Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
- 1 2 1 ~7406
Témoin de révélation de contaminants et procédé
d'application à la réalisation d'un antibiogramme
directement effectué sur prélèvement.
La présente invention concerne un procédé d'évaluation
"in vitro" de la sensibilité aux antibiotiques des germes
responsables d'une pathologie, procedé couramment désigné
sous le néologisme d'antibiogramme.
Elle vise également le témoin de révelation des
contaminants mis en oeuvre dans ce procédé destiné à
indiquer les limites d'incubation de l'antibiogramme appelé,
par conséquent, témoin limite d'incubation.
Pour le biologiste, le choix d'un antibiotique adapté au
traitement d'une infection dépend, pour une large part :
- de l'étude "in vitro" de la sensibilité de la bactérie
responsable de l'infection à divers agents antibactériens ou
antibiotiques (réalisée par un antibiogramme) ;
- des propriétés pharmacologues des antibiotiques (diffusion
dans le foyer infectieux, toxicité, etc...) et
- de l'état immunitaire du patient.
Le role du laboratoire est de déterminer "in vitro" les
concentrations d'antibiotiques nécessaires pour inhiber ou
tuer les bactéries. Dans la pratique médicale, le choix des
antibiotiques testés et des méthodes d'investigation mises
en oeuvre dépendra de l'espèce bactérienne isolée, de la
nature et de la gravité de l'état infectieux.
Dans des cas limités, il est possible de traiter une
infection sans faire d'antibiogramme, si les données
épidémiologiques permettent de suspecter la bactérie
probablement responsable, et si la résistance de cette
espèce évolue peu. Mais, dans le cas d'infections sévères ou
récidivantes et d'infections nosocomiales dues à des
bactéries fréquemment porteuses de résistances acquises
(staphylocoques, entérobactéries, etc...), l'évaluation "in
vitro" de la sensibilité des germes responsables est
indispensable, ainsi que dans de nombreuses infections :
bactériemies, méningites, infections urinaires non
compliquées, par exemple où la valeur prédictive de
- 2 - 21~7406
l'antibiogramme et de la~CMI (concentration minimale
inhibitrice) est nécessaire.
Pour définir la CMI, il doit être rappelé que l'action
d'un antibiotique consiste à atteindre une cible moléculaire
représentee par une étape précise du métabolisme bactérien.
Globalement, il en résulte des modifications de la
croissance (bactér;ostase) et de la capacité de survie
(bactéricidie) des bactéries, lorsque la concentration
d'antibiotique parvenant a leur contact est suffisante. La
détermination de cette concentration permet d'apprécier la
- sensiblité des bactéries isolées en clinique. Différentes
concentrations (ou points limites) définissent les effets
bactériostatique et bactéricide : la CMI (concentration
minimale inhibitrice) est la plus faible concentration
d'antibiotique inhibant toute croissance visible après un
temps d'incubation de 18 à 24 heures. C'est la référence
universellement utilisée pour caractériser l'activité d'un
antibiotique.
Par analogie avec la CMI, on définit arbitrairement la
CMB (concentration minimale bactéricide) qui est la
concentration d'antibiotique permettant d'obtenir après 18
heures de contact un taux de survivants inférieur ou égal à
0,01 % de l'inoculum initial.
L'activité "in vitro" d'un antibiotique est définie par
ses valeurs de CMI et CMB qui peuvent être modifiées par de
nombreux facteurs comme :
- 1/ La densité de l'inoculum ; en effet, plus l'inoculum
est dense, plus il peut y avoir des sortes différentes de
bactéries dont des bactéries inactivant l'antibiotique
provoquant des différences de CMI.
- 2/ Le temps, la température et l'atmosphère d'incubation ;
en effet, la durée d'incubation est également un facteur de
variabilité des CMI, qui peut dépendre de l'instabilité des
antibiotiques en solution et de la "recroissance" tardive
des bactéries persistantes. Une lecture après 16 à 18 heures
d'incubation à 37 degrés Celsius donne des résultats les
plus reproductibles.
- 3/ La nature du milieu de culture (constituant du milieu,
~ 3 ~ 21 8 74Uo
ions, pH).
Dans le but de palier à ce dernier facteur influençant
l'activite "in vitro" des antibiotiques, il a été comparé de
nombreux milieux de culture, parmi eux, celui de
Mueller-Hinton constitue le milieu universellement utilisé
pour déterminer l'activité "in vitro" des antibiotiques.
La reproductibilité des résultats implique donc une
standardisation des méthodes d'investigation.
Le biologiste dispose de plusieurs méthodes
standardisées pour évaluer l'activité antibactérienne des
antibiotiques et guider le choix thérapeutique. La plus
simple reste la détermination de la CMI ou son approximation
par une méthode d'antibiogramme automatisée.
Les méthodes d'étude de la CMI sont également utilisées
pour la réàlisation d'antibiogrammes. Elles s'effectuent
selon les principes de la microbiologie dominée par l'école
pasteurienne et consistent :
- à isoler sur la gélose, en premier lieu, la bactérie
responsable de la pathologie sur un milieu de culture
classique afin de se débarrasser notamment des contaminants
presents géneralement à des concentrations inférieures à
10 UFC/ml (Unité Formant Colonies/ml équivalent germe/ml)
qui sont ignorés sur la gélose et ainsi seules les bactéries
présentes à des concentrations supérieuresà103 UFC/ml sont
étudiées ;
- puis à tester la bacterie à une concentration donnée pour
réaliser l'antibiogramme dans un milieu de réaction de type
Mueller-Hinton selon les techniques couramment utilisées par
le biologiste, à savoir par :
- la diffusion en milieu gélosé décrite notamment dans
"ECCLS Standard for antimicrobial susceptibility testing by
diffusion methods" ECCLS, 1985, 5:4, ainsi que dans "Report
of an international collaborative study", Acta pathol.
Microbial. Scand, Sect B, 1971, Suppl. 217 : 1-90 par
Ericsson HM, Sherris JC ;
- ou la méthode par dilution décrite dans l'article
"NouvelLes approches de l'étude de sensibilite des bactéries
aux antibiotiques" de la Revue Francaise du Laboratoire,
~ 4 ~ 2 1 87 4 0 6
1986, 151 ; 7-12 ;
- ou l'antibiogramme automatisé décrit également dans le
document susmentionné.
En résumé, la méthode par diffusion en milieu gélosé
utilise pour la détermination de la sensibilité des
bactéries aux agents antimicrobiens et le dosage
microbiologique des antibiotiques, la propriété de diffusion
de l'antibiotique (dépôt en surface d'un disque de papier
buvard pré-imprégné) dans un milieu de culture gélose
(contenant une bactérie à tester), en réalisant un gradient
de concentration.
Après 3 à 4 heures, une zone d'inhibition peut être
déterminée correspondant à la distance que la concentration
inhibitrice d'antibiotique a pu parcourir avant que soit
atteinte une certaine densité bactérienne.
L'antibiogramme par diffusion en milieu gélosé, ou
méthode des disques, est un procédé largement répandu du
fait de sa simplicité et de son faible coût. Cependant, la
qualité des résultats peut varier en fonction de plusieurs
paramètres qui vont influer sur la constitution de la zone
d'inhibition. De sorte que pour une même souche bactérienne
de sensibilité à un antibiotique donné, des résultats
reproductibles ne sont obtenus que pour un inoculum, un
milieu et des conditions d'incubation identiques.
Pour un même antibiotique, des souches d'espèces
différentes avec des temps de latence (temps de latence
avant la croissance exponentielle des bactéries) et de
génération très différents mais une sensibilité identique,
donnent des zones d'inhibition très différentes. C'est
pourquoi, les bactéries qui présentent une importante
variabilite de souche a souche, liée au taux de croissance,
ne peuvent etre étudiées valablement dans les conditions
standardisées des tests de diffusion, qui s'appliquent aux
bactéries à croissance rapide (entérobactéries, staphyloco-
ques, etc.) pour lesquelles les temps critiques varient dans
des limites acceptables, influant peu sur la zone
d'inhibition.
D'autre part, la diffusion de l'antibiotique dans la
_ ~ 5 ~ 2187406
gélose n'est pas linéaire avec la concentration
d'antibiotique au niveau de la source.
Les recommandations préconisées doivent être
rigoureusement suivies pour garantir l'exactitude et la
reproductibilité des résultats par cette méthode. En France,
La méthode la plus utilisée répond aux normes édictées par
l'OMS présentées dans le 28ème rapport, de la série de
rapports techniques N, 610, OMS Genève, 1977, 106-138 du
Comité OMS d'Experts de la Standardisation biologique.
La composition du milieu de Mueller-Hinton est
standardisée, avec en particulier, un pH de 7,4, une
concentration adaptée en ions Mg++ et Ca++ , et une
concentration en thymidine inférieure à 50 ng/ml.
L'épaisseur de la gélose doit être de 4 mm. L'inoculum doit
être préparé, de préférence, à partir d'une culturé agitée
de 4 heures au bain marie, ajustée par dilution à 2-3 x 106
bactéries par ml (étalonnage photométrique). L'ensemencement
est réalisé par inondation avec quelques millilitres de
cette dilution.
Selon la méthode par dilution en milieu gélosé,
l'antibiotique requis par le traitement est détermine ainsi
que sa CMI en ensemençant 1 à 5 ~l de l'inoculum
correspondant à chaque bacterie testée (104 bactérie par
spot) dans un milieu liquéfié à 45 degrés Celsius contenant
chacun une concentration d'antibiotique précise.
La CMI est définie par la concentration d'antibiotique
ne laissant subsister aucune ou, au plus, 1 à 3 colonies
après 18 heures d'incubation à 37 degrés Celsius. Il s'agit
d'une méthode de référence permettant de tester
simultanément un grand nombre de souches (25 à 96 selon le
type d'inoculateur) vis-à-vis d'un même antibiotique.
Les méthodes de dilution en bouillon Mueller-Hinton sont
réalisées elles en tubes (macrométhode) ou en plaques de
microtitration (microméthode). Les microméthodes sont plus
adaptées à la pratique de l'antibiogramme, grâce à une
automatisation possible de la préparation des dilutions
d'antibiotiques et de la lecture des CMI. Elles permettent
la détermination ultérieure des CMB. Cependant, le
_ - 6 2187406
dénombrement des survivants après subculture est plus aisé
en macrométhode qu'en microméthode (un inoculum de 106
bactéries/ml représente 2 x 106 bactéries par tube de 2 ml
de milieu et 5 x 104 bactéries par cupule de 50 ~l), ce qui
peut expliquer une CMB plus élevée en macrométhode.
D'autre facteurs techniques peuvent influencer
l'évaluation de la CMB, comme l'adhésion des bactéries
survivantes aux parois des tubes ou des plaques de
microtitration, une agitation insuffisante avant réalisation
des subcultures, ou un phénomène de transfert d'antibiotique
sur le milieu de dénombrement lié a la prise d'une aliquote
de milieu trop importante (en macromethode, le volume
nécessaire aux subcultures ne doit pas dépasser 0,1 ml ; il
est de 5 à 10 ~l en microméthode).
D'autre part, il existe diverses méthodes
d'antibiogramme permettant une lecture automatisée des
résultats telles que décrites dans l'article "Nouvelles
approches de l'étude de sensibilité des bactéries aux
antibiotiques" de FLANDROIS JP, CARRET G, de la Revue
ZO française du Laboratoire, 1986, à savoir :
- Des systèmes utilisant deux concentrations d'antibiotiques
(ex : ABAC, API-ATB). Ils permettent de classer les
bactéries en catégories (sensible, intermédiaire, résistant)
par mesure de croissance bactérienne en présence des deux
concentrations critiques, haute et basse. La croissance aux
deux concentrations définit les souches résistantes,
l'absence de croissance les souches sensibles, la croissance
à la concentration critique basse les souches
"intermédiaires". La lecture photométrique du résultat est
effectuée à la 24ème heure de croissance.
- Des systèmes rapides (ex : AUTOBAC, COBAS-BACT, RAPID-ATB,
VITEK). Ils étudient la croissance bactérienne en présence
d'une seule concentration d'antibiotique (independante des
concentrations critiques), choisie pour permettre de
discriminer au mieux les populations en catégories S, I, R,
par référence aux CMI des germes. Ces systèmes automatisés
donnent des résultats en 3 à 6 heures.
Toutefois, les évaluations récentes des divers systèmes
~ 7 ~ 2 1 8 74 06
_
d'antibiogrammes automatisés montrent que la concordance
avec la CMI, méthode de référence, existe dans plus de 85 %
des cas. Ce pourcentage de concordance peut varier selon le
systéme, et les discordances observées sont surtout le fa;t
de certa;ns couples "bactérie-antibiotique" : staphylocoques
vis-à-vis de la méticilline, de l'érythromicine et de la
clindamycine ; entérocoques vis-à-vis de la céfalotine, de
la tétracycline et du chloramphénicol ; enterobacter
vis-à-vis de l'ampicilline, de la céfalotine et de la
tétracycline ; Klebsiella vis-3-vis de l'ampicilline ;
Serratia vis-à-vis des polymyxines ; Pseudomonas vis-à-vis
de la gentamicine et de l'amikacine. Ces discordances sont
liées à l'espèce étudiée et au mode d'action de
l'antibiotique. Ainsi, la croissance en micro-agglutinats,
la lyse tardive des bactéries par certains antibiotiques,
une recroissance tardive, un mécanisme de résistance
inductible à l'antibiotique, sont les causes les plus
fréquentes de discordances (faux sensibles et faux
résistants) dues au système de lecture automatique et au
temps de lecture (3-6 heures ou 24 heures). La difficulté de
détecter certains mécanismes de résistances aux
~-lactamines, aux aminosides et aux macrolides, en raison de
leur niveau ou de leur mode d'expression, constitue
également une source d'erreur.
Tous les systèmes automatisés permettent d'étudier la
sensibilité des seules bactéries non exigeantes et à
croissance rapide.
Au vu de la description des trois techniques
susmentionnées, antibiogramme par diffusion en milieu
gélosé, méthode par dilution, antibiogramme automatisé, il
s'avère que chacune d'elles nécessite, pour sa mise en
oeuvre, l'observance minutieuse d'un protocole (température,
temps d'incubation, etc.) et ne peut être généralisée à tout
type de bactérie.
Outre les inconvén;ents susment;onnés inhérents à chacun
des systèmes decr;ts ci-dessus, l'antibiogramme
conventionnel réalisé selon l'une quelconque de ces
techniques présente principalement les trois inconvénients
- 8 - 2 1 8 7406
majeurs su;vants découLant du-fait qu'elles ne tiennent pas
compte :
- de la pharmacologie particulière de chaque antibiotique ;
- de l'état immunitaire du patient au stade de l'infection
et/ou de la présence de corps étrangers ;
- des infections plurimicrobiennes ;
d'où il résulte des discordances entre les tests "in vitro"
(les résultats de l'antibiogramme) et la réponse au
traitement.
Le premier inconvénient est dû à l'utilisation d'un
milieu de réaction type Mueller-Hinton annulant complètement
l'effet du contexte culturel environnemental sur
l'antibiothérapie. Or, il est connu que l'affinité du germe
pour une humeur ou un tissu particulier n'est pas la meme
d'une humeur 3 l'autre, l'adhésivité bactérienne, donc le
pouvoir pathogène, varie en fonction de nombreux facteurs.
Face à cette multitude de sites anatomiques de nature
différente (urine, LCR, sang, muqueuse, ...) sur lesquels la
croissance bactérienne est variable, l'antibiogramme actuel
20, ne retient, pour l'expression de la sensibilité, qu'un
milieu polyvalent : le milieu de Mueller-Hinton. Ce milieu
très éloigné des conditions culturelles du germe donnant
l'infection en un site déterminé, ne rend pas compte de la
réelle activité de l'antibiotique dans-le site où a lieu
l'infection. C'est ainsi qu'un antibiotique à vocation
urinaire devrait etre étudié en milieu urinaire (effet du
pH, effet du NaCl, effet des ions, ...).
Certains pharmacologues ont montré que le Pseudomonas
présente vis-à-vis des quinolones, des CMI variant de 1 à
100 suivant que l'on utilisait un milieu Mueller-Hinton ou
un milieu à base d'urine.
Le deuxième inconvénient susmentionné est du au fait que
la bactérie, après avoir été isolée, est testée à une
concentation déterminée arbitraire. Or, il est connu que
suivant le site d'infection, l'état immunitaire du malade,
et suivant le stade de cette infection, la concentration du
germe responsable peut varier.
C'est ainsi que d'un germe/ml (cas des hémocultures dans
les fièvres thyphoides) les germes peuvent atteindre 104
germes/ml dans les prostatites, 106 dans les infections
-- - 9 - 2187406
urinaires et 108 dans les pus profonds et méningites
purulentes. IL va de soi comme on l'a déjà souligné, que le
résultat de l'antibiogramme dépend de cet effet inoculum.
Le troisième inconvénient susmentionné résulte de
l'isolement de la bactérie pathogène du prélèvement pour
réaliser l'antibiogramme. Ainsi on ne tient pas compte de la
présence de plusieurs bactéries sur le même site d'infection
qui peuvent présenter des interactions dont certaines sont
très connues, à savoir :
- 1/ Synergie entre différents germes (exemple de certains
écosystèmes) :
- association fuso-spirillaire dans l'angine de Vincent
(présence de Fusobacterium nucleatum et de spirochètes)
- mycoplasmes et anaérobies dans les vaginoses (par
effet pH).
- 2/ Antagonisme :
- Saccharomices cerivisiae et Clostridium difficile (par
compétition)
- Proteus mirabilis et Streptococcus faecalis (par effet
pH).
- Par les méthodes classiques d'antibiogramme, l'étude de
la sensibilite "in vitro" des antibiotiques pour des germes
d'une infection plurimicrobienne est alors forcément
différente de la réalité "in vivo", car les germes sont
testés isolément à partir de plusieurs colonies pures.
Autrement dit, l'étude de la sensibilité des
antibiotiques pour des germes d'une infection
plurimicrobienne sera forcément différente si les germes
sont étudiés simultanément dans le meme milieu
(antibiogramme effectué directement sur l'écouvillon) ou si
les germes sont testés isolément à partir de plusieurs
colonies pures (antibiogramme conventionnel). Pour ces
raisons, il semble évidemment préférable d'effectuer une
étude de sensibilité, aux antibiotiques directement à partir
de l'écouvillon dans un milieu qui pourra exprimer pour un
ant;biotique donné la synergie ou l'antagonisme des
differentes bactéries présentes dans le prélèvement
plurimicrobien.
- 2 1 ~37406
Toutefois, malgré cette év;dence, il n'existe pas de
technique fiable d'antibiogramme directement sur le
prélèvement.
Par ailleurs, la lecture interprétative de
l'antibiogramme conventionnel conditionne également les
chances de succès thérapeutique. Il faut savoir "lire entre
les lignes" d'un antibiogramme et déceler un méc.anisme de
résistance qui ne s'exprime que faiblement "in vitro", mais
qui est inscrit dans l'ADN bactérien et peut entra;ner une
mauvaise réponse du traitement. Ceci implique une
connaissance rigoureuse de ces mécanismes et des phénotypes
qu'ils entra;nent. Cette connaissance ne doit pas rester
l'apanage de quelques spécialistes, il est probable que dans
un proche avenir, le développement de systèmes experts
contribuera à une meilleure validation des techniques
d'antibiogramme.
Un objet de l'invention est donc de remédier aux
inconvénients des antibiogrammes classiques ou
conventionnels en testant la croissance (qui se visualise
par une zone trouble) ou l'absence de croissance des
bactéries pathogènes prélévées directement du milieu infecté
à traiter et inoculées dans des milieux contenant chacun un
antibiotique différent présent à une concentration égale à
sa CMI.
Selon le procédé de l'invention, ce but est atteint
grâce au fait que l'évaluation de la sensibilité du
prélèvement aux différents antibiotiques (ou antibiogramme)
s'opère en présence d'un témoin de révélation des
contaminants, appelé témoin limite d'incubation.
Ce témoin de limite d'incubation comprend au moins une
souche ou catégorie de bactéries classiquement contaminantes
sous forme déshydratée, et qui,une fois régénérée,sera
présente à un taux de 10 UFC/ml maximum, ledit témoin de
limite d'incubation comprenant également un milieu utilisé
pour la déshydratation de la ou desdites bactérie(s)
contaminante(s) comprenant un substrat déterminé en fonction
de cette ou de ces dernières et un indicateur de croissance,
de préférence constitué par un indicateur de virage de pH.
'~ 2 1 8 7 4 0 6
Selon une variante de réalisation, le substrat et
l'indicateur de croissance tel que, par exemple,
l'indicateur de virage de pH sont contenus dans le milieu de
rehydratation ou régénération de la ou desdites bactérie(s)
contaminante(s).
L'utilisation du témoin limite d'incubation (ou TLI)
pour la réalisation d'antibiogramme effectué directement sur
le prélèvement permet de détecter précisément le moment où
les contaminants présents dans ce témoin (en général
également présents à des concentrations inférieures ou
égales a 103 UFC/ml dans le prélèvement) poussent en créant
une modification dudit témoin TLI (virage d'un indicateur
coloré, apparition d'un trouble ou variéte de l'activité
ATPéasique).
A ce moment précis, la lecture de l'antibiogramme doit
etre stoppée car la croissance révélée par ce dernier ne
correspond plus uniquement à celle des bactéries pathogènes
mais egalement à celle des contaminants présents dans ledit
prélèvement ce qui fausse les résultats de l'antibiogramme.
Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, ce
moment précis est signalé et visualisé, de préférence, par
le virement d'un indicateur coloré agissant comme révélateur
de la croissance des bactéries contaminantes.
Grace au fait que la croissance des contaminants est
dépendante de la température du milieu, l'antibiogramme peut
alors s'effectuer à plusieurs vitesses en jouant sur la
température.
L'antibiogramme selon l'invention, réalisé directement
sur le prélèvement procure notamment les avantages
suivants :
- de donner, et c'est un avantage majeur, des resultats "in
vitro" plus en accord avec la réalité "in vivo" car
- il garantit d'avoir dans le milieu de culture des
eléments culturels venant du prélèvement lui-meme, à la
différence de l'antibiogramme conventionnel effectué à
partir d'une colonie pure ;
- il tient compte de l'effet inoculum ; en effet, le
milieu inocule et testé envers différents antibiotiques
- 12 - 21 874!J6
comporte les concentrations et proportions de
micro-organismes présents dans le site infecté et la
réponse aux antibiotiques a été obtenue dans des
conditions comparables à celles du milieu naturel
infecté et non plus à une concentration arbitraire ;
- il tient compte des intéractions bactériennes
existantes dans le cadre des infections
plurimicrobiennes ; l'étude de sensibilité aux
antibiotiques directement à partir du prélèvement se
fait en effet dans un milieu qui peut exprimer pour un
antibiotique donné la synergie ou l'antagonisme des
différentes bactéries présentes dans le prélèvement
plurimicrobien, ce qui n'est pas possible dans le
mil;eu type Mueller-Hinton, dans lequel seule la
bactérie isolée est testee.
- d'être rapide et facile a mettre en oeuvre ; en effet, les
étapes d'isolation de la bactérie pathogène sont supprimées
et les conditions expérimentales de l'antibiogramme sont
simplifiées (températures variables, temps variable... ;
- d'être d'une lecture facile.
Les buts, caractéristiques et avantages ci-dessus et
d'autres encore ressortiront mieux de la description qui
suit dans laquelle des exemples non limitatifs de
composition du témoin limite d'incubation sont décrits ainsi
que son procédé d'utilisation à la réalisation d'un
antibiogramme directement effectué sur le prélèvement.
Le témoin de révélation des contaminants ou TLI est
remarquable par le fait qu'il comporte, d'une part, au moins
une catégorie de bactérie classiquement contaminante
présente à un taux maximum, par exemple égal ou inférieur à
103 UFC/ml avec son substrat approprié et, d'autre part, un
révélateur de la croissance des contaminants, de préférence,
un indicateur coloré de changement de pH dans un milieu
standard à pH determiné.
La bactérie classiquement contaminante peut etre de
différentes catégories suivant qu'il s'agit d'une bactérie
qui dégrade l'urée (bactérie uréase +~ comme par exemple
Coryne Bactérium, staphylococcus intermedius, etc, et/ou le
- 13 - 2 1 ~7406
-
glucose (bactérie glucose +) comme par exemple Escherichia
Coli, staphylococcus intermedius, etc. De très nombreuses
espèces de bactéries (environ 90 % des espèces) dégradent le
glucose, comme la famille des bacilles gram - et gram +, ce
qui permet d'avoir un choix important pour la bactérie
classiquement contaminante du témoin limite d'incubation.
Le choix de cette bactérie peut de façon avantageuse
être guidé par le type de l'infection où le prélèvement est
effectué et qui présente des contaminants qui peuvent être
connus
Le substrat est fonction de la bactérie contaminante et
peut notamment être du glucose, de l'urée, etc.
Le pH du milieu est maintenu acide dans le cas où l'urée
est le substrat, et basique dans le cas où il s'aglt du
glucose.
A titre indicatif, le témoin limite d'incubation
contenant la bactérie uréase + : staphylococcus intermedius,
comporte également de l'urée, un indicateur de virage dans
un milieu à pH acide (5,5).
Afin de permettre une meilleure conservation de la
bactérie contaminante, cette derniere est présente, au
depart, dans le temoin limite d'incubation sous forme
déshydratée, de façon a être, une fois régénérée, à un taux
de 103 UFC/ml maximum.
Selon une première forme de mise en oeuvre de
l'invention, le milieu de réhydratation de la bactérie
contaminante déshydratée est un milieu de culture
conventionnel à un pH détermine (acide dans le cas d'une
bactérie urease + et basique dans le cas d'une bacterie
glucose +) et contenant alors :
- le substrat
- et/ou l'indicateur de virage de pH.
De façon avantageuse, on peut ajouter dans ce milieu de
réhydratation, divers réactifs améliorant la pousse des
coccies gram + (comme des staphylocoques) qui présentent une
croissance moins rapide que les bacilles gram - en milieu
conventionnel.
Selon une autre forme de mise en oeuvre de l'invention,
- 14 - 2 1 87406
le substrat, l'indicateur de pH et les réactifs sont
contenus dans le milieu de déshydratation correspondant à un
milieu de culture conventionnel à pH déterminé (acide dans
le cas d'une bactérie uréase + et basique dans le cas d'une
bactérie glucose +) contenant des élements essentiels connus
en soi pour la stabilité de la bactérie déshydratée, par
exemple : gélatine à 1 % final, sérum de poulain à 68 %
final, polyol à 1,2 % final. D'autre part, dans ce
déshydratat, divers réactifs qui améliorent la croissance
des coccies gram + comme les statphylocoques, sont ajoutes.
Ces réactifs peuvent être également ajoutés dans le milieu
de réhydratation : Arg a 0,05 % final, Cyst à 0,05 % final,
Thiamine 0,1 % final, acide nicotinique 0,1 % final. Ces
réactifs supplementaires ont pour but d'ameliorer la pousse
des coccies gram + qui présentent une croissance moins
rapide que les bacilles gram - en milieu conventionnel.
Le milieu défini pour notre test comporte donc les
elements essentiels pour une croissance des bacilles gram -
et des coccies gram +, et ne favorise aucun micro-organisme
des deux groupes plus qu'un autre.
Ce milieu est également adapté à la croissance des
contaminants que l'on rencontre dans les infections
externes : otites, pyodermites.
En effet, le substrat, l'indicateur de virage de pH et
les reactifs susmentionnés peuvent être présents de façon
interchangeable dans le milieu de déshydratation ou dans le
milieu de réhydratation, comme indique ci-dessus.
Le principe mis en oeuvre dans le témoin limite
d'incubation consiste à révéler la croissance des bactéries
contaminantes par le changement de pH du milieu qui en
résulte.
En effet, la croissance par exemple d'une bactérie
uréase + nécessite la dégradation de l'urée qui provoque une
alcalinisation du milieu. L'alcalinisation du milieu est due
lors de la dégradation de l'urée au dégagement d'ammoniac
selon la réaction suivante :
-- 21 8 7406
~ NH2
H20 + 0 = C \ ~ C~2 + 2NH3
NH2
Alors que la croissance d'une bacterie glucose +, grace à la
dégradation du glucose, provoque l'acidification du milieu.
De façon préférentielle, l'indicateur du pH est le rouge
de phénol, de couleur rouge à pH alcalin et jaune à pH
acide.
Selon une caractéristique importante de l'invention, le
virage du témoin limite d'incubation se fait avec une
cinétique :
- proportionnelle à la concentration de bactérie
contaminante du départ ; et
- proportionnelle à la temperature environnante de 24 heures
a 40 degrés Celsius à 4 jours à 20 degres Celsius.
Selon l'invention, la concentration de bactérie
contaminante est constante, 103 UFC/ml, de sorte que le
virage dépend uniquement de la température environnante. En
effet, la chaleur apportee au temoin limite d'incubation
favorise alors les réactions biochimiques de dégradation du
substrat par la bacterie contaminante. Le changement de pH
et sa révélation avec l'indicateur colore se fait, par
conséquent, de façon plus ou moins rapide, selon la
température apportée au témoin limite d'incubation.
Les travaux et expérimentations ayant abouti à la
présente invention ont essentiellement porté sur
l'utilisation de ce témoin de révélation des contaminants
pour la réalisation d'un antibiogramme effectué directement
sur le prélèvement.
Il ne s'agit cependant pas d'une application limitative.
En effet, ce tèmoin limite d'incubation, de par sa
composition et sa destination, permet de révéler tous
contaminants et peut être utilisé de façon plus générale
dans le cadre d'expériences et de tests pratiqués
directement sur tout prélèvement de tissus ou de milieux
infectieux, en vue de déterminer et de visualiser la
croissance des contaminants pouvant etre présents dans le
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prélèvement.
De façon particulière, ce témoin limite d'incubation
peut également etre utilise dans le cadre de
l'identification des bactéries à taux suprapathologique
(supérieur à 10 UFC/ml) effectue directement à partir d'un
prelèvement. Ces dernières sont détectées par leur
croissance formant un trouble dans le milieu avant que le
témoin limite d'incubation ne vire.
Selon l'invention, la realisation d'un antibiogramme
consiste en premier lieu, à prélever du milieu infecte
contenant les bactéries pathogènes à tester, sous forme
d'écouvillon du tissu infecté ou sous forme de liquides
biologiques (liquide d'épanchement infecté...), à l'inoculer
dans des milieux de culture contenant différents
antibiotiques à leur CMI. De façon preférentielle, on dilue
le milieu prélevé à 102 UFC/ml, dans un milieu de transport
qui garde viable toutes les espèces bactériennes aux memes
concentrations que celles du prélèvement, puis on ensemence
dans un milieu de culture et on inocule ensuite ce milieu de
culture ensemencé à différents antibiotiques présents, à
leur CMI.
A titre indicatif, et dans notre cas d'etude 200 ~l de
ce milieu ont été distribués dans divers puits ou autres
réceptacles contenant différents antibiotiques, à leur CMI
dans un m;lieu de culture conventionnel.
Gr3ce au milieu de transport utilise qui garde stable 10
heures à la température ambiante et 24 heures à 4 - 8 degrés
Celsius le milieu de transport ensemence, le technicien de
laboratoire ou de façon plus générale le manipulateur n'est
pas contraint d'inoculer rapidement après l'ensemencement.
Il est nécessaire pour que les résultats de
l'antibiogramme soit correct que le témoin limite
d'incubation soit réhydraté ou préparé lorsque que le
prélèvement est inoculé aux différentes concentrations
d'antibiotiques. Ce moment determine le point de départ
(T = 0) des différentes réactions s'effectuant entre
bacteries, antibiotiques, contaminants et substrats du
prélèvement présents dans les diffèrents puits ou
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réceptables contenant les différents antibiotiques ainsi que
la réaction de dégradation du substrat par la bactérie
contaminante dans le témoin limite d'incubation.
La lecture de cet antibiogramme est simple en ce sens
qu'il suffit de voir avant le changement de couleur du
témoin limite d'incubation dans quel puits ou réceptable
aucune bactérie s'est développée (aucun trouble) pour savoir
quel est ou quels sont les antibiotiques requis pour le
traitement de l'infection où s'est effectué le prélèvement.
Cette lecture est conditionnée au changement de couleur
du témoin limite d'incubation.
Par exemple, la lecture de l'antibiogramme est stoppée
des que le temoin d'incubation limite initialement jaune (pH
5,5) vire au rouge lorsque le témoin limite d'incubation
contient la bactérie uréase + ; staphylococcus intermedius,
de l'uree et du rouge de phénol.
Selon une caracteristique avantageuse de l'invention, le
virage du temoin d'incubation limite est uniquement
proportionnel à la température environnante de 18 à 24
heures à 40 degrés Celsius, de 36 à 44 Heures à 25 degrés
Celsius et 4 jours à 20 degrés Celsius.
La réalisation d'un antibiogramme directement sur le
prélèvement à des températures variables d'un test à l'autre
ou variables dans le temps pour une température constante
est ainsi possible. En effet, tant que le témoin
d'incubation limite ne vire pas, la lecture de
l'antibiogramme est possible sans risque d'interférence des
contaminants. L'effet de la température sur la croissance
des bactéries aura lieu aussi bien sur le témoin
d'incubation limite que sur le système d'antibiogramme dans
lequel se retrouvent les germes responsables de l'infection.
Quelle que soit la temperature, les bactéries pathogènes
présentes sur le site de l'infection poussent avant que le
témoin limite d'incubation ne vire. Seul le temps que met le
temoin limite dlincubation à virer dépend de la température
ambiante, généralement :
- 40 degrés Celsius - 18 à 24 heures
- 25 degrés Celsius - 36 à 44 heures
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- 20 degrés Celsius - 4 jours (96 heures)
Cette sécurité permet de réaliser des antibiogrammes non
seulement directement à partir du prélèvement mais de ne pas
se soucier des conditions de température, donc de réaliser
ces tests en ambulatoire, soit par les vétérinaires, soit
par des médecins eloignés d'une unité de laboratoire. On
peut en effet pratiquer l'antibiogramme sans étuve et sans
régulation de température.
Dans des conditions opératoires simplifiées (à partir du
prélèvement, sans souci de température) cet antibiogramme
peut etre non seulement pratique par un personnel non
spécialisé, mais de plus par le malade lui-meme (dans le
cadre d'infections urinaires de la femme enceinte éloignée
d'un centre médical, plaie de blessure de guerre, ...), donc
dans le cadre de la médecine humanitaire ou de la médecine
de guerre.
Le vétérinaire ou autre utilisateur de cet antibiogramme
a ainsi la certitude que l'antibiotique révélé efficace "in
vitro" par cet antibiogramme aboutira plus certainement à un
rèsultat thérapeutique. Compte tenu de l'exposé qui precède,
les moyens permettant de réaliser les antibiogrammes, selon
l'invention, peuvent etre avantageusement executes sous
forme de kits.
Outre la connaissance du type ou des types
d'antibiotiques requis pour le traitement, l'antibiogramme
exécuté selon l'invention, permet également de connaître si
le taux de bactérie prélevé et testé est ou non
suprapathologique (germe doué dans ce cas précis d'un
pouvoir pathologique probable) quelle que soit la
température dans laquelle l'antibiogramme est porté.
En effet, si une croissance bactérienne se produit dans
les tubes contenant un antibiotique précis à sa
concentration CMI et du prélévement (se visualisant sous la
forme de trouble) avant que le témoin d'incubation limite ne
vire du jaune au rouge, l'on est sûr que la bactérie
présente sur le site de l'infection est présente à un taux
supérieur à 10 UFC/ml donc qu'elle correspond à un taux dit
suprapathologique (germe doué dans ce cas précis d'un
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pouvoir pathologique probable).
Inversement, si aucune croissance bactérienne ne se
produit avant que le témoin d'incubation limite ne vire,
cela signifie qu'aucune bactérie n'est présente sur le site
d'infection à des concentrations inférieures à 103 UFC/ml.
Si après que le témoin d'incubation limite ait viré au
rouge une croissance bactérienne apparaît, il peut s'agir :
- d'un contaminant si le prélèvement est un prélèvement
externe (muqueuse, pus, urines...) ;
- d'un germe d'une humeur profonde à un taux supérieur à
103 UFC/ml (ex : Hémoculture ou LCR : milieu ne présentant
jamais de contaminant).
