Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
~0~ 9s~706s ~ ~ ~7 f 7t~ r~ 7C
PR0(-FT~E DF ~FT Ft-TlONDE l :FT 1 I Jl F~ FUCARYOT~ TRANSFORMF~ FT
T~T T ~ JT F~ QBTFNUES
La présente invention concerne, notamment, un nouveau
procédé pour sélectionner des cellules eucaryotes, particulièrement
5 animales ou végétales transformées.
Cette invention concerne l'~tilisation de gènes codant pour des
protéines capables d'inactiver les ~L~ uLh~ les dans la sélection de tissus
végétaux transformés, en particulier des streptothricine-acétyle
transférases.
Les ~L~t:yLuLIllicines isolées de Streptomyces lavendulae sont
des agents ar, !microbiens. Elles sont constituées de trois régions
IL~ IL~ par de la gl1loc~mine~ de la streptolidine et ~r une chaine
peptidique de ~-lysines. La longueur de cette chaine est variable de 1 à 7
résidus et caractérise le type de ~ LuLllii~ille A, B, C, etc. (Khoklov et
Shutova, 1972; Carter et al., 195~). Cette classe d'antibiotique possède à la fois
une action ba.~éliu~Ldlique et bactéricide, aussi bien sur les bactéries gram-
positives que gram-négatives, en particulier les entér~ ctéries. Ce type
d'antibiotique se fixe sur la sous unité 30s des ribosomes entrainant une
inhibition des synthèses l,lu~ ue5.
Suite à l'utilisation de la ~L.~L~LI.. icine dans l'~ ti-, ~ du
bétail, il a été isolé des souches d'Esche~ichia coli résistantes à cet
antibiotique. Il a été démontré que dans la plupart des cas, cette résistance à
la ~L~ LuLIIlicine était portée par des plasmides de différents groupes de
compatibilité, qui codaient pour une acétyl-L.dll~r.'..dse spécifique appelée
~ Lulllli~ille acétyle ~Idll~rLl.lSe (SAT). La streptothricine acétylée sur le
groupement amine des résidus Iysines est inactive.
Deux gènes satl et sat2 ont été .~d.~tlis~ (Tietze et al., 1988).
11s proviennent respectivement des transposons Tnl825 et Tnl8~6
a,u~d~ ~ au Lldll~ ull Tn7. La séquence nucléotidique de ces deux gènes
a été ~1~tf~tmin~ (Heim et al., 1989; Tietze et Brevet, 1990). Un très haut degré
d'hnml~ est trouvé entre ces deux c~q1l~n~f~c
Un autre gène, sat1, codant pour une ~L~ u~ll-icine acétyl-
Lldll~r~:ld~ a été caractérisé (Jacob et al., FEMS Microbiol. Lett.; 1994, Jul 1:
120(1-2): 13-7). Ce gène était détecté dans E. coli contenant un plasmide
r~cr~mhin~nt pAT132 qui porte ce gène.
Dans le cadre~de la présente invention, on a pu mettre en
évidence l'existence d'un gène sat3 qui code aussi pour une ~ u~ll-icine
W095127065 218 7I 70 ~ rl~
acéyle L,~u.:,' .ase mais ne présente sPncihll~m~nt pas d'homologie avec les
gènes satl ou sar2.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un
procédé d'obtention de cellules Cu.d~ isolées ou non, I~_oioL~Ul~o à la
5 ~L~ Lhli~ e ou à ses ana~ogues ~UIII~ dll~ les étapes suivantes:
- Ll dllor~ udLiull desdites cellules eucaryotes à l'aide d'un vecteur
d'expression d'une séquence d'ADN codant pour une O~ L~luiCine
acétyl lldllor~ldo~ (SAT) ~'UlU~JUl~UII la séquence d'ADN codant pour
ladite streptothricine acétyl transférase (ADN-SAT) située en
... ;~ convenable et une ou plusieurs séquences d'ADN codant
pour les éléments cvull~ll~ll I'expression de ladite séquen~e d'ADN-
SAT dans lesdites cellules, et
- sélection des cellules résistantes à la streptothricine ou à ses
analogues après 1~ ,., .~ ru~
Par "vecteur d~e~.yl~DOiUll~, on entend désigner tout système
permettant l'in~ol~c~,dli~ll et l'expression de la séquence d'ADN codant
pour un SAT, il pourra s'agir de système autoréplicatif, type plasmide, ou
intégratif, type virus ou ADN nu.
Parmi les techniques de transformation utilisables pour la
mise en oeuvre de la présente invention, on utilisera dvdulldgeus~''ent,
pour les cellules vegétales, la technique dite "d'Agro-infection" utilisant
une bactérie Agrobacterium IlliLuh~ o possédant un vecteur binaire ou un
vecteur de co-intégration, ou la technique dite ~de bombardement d'ADN"
ou "biolistique", et pour les cellules animales, on utilisera av~n
des séquences d'un rétrovirus.
Il est important de préciser que parmi les séquences codant
pour la Oll.~ tlllicine acéyl transférase on préfèrera tout parti-
.ulièlelllc.lL les séquences choisies parmi:
a) les gènes satl, sat2 et sat3, sat4,
30 b) les séquences d'ADN qui s'hybrident avec lesdits gènes et qui codent
pour une protéine ayant une activité SAT, et
c) les séquences d'ADN qui sûnt obtenues par dégénérescence à partir
des séquences a) et b) et qui codent pour une protéine ayant une
activité SAT.
La séquence de sat3 est annexée à la présente d~ icll.
La séquence de sarl f~gure n~L~umll~ll dans Heim et al, 1989.
La séquence de sat2 figure nnt~mm~nt dans Tietze ~t Brevet, 1990.
wo ss/2706s 2 ~ 0 ~ /r~ 5 : ~
Les séquences ADN-SAT sont placées sous le contrôle d~au
moins un ,U~UlllUt~ rull~liullllcl dans la ceilule lldularulul~C, I'ULili~dliUII de
tels promoteurs feront l'objet d'exemples, il s'agil là nt~:lnmr)inc d'éléments
qui sont connus par l'homme de métier pour les cellules eucar~otes, qu'il
S s'agisse de cellules animales ou de cellules de végétaux.
On peut également prévoir des processus mettant en oeuvre des
U dUl;~OSVlls.
La présente invention est, en particulier, destinée à être
appliquée à des cellules végétales, c'est pourquoi les vecteurs mis en oeuvre
10 sont plus particulièrement des vecteurs dérivés d'Agrol~acrerium,
nVL~Lulu~ dérivés d'A. 1;.,... r~ ;..,C Ou d'A. rhizogenes, s'agissant là
également d'une technologie connue par l'homme de métier.
La présente invention concerne ~ 3h~nn~nt 1~11tiliC~tiOn des
gènes codant pour ces ~L~e~lvlhlicines acétyl transférases à titre de
15 lllduu,ueul~ sélectifs de cellules eucaryotes ~ldll~rUllUe~, isolées ou non,
différencl~es ou non, se ~ c..llkull, par exemple, sous forme de 5l~cppncioAn
cellulair~, d'agrégats cellulaires, d'embryons, de tissus ou de plantes.
La présente invention concerne égaiement l'~ltilic~tir,n des
gènes codant pour des ;,1l el,lOIlll icines acétyl transférases à titre de
20 llldlU,U~ sélectifs pour piéger un promoteur de plantes. On a effet trouvé
que lesdits gènes, .luldluu.e.ll lorsqu'ils sont placés avec la bordure droite
d'un T-DNA, peuvent etre exprimés par un promoteur de la plante.
Toutefois, il est bien entendu que l'expression de la
~ll e~lullll icine acétyl 11 dll~ré. dse n'est qu'un élément de sélection, que
25 dans la plupart des cas la construction génétique utilisée pour la
transformation CUII1l)01 1~_l d, en outre, un ensemble de séquences d'ADN
p~ lldUlt à la cellule l.d..~ru..llcc et aux tissus, organes ou plantes
transformés qui en seraient issus, d'exprirr~r un caractère d'intérêt,
notamment, dans le cas des cellules végétaies, un caractère d'intérêt
30 agronomique.
Il n'est, bien entendu, pas possible de faire une liste
exhaustive des caractères d'intérêt qui peuvent etre portés par les vecteurs,
on citera simplement la résistance à certains insectes dans la lutte contre
les rongeurs de culture, la résistance à certains herbicides afin de faciliter
35 par exemple le désherbage de certaines cultures, ~ nnenr la résistance à
certains types de maladie tels que les maladies fongiques, ou conditions
ciimatiques, on pourra égaiement citer des caractères tels que
wo95n7o65 2187I7~ /rl --
n de la teneur dans certains principes actifs ou produits du
métabolisme secondaire, ou bien la pOCc;hilit~ pour certaines plantes de
pouvoir se passer de certains apports comme par exemple les apports azotés,
ou encore l'dUleliUldLiOn des ,ulu,uliéLéa terhn~ giques ou ali~u~ dil~D de
5 certaines plantes.
La présente invention concerne également les cellules
obtenues par le procédé selon ~ iOII et les cultu}es de tissus ou les
plantes régénérées à partir de ces cellules.
La présente invention cDncerne ~gRIem~nt une séquence
10 d'ADN codant pour la ~ ulllli~ille acétyl lldUl~ d~e (ADN-SAT) choisie
parmi:
a) la séquence sat3 annexée à la description,
b) les séquences d'ADN qui s'hybrident avec ledit gène et codent pour
une protéine ayant une activité SAT,
15 c) les séquences d'ADN qui sont obtenues par dég~lléle~cllce à partir
des ~é4u~ es a) et b) et qui codent pour une protéine ayant une
activité SAT.
Il faut l-.Udl-~U~::I que la ~UlU~dUdisUII de cette séquence sat3
avec celle de satl et sat2 ne montre aucune homologie. Ceci confirme le
20 résultat de tests ,ul~'~f~ "--..l réalisés ne mettant en évidence aucune
hybridation entre la séquence sat3 d'une part et les séquences satl et sat~
d'autre part. Le gène sat3 code pour une protéine de 180 acides aminés ayant
un poids m/7léc~ ire de 20 335 daltons. L'activité acétyl-lld..~r~.dse de ces
trois gènes est spécifique de la ~ i.i..e et est inactive sur d'autres
25 d..li~;~)li4ues comme le chlu- ~"l,l..' .;~ol, la gentamycine, la l;anamycine et
les néomycines (Tschape et al., 1984).
La présente invention concerne également les vecteurs de
clonage et d'eA,u.~,~ioll des séquences d'ADN-SAT ainsi que les vecteurs
plasmidiques, les vecteurs d'intégration, les cellules eucaryotes
30 transformées, isolées ou non, dirr...ll~;é.~ ou non, et les plantes, obtenus
par la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention.
D'autres cara~leli~Li4ues et avantages de la présente invention
d,Uydidi~lullt à la lecture des exemples ci-après.
Un des intérets des ~LI~}JLuLllli~illes est qu'un grand nombre de
35 cellules procaryotes et eucaryotes y sont sensibles.
Avant de tester l'efficacité de la CUIl~Llu~Liull pr~cé~mm-~nt
décrite, la sensibilité de différents Ol~;dUli~Ul~s vis à vis de la ~LIeAuLuLllll~ille
.,
21~7170
WO 9sl27065 5 1 ~I/r~_.
a été I e~llLl .L~c. A titre d'exemple, les concentrations inhibitrices
optimales trouvées pour dirr~ es cellules sont données dans le tableau l.
On appellera cv.lc~ ,dlion inhibitrice optimale, la Cull.elllldlion minimum
à partir de laquelle la division cellulaire est comp~ètement abolie.
5 L'expé}imr~nt:ltr~l-r averti saura que cette collcelllldLion optimale varie
selon les cellules concernées et le mode de culture, et qu'elle devra etre
déterminée avant de procéder à la lldll~rUlUldliOn de nouvelles cellules.
T~hi~nl 1: Co~ -.,.lion inhihitrice orlin~le de la ~ ulll.icine I~OUr
10 ~iirrélr..lr~ cr~ ltoc et tissus
Cellules Concentration en mg/l
Escherichia coli 100
Agrobacterium lumefaciens 100
Saccharomyces cerevisiae 100
15S~ uodcc~ld~ v~y~O pombe 50
Nicotiana tabacum (disques foliaires) 100
Daucus carota (ahairy root" 100
Lotus cu~ ulaLuo ~germination de graines 100
Ara~idopsis thaliana (culture de racine in ~S
20vitro)
Vigne (culture de cellules en S .~r,.-iol.) 10
Cellules L~lallllll~ o de souris HC11(culture in 100
vitro)
Cellules d'ovaire de hamster CHO (cultu}e in 100
25vitro)
Les expér}~nces qui suivent SOllt fournies à titre d'exemple
pour mieux comprend~e l'utilisation de l'i~ention présente. Il doit être
compris que ces exemples sont fournis pour illustrer l'intérêt d'un tel
marqueur de sélection, mais ne peuvent en aucun cas être considérés
comme seuls cas possibles de l'utilisation de ce marqueur.
Sur les figures annexées,
- la figure 1 représente le fragment Bglll-Bglll de la construction
pJBJ106, ce fragment ~UIl~liLUdlll le segment d'ADN essentiel pour les
35 transformations décrites dans les exemples ci-aprèO,
- la figure 2 représente la-carte de construction réalisée pour obtenir le
plasmide pJBJ333 ~L~ ll~ll l'utilisation du gène sat3 pour pièger des
promoteurs de plantes.
wo 95/27065 ~ rl ~ .
2I8~I 70
~Y~rTlt~
PrPmitare exDérience
La construction l~ul~is~u.l les éléments essentiels pour tester
l'utilisation du gène sat3 dans la sélection des plantes transgéniques a été
5 réalisée dans le vecteur pKl8 (Pridmore, 1987). Dans ce vecteur différents
r d~ d'ADN ont été clonés séq~nti~ m~nt. La ~U~ U~liUll flnale
porte le nom de pJBJ106. Seul le fragment Bg~l-Bgl[l (4,7 kb), essentiel dans
cette étude, est l.~ é (Fig. l). En partant de la gauche vers la droite,
entre les sites Bglll et Clal, se trouve un fragment Bglll-Dral qui cûuvre la
l0 partie gauche du T-DNA de pRi2659 (plasmide à .U.u.u~ c d'A. ~ ~e~
NCPPB2659 (Brevet et al., 1988)). Ce fragment issu de la digestion du
plasmide pMOA4 (Brevet et al., 1988) contient la bordure gauche du T-DNA de
pRi2659. Les sites Clal, Hindlll et EcoRV proviennent de la séquence à
clonage multiple (MCS) du plasmide Bluescript KS (Stratagene). La séquence
15 située entre Xmnl et Sstl contient la partie ~ , non traduite de la
nopaline synthase (nos-ter) isolée sous forme de fragment EcoRI-Sstl du
plasmide pBil21 (Clontech). Le site EcoRI qui a servi de site de clonage a
ensuite été digéré et rempli par l'enzyme Klenow pour donner naissance au
site Xmnl. Le fragment Kpnl-BamHI contient la séquence codante du gène
20 sat3. Ce fragment provient du plasmide pJBsat3 construit en clonant un
fragment Sspl-Hindll issu du plasmide plE928 (Tietze et al., 1989) au site
unique Smal de pK18 (Pridmore, 1987). Dans la construction pJBJ106, entre
le site BamHI et le Spel est contenue la séquence du promoteur 35S du CAMV
extrait du plasmide pBil21 (Clontech) à la suite d'une digestion Hindll-
25 BamHI. Le segment Spel-EcoRI, qui fait suite, consiste en la partie droite duT-DNA du plasmide pRi2659 issu du plasmide pMOA9 (Brevet et al., 1988). Ce
segment contient le gène entier de la synthèse de la cucumopine,
fonctionnel, ainsi que la bordure droite du T-DNA avec ses séquences
répétées (Hansen et al., 1992). La portion compAse entre EcoRI et Bglll est
30 une fraction du plasmide vecteur pK18. L'ensemble du fragment compris
entre les deux sites extrêmes Bglll à ensuite été ligaturé au segment Bglll-
Bglll de pBinl9 (Bevan, 1984) qui contient l'origine de réplication de ce
plasmide à large spectre d'hote déAvant du plasmide RK2 et qui possède
comme marqueur de sélection bactérienne le gene de résistance à la
35 kanamycine. Cette dernière construction porte le nom de pJBJ3~2.
. . .
~09s/27065 21 ~I 70 7 ~I/r~
Le plasmide pJBJ302~ a été introduit dans une souche
d'A. I~ w possédant le plasmide à matLnopine pRi8196 (Chilton et al.,
1982) par éle~llul~u.dLion et lw cellules Ll~ul~[ullllLCS ont été sélectionnées
sur milieu riche gélosé ~ itinnn~ de ~dlldllly~ille (Km) à 100 mg/l. Les
s ll~ul~rulllldll~ ont été repiqués sur milieu synthétique gélosé ~f~ijtionn~ delU~Ul~ opille comme seule source de carbone et de kanamycine (100 mg/1).
Un clone a été sélectionné et son contenu plasmidique a été vérifié par
électrophorèse en gel d'agarose, après une mini-extraction (sur 5 ml de
culture d'une nuit à 28 en milieu riche supplémenté en Km) selon la
méthode Kado (Kadp et Liu, 1981) mais réalisée à 37 pour l~lillh~ el des
cassures du plasmide 3~i. Ce plasmide pRi8196 sert a la fois comme donneur
de T-DNA induisant la formation de rddnes de type Uhairy root", et fournit
les fonctions VlRs nLCCD~dil.~. au mnsfert du T-DNA construit porté par le
vecteur binaire. Une bactérie portant ces deux plasmides ewt capable,
lorsqu'elle est inoculée à une plante, de ~JlU~Cl~Uèl la lirrél~:llcid~ion de
rddnes rlrlllhl~mrnt ~.~ul~rullllc~s, contenant à la fois le T-DNA de Uhairy
root" et celui d'intérêt porté par le second plasmide. Ce clone a servi à
inocule} des disques de carotte (Petit et al., 1983). Après deux à trois
semaines des rdcines de type Uhairy root~ d,UL~dldi~llL. Elles ont été
excisées du disque de carotte et mises en culture à 25- à l'obscurité sur du
milieu MS saccharose (à 3û g/l) (Murashige et Skoog, 1962) gélosé ne
Cull~lldlll pas d'hormone de croissance mais additionné de céphalosporine
(250 mg/l) pour inhiber toute .lU;SSdllCt: bactérienne. Sur ce milieu, les
rdcines ont une .lui~dllce de 2 à 5 mm en 24 heures et ellew présentent de
nombreuses ramifiration~ On sait que ces racines constituent des clones
cellulaires (David et al., 1984). Dw racines (1,5 cm environ de longueur) ont
été Llcul~luldull~es sur milieu MS ~--c.lldlu~e solide afiflitit~nn!5 ou non de
~LI~utullllicine (100 mg/l). Les racines ne contenant que le T-DNA de
pRi8196 ont montré une faible croissance en 24 heures et se sont arrêtées de
pousser. Replacées sur du milieu dépourvu de streptothricine leur
croissance n'a pas repris, montrarlt l'effet irréversible de l'antibiotique.
Par contre, certaines racines ont montré une croissance importante aussi
bien sur milieu additionné de streptothricine que dépourvu de cet
antibiotique. Ces racines ont été considérées comme ayant intégré l~
- 35 construction contenarlt le gène sad. Prdtiquement 70 % à 80 % des rdcines
se sont révélées capables de pousser en présence de ~LIt:llluLllli-ille. Ce
résultat est en bon accord avec des observations précédemment décritew
(Petit et al., 1986).
Wo sst27065 2 1 8 7 1 7 ~ r~lr~
8 .
Pour vérifie} que les racines poussant en présence de
icine contenaient bien la construction, des analyses, par
électrophorèse sur papier, du contenu en opines des racines, ont été
réaiisées (Petit et al., 1986). Les racines incapables de pousser sur la
S ~.eL,~,Ll.licine ne ~.,.lr~ .t que la ~ o~ e, marqueur du T-DNA de
pRi8106, alors que toutes les racmes capables de pousser sur ~le~ e
(20 racines in-l~r~nrl~ntes analysées) r,~lr., i~--t à la fois de la matmopineêt dê la cllrl~mr)rine, cette dernière étant un marqueur contenu dans la
construction. Ce résultat indique que les racinês résistantes à la
10 ~ ille ont intégré la construction. Pour confirmer que ces racines
synthétisant de la cucumopine Fr~ nt bien le gène sat3, une analyse
d'ADN génomique e~trait des racines a été ellllelJIiSe par la technique de
PCR ("Polymerase Chain Reaction~). Deux oligonucléotides ont été
synthétisés. L'un de 20 bases possède la séquence 5'-
TCAATGCGTGAATTGGTCAT-3' située à la position 233-252 sur la séquence,
I'autre de 18 bases posséde la séquence 5'-GGATGCAGGCCACGATAC-3' située à
la position 720-703 sur la séquence. L'utilisation de ces r li~- "~..rl~ ~ ~ides dans
une réaction PCR permet d'amplifier une séquence d'ADN de 488 paires de
base couvrant la presque totalité du gène sat3 qui peut être mis en évidence
20 après une éle~LIu~llul.~;, du mélange soumis à la réaction de PCR, sur gel
d'agarose. L'ADN génomique de racine a été extrait en broyant 1 cm de
racine dans 0,1 ml d'eau distillée stérile dans des tubes de type Eppendorf et
les tubes ont été incubés 5 minutes dans un bain marie bouillant. Après
centrifugation 1 1ll de surnageant a été ajouté à 50 ~11 du mélange
25 réactionnel classique pour PCR L'ADN recherché a été amplifié au cours de
30 cycles (1 cycle comprend les ill~ubdlil,lls suivantes: 1 min. à 94, 1 min à
55 et 1,5 min à 72'). Les résultats ont montré que seuls les ADNs
génomiques extraits de racmes synthétisant de la cucumopine, pclllle~ldiellt
d'obtenir l'z~nrlifir~tir1n d'un fragment de 488 paires de base c~,llrlllll~ll la
30 présence du gène sat3.
En ~rl,.rl"~: .", les racines capables de pousser sur 100 mgA de
~LIel~u~lllicil~e se sont révélées être des racines réellement transformées
par la construction.
EYr~mnle 2
35 Deuxi~me ~V..i.ll~e
Le plasmide p~BJ302 a=été introduit dans la souche d'A.
t~nPf~rirn.~ LBA4404 contenant le plasmide pA14404 (Ooms et al., 1982). Ce
plasmide désarmé fournit les fonctions VlRs l~éC~ ,diles au transfert de tout
_ _ _ . _ .. _ .. .... .
~;9~2706s ~187170 9 . llrl ~. -
T-DNA. Ies bactéries transformées ont été sélectionnées sur milieu riche
gélosé additionné de kanamycine. Les clones obtenus onl été analysés
comme dans la première t~ é~ ce et un clone s~lPrtirnnr' a été utilisé
pour inoculer des disques foliaires de Nicotiana tabacum va.. Xanthi selon la
méthode de Horsch et al., 1985. 24 heures après l'in-~c~ ti-~n, les disques ont
été lldl.~rél~.. sur du milieu solide MS ~ririitiC~nné de 6-benzyl-~uillc~lulil-e
(BAP) (1 mg/l), d'acide acétique-naphtalène (NAA) (0,1 mg/l), de
céphalosporine (250 mg/l) et de ~LIel~Iu~llli~ille (100 mg/l) pour obtenir des
plantules issues des cellules Lldll~[Ullll~.~S. Après quatre semaines des
plantules sont apparues. Elles ont été ~ "~ sur milieu MS contenamt
de la streptothricine. Leurs racines se sont développées. Après trois
semaines, les plantes ont été bouturées indiviri~ lipm~qnt sur du milieu MS
solide en pot Magenta pour obtenir un développement des plantes. Un
disque de feuille d'un centimètre de diamètre a été prélevé sur chaque
plante afin de rechercher son contenu en cucumopine par électrophorèse
(Petit et al., 1986). Sur 50 plantes analysées, 46 ont nettement montré la
présence de ~uculllu,uille, ce qui représente un ~UU~ dg~: de 92 %. Les
quatre plantes a~udl~'lllll~llt négatives peuvent représenter des faux
positifs ou des plantes dans lesquelles la cucumopine synthase est tr~p
pihlPment exprimée. De toute façon, une plU,UUl~iUII de 10 % de plantes
r~ " positives serait ,u~rdi~ acceptable et refléterait ce qui est
souvent observé avec la plupart des marqueurs de sélection utilisés pour
sélectionner des tissus transformés. Pour confirmer que les plantes
contenant de la ~u~uluuL)ille avaient ~ lPm~nr intégré le gène sat3, leur
ADN génomique a été extrait (Edwards et al., 1991) et analysé par la
technique de PCR comme dans la première e7~périence. L'ADN extrait de
tabac normal ne donne aucun signal alors qu'avec les ADNs extraits de
plantes synthétisant de la cucumopine, il a toujours été trouvé
l-,.,""l,ri.,.,;.". d'un fragment d'ADN de 488 paires de base, Cullrilllldllt laprésence du gene sat3.
~ )rl"~ , la sélection de tabacs transgéniques en utilisant
le marqueur de sélection sat3 s'est révélée très efficace dans au moins 90 %
- des cas.
E~r~mnle 3
- 35 Trr~ici~mP Exoérience
La souche d'A. i~umefaciens utilisée dans la seconde expérience
(souche LBA4404 .ull~ell~.llt le plasmide pJBJ302) a été utilisée pour
clll.er des racines d'Arabidops~s thaliaJ~a selon la méthode de
Wo 9512706s 218 ~ 0 ~ r~
Valvekens et al., (1988) mais en utilisant de la ~lleyLoLllli.iule comme agent
sélectif à la place de la kanamycine. Deux concentrations d'antibiotique,
25 mg/l et 40 mg/l, ont été testées en parallèle. Après trois semaines, les
plantules vertes sont apparues et ont été transplantées sur milieu GM
(Vanvekens et al., 1988) ~uyy~ ellLé en ~LI.~uLll~iCme (75 OU 40 mg/l)
pour leur permettre de se développer individ~ llPm(-nt L'analyse du
contenu en opine de ces plantules a été entreprise. Sur 10 plantules ayant
pousse sur 25 mg/l de streptothricine, 5 ont montré la présence de
cucumopine alors que 1~ sur 15 plantules ayant poussé sur 40 mg/l
d'antibiotique, se sont révélées contenir de la cucumopine. Ce résultat
souligne lilupc,lLdll.e d'utiliser une Cull.ell~ldlion d'antibiotique optimale
pour obtenir une haute probabilité de s~ tir~nn~r uniquement ou au moins
majoritairement, des plantes Lldll~ulllleés. Avec 40 mg/l de ~LIey~u~lllicine,
93 % des plantes obtenues avaient intégré la CUII~Ll U~Livll. Pour vérifier que
ces plantes pocc~5~lqiPnt bien le gène sat3, leur ADN génomique a été extrait
et a servi de matrice dans des réactions de PCR comme dans la première
expérience. L'ADN de toutes les plantes synth~ticqnt de la cucumopine a
permis d'amplifier le fragment d'ADN type du gène sat3 de 488 paires de
base alors que l'ADN des plantes non tr~nsformées n'a donné aucun signal.
Ces résultats confirment qu'il est important de détermmer la
COn~ellLldLiul~ optimale de ~LI~I~IuLlllicine pour chaque type de cellules que
l'on veut lldll~rullll~l et qu'il est possible d'utiliser, dans ces conditions, le
gène sat3 pour sélectionner des tissus transformés avec une haute
fréquence.
FYf-mnle 4
Ouatri~me e~"é~ e
Des disques foliaires d'un centimètre de diamètre, découpés
st-~rilf m~nt à l~aide d~un emporte-pièce m~tqlliqtle, ont été prélevés soit surdes tabacs normaux, soit sur des tabacs transformés par le gène sat3, cultivés
in vitro. Ces disques ont été placés dans des boîtes de Pétri contenant du
milieu ~S~0 gélosé supplémenté en NAA (1 g/l) pour induire la formation
de racines. Un lot de boites de Pétri avait été q~l~itionn~5 de streptothricine
(100 mg/l). Les disques foliaires ont été incubés à ~4 sous 16 heures de
lumière par jour. Après quinze jours des racines sont apparues à partir des
disques de tabacs normaux et transgéniques sur le milieu dépourvu de
~LleyluLllli~ille~ Par contre sur le milieu contenant l'antibiotique, seuls les
~ogsn706s ~7f 7a 11 r~r~
disques de tabacs tr~nC~niq~l~c ont donné naissance à des racines alors que
les disques de tabacs normaux ne pr~ePnr~ nt aucun développement
cellulaire ou racinaire.
Ce résultat montre que l'expression de la résistance à la
5 bLI~LulllliCine se maintient au cours du dcv~lv,u,u~...~.l de la plante et qu'il
est tre~ aisé de faire, a postériori, la flictjnrtjon entre des plantes contenant
le gène sat3 et celles qui en sont dépourvues.
Fr~ennr~, 5
Cellules de levure et cellules de 111~1~11111irrl~o
lû D'autres eApériences ayant pour objet de vérifier l'efficacité
du gène sat3 pour la sélection de cellules ll~ ru..l.ées de la levure
.Srhi7oQ~charomyces pombe ont été entreprises, suivant un protocole
classique de Lldl.brc....dLiu-l avec la constructlon décrite dans la figure
annexée dans laquelle le gène sat3 est placé sous le contrôle du promoteur
15 de l'ARN 35S du virus de la mosaique du chou-fleur, dont on sait qu'il est
actif dans cette levure. Ces eA,uéli~uces ont permis de montrer l'efficacité
du gène sat3 dans Schlzosaccharomyces pombe. La lld~bru~ udliOn a été
réalisée en utilisant la technique de lto et al (1983).
Pour une utilisation dans les cellules animales, le gène de
20 résistance à la OLIc,uLuLllli~ille peut être placé sous le contrOle de prom~teur
permettant une t:A~Ul~:ooiUII ~ '.UiLdil~: comme celui des gènes précoses du
cytomegalo virus humain (CMV) (utilisé dans les eA~cli~..ccs décrites), du
virus SV40 ou du virus du sarcome de Rous (RSV). Il peut tout aussi bien être
placé sous le controle du ~UIUIIIUlt:UI d'un gène ne s~A~JlillldUlL que dams un
25 type cellulaire donné. Des expériences ont été réalisées avec une
.UIlbLl U.Liull où le gène Sat3 a été placé sous le contrôle du promoteur CMV
Des cellules UldLUlUdil~o de souris HC11 et des cellules d'o~aire de hamster
CHO ont été ~I~lOrul~..c~ avec cette construction par la technique des
liposomes décrite par Felgner et al. (1987). Dans les deux cas il a été possible30 d'obtenir un grand nombre de clones transformés par sélection en
présence de bLI~LuLllli~ille.
Ces expériences montrent que le gène sat3 peut etre utilisé
pour s.5lf~rtinnnf~r des cellules transformées de levures et de l"d uulir~l~S.
Le but de cette expérience est de vérifier que le gène sat3 est
utilisable pour piéger des prclmoteurs de plantes. La stratégie développée est
W09!;127065 2187170 ~ r~llr~5l~
basée sur celle décrite dullcliLu~ (Koncz et al., 1989), où le gène
aph(3')11 (aminoglycoside phosph-l~d~ II) a été utilisé comme
marqueur de sélection. Le principe de la stratégie est de placer le gène sat3,
dépourvu de promoteur, entre les bordures d'un T-DNA d 'Agrobacterium
.1, ~-g~. O, le codon ATG de début de traduction du gène de sélection étant
placé en j ,~ irn avec l'extrémité interne de la bordure droite du T-
DNA. Si l'iu~ dLiull de ce T-DNA dans le génome végétal se fait dans une
région promotrice, le gène sar3 sera ex.primé. Les cellules ~I~lOrùlul~.O
acquerront la résistance à la S~ u~ icille et elles seules pourront
régénérer des plantules en présence de l'antibiotique. Pour tester
l'hypothèse, la construction du plasmide pJBJ332 a été réalisée. Seule la
partie essentielle est l.~ e (Fig. 2), le reste du plasmide n'est autre
que la partie réplicon du type pBinl9 (Bevan, 1984), comme dans le cas du
plasmide pJBJ302 utilisé dans les expériences précédentes. En lisant la
figure 2 de la gauche vers la droite, on trouve le segment d'ADN Bg~l~-C~al,
qui contient la bordure gauche du T-DNA du plasmide pRi2659. Il est issu du
plasmide pJBJ106 préC~5riPmm~nt décrit (Fig. 1). Le segment compris entre
HindIII et EcoRI n'est autre que le site multiple de clonage (MCS) provenant
du plasmide pUC19 (Yanisch-Perron et al. 1985). La région comprise entre
EcoRI et Xho~ contient la partie Irl ,i ,~ non traduite de la nopaline
synthase (nos-ter), le gène sat3, dépourvu du ~JIUIIIU~UI auquel a été ajouté
un site Xho~ juste en amont de l'ATG du debut de traduction. La région de
droite Xho~-Bg~ l contient la bordure droite du T-DNA du plasmide pRi2659.
Dans le plasmide pJBJ332, au site EcoRI, a été cloné le plasmide pUC18
(Yanish-Perron et al., 1985) pour donner la ulloLluLLiol~ pJBJ333 (Fig. 2).
pJBJ333 est un plasmide à large spectre d'hôte qui a été
introduit, par éle.~lu~ uldliul1, dans la souche d'A. rumefac~ens LBA4404
contenant le plasmide Vir pAL4404 (Ooms et al., 1982). Les bactéries
transformées ont été s~lrrtir,nn~rc sur un milieu riche gélosé en présence
de Kanamycine. Les clones obtenus ont été analysés pour leur contenu
pldO~i-liu,ue et un clone a été retenu pour la suite de l'rxl~n-~nre ll a servi
à infecter 200 disques foliaires de tabacs. La l~ iull et la sélection des
plantules ~I~.llOrul ulées ont été conduites comme dans la deuxième
expérience décrite pr~cé~l~mment Après 8 semaines, 13 plantules bien
3~ d~i~KJ~ c~o sont apparues parmi de très nombreuses petites plantules à
développement très faible. ~lles ont été repiquées sur milieu MS sans
antibiotique pour leur permettre un ~ ,. ,t rapide. Des disques
~0 95/27065 21 8 ~ ~ 7 ~ 13 I ~ l /rl l '
foliaires ont été prélevés pour extraire l'ADN génomigue (~idwards et al.,
1991) et urle analyse par la technique PCR a été entreprise comme dans la
première ~Ay;~ ce. Neu. plantes ont donné un signal PCR qui ~u~ ulld
à 1'~ " attendue du gène sat3.
S Pour vérifier que le gène sat3 est transcrit dans les plantes
5~ ctionn~ ARN total a été extrait à partir de 200 mg de feuille
(Tf)l~Tn~nn et al. 1987) et traité par une digestion à la DNasel Rnase Free
tPlldlula~id) pour éliminer toute trace d'ADN. Des ADNs rnmrll ".~..l,.;,~5
(cDNA) des ARNs Ill~ d~;el~t ont été synti~_:isés in vitro à partir de 1 ~-g
10 d'ARN total, en utilisant une amorce de poiy dT et le Kit de Boehringer
appelé "First strand cDNA synthesis". Une fraction du milieu l~:a.~io~ el a
été utilisée comme matrice dans une réaction PCR en utilisant les deux
oligonucléotides décrits L~lé~ nt pour l'amplification du gène sat3.
Cette méthode de recherche d'ARN trdnscrits porte le nom abrégé de RT-
15 PCR. Les neuf plantes sélectionnées précédemment ont donné une:Imrlifi~tion du fragment d'ADN typique du gène sat3 alors que les plantes
jugées négatives n'ont donné aucun signal d'ADN.
Afin de vérifier que les plantes transformées ~:Ayliu~ai~lll la
résistance à la Streptothricine, les 13 plantes ~ livllllccs au cours de la
20 première étape ont été bouturées in vitro sur du milieu gélosé MS20
contenant l'antibiotique. Seules les plantes II~UI~rU1IIIé~ ont développé des
racines en présence de l'agent sélectif, dans un laps de temps de huit jours.
La conclusion de cette expérience est que le gène sat3
dépourvu de ~ loL~:ul, placé en j~ -,. avec la bordure droite d'un T-
25 DNA, peut être eAprimé par un yluuuul~:ul de plante à la suite de sonilllé~ldli~,ll dans le génome végétal et constitue un marqueur utilisable
pour pièger un tel promoteur. Par ailleurs, la construction utilisée pJBJ333,
contient entre les deux bordures, I'origine de réplication du plasmide pUC18
et le gène de résistance à l'Ampicilline. Cette structure doit permettre de
30 cloner dans E coli, le segment d'ADN végétal contenant le site d'iul~é~,ldlio tel qu'il a été proposé par Koncz et al., (1989).
~17~
W0 95/27065 1 4 r~ r~ 5 ~ ~ '
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFOR~ATIONS GENEP~ALES:
i ) DE POSANT:
A I NOM: LVMH RECHERCHE
B RUE: 25 RUE DES PEUPLIERS
C I VILLE: NANTERRE
E I PAYS: FRANCE
Fl CODE POSTAL: 92000
ii) TITRE DE L' INVENTION: PROCEDE DE SELECTION DE CELLVLES EUCARYOTES
TRANSFORMEES ET CELLULES OBTENUES
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE A~Tr~RTr~rlRF:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 94 03969
(B) DATE DE DEPOT: 05-APR-1994
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1074 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: n~
(ii) TYPE DE UOLECULE: ADN (génomique)
(iv) ANTI-SENS: OUI
( i x ) CARACTERIS T I QUE:
(A) NOMtCLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:221..~63
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CTGCAGGAGC A~.AA(~At~r~T AQTCTGGAA GCAAAGCCAG GAAAGCGGCC TATGGAGCTG 60
TGCGGQGCG CTCAGTAGGC AATTTTTCAA AATATTGTTA AGCCTTTTCT GAGQTGGTA 120
TTTTTCATGG QTTGCTATG ATTTATTTTT TA~AACTATT GAAAATAAAG AAAATTATTA 180
TATTATTTAT AATAAAGGTC TGTGACAAGG AATCCCCGTC ATG ACG CCA CAG TCA 235
Met Thr Pro Gln Se5r
ATG CGT GAA TTG GTC ATC TGT CGT GCA AGC GAT GCC GAC GTT CTT QG 283
Met Arg Glu Leu Val Ile Cys Arg Ala Ser Asp Ala Asp Val Leu Gln
10 15 20
CTT GCG CGG TGC GAT TTC TCT TTC GAG GTC ACA GCT GAG CTC GAA GAG 331
Leu Ala Arg Cys Asp Phe Ser Phe Glu Val Thr Ala Glu Leu Glu Glu
~j~095127065 21~170 15 E~.l/rl~
CCG TTC GAT GAC ATG CGG TCC GTT CCA GTC AAG CCG CCC TAC CTC AAG 37 9
Pro Phe Asp Asp Met Arg Ser Val Pro Val Lys Pro Pro Tyr Leu Lys
40 45 50
AAC TAT GGC TTT GAT GCC GAT GAG TTG GTC GAG CAT ATG AAC AAC TCT 427
Asn Tyr Gly Phe Asp Ala Asp Glu Leu Val Glu His Met Asn Asn Ser
55 60 65
GCT GGG GCG TTG TTT GTG GCT CGG GCG GAC AAT TGC CTT GTT GGC TAC 475
Ala Gly Ala Leu Phe Val Ala Arg Ala Asp Asn Cys Leu Val Gly Tyr
70 75 80 85
TTG GCC GTG TCT CAA AGC TGG AAC GAA TAT GCC GTC ATC GAT GAT ATC 523
Leu Ala Val Ser Gln Ser Trp Asn Glu Tyr Ala Val Ile Asp Asp Ile
90 95 100
GCG GTC GAT GTG CCC TAT CGG GGG AGT GGC GTT TCG CGC TTG CTG ATG 571
Ala Val Asp Val Pro Tyr Arg Gly Ser Gly Val Ser Arg Leu Leu Met
105 110 115
GAT GCA GCT GTG GAC TGG GCA CGA AAT GTG CCG TCG GCA GGC GTA CGT 619
Asp Ala Ala Val Asp Trp Ala Arg Asn Val Pro Ser Ala Gly Val Arg
120 125 130
CTG GAG ACG CAG TCC GTT AAT CTC GCC GCA TGT CGC TTT TAC CGA CGA 667
Leu Glu Thr Gln Ser Val Asn Leu Ala Ala Cys Arg Phe Tyr Arg Arg
135 140 145
TAC GGT TTC CGG TTA GGT GGT TAT GAT CGC TAC CTG TAT CGT GGC CTG 715
Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Arg Tyr Leu Tyr Arg Gly Leu
150 155 160 165
QT CCG GGC AGC CGA GAG GTA GCT CTG TTC TGG TAT TTG AGT TTT TAA 7 63
His Pro Gly Ser Arg Glu Val Ala Leu Phe Trp Tyr Leu Ser Phe
170 175 180
ATGACAAACT ll~ UUblU~ Gr~rAAArr~r~ ACTCGGCCAG ATGAGCGGAG TTATGAATGA 823
GTGAGTGGCG ArrAr~r~rAA GTCTGTGCAC CTATTCCCAT GCCTGCGAGC ATGGCAACCA 883
GTCTGGAAGG ATACCAATGG GCGCCTATCA CAATTGGTGA ATCCGGCAGC AATGTTTATC 943
GACTTTATGG r.~AArrAA~ ~,Ul~ TGTTTTTGAA Grr~ArrTAAr~ TACGACGTTG 1003
CTGATGATGT GACCGATGAA ATGGTCAGGC TACGCTGGCT TGCCGAACGT ATCCCTGTGC 1063
CAACCGTCGT C 1074
(2) INFORI~ATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
i) rAR~r~ UI;~ DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 181 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
- (D) CONFIGURATION: linéair~a
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQ~IENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Thr Pro Gln Ser Met Arg Glu Leu Val Ile Cys Arg Ala Ser Asp
l87l7a
W0 95127065 2 6 ~ /r
la Asp Val Leu Gln Leu Ala Arg Cys Asp Phe Ser Phe Glu Val Thr
20 25 , 3à
la Glu Leu Glu Glu Pro Phe Asp Asp Met Arg Ser Val Pro Val Lys
35 40 45
Pro Pro Tyr Leu Lys Asn Tyr Gly Phe Asp Ala Asp Glu Leu Val Glu
50 55 60
His Met Asn Asn Ser Ala Gly Ala Leu Phe Val Ala Arg Ala Asp Asn
65 70 75 80
y9 Leu Val Gly Tyr Leu Ala Val Ser Gln Ser Trp Asn Glu Tyr Ala
85 90 95
al Ile Asp Asp Ile Ala Val Asp Val Pro Tyr Arg Gly Ser Gly Val
100 105 110
Ser Arg Leu Leu ~et Asp Ala Ala Val Asp Trp Ala Arg Asn Val Pro
115 120 125
Ser Ala Gly Val Arg Leu Glu Thr Gln Ser Val Asn Leu Ala Ala Cys
130 135 140
Arg Phe Tyr Arg Arg Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Gly Tyr Asp Arg Tyr
145 150 155 160
eu Tyr Arg Gly Leu His Pro Gly Ser Arg Glu Val Ala Leu Phe Tr
165 170 175
yr Leu Ser Phe
180
r ~ rl_ .
~j95/27065 218717~ 17
REFERENCES
- Bevan M. (1984). Nucl. Acids Res. 12:8711-8721.
5 - Brevet J., Borowski D. et Tempé J. (1988). Mol. Pl~nt-Microbe Inter.
1:75-79.
- Carter H.R., Hearn W.R., Lansford E.M., Page A.C., Salzmann N.F.,
Shapiro D. et Taylor W.R (1~52). ~. Amer. Chem. Soc. 74: 3704-3707.
;, ,,
- Chilton M.D., Tepfer D.A., Petit A. David C., Cass~Delbart F., Tempé J.
(1982) Nature 295:432434
David C., Chilton M.D. et Tem~ - J. (1984). Bivl~ I"~ / 2:73-76.
- Edwards K., Johnstone C. et Thompson C. (1991) Nucl. Acids Res.
l9:pl349.
- Felgner P.L, Gradek T.R., Holm M., Roman R., Chan H.W., Wanz M.,
~orthrop J.P., Ringold G.M. et Danielsen M. (1987), Proc. Natl. Acad.
~s:iL~ 84: 7413-7417.
- Hansen G., Tempé J. et Brevet J. (1992) Plant Mol. Biol. 20:113-122.
- Heim U., Tietze E, Weschke W., Tschape H. et Wobus U. (1989) ~5;1~j~
Acis Res. I7:p7103.
- Horsch R., Rogers S. and Frdley R.T. (1985) Çold S~rin~ Harbor Svmn.
O.l~nt. ~ l 50:433437.
- Ito H., Fukuda Y., Murata K. et Kimura A. (1983) Tldll~r~lllld~iOn of
intact yeast cells treated with alkali cations, ~. Bacteriol. 153: 163-168.
- Kado C.l. et Liu S.T. (1981) 1. Bacteriol. 145:1365-1373.
- Khoklov A.S. et Shutova K.J. (1972) 1. Antihif~t. 25:501-508.
W09s/2706s 21g7I70 18~ r~
- Koncz C., Martini N., Mayerhofer R., Koncz-Kàlman Z., Korber H.,
Redei G.P. and Schell J. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8467-8471.
- Logemann J., Schell J. and Willmitzer L (1987) ~LLZ~j~h~m. 163:16-
20.
- Murashige T. et Sl;oog F. ( 1962) Phvsiol. Plant 15:473-497.
- Ooms G., Hooyi;aas P.J.J., Van Veen R.J.M., Van Beelen P., RCg.~1~1JU~
TuînkT.J.G. et Schilperoort R.A. (1982) Plasmid7:15-29.
- Petit A., BerlialofF A. et Tempé J. ( 1986) Mol. Gen. Genet. 202:388-393.
- Petit A., David C., Dahl G.A., Ellis J.G., Guyon P., Casse-Delbart ~. et
TempéJ. (1983) Mol. Gen. Genet. 190:20~214.
- Pridmore RD. ( 1987) Ç~ 56:309-312.
- rletze E et Brevet J. ( 1990) Nucleic Acids Res. 1 8:pl283.
- Tietze E, Brevet J., Tschape H. et Voigt E. (1988) T. Basic Microbiol.
28:129-136.
- Tietze E, Tschape H. et Voigt W. (1989) T. Basic Microbiol. 29:695-706.
- Tschape H., Tietze E, Prager R., Voigt W., Wolter E., et Seltmann G.
(1984) Plasmid 12:189-196.
- Valvel;ens D., Van Montagu M. et Van Lujseb~ ls M. (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:5536-5540.
- Yanisch-Perron C., Vieira J. and Messing J. (1985) Gene 33:103-119.
