylon d'après la technique de Southern.
L'hybridation des Southern blots a été réalisée avec l'ADN
de Tc 50 de 594 pb, qui est un fragment de l'ADN de Tc100
décrit précédemment, radiomarqué au 32P par incorporation
aléatoire (Amersham).
- Clonaae d'un fragment qénomiq_ue Tc100 de 3500 bb
2173957
~0
D'après les résultats obtenus en Southern blot,
l'ADN génomique de T. cruz_ib souche G, a été digéré par
l'enzyme EcoRI puis séparé sur gel d'agarose. Les
fragments de restriction Ec~oRI d'environ 3500 pb (figure
1) ont été clonés dans le vecteur lambda gtl0* (Huynh et
al., 1984(10)) linéarisé par EcoRI. Le clone phagique
contenant l'insert génomique Tc100 de 3500 pb a été isolé
à l'aide de la sonde radiomarquée de 594 pb décrite ci-
dessus. Un fragment de 1041 pb situé dans la région 3' de
l'insert génomique Tc100 de 3500 pb a été séquencé. Ce
séquençage a été effectué progressivement à l'aide des
amorçes suivantes:
SEQ ID N05 5' (TCGGGCACTGACGCGGCG) 3' 18
SEQ ID N06 5' (CTT'ATGAGTATTTCTTCCAGGGTA) 3' 24
20
L'amorce SEQ ID N05 est située dans la partie
séquencée préalablement du fragment de 594 pb de Tc50.
L'amorce SEQ ID N06 correspond à l'amorce du phage lambda
gtl0.
Ce fragment de 104. pb, qui commence au nucléotide
1403 et se termine au nuc7.éotide 2443 de la SEQ ID NO1,
présente un cadre ouvert de lecture, en phase avec la
séquence du fragment de 594 pb de Tc50.
* Marques de commerce
A
WO 96105312 _ 217 3 9 5 ~ p~.~y5101071
21
Exemple 5: Clonage dde l'ADNc Tc100
L'ADNc a été syntrêtisê à partir d'ARN totaux
d'êpimastigotes de T. cruzi, souche G. L'ADNc Tc100 a été
amplifié par la technique PCR, en trois différents
fragments: un fragment A co~__°respondant à la région 5' de
1459 pb, un fragment B correspondant à la région centrale
de 942 pb, un fragment C correspondant à la région 3' de
1406 pb de l'ADNc de Tc100, comme représenté
schématiquement sur la figure 2.
- Clonage du fragment A de l'ADNc Tc100
L'ADNc total synthétisé par la transcriptase
inverse de l'AMV ("avian mye:loblastosis virus"), à l'aide
d'hexanucléotides aléatoires (Boehringer Mannheim), a été
amplifié, par PCR, grâce au couple d'amorces suivant .
SEQ ID N07 5'(AACGC'.TATTATTAGAACAGTT)3' 21 , et
SEQ ID N08 5'(TGCAGCAGCGGCAGAAGT)3' 18
La SEQ ID N07 correspond à une partie de la
sëquence consensus de 35 nucléotides présente en 5' des
ARNm chez les trypanosomatides et appelée "Spliced leader"
(Pansons et al. 1984(11)).
La SEQ ID N08 correspond à la séquence
complémentaire d'une partie de la séquence prédéterminée
du fragment de 594 pb, et commence au nucléotide 1442 pour
se terminer au nuclêotide 1459 de la SEQ ID N01, selon la
numérotation du brin codant.
Aprés vérification e:n Southern blot à l'aide de la
sonde de 594 pb radiomarquée préalablement décrite, le
fragment d'ADNc de 1459 pb correspondant à la rëgion 5' de
Tc100 a été cloné dans le plasmide nommé pCRII (nom
commercial) (InvitrogenJ, et séquencé. La séquence
représentée dans l'id.entificateur SEQ ID NO1 commence au
nucléotide 1 et se termine au nucléotide 1459.
WO 96105312 PCT/FR95101071
22
- Clonage du fragment B de l'ADNc Tc100
L'ADNc total de T. cruzi a été amplifié par PCR à
l'aide des amorces .
SEQ ID N09 . 5'(CAGCCGACGGTAGCTGCGTCCT)3' 22, et
SEQ ID NO10 . 5'(ACATAATGGCCTCGTTCACAC)3' 21
La séquence ID N09 qui correspond à une partie de
la séquence prédéterminée de 594 pb du gène Tc100,
commence au nucléotide 1266 et se termine au nucléotide
1287 de la SEQ ID NO1.
La séquence SEQ ID NO10 correspond à la séquence
complémentaire d'une partie de la séquence préalablement
décrite de 1041 pb du gène Tc100. Cette séquence
SEQ ID NO10 commence au nucléotide 2187 et se termine au
nucléot~ide 2207 de la SEQ ID NO1, selon la numérotation du
brin codant.
Le fragment obtenu, d'une longueur de 942 pb a été
cloné dans le plasmide pCRII et séquencé. La séquence
représentée dans l'identificateur SEQ ID NO1 commence au
nucléotide 1266 et se termine au nucléotide 2207.
- Clonage du fraqment C de l'ADNc Tc100
Afin d'isoler la partie 3' de l'ADNc Tc100, l'ADNc
total de T. cruzi a été synthétisé à l'aide de l'amorce
hybride oligo(dT)16 adaptateur .
SEQ ID NO11: 5' (GACTCGCTGCAGATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT)3' 34,
suivant le protocole RACE ("Rapid Amplification of cDNA
Ends") (Frohman et., 1988(12)).
La région 3' de l'ADNc Tc100 a été amplifiée grâce
à l'amorce adaptateur et au couple d'amorces suivant:
SEQ ID N012 . 5'(CGAAGAGACCATGAACAACTT)3' 21, et
SEQ ID N013 . 5'(GACTCGCTGCAGATCGAT)3' 18
La séquence SEQ ID N012 correspond à une partie de
la séquence 1041 pb précédemment décrite du gène Tc100,
WO 96105312 ~ I 7 3 9 5 '~ p~~5101071
23
commençant au nucléotide 1997 et se terminant au
nucléotide 2017.
La séquence SEQ ID 1V011 correspond à la séquence
arbitraire de l'adaptateaur représentée dans la
SEQ ID NO11.
Aprës contrôle en Southern blot à l'aide du
fragment radiomarqué de 104'.1 pb, décrit précédemment, le
fragment 3' de l'ADNc Tc100, long de 1423 pb, a été cloné
en pCRII et séquencé. La séquence représentée dans
l'identificateur SEQ ID NO1 commence au nucléotide 1997 et
se termine au nucléotide 3402.
L'ADNc complet Tc100, d'une taille de 3402 pb, a
été entièrement séquencé. Il prêsente un cadre ouvert de
lecture de 2745 pb, et la séquence déduite en amino-acides
est de 915. Le codon méthion,ine est en position 266 et le
codon stop en position 3011.
Le gène Tc100 de T~rypanosoma cruzi code pour la
nouvelle protéine PTc100, de masse moléculaire théorique
de 100 kDa.
2o Bien entendu, puisque la séquence d' ADN du gène a
été entièrement identifiée, il est possible de produire
l'ADN correspondant entièreament par synthèse chimique,
puis d'insérer l'ADN dans des vecteurs d'ADN disponibles
commercialement, en utilisant des techniques connues de la
technologie relative à la recombinaison gënétique.
WO 96105312 PCT/FR95/01071
2~'~39~'~
2-l
TABLEAU
Maladie seraDO (992nm)
seuil de dtection =
0,370
MALADIE DE CHAGAS 1 1.358
2 1.278 i
3 0.328
4 O.dOd r
5 1.378
6 t .059
7 0 895
g t,79t
9 t .635
1 7 427 r
Q
1 1.009 t
1
1 1,7d3
2
t 0.530
3
14 1,035
1 O.d61 (.
LEISHMAI3IOSE CTANE 76 0291
LEZSHMANIOSE VISCRALE (Kala-azar)17 0,071 (-)
1 0.081 (-)
8
t oz79 (-)
9
2 0,098 (-)
0
21 0,067 {-)
2 0,125
2
WO 96/05312 PCT/FR95/01071
21'~395'~
NOMBRE DE SEQUENCES:13
1 INFORMATIONS 1?OUR LA SEQ ID NO: 1
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
5 liA LONGUEUR:3402
liB TYPE: acide nucléique
liC NOMBRE DE BRINS: double
1iD CONFIGURATION.: linéaire
lii TYPE DE MOLECtJLE:ADN complémentaire
ivi ORIGINE: T. cruzi
lviA ORGANISME: T. cruzi
lviB SOUCHE: G
lviD STADE DE DEVELOPPEMENT: épimastigote
lviiA BIBLIOTHEQUE:
lviiB CLONE:Tc100
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 1
WO 96/05312 PCT/FR95/01071
,2173957
26
20 30 40 50 60
AACGCTATTA TTAGAACAGT TTCTGTACTA TATTGTCATT TGGGGAGGGG GGAAAGGGGG
5 70 80 90 100 110 120
GAAGTACTTG CCGTTTTGTG TGGGTGACGA GACAACACAC ATCGAGCGGG AAGAAAAAAA
130 140 150 160 170 180
AAAAGGAAAT AAATTAAATT AAATTATTTG TTCTTTGAAT AGGCAAAGAA GAAGAAGAAG
190 200 210 220 230 240
AAAAGGTGCT GGGGAGGGAG GAGAAAGCGA CACACACACA AAAAAAAAAA AAGGAATTGC
250 260 270 280 290 300
GGAAATAACA ACGCAAGGCG CGGACATGAC CGTGACGGTG GATTTGTTCA ATCATGCGAA
310 320 330 340 350 360
GCCGAGCAAC AATGAGGGCC GCGTGTGGTC TGTGGACGCC GCGACATTTA ACGAGGTGCC
370 380 390 400 410 420
TGAGGCGCAG CGTGTGCTGG CGGATTCGCA GTTTTATCTT GCCTACACCA TGAAGCGGCG
430 440 450 460 470 480
TCACGTGCTG CGTGTGGTGA AGCGCTCGAA CCTTTTGAAG GGCACCGTGC GGGCACACTC
490 500 510 520 530 540
AAAGCCCATT CATGCGGTGA AGTTTGTGAA TTACCGCAGT AACGTCGCAG CATCGGCTGG
550 560 570 580 590 600
GAAGGGGGAG TTCTTCGTGT GGGTTGTGAC GGATGAAACG GAGGCGAGCA ACGGCAAGCC
610 620 630 640 650 660
GGATCTCGCA GCCCGCCTCA CAGTGAAGGT GTACTTTAAG CTTCAGGATC CTGTCACAAT
670 680 690 700 710 720
TCCATGCTTT TCTTTCTTTA TCAACGCCGA GAGTCAGCGG CCTGATCTGC TTGTCCTTTA
730 740 750 760 770 780
CGAAACGCAG GCGGCAATTC TTGACAGCTC CTCCCTCATT GAGCGCTTTG ACGTGGAATC
790 800 810 820 830 840
ACTGGAGGCA ACACTACAGC GGAATTGCAC AACCCTGCGA ACCCTGACTC AACCGGTTAG
850 860 870 880 890 900
TGAGAACAGT TTATGCTCCG TTGGCTCTGG CGGATGGTTC ACCTTTACCA CGGAACCAAC
910 920 930 940 950 960
AATGGTAGCG GCATGCACAT TACGAAACCG CAGCACTCCA TCATGGGCGT GTTGCGAGGG
SO 970 980 990 1000 1010 1020
TGAGCCAGTG AAGGCATTGC ATCTCCTTGA CGCAACCGTT GAGGAAAATG TCAGTGTTCT
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CGTGGCCGCA TCTACAAAAG GGGTGTACCA ATGGCTCCTT ACGGGTGTAG CAGAACCAAA
1090 1100 1110 1120 1130 1140
CTTGTTGCGC AAGTTTGTCA TTGATGGATC TATTGTCGCG ATGGAAAGCT CACGAGAAAC
1150 1160 1170 1180 1190 1200
GTTTGCCGTG TTTGACGACA GGAAGCAGCT GGCGCTGGTG AACATGCATT CCCCTCATAA
1210 1220 1230 1240 1250 1260
CTTTACCTGC ACACACTACA TGATGCCTTG_TCAGGTACAG CGTAACGGCT TTTGCTTCAA
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
WO 96105312 '~ ~ ~~ ~ 9 ~ ~ PCTIFR95101071
27
1270 1280 1290 1300 1310 1320
TCGTACAGCC GACGGTAGCT GCGTCCTGGC TGACATGTCG AATCGATTGA CGATCTTCCA
1330 1340 1350 1360 1370 1380
TCTCCGGTCC TCCCGCAGGG AAGAACAGCA GC:CAGGCCAA AAAACATCGG TAGTGGCGAC
1390 1400 1410 1420 1430 1440
GGCGAAACCG GGGTGTGTGT CCTCGGGCAC TGACGCGGCG AGTAGCAGTC ATACCAATAC
1450 1460 1470 1480 1490 1500
GACTTCTGCC GCTGCTGCAT CCCCTGCATC AC:CCCCTGTT TCAGCGCCAG CGAAGGCAGC
1510 1520 1530 1540 1550 1560
CGCGCCTCCT GCCGCGGCGC GATCGGCTGA GC:CGCACGTG GGGAGCAAGA TCATTGCTAA
1570 1580 1590 1600 1610 1620
TCTAGTGAAT CAGCTGGGGA TTAATGTCAC CC'.AAAGGAGC GTCGTCAGCA CTGGAGCGCC
1630 1640 1650 1660 1670 1680
GGCCACGACG AGGTCTACGG CGGTGACGTC CP.CGACTACC GCCCCGCAGC GAACAAGTCC
1690 1700 1710 1720 1730 1740
ATACGGGCAC AATGGCCGAC CTGTGACGGC TGGATTGGTG GCAGCTAATA GTGGTGCCAG
1750 1760 1770 1780 1790 1800
CGCGGCCTCG TCTCCCACAG CCGCGGCGAA ACCAACAGGA GAAGAAAAGG CCTCCGCGGC
1810 1820 1830 1840 1850 1860
ATGTGAAACG AGCTCCGTGG CGATAAATGC GA.CACGCCCG GCGCTTCACA ACGCCTCTCT
1870 1880 1890 1900 1910 1920
CCCGCAGGCG CCAACGGATG GCGTTTTGGC GGCAGCAGTA TACCAGTCGG AGGGCGAGGT
1930 1940 1950 1960 1970 1980
TCATCAGTCG CTGGAGCGGC TGGAGTCCGT CA.TAACCAAC ACGTCTCGGG TTCTGAAGTT
1990 2000 2010 2020 2030 2040
GCTCCCTGAC ACCATTCGAA GAGACCATGA AC'AACTTCTG AATCTGGGTT TAGAGGCACA
2050 2060 2070 2080 2090 2100
GATGACAGAG CTGCAGCAGA GCCGTCCAAC AC'CGCAAACA CAGCCGAGAG ACACAAGCTC
2110 2120 2130 2140 2150 2160
CGCGAAATCA TCCGTGTTTG AGACGTACAC CC'TTGTTCTC ATTGCGGATT CCCTCTCTCG
2170 2180 2190 2200 2210 2220
CAACATCACG AAGGGGGTGA AGCGTGGTGT GAACGAGGCC ATTATGTTGC ATCTCGACCA
2230 2240 2250 2260 2270 2280
TGAGGTGCGG CACGCCATAG GGAACCGGCT TCGGCAAACA CAAAAGAACA TCATCAAGAG
2290 2300 2310 2320 2330 2340
CCGCCTCGAT GAAGCGTTGA AGGAAAGCAC TA.CACAGTTT ACGGCTCAAT TGACGCAAAC
2350 2360 2370 2380 2390 2400
GGTGGAGAAT CTGGTGAAGC GCGAGCTTGC CGAGGTGCTT GGTAGCATCA ACGGCTCCCT
2410 2420 2430 2440 2450 2460
CACTTCTCTC GTGAAGGAAA ATGCCTCATT ACAGAAAGAG TTGAATTCCA TAATGTCTAG
2470 2480 2490 2500 2510 X520
TGGGGTGTTG GATGAAATGC GTCGTATGCG GGAAGAGCTG TGCACATTGC GAGAGTCCGT
2530 2540 2550 2560 2570 2580
F~.EE DE i~NIP~NT tR~GiF tôt
WO 96/05312 G ' 1 7 3 9 5 7 pCT~5~01071
28
TGCGAAGCGG AAGGCAACAA TGCCAGATTC TTCTCTTCAC GCCACGAGCT CCTTTCAAGG
2590 2600 2610 2620 2630 2640
AAGAAGGTCT GCGCCCGAGA CAATTCTTGC AACCGCGTTA TCGATGGTGC GAGAGCAGCA
2650 2660 2670 2680 2690 2700
ATACCGTCAG GGACTGGAAT ACATGTTGAT GGCTCAGCAG CCCTCTCTCC TCCTGCGGTT
2710 2720 2730 2740 2750 2760
CCTCAGCATA CTTACAAGGG AAAACGAAAA CGCCTACTCG GAACTTATTG AAAATGTAGA
2770 2780 2790 2800 2810 2820
GACGCCGAAT GACGTGTGGT GTTCGGTTCT GTTGCAACTC ATAGAGGCCG CGGCGACGGA
2830 2840 2850 2860 28?0 2880
GGCTGAGAAG GAGGTGGTTG TTGGCGTCGC CATTGATATT CTCTCCGAGC GCGATCAAAT
2890 2900 2910 2920 2930 2940
TGCTCAGAAC GGCGCACTCG GCTCGAAACT CACCACCGCC ATGCGAGCCT TTGAGCGACA
2950 2960 2970 2980 2990 3000
GGCAAGGTCG GAGACAACGA GCAGGTCATT CTTGCAATGC CTGAAGAACC TGGAAAAGCT
3010 3020 3030 3040 3050 3060
TCTGCAATCA TGATAATAAA AAGAACTCAA CGAATACAGT TGTTGATTAT TAAGGAAGGG
3070 3080 3090 3100 3110 3120
AAAAGAGAGA AAGAGAGAGA GAGAGAGAGA AATGTAATGG GCGTTTAGTT ACGGTAGAAA
3130 3140 3150 3160 3170 3180
GAAAACGTGT GGATAAGAAG GAGGGGTTTT GTGTGCGACC AGGAATTACT GGGGAACGCT
3190 3200 3210 3220 3230 3240
GCTACACGGC GGAATCGACC ATTTTATTAT TATTATTATT GTCTTTAGTA TTATGTTTTT
3250 3260 3270 3280 3290 3300
TCTTGTGTGT GTGTGTGTGT GTTTGTGTGT GTGCGGTTAT TTTGTATCCG TTTGCTCCCG
3310 3320 3330 3340 3350 3360
CCCCTGCCCC CCATCACCCG AGGAGAAAGT AGAATAAGAC ACATACGATT GTTGTTTTTG
3370 3380 3390 3400
TTATCCTTAA AAGGAAGAGA GACCAAAAAA AAAAAAAAAA AA
FEUILLE DE REr9PLACEMENT (RE~LE 26)
WO 96/05312 2 ~ ~ ~ 9 ~ ~ PCT/FR95101071
29
1 INFORMATIONS POCfR LA SEQ ID NO: 2
1i CARACTERISTIQUE~~ DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR:915
liB TYPE: protéique
liC NOMBRE DE BRINS: simple
lvi ORIGINE: T. cruzi.
lviA ORGANISME: T. cna2i
lviB SOUCHE:G
lvii SOURCE IMMEDIATE:
lviiA BIBLIOTHEQUE:
lviiB CLONE:Tc100
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 2
WO 96105312 ~' ~ 7 3 9 5 7 p~~5101071
2 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO . 2
2i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE .
2iA LONGUEUR : 915 acides aminés
5 2iB TYPE . protéique
2iC NOMBRE DE BRINS . simple
2vi ORIGINE . T. cruzi
2viA ORGANISME . T. cruzi
10 2viB SOUCHE . G
2vii SOURCE IMMEDIATE .
2viiA BIBLIOTHEQUE .
2viiB CLONE . Tc100
2xi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE . SEQ ID NO . 2
FE~IL~E RECTlFIEE (REGLE 9'
ISrIIEP
WO 96/05312 PCT/FR95101071
31
10 15 20
Met Thr Val Thr Val Asp Leu Phe Asn His Ala l.ys Pro Ser Asn Asn Glu Gly Arg
Val
25 30 35 40
Trp Ser Val Asp Ala Ala Thr Phe Asn Glu Val Pro Glu Ala Gln Arg Val Leu Ala
Asp
5 45 50 55 60
Ser Gln Phe Tyr Leu Ala Tyr Thr Net Lys Arg I~rg His Val Leu Arg Val Val Lys
Arg
65 70 75 g0
Ser Asn Leu Leu Lys Gly Thr Val Arg Ala His Ster Lys Pro Ile His Ala Val Lys
Phe
85 90 95 100
1 0 Val Asn Tyr Arg Ser Asn Val Ala Ala Ser Ala Cily Lys Gly Glu Phe Phe Val
Trp Val
105 110 115 120
Val Thr Asp Glu Thr Glu Ala Ser Asn Gly Lys F~ro Asp Leu Ala Ala Arg Leu Thr
Val
125 130 135 140
Lys Val Tyr Phe Lys Leu Gln Asp Pro Val Thr Ile Pro Cys Phe Ser Phe Phe Ile
Asn
1 5 145 150 155 160
Ala Glu Ser Gln Arg Pro Asp Leu Leu Val Leu Tyr Glu Thr Gln Ala Ala Ite Leu
Asp
165 170 175 180
Ser Ser Ser Leu Ile Glu Arg Phe Asp Val Glu Ser Leu Glu Ala Thr Leu Gln Arg
Asn
185 190 195 200
2 0 Cys Thr Thr Leu Arg Thr Leu Thr Gln Pro Val Ser Glu Asn Ser Leu Cys Ser
Val Gly
205 210 215 220
Ser Gly Gly Trp Phe Thr Phe Thr Thr Glu Pro Thr Met Val Ala Ala Cys Thr Leu
Arg
225 230 235 240
Asn Arg Ser Thr Prô Ser Trp Ala Cys Cys Glu Gly Glu Pro Val Lys Ala Leu His
Leu
2 5 245 250 255 260
Leu Asp Ala Thr Val Glu Glu Asn Val Ser Val Leu Val Ala Ala Ser Thr Lys Gly
Val
265 270 275 280
Tyr Gln Trp Leu Leu Thr Gly Val Ala Glu Pro Asn Leu Leu Arg Lys Phe Val Ile
Asp
285 290 295 300
3 0 Gly Ser Ile Val Ata Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Phe Ala Val Phe Asp Asp
Arg Lys
305 310 315 320
Gln Leu Ala Leu Val Asn Met His Ser Pro His Asn Phe Thr Cys Thr His Tyr Met
Met
325 330 335 340
Pro Cys Gln Val Gln Arg Asn Gly Phe Cys Phe Asn Arg Thr Ala Asp Gly Ser Cys
Val
3 5 345 350 355 360
Leu Ala Asp Met Ser Asn Arg Leu Thr Ile Phe His leu Arg Ser Ser Arg Arg Glu
Glu
3b5 370 375 380
Gln Gln Pro Gly Gln Lys Thr Ser Val Val Ala Tlhr Ala Lys Pro Gly Cys Val Ser
Ser
385 390 395 400
4 0 Gly Thr Asp Ala Ala Ser Ser Ser His Thr Asn Tlhr Thr Ser Ala Ala Ala Ala
Ser Pro
405 410 415 420
Ala Ser Pro Pro Val Ser Ala Pro Ale Lys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Arg
Ser
425 430 435 440
Ala Glu Pro His Val Gly Ser Lys Ile Ile Ala Aan Leu Val Asn Gln Leu Gly Ile
Asn
4 5 445 450 455 460
Val Thr Gln Arg Ser Val Val Ser Thr Gly Ala Pro Ala Thr Thr Arg Ser Thr Ala
Val
465 470 475 480
Thr Ser Thr Thr Thr Ala Pro Gln Arg Thr Ser Pro Tyr Gly His Asn Gly Arg Pro
Val
485 490 495 500
5 0 Thr Ala Gly Leu Val Ala Ala Asn Ser Gly Ala Ser Ala Ala Ser Ser Pro Thr
Ala Ala
505 510 515 520
Ala Lys Pro Thr Gly Glu Glu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Glu Thr Ser Ser Val Ala
Ile
525 530 535 540
Asn Ala Thr Arg Pro Ala Leu His Asn Ala Ser Leu Pro Gln Ata Pro Thr Asp Gly
Val
FEU/! LE RECTIFIES (REGLE 91 )
i S,A,% ~ P
WO 9G!05312 ~ PCTIFR95/01071
32
545 550 555 560
Leu Ala Ala Ala Val Tyr Gln Ser Glu Gly Glu Val His Gln Ser Leu Glu Arg Leu
Glu
565 570 575 580
Ser Val Ile Thr Asn Thr Ser Arg Val Leu Lys Leu Leu Pro Asp Thr Ile Arg Arg
Asp
585 590 595 600
His Glu Gln Leu Leu Asn Leu Gly Leu Glu Ala Gln Met Thr Glu Leu Gln Gln Ser
Arg
605 610 615 620
Pro Thr-Pro Gln Thr Gln Pro Arg Asp Thr Ser Ser Ala Lys Ser Ser Val Phe Glu
Thr
625 630 635 bç0
1 0 Tyr Thr Leu Val Leu Ile Ala Asp Ser Leu Ser Arg Asn Ile Thr Lys Gly Val
Lys Arg
645 650 655 660
Gly Val Asn Glu Ala Ite Met Leu His Leu Asp His Glu Val Arg His Ala Ile Gly
Asn
6b5 670 b75 680
Arg Leu Arg Gln Thr Gln Lys Asn Ile Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ala Leu Lys
Glu
1 5 685 690 695 700
Ser Thr Thr Gln Phe Thr Ala Gln Leu Thr Gln Thr Val Glu Asn Leu Val Lys Arg
Glu
705 710 715 720
Leu Ala Glu Val Leu Gly Ser Ile Asn Gly Ser Leu Thr Ser Leu Val Lys Glu Asn
Ala
725 730 735 740
2 0 Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asn Ser Ile Met Ser Ser Gly Val Leu Asp Glu Met
Arg Arg
745 750 755 7b0
Met Arg Glu Glu Leu Cys Thr Leu Arg Glu Ser Val Ala Lys Arg Lys Ala Thr Met
Pro
765 770 775 7g0
Asp Ser Ser Leu His Ala Thr Ser Ser Phe Gln Gly Arg Arg Ser Ala Pro Glu Thr
Ile
2 5 785 790 795 800
Leu Ala Thr Ala Leu Ser Met Val Arg Glu Gln Gln Tyr Arg Gtn Gly Leu Glu Tyr
Met
805 810 815 g2p
Leu Met Ala Gln Gln Pro Ser Leu leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Leu Thr Arg Glu
Asn
825 830 835 840
3 0 Glu Asn Ala Tyr Ser Glu Leu Ile Glu Asn Val Glu Thr Pro Asn Asp Val Trp
Cys Ser
845 850 855 8b0
Val Leu Leu Gln Leu lle Glu Ala Ala Ala Thr Glu Ala Gtu Lys Glu Val Val Val
Gly
8b5 870 875 gg0
Val Ala Ile Asp Ile Leu Ser Glu Arg Asp Gln Ile Ata Gln Asn Gly Ala Leu Gly
Ser
3 5 885 890 895 900
Lys Leu Thr Thr Ala Met Arg Ala Phe Glu Arg Gln Ala Arg Ser Glu Thr Thr Ser
Arg
905 910 915
Ser Phe Leu Gln Cys Leu Lys Asn Leu Glu Lys Leu Leu Gln Ser
FEt,EI~ 'E RECTIFIES (REGLE 91)
i~A/EP
WO 96105312 PCT/FR95I01071
2173957
33
1 INFORMATIONS I?OUR LA SEQ ID NO:
3
1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:
liA LONGUEUR: 24 bases
liB TYPE: acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS: simple
liD CONFIGURATION;; linaire
lii TYPE DE MOLECiILE: ADN (phagique)
liii HYPOTHÉTIQUE .. non
liv ANTI-SENS . non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse
ivii SOURCE IMMÉDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO: 3
GGTGGCGACGACTCCTGGACsCCCG 24
WU 96/05312 PCT/FR95/01071
34
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR: 24 bases
liB TYPE: acide nucléique
liC NOMBRE DE BRINS: simple
liD CONFIGURATION: linéaire
lii TYPE DE MOLECULE: ADN (phagique)
liii HYPOTHETIQUE . non
liv ANTI-SENS . oui
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse
lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 4
TTGACACCAGACCAACTGGTAATG 24
WO 96/05312 PCT/FR95/01071
2173957
:35
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR: 18 bases
1iB TYPE: acide nucléique
liC NOMBRE DE BRINS: simple
liD CONFIGURATION: linéaire
lii TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
liii HYPOTHETIQUE . non
liv ANTI-SENS . non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse
lvii SOURCE IMMEDIA.TE: bioMërieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE. LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 5
TCGGGCACTGACGCGGCG 18
WO 96105312 PCT/FR95101071
2173957
36
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR: 24 bases
liB TYPE: acide nucléique
liC NOMBRE DE BRINS: simple
liD CONFIGURATION: linéaire
lii TYPE DE MOLECULE: ADN (phagique lambda gtio)
liii HYPOTHETIQUE . non
l0
liv ANTI-SENS . oui
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse
lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
,SEQ ID NO: 6
CTTATGAGTATTTCTTCCAGGGTA 24
WO 96/05312 ~ PCTIFR95I01071
2. ~ ~' 3 9 5'I
37
1 INFORMATIONS 1?OUR LA SEQ ID NO: 7
1i CARACTERISTIQ1;JES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR: 21 bases
liB TYPE: acide nucléique
liC NOMBRE DE BRI1JS: simple
liD CONFIGURATION: linëaire
1 i i TYPE DE MOLEC1:TLE : ADNc
liii HYPOTHETIQUE . non
liv ANTI-SENS . non
1v TYPE DE FRAGMENT:
' lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse
lvii SOURCE IMMEDI~ATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION D:E LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 7
AACGCTATTATTAGAACAG'rT 21
WO 96/05312 PCT/FR95/01071
~~.'~~9~~
38
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR: 18 bases
liB TYPE: acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS: simple
liD CONFIGURATION: linaire
lii TYPE DE MOLECULE: ADN (gnomique)
liii HYPOTHETIQUE . non
liv ANTI-SENS . oui
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonuclotide de synthse
vii SOURCE IMMEDIATE: bioMrieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 8
TGCAGCAGCGGCAGAAGT 18
z~~~~~~~
WO 96105312 PCTIFR95/01071
39
1 INFORMATIONS 1?OUR LA SEQ ID NO: 9
1i CARACTERISTIQ1:JES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR: 22 bases
liB TYPE: acide nucléique
liC NOMBRE DE BRI1QS: simple
liD CONFIGURATION: linêaire
Iii TYPE DE MOLEC1JLE: ADN (génomique)
liii HYPOTHETIQUE . non
liv ANTI-SENS . non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse
lvii SOURCE IMMEDI~ATE: bioMërieux S.A.
lxf DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 9
CAGCCGACGGTAGCTGCGTCCT 22
WO 96/05312 PCTIFR95/01071
~~.'~395~
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR: 21 bases .
liB TYPE: acide nucléique
5 liC NOMBRE DE BRINS: simple
liD CONFIGURATION: linéaire
lii TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
liii HYPOTHETIQUE . non
liv ANTI-SENS . oui
1v TYPE DE FRAGMENT:
~ lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse
lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 10
ACATAATGGCCTCGTTCACAC 21
WO 96/05312 ~ PCT/FR95/01071
2173957
41
1 INFORMATIONS 1?OUR LA SEQ ID NO: 11
1i CARACTERISTIQtJES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR: 3~. bases
liB TYPE: acide nucléique
liC NOMBRE DE BRINS: simple
liD CONFIGURATION.: linëaire
lii TYPE DE MOLECULE: ADNc
liii HYPOTHETIQUE ., non
liv ANTI-SENS . oui
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse
ivü SOURCE IMMEDIATE: bioMërieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 11
GACTCGCTGCAGATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 34
W0 96105312 PCTIFR95/01071
.l2
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12
1i CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:
liA LONGUEUR: 21 bases
liB TYPE: acide nuclique
liC NOMBRE DE BRINS: simple
1iD CONFIGURATION: linaire
lii TYPE DE MOLCULE: ADN (gnomique)
liii HYPOTHTIQUE . non
liv ANTI-SENS . non
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonuclotide de synthse
lvii SOURCE IMMDIATE: bioMrieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE:
SEQ ID NO: 12
CGAAGAGACCATGAACAACTT 21
WO 96105312 2'_ ~ 3 g ~ ~ PCT/FR95I01071
:13
1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13
1i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
liA LONGUEUR: 18 bases
lié TYPE: acide nucléique
liC NOMBRE DE BRINS: simple
liD CONFIGURATION: linëaire
lii TYPE DE MOLECULE: ADN
liii HYPOTHETIQUE . non
l0
liv ANTI-SENS . oui
1v TYPE DE FRAGMENT:
lvi ORIGINE: oligonuclëotide de synthêse
lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.
lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:
SEQ ID NO: 13
GACTCGCTGCAGATCGAT 18
WO 96/05312 PCT/FR95/01071
~~'~~9~'~
44
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Les techniques classiques de biologie moléculaire
ont été effectuées d'aprés les protocoles cités dans
"Molecular cloning, a laboratory manual". Maniatis T.,
Fritsch E.F. & Sambrook J. Second edition. Cold Spring
Harbor Laboratory Press (New York) (1989).
1. Paranhos-Baccala G., Santos M., Cotrim P.,
Rassi A., Jolivet M., Camargo M.E. & Da Silveira J F.
Detection of antibodies in sera from Chagas disease
patients using a Trypanosoma cruzi immunodominant
recombinant antigen. Parasite Immunology (1994) . 16
165-169.
2. Lafaille J.J., Linss J., Krieger M.A., Padron
T.S., De Souza W & Goldenberg S. Structure and expression
of two Trypanosoma.cruzi genes encoding antigenic proteins
bearing repetitive epitopes. Molecular and Biochemical
Parasitology. (1989). 35 . 127-136.
3. Young R.A. & Davis R.W. Efficient isolation of
genes by using antibody probes. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. (1983). 80 . 1194-1198.
4. Cotrim P.C., Paranhos G., Mortara R.A.,
Wanderley J., Rassi A., Camargo ME. & Da Silveira J.F.
Expression in Escherichia coli of a dominant immunogen of
Trypanosoma cruzi recognized by human chagasic sera.
Journal of Clinical Microbiology. (1990). 28(3) . 519-524.
5. Sanger F., Nicklen S. & Coulson A.R. DNA
sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. (1977). 74 . 5463-5467.
WO 96105312 21 7 3 9 5 7 PCT/FR95101071
6. Laemmli U.K. Cl.eavage of structural proteins
during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature. (1970). 227 . 680-685.
5 7. Towbin H., Staehelin T. & Gordon J.
Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide
gels to nitrocellulose sheets . procedure and some
applications. Proc. Natl. ,Acad. Sci. USA. (1979). 76
4350-4354.
8. Smith D.B. & Johnson K.S. Single step
purification of polypeptides~ expressed in Escherichia coli
as fusions with glutathione: S transferase. Gene. (1988).
67 . 31-40.
9. Voller A., Draper C., Bidwell D.E. & Bartlett
A. Microplate enzyme-linked immunosorbent assay for Chagas
disease. Lancet (1975). 1.: 426-428
10. Huynh T.V., S~oung R.A. & Davis R.W. DNA
Cloning . A practical approach. (1984)(Ed. D. Glover) 49-
78. IRL. Oxford.
11. Parsons M., :Nelson R.G., Watkins K.P. &
Agabian N. Trypanosome mRN.As share a common 5' Spliced
Leader sequence. Cell. (1984). 38 . 309-316.
12. Frohman M.A., Dush M.K. & Martin G.R. Rapid
production of full lengh cDNA from rare transcripts
amplification using a singlEa gene specific oligonucleotide
primer. Proc. Natl. Acad. Sc:i. USA.(1984) 85 . 8998-9002.
13. Nielsen P.E et. al., Science, 254, 1497-1500
(1991).
WO 96/05312 21 7 3 9 5 7 p~~5~01071
46
14. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor (1982).
15. Southern E.M, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975).
16. Dunn A.R, Hassel J.A, Cell, 12, 23 (1977).
17. Yoshida N, Surface antigens of metacyclic
trypomastigotes of Trypanosoma cruzi, Infection and
Immunity, 40, 836-839, (1983).
