Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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~.. . . . 1
PROCEDE DE PRODUCTION D'ACIDES GRAS OU DERIVES
' A PARTIR DE PLANTES OLEAGI~EUSES
L'invention concerne un procédé de
production d'acides gras ou dérivés d'acides gras (esters
ou autres dérivés) à partir de plantes oléagineuses. Le
procédé de l'invention s'applique en particulier à des
plantes oléoprotéagineuses telles que colza, tournesol,
so~a, crambé... L'invention peut notamment être utilisée
pour fabriquer des bio-carburants (diester), lubrifiants,
ad~uvants phytosanitaires, détergents... par transformation
des acides gras~proauits.
On a tenté depuis 1970 de substituer aux
produits dérivés du pétrole (notamment carburants~ des
produits obtenus à partir de matière végétale afin de
réduire la dépendance vis-à-vis des pays producteurs de
pétrole et d'élargir les débouchés des produits agricoles.
La filière utilisant les plantes oléagineuses comme matière
première passe par la production d'acides gras libres qui
constituent la matière première pour les industries de
transformation vers les carburants, lubrifiants... Les
lipides accumulés par les plantes oléagineuses peuvent être
transformés en acide gras par hydrolyse : deux procédés
sont actuellement exploités industriellement pour opérer
cette transformation.
Un premier procédé consiste à hydrolyser
les lipides après extr~ction en mettant en contact à chaud
et sous pression les lipides extraits avec du méthanol
sulfurique ou ae la potasse méthanolique. ~n autre procédé
consiste à opérer l'hydrolyse dans des conditions
similaires directement sur le broyat de graines sans
extraction préalable. On pourra par exemple se reporter à
la référence suivante pour plus de détails sur ces procédés
qui sont les seuls exploités dans l'industrie pour
hydrolyser les huiles végétales : K.J. Harrington et
C. a'Arcy-Evans, Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Dev. 1985, 24,
314-318. Les défauts bien connus de ces procédés sont les
suivants : coût de mise en oeuvre élevé, infrastructure
-- , .
~ C~ 2 Z 1 9 ~ 5 ~ ~
~,~ ... .....
industrielle lo~rde, caractère polluant des effluents,
production de glycerol comme sous-produit sans marché
act~ t. Ces procédés sont mis en oeuvre faute de
techniques de remplacement.
Par ailleurs, des expérimentations ont été
conduites en laboratoire pour réaliser l'hydrolyse des
lipides par voie enzymatique en melangeant une lipase avec
les lipides ex~raits des graines (G.P. McNeill et al.,
JAOCS, Vol. 68 n~ 1 janvier 1991, p. 1-5 ; S.M. Kim et J.S.
Rhee, JAOCS Vol. 68 n~ 7 juillet 1991, p. 499-503 ; C.
Gancet, In Heterogeneous Catalysis And Fine Chemicals II
1991, Guisnet Editors, p. 93-104). Toutefois, ces essais
sont restés au. stade ~ laboratoire car la technique est
incompatible avec une exploitation industrielle en raison
des quantités d'enzyme nécessaires et du coût de celle-ci
Il convient de souligner que sont déjà
connus en tant que tels des procédés permettant de faire
produire des en=zymes par des plantes (brevet WO-A-92/01042
et EP-A-0.449.376). Ces procédés conduisent à une
production à bon marché des enzymes qui sont ensuite
utilisées dans divers processus de transformation
industrielle ou alimentaire, soit après isolement, soit
sans les isoler.
Toutefois, cet enseignement est totalement
étranger au problème concerné visant la production d'acides
-- gras directement à partir de plantes oléagineuses.
La présente invention se propose de fournir
une nouvelle solution au problème de la production d'acide
gras à partir de plantes oléagineuses. Elle vise à fournir
une solution dont les coûts de mise en oeuvre sont
considérablement abaissés par rapport aux procédés connus
(aussi bien procédés chimiques industriels que procédé
enzymatique de laboratoire).
Un objectif de l'invention est ainsi de
fournir un procedé exploitable sur le plan industriel dans
des conditions douces de température et de pression, qui
bénéficie d'une mise en oeuvre simple et non polluante,
utilise une infrastructure légère et ne conduit à aucun
f ~ 214 ~1 95560
sous-p-rodult genant.
Un autre objectif, lié au précédent, est de
permettre de multiplier les installations de production
d'acides gras en vue de les rapproc~er des lieux de culture
des plantes oléagineuses et de réaliser ainsi des économies
de transport de la matière première.
A cet effet, le procédé conforme à
l'invention pour la production d'acides gras ou dérivés
d'acides gras à partir de plantes oléagineuses se
caractérise en ce que :
on prod~it des p ~ _ _ _ _ ~ s
/
,
WO96~3511
r~l,
3 2 ~ 955 60
transgéniques possédant, d'une part, au moins un gène
codant pour une enzyme lipase, dit gène de lipase, d'autre
part, associé à ce gène de lipase, un promoteur permettant
une éxpression dudit gène soit dans des compartiments
, 5 cellulaires, extracellulaires ou tissulaires differents de
ceux où s'accumulent les lipides de la plante, soit sur
induction exogène,
- on recueille les graines ou fruits
contenant les lipides desdites plantes,
- on broie lesdites graines ou fruits, le
cas échéant après traitement inducteur, de facon à mettre
en contact les lipides et la lipase contenue dans lesdites
graines ou fruits,
- on laisse incuber l'ensemble pour
engendrer une hydrolyse enzymatlque des lipides du broyat
sous l'action catalytique de la lipase contenue dans ledit
broyat,
- on extrait les acides gras issus de
l'hydrolyse ou on les transforme pour obtenir les dérivés
d'acides gras recherchés.
Ainsi le procédé de l'invention est un
procédé d'hydrolyse enzymatique qui bénéficie des avantages
de ce type de procédé (conditions douces de mise en oeuvre,
absence de pollution, installations légères et peu
coûteuses, absence de sous-produits gênants). Dans ce
procédé, on amène la plante à produire elle-même l'enzyme
nécessaire à la transformation ultérlèure des lipides, en
évitant gue cette enzyme ne vienne prématurément au contact
des lipides de façon à écarter tout risque d'auto-
dégradation de la plante avant la récolte. L'hydrolyse estensuite obtenue sans addition d'enzyme exogène en opérant
la mise en contact des lipides et des enzymes produits par
la plante. Un tel procédé presonte un coût glo~al de mise
en oeuvre particulièrement réduit. Les installations de
broyage et d'incubation sont légères et courantes dans lo
miliou agricole, de sorte que ces opérations peuvent êtro
oxécutées sur les sites de récolte des plantes.
La production des plantes transgéniques est
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~ 4 ~ 1 9 5 5 6 ~ ~
obtenue en réalisant in$tialement la transformation
génétique d'une plante oléagineuse naturelle, en amenant la
plante génétiquement transformée à se multiplier par la
voie sexuée pour la production de semences transgéniques et
en utilisant ensuite ces semences pour l'obtention de
plantes transgéniques descendantes.
La transformation génétique initiale
consiste, selon un processus act~ nt bien connu, à
réaliser une cassette d'expression comprenant le gène de
lipase et le promoteur d'expression de ce gène et à
introduire cette cassette d'expression dans le génome de la
plante.
Une des caractéristiques essentielles du
procédé de l'invention est que le promoteur associé au gène
de lipase est adapté pour éviter une mise en contact
prématurée de l'enzyme et des lipides ; ce promoteur peut
être de plusieurs types : il peut soit (1) diriger
l'expression du gène dans des compartiments différents de
ceux où s'accumulent les lipides, soit (2) initier
l'expression du gène au moment opportun par induction
exogène.
Dans le premier cas, deux types de
cassettes d'expression peuvent être utilisés :
(1A) soit une cassette d'expression
comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlant
l'expression de ce gène dans un compartiment cellulaire ou
tissulaire dii-férent du compartiment d'accumulation des
lipides,
(1B) soit une cassette d'expression
comprenant un promoteur constitutif et un gène de lipase
muni d'une séquence d'adressage vers des compartiments
cellulaires ou extracellulaires différents de ceux où
s'accumulent les lipides.
Dans le second cas (2), le promoteur
utilisé dans la cassette d'expression est du type
contrôlable de façon exogène par des 5ignaux physiques,
chimiques ou biochimiques, en particulier promoteur de
st~ess ~ ~n~nt l'expression sur application d'un
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~ ' 5 2 ~ 9 5 5 6 0
traumatisme physique sur les graines ou fruits.
Par exemple pour produire des acides gras à
partir de plantes o~éoprotéagineuses, on peut utiliser le
~ mode de mise en oeuvre 1A ci-dessus évoqué :
- la transformation génétique de la plante
est effectuée en réalisant une cassette d'expression
comprenant un gène de lipase et un promoteur contrôlant
l'expression d'une protéine déterminée de la graine, et en
introduisant cette cassette d'expresslon dans le génome de
la plante de facon à faire exprimer la lipase dans les
compartiments de la graine où s'accumulent la protéine
précitée,
- la mise en contact des lipides et de la
lipase est effectuée par simple broyage.
Pour le colza, le promoteur de la protéine
utilisé est avantageusement le promoteur de la napine qui
permet une ~c~ lation massive de lipase dans les corps
protéiques de la graine, séparés des globules lipidiques.
Le mode de mise en oeuvre lB ci-dessus peut
être utilisé quel que soit le type de plante oléagineuse,
par exemple en choisissant le promoteur constitutif 35S du
CaMV (Virus de la mosaïque du chou-fleur) et la séquence
d'adressage PR-S du tabac afin de diriger l'excrétion des
lipases produites vers les compartiments extracellulaires.
- 25 La mise en contact des lipides et des lipases est également
effectuée dans ce cas par simple broyage.
Le mode de mise en oeuvre (2) ci-dessus
peut être utilisé quel que soit le type de plante
oléagineuse, par exemple en choisissant le promoteur
inhibiteur de protéase isolé de la pomme de terre, qui
Cl ~n~ 1 ' expression des gènes en cas de blessures. Le
traitement inducteur qui provoque la synthèse des lipases
peut être dans ce cas une action de décorticage des
graines, réalisée avant le broyage.
De préférence, quel que soit le mode de
mise en oeuvre choisi, on utilise un gène codant pour une
lipase non spécifi~ue, c'est-à-dire caractérisée par une
activité hydrolyti~ue non spécifique, afin d'obtenir une
WO9~03511 I~l/rhv~l 5~
~ 6 2 1 9 5 5 6 0
hydrolyse totale des lipides accumulés par la plante et
d'évlter les réactions parasites de saponification. Il est
toutefois possible, pour certaines utilisations des acides
gras, de faire produire à la plante des lipases à activité
hydrolytique spécifique afin de favoriser un type donné
d'hydrolyse (par exemple : monoacylglycérollipase du
Penicyllium camembertii réalisant uniquement l'hydrolyse
d'une des trois liaisons du glycérol avec les acides gras,
en vue de la fabrication de diacylglycérols).
On peut en particulier utiliser des gènes
de lipase non spéc$fique, caractérisé par les séquences
suivantes ou par des séquences analogues aux séquences
suivantes (les flèches délimitent la partie codante) :
SEQUENOE I
1 G~ATGACAACT TGGTTGGTGG CATGACTTTG GACTTACCCA GCGATGCTCC
51 TCCTATCAGC CTCTCTAGCT CTACCAACAG CGCCTCTGAT GGTGGTAAGG
101 TTGTTGCTGC TACTACTGCT CAGATCCAAG AGTTCACCAA GTATGCTGGT
151 ATCGCTGCCA CTGCCTACTG TCGTTCTGTT GTCCCTGGTA ACAAGTGGGA
201 TTGTGTCCAA TGTCAAAAGT GGGTTCCTGA TGGCAAGATC ATCACTACCT
251 TTACCTCCTT GCTTTCCGAT ACAAATGGTT ACGTCTTGAG AAGTGATAAA
301 CAAAAGACCA TTTATCTTGT TTTCCGTGGT ACCAACTCCT TCAGAAGTGC
351 CATCACTGAT ATCGTCTTCA ACTTTTCTGA CTACAAGCCT GTCAAGGGCG
401 CCAAAGTTCA TGCTGGTTTC CTTTCCTCTT ATGAGCAAGT TGTCAATGAC
451 TATTTCCCTG TCGTCCAAGA ACAATTGACC GCCCACCCTA CTTATAAGGT
501 CATCGTTACC GGTCACTCAC TCGGTGGTGC ACAAGCTTTG CTTGCCGGTA
S51 TGGATCTCTA CCAACGTGAA CCAAGATTGT CTCCCAAGAA TTTGAGCATC
601 TTCACTGTCG GTGGTCCTCG TGTTGGTAAC CCCACCTTTG CTTACTATGT
651 TGAATCCACC GGTATCCCTT TCCAACGTAC CGTTCACAAG AGAGATATCG
701 TTCCTCACGT TCCTCCTCAA TCCTTCGGAT TCCTTCATCC CGGTGTTGAA
751 TCTTGGATGA AGTCTGGTAC TTCCAACGTT CAAATCTGTA CTTCTGAAAT
801 TGAAACCAAG GATTGCAGTA ACTCTATCGT TCCTTTCACC TCTATCCTTG
851 ACCACTTGAG TTACTTTGAT ATCAACGAAG GAAGCTGTTT GTAAAACACT
901 TGACGTGTTA CTCTAATTTT ATAATAAAAT TAAGTTTTTA TACAAT
W096103511 7 P~l/r
sEQuENcE ~ ;i 2-1 9 5 5 6 0
1 GTCGACCATT TCAGCCTGTT TTGCTCGCAA AACGACGCCG CGGGCGTGCG
Sl CTACCGCACA CTCCGTCGCT GGGCGTTGTG CGGGGAAGAT TCAAACGRGC
' ~
101 GTTTCGCGCC GTQACAACCC GCTCTCrTCC GCTCTGCCAC GCAGGTTATG
151 RCCGGCCGCC AGGAAGCCGC GGATTTCCTG GCCTGGAGGA AAAAAGCCGA
Z01 AGCTGGCAC:G GTTCCTGGCG CAAGGGACAG CGAAGCGGTT CTCCCGGAAG
251 GATTCGGGCG ATGGCTGGCA GGQCGCGCCC CTCGGCCCCA TCAACCTGAG
301 ATGAGAACAA C~ATGAAGAAG AAGTCTCTGC TCCCC-CTCGG CCTGGCCATC
351 GGTCTCGCCT CTCTCGCTGC CAGCCCTCTG ATCCAGGCCA GCACCTACAC
401 CCqGACCAAA TACCCCATCG TGCTGGCCCA CGGCATGCTC GGCTTCGACA
451 ACATCCTCGG GGTCGACTAC TGGTTCGGCA TTCCCAGCGC CTTGCGCCGT
501 GACGGTGCCC AGGTCTACGT CACCGAAGTC AGCCAGTTGG ACACCTCGGA
551 AGTCCGCGGC GAGCAGTTGC TGCAACAGGT CCACCAAATC GTCGCCCTCA
601 GCGGCCAGCC CAAGGTCAAC CTGATCGGCC ACAGCCACGG CGGGCCGACC
651 ATCCGCTACG TCGCCGCCGT ACGTCCCGAC CTGATCGCTT CCGCCACCAG
701 CGTCGGCGCC CCGCACAAGG GTTCGGACAC CGCCGACTTC CTGCGCCAGA
751 TCCCRCCGGG TTCGGCCGGC GAGGCAGTCC TCTCCGGGCT GGTCAACAGC
801 CTCGGCGCGC TGATCAGCTT CCTTTCCAGC GGCAGCACCG GTACGCAGAA
Z5 851 TTCACTGGGC TCGCTGGAGT CGCTGAACAG CGAGGGTGCC GCGCGCTTCA
901 ACGCCAAGTA CCCGCAGGGC ATCCCCACCT CGGCCTGCGG CGAAGGCGCC
951 TACAAGGTCA ACGGCGTGAG CTATrACTCC TGGRGCGGTT CCTCGCCGCT
1001 GACCAACTTC CTCGATCCGA GCGACGCCTT CCTCGGCGCC TCGTCGCTGA
1051 CCTTCAAGAA CGGCACCGCC AACGACGGCC TGGTCGGCAC CTGCAGTTCG
1101 CACCTGGGCA TGGTGATCCG CGACAACTAC CGGATGAACC ACCTGGACGA
1151 GGTGAACCAG GTCTTCGGCC TCACCAGCCT GTTCGAGACC AGCCCGGTCA
~ 1201 GCGTCTACCG CCAGCACGCC AACCGCCTGA AGAACGCCAG CCTGTAG~
FEUiLlE DE RElllPL~,CEMEUt ~REGLE 26~
W09~03511 iJ~ T~llr~'.'C,~/ ~
' ~ ~ 95560
SEQUENCE III
1 :GGGTGCATGC CAGCTCCCAC CGGACACCTG GCCCGTCGCT GAAQC',TGTT
51 TTCGCTTTCT CTACQAATCC QACQQCQGQG AGGCACTQCC~ATGGGTQTCT
101 TTGQCTRTAA QAQCCTTGGC Q:CCGQGGGTT CCAAAQCGTT GTTCGCCGQT
151 GCCQTGGCGQ TCQCGTTGTQ TTCCTQTCQC QQCCTGGATQ QCGGCTTTGC
201 CGTGGGCTAC CAGCACAACG GGTTGGGCTT GGGGCTACCG GCCACGCTGG
251 TCGGTGCGCT GCTCGGCAGC ACGGATTCCC QGGGCGTGAT CCCTGGCATC
301 CCGTGGAQCC CGGATTCQGQ QQQAGCCGCC CTTGAGGCGG TGCAGAAAGC
351 CGGTTGGACA CCGATCAGCG CCRGTGCCCT GGGCTACGCC GGCQQGGTCG
401 QTGCQCGTGG CACCTTCTTT GCCCAAAAAC CCGGCTQCAC CQCGGCCCAG
451 GTCGAGGTAC TCGGCAAATA CGQTGACGCC GGCAAGCTGC TCGAAATCGG
501 CATCGGTTTT CGTGGCACTT CGGGGCCACG GGQAACCTTG ATCAGCGACT
551 CGATCGGCGA CTTGATCAGC GQTCTGCTCG CGGCCCTGGG GCCCAAGGAT
501 TACGCGAAAA ACTACGCCGG CGAAGCCTTC GGCGGCTTGC TCQAGAATGT
651 TGCCGACTAC GCCGGTGCCC ATGGCCTGAC CGGCAAGGAC GTGGTGGTCA
701 GCGGCCACAG CCTGGGCGGG CTGGCGGTCA ACAGCATGGC GGACTTGAGC
751 AACTACAAAT GGGCGGGGTT CTACAAGGAC GCCAACTATG TTGCCTATGC
801 CTCGCCGACC CAGAGTGCCG GCGACAAGGT GCTCAATATC GGTTACGAAA
851 QCGACCCGGT GTTCCGCGCG CTGGACGGCT CGTCGTTTAA CCTGTCGTCG
901 CTGGGCGTGC ACGACAAACC CCACGAGTCC ACCACCGATA ACATCGTCAG
951 CTTCAACGAC CACTACGCCT CGACGCTGTG GAATGTGCTG CCGTTTTCCA
1001 TCGTCAACCT GCCCACCTGG GTCTCGCATT TGCCGACGGC GTACGGCGAT
1051 GGCATGACGC GCATCCTCGA GTCCGGCTTC TACGACCAGA TGACCCGTGA
1101 CTCCACGGTG ATTGTTGCCA ACCTGTCCGA TCCGGCGCGG GCCAACACCT
1151 GGGTGCAGGA CCTCAACCGC AATGCCGAGC CCCACAAGGG CAQCACGTTC
1201 ATCATCGGCA GCGACGGCAA CGACCTGATC CAGGGCGGCA ACGGTGCGGA
1251 CTTTATCGAG GGTGGCAAAG GCAACGACAC GATCCGCGAC AACAGCGGGC
1301 ACAACACCTT TTTGTTCAGC GGCCACTTTG GCAATGATCG CGTGATTGGC
_ _ _ _ _ . . , , , .. , , ., . , .. , ., . . . ,, . , .. ,, ,, . , . ~ ,_ ~ .
W096/03511 ~ 2 ~ ~560
~3 ~
1351 TACCAGCCCA CCGACAAACT GGTGTTCAAG GACGTGCAAG GAAGCACCGA
1401 CCTGCGTGAC CACGCGAAGG TGGTCGGCGC CGATACGGTG CTTRCGTTTG
1451 GGGCCGACTC GGTGACGCTG GTCGGCGTGG GGCATGGCGG GCTGTGGACG
1501 GAGGGCGTGG TGATCGGCTG A~TTACTCACG CAACCGATCA GTGCCAGTGC
1551 TGCCCCCGCC AGCCACCGCC CCAATTGGGC CGGTGGGGGT AGCCATAGCC
SEQ~ENCE IV
1 GGGCGATGGC TGGCAGGACG CGCCCCTCGG CCCCATCAAC CTGAGATGAG
51 AACAACATGA ACAACAACTC TCTGCTCCCC CTCGGCCTGG CCATCGGCCT
101 CGCCTCTCTC GCTGCCAGCC CTCTGATCCA GGCC~AGCACC TACACCCAGA
151 CCAAATACCC CATCGTGCTG GCCCACGGCA TGCTCGGCTT CGACAATATC
201 CTCGGGGTCG ACTACTGGTT CGGCATTCCC AGCGCCTTGC GCCGTGACGG
251 TGCCCAGGTC TACGTCACCG AAGTCAGCCA GTTGGACACC TCGGAAGTCC
301 GCGGCGAGCA GTTGCTGCAA CAGGTGGAGG AAATCGTCGC CCTCAGCGGC
351 CAGCCCAAGG TCAACCTGAT CGGCCACAGC CACGGCGGGC CGACCATCCG
401 CTACGTCGCC GCCGTACGTC CCGACCTGAT GCCTTCCGCC ACCAGCGTCG
451 GCGCCCCGCA CAAGGGTTCG GACACCGCCG ACTTCCTGCG CCAGATCCCA
501 CCGGGTTCGG CCGGCGAGGC AGTCCTCTCC GGGCTGGTCA ACAGCCTCGG
551 CGCGCTGATC AGCTTCCTTT CCAGCGGCAG CGCCGGTACG CAGAATTCAC
601 TGGGCTCGCT GGAGTCGCTG AACAGCGAGG GGGCCGCGCG CTTCAACGCC
651 AAGTACCCGC AGGGCATCCC CACCTCGGCC TGCGGCGAAG GCGCCTACAA
701 GGTCAACGGC GTGAGCTATT ACTCCTGGAG CGGTTCCTCG CCGCTGACCA
~5i ACTTCCTCGA TCCGAGCGAC GCCTTCCTCG GCGCCTCGTC GCTGACCTTC
~Ol ~C~ c~ cGA CGGCCTGGTC G~C~CCTGCA GTTCG~ACCT
851 GGGCATGGTG ATCCGCGACA ACTACCGGAT GAACCACCTG GACGAGGTGA
901 ACCAGGTCTT CGGCCTCACC AGCCTGTTCG AGACCAGCCC GGTCAGCGTC
951 TACCGCCAGC ACGCCAACCG CCTGAAGAAC GCCAGCCTGT AGGACCCCGG
lOqL CCGGGGCCTC GGCCCCGGCC CTTTCCCGGA AGCCCCCTCG CGTGAAGAAA
1051 ATCCTCCTGC TGATTCCACT GGCGTTCGCC GCCAGCCTGG CCTGGTTCGT
~ . . ~
Wo96/03511 r~lrh~ J/
2 1 9 5 5 6 0
SEQUE~CE V
1 ~CAGGCCCCCA CGGCCGTTCT TAATGGCAAC GAGGTCATCT CTGGTGTCCT
5L TGGGGGCAAG GTTGATACCT TTAAGGGAAT TCCATTTGCT GACCCTCCTG
101 TTGGTGACTT GCGGTTCAAG CACCCCCAGC CTTTCACTGG ATCCTACCAG
151 GGTCTTAAGG CCAACGACTT CAGCTCTGCT TGTATGCAGC TTGATccrGG
201 CAATGCCATT TCTTGGCTTG ACAAAGTCGT GGGCTTGGGA AAGATTCTTC
251 CTGATAACCT TAGAGGCCCT CTTTATGACR TGGCCCAGGG TAGTGTCTCC
301 ATGAATGAGG ACTGTCTCTA CCTTAACGTT TTCCGCCCTG CTGGCACCAA
351 GCCTGATGCT AAGCTCCCCG TCATGGTTTG GATTTACGGT GGTGCCTTTG
401 TGTTTGGTTC TTCTGCTTCT TACCCTGGTA ACGGCTACGT C~nCCnCnCT
451 GTGGAAATGG GCCAGCCTGT TGTGTTTGTT TCCATCAACT ACCGTACCGG
501 CCCCTATGGA TTCCTGGGTG GTGATGCCAT CACCGCTGAG GGTRACACCA
551 ACGCTGGTCT GCACGACCAG CGCAAGGGTC TCGAGTGGGT TAGCGACAAC
601 ATTGCCAACT TTGGTGGTGA TCCCGACAAG GTCATGATTT TCGGTGAGTC
651 CGCTGGTGCC ATGAGTGTTG CTCACCAGCT TGTTGCCTAC GGTGGTGACA
701 ACACCTACAA CCCn~ACnnC CTTTTCCACT CTGCCATTCT TCAGTCTGGC
751 GGTCCTCTTC CTTACTTTGA CTCTACTTCT GTTGGTCCCG AGAGTGCCTA
801 CAGCAGATTT GCTCAGTATG CCGGATGTGA TGCCAGCGCC AGTGACAATG
851 AAACTCTGGC TTGTCTCCGC AGCAAGTCCA GCGATGTCTT GCACAGTGCC
901 CAGAACTCGT ACGATCTCAA GGACCTGTTT GGCCTGCTCC CTCAATTCCT
951 TGGATTTGGT CCCAGACCCG ACGGCAACAT TATTCCCGAT GCCGCTTATG
1001 AGCTCTACCG CAGCGGTAGA TACGCCAAGG TTCCCTACAT TACTGGTAAC
1051 CAGGAGGATG AGGGTACTAT TCTTGCCCCC GTTGCTATTA ATGCTACCAC
1101 GACTCCCCAT GTTAAGAAGT GGTTGAAGTA CATTTGTAGC GAGGCTTCTG
1151 ACGCTTCGCT TGATCGTGTT TTGTCGCTCT ACCCCGGCTC TTGGTCGGAG
1201 GGTGCGCCAT TCCGCACTGG TATTCTTAAT GCTCTGACCC CTCAGTTCAA
125L GCGCATTGCT GCCATTTTCA CTGATTTGCT GTTCCAGTCT CCTCGTCGTG
1301 TTATGCTTAA CGCTACCAAG GACGTCAACC GCTGGACTTA CCTTGCCACC
~ W096/U3511 P~l/rhv. ,~/
? ' 2195560
.,~ 11
1351 CAGCTCCATA ACCTCGTTCC ATTTTTGGGT ACTTTCCATG GTAGTGATCT
1401 TCTTTTCCAA TACTACGTGG ACCTTGGCCC ATCTTCTGCT TACCGCCGCT
1451 ACTTTATCTC GTTTGCCAAC CACCACGACC CCAACGTTGG CACCAACCTG
1501 AAACAGTGGG ATATGTACAC TGATGCAGGC AAGGAGATGC TTCAGATTCA
1551 TATGGTTGGT AACTCTATGA GAACTGACGA CTTTAGAATC GAGGGAATCT
1601 CGAACTTTGA GTCTGACGTT ACTCTCTTCG GTTAA~
SEQUENCE VI
1 ATGGAGCTCG CTCTTGCGCT CCTGCTCATT GCCTCGGTGG CTGCTGCCCC
51 CACCGCCACG CTCGCCAACG GCGACACCAT CACCGGTCTC AACGCCATCA
101 TCAACGAGGC GTTCCTCGGC ATTCCCTTTG CCGAGCCGCC GGTGGGCAAC
151 CTCCGCTTCA AGGACCCCGT GCCGTACTCC GGCTCGCTCG ATGGCCAGAA
201 GTTCACGCTG TACGGCCCGC TGTGCATGCA GCAGAACCCC GAGGGCACCT
251 ACCnCCACAn CCTCCCCAAG GCAGCGCTCG ACTTGGTGAT GCAGTCCAAG
301 GTGTTTGAGG CGGTGCTGCC GCTGAGCGAG GRCTGTCTCA CCATCAACGT
351 GGTGCGGCCG CCGGGCACCA AGGCGGGTGC CAACCTCCCG GTGATGCTCT
401 GGATCTTTGG CGGCGGGTTT GAGGTGGGTG GCACCAGCAC CTTCCCTCCC
451 GCCCAGATGA TCACCAAGAG CATTGCCATG GGCAAGCCCA TCATCCACGT
501 GAGCGTCAAC TACCGCGTGT CGTCGTGGGG GTTCTTGGCT GGCGACGAGA
551 TCAAGGCCGA GGGCAGTGCC AACGCCGGTT TGAAGGACCA GCGCTTGGGC
601'''ATGCAGTGGG TGGCGGpCAA CATTG'CG'G'CG TTTGGCGGCG ACCCGACCAA
651 GGTGACCATC TTTGGCGAGC TGGCGGGCAG CATGTCGGTC ATGTGCCACA
701 TTCTCTGGAA CGACGGCGAC AACACGTACA AGGGCAAGCC GCTCTTCCGC
751 GCGGGCATCA TGCAGCTGGG GGCCATGGTG CCGCTGGACG CCGTGGACGG
801 CATCTACGGC AACGAGATCT TTGACCTCTT GGCGTCGAAC GCGGGCTGCG
8;51 GCAGCGCCAG CGACAAGCTT GCGTGCTTGC GCGGTGTGCT GAGCGACACG
901 TTGGAGGACG CCACCAACAA CACCCCTGGG TTCTTGGCGT ACTCCTCGTT
~ , 12 ~1 9 5 5 6 ~
= 1 .n
951 GCGGTTGCTG TRCCTCCCCC GGCCCGRCGG CGTGRACATC ~CCGQCGACA
1001 TGTACGCCTT'GGTGCGCGAG GGCAAGTRTG CCAACATCCC TGTGATCATC
1051 GGCGACC4G.4 ACGACGAGGG CACCTTCTTT GGCACCCTGC TGTTGRACGT
1101 G4CCRCGGAT GCCCRGGCCC GCGAGTACTT CRAGCAGCTG TTTGTCCACG
1151 CCRGCGACGC GGAGATCGAC ACGTTGATGA CGGCGTRCCC CGGCGACATC
1201 ACCCAGGGCC TGCCGTTCGA CACGGGTATT CTCRACGCCC TCAC'CCCGC.4
1251 GTTCAAGAGA ATCCTGGCGG TGCTCGGC~ CCTTGGCTTT ACGCTTGCTC
1301 GTCGCTACTT CCTCRACCAC TRCACCGGCG GCRCCAAGTQ CTCRTTCCTC
1351 CTGAAGCAGC TCCTGGGCTT GCCGGTGCTC GGAACGTTCC RCTCCARCG.4
1401 CATTGTCTTC CRGGACTACT TGTTGGGCAG CGGCTCGCTC ATCTACRACP.
1451 ACGCGTTCAT TGCGTTTGCC ACGGACTTGG ACCCCRAC~C CGCGGGGTTG
1501 TTGGTGAAGr GGCCCGAGTA CRCCRGCAGC CTGCRGCTGG GC4ACRACTT
1551 GATGRTGRTC ARCGCCTTGG GCTTGTAC'.QC CGGCAAGGAC ARCTTCCGCA
1601 CCGCCGGCTA CGACGCGTTG TTCTCCAACC CGCCGCTGTT CTTTGTGTP,
L'identification des six séquences ci-
dessus uisées es.t ls suiuante dans la banque de données
"EMBL" et "GENE BANK" :
ST~OUENCE r
LOCUS: RC~LIP~.SE, 9'.r6bpss mR\~ PL~' 23/01/93
DEFL~TITION ~ opus niveus mR1\iA for lipase, pa~ial sequence
ACCESSION: D 12 6bO
SE~OUI~?~CE rlT
LOC~iS:PALIPAG,121/bpDNABCT 2!/0//9'
25 DEFT~,l'rO~': P. a r.~oinosa lip A oe.-.e ror IIP2Se
ACCESSION: :~; co 3~0 S '3 ~3
SEQUEi'iCE III
LOCUS: PSELIPASEE, 1~00 bp ds-DNA BCT 1~10 1l9'
DEI-INITION: p~lld~ fluorescens lipase cene, com~lele cds
3 0 ACCESSION: ~.36350
FEU~i_'L~ I,A9L;IFIEE
. ~ .
.. . .. . . . , .. _ .. . . _ . _ _ _ .
2 1 9 ~ 5 6 0
12~is
~,.
SEOUENCE IY
LOCUS: PSELIPL, 1282 bp ds-DNA BCT 1~/04l97
DEFIl~ITION: Ps~utlnm~n~c sp. Lipl gene for lipase
s ACCESSION: D 10166 D 90398
SEOl~i\TcE ~
LOCUS: GC~' 02387, 1635 bp DNA PLN 0?110193
DEEINITION: Geotrichum candidum NRRL Y-5~3 Lipase gene, par~ial cds
ACCESSIONT: UO 2387
1 0 SEOUF~1~C~ Yl .
LOCUS: CCLIP1, 1733 bp DNA PLN - 27/04193
DEFII~rITIONT: C. Cylindracea LIP1 gene for lipase
/
n~!'ct
WO 96/03511 ~ i 9 5 5 6 0
La séquence I correspon~ à un cDNA de
~hizopus niveus, la séquence II peut être isolée à partir
du génome de pS~1r,7. -777;7C aeruginosa, la séquence III à
partir de Pse~ S fluorescens, la séquence IV à partir
de Pse~ sp, la séquence V à partir de Geotrichum
candidum, la sequence VI à partir de Candida cylindracea.
Par ailleurs, l'introduction de la cassette
d'expression : gène de lipase/promoteur d'expression de ce
gène, dans le génome de la plante oléagineuse peut être
réalisée par tout protocole connu.
Par exemple, selon le protocole le plus
courant actuellement, cette cassette d'expression peut être
introduite dans le génome de cellules somatiques de la
plante par un transfert à l'aide de la bactérie
Agrobacterium tumefaclens. Cette introduction dans lesdltes
cellules somatiques de la plante peut également être
réalisée par ~une autre technique connue, notamment par
électroporation, par biolistique ou par microinjection.
Il est également possible d'introduire la
cassette d'expression dans le génome de microspores de la
plante par électroporation ou biolistique.
Dans le protocole fourni plus loin à titre
d'exemple, on a décrit la technique d'électroporation pour
l'introduction de la cassette dans les microspores du
colza.
On pourra se reporter au document suivant
"P.J.J. Hooykaas et R.A. Schilperoort, TIBS août 1985,
p. 305-309" pour plus de détail sur la technique de
transfert à l'aide de la bactérie Agrobacterium
tumefaciens. On rappelle que cette technique consiste à
introduire la cassette d'expression concernée dans le
plasmide Ti de la bactérie notamment par choc thermique,
puis à mettre en contact la bactérie avec des disques de
feuilles de la plante, à laisser incuber l'ensemble jusqu'à
obtenir le transfert de la cassette d'expression dans le
génome des cellules des disques foliaires, et à cultiver
ces disques foliaires sur une succession de milieux jusqu'à
régênération des plantes transgéniques.
WO96/03~ll P~l/rr 7_.1 .J/
14
On pourra se~rePo~te9r5a5u6Qdocument suivant
"J.A. Russell et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 1992, 28P,
p. 97-105" pour plus de détail sur la technique de
biolistique. On rappelle que cette technique consiste à
fixer le plasmide contenant la cassette d'expression sur
des microbilles d'or ou de tungstène, à pro~eter ces
microbilles à l'aide d'un canon à particules sur les
cellules de la plante à transformer, et à cultiver ces
cellules ~usqu'à régénération des plantes transgéniques.
On pourra se reporter au document suivant
"Crossway A et Al, 1986, Mol.~Gen. Genet 202, 179-185" pour
plus de détail sur la technique de micro-in~ection. On
rappelle que cette technique consiste à in~ecter dans des
protoplastes ou de très ~eunes embryons le plasmide
contenant la cassette d'expression à l'aide de micro-
seringues, et à cultiver les protoplastes ~usqu'à
régénération des plantes transgéniques.
Après mise au contact par broyage de la
lipase et des lipides, on laisse incuber l'ensemble pour
réaliser l'hydrolyse enzymatique. Cette incubation est
réalisée dans des conditions classiques, en particulier
entre 20~ C et 60~ C, pendant le temps nécessaire à
l'obtention d'une hydrolyse totale ou quasi-totale.
L'extraction des acides gras issus de
l'hydrolyse est ensuite opérée par tout procédé connu, en
particulier par une extraction liquide/liquide utilisant un
solvant apolaire tel que le chloroforme ou l'hexane.
Selon un autre mode de mise en oeuvre, il
est possible de réaliser in situ une transformation des
acides gras pour obtenir des dérivés d'acides gras qui sont
ensuite extraits. Par exemple, les acides gras issus de
l'hydrolyse peuvent être méthylés in situ par mise en
contact avec du méthanol en catalyse acide sous ultrasons
en vue de les transformer en esters~methyliques, ces
derniers étant extraits par une extraction liquide/liquide
utilisant un solvant apolaire. ~ ~
La présente demande vise, en tant que
produit nouveau, toute plante oléagineuse ou semence de
WO96103511 , }_I/r. _. ,.~1
5 ~ 1 9 ~ ~ 6 0
plante oléagineùse, d'une variété non protégeable par un
certificat d'obtention végétale, qui comprend dans son
génome une cassette d'expresslon possédant au moins un gène
codant pour une enzyme lipase, associé à un promoteur
permettant une expression dudit gène dans des compartiments
reS, extracellulaires ou tissulaires différents des
compartiments lipidiques de la plante ou de la semence.
Le promoteur associé au gène de lipase peut
être un promoteur à expression cellulaire ou tissulaire
spécifique. Ce promoteur peut également être un promoteur
constitutif, auquel cas le gène de lipase est muni d'une
sequence d'adressage vers des compartiments cellulaires ou
extracellulaires différents des compartiments
d'accumulation des lipides.
La présente demande vise également toute
plante oléagineuse ou semence de plante oléagineuse, d'une
variété non protégeable par un certificat d'obtention
végétale, qui comprend dans son qénome une cassette
d'expression possédant au moins un gène codant pour une
enzyme lipase, associé à un promoteur permettant une
expression dudit gène sur induction exogène, en particulier
par un stress.
La description qui suit en réference au
dessin fournit à titre d'exemple un protocole de mise en
oeuvre du procédé de l'invention ; la figure 1 du dessin
schématise la préparation du matériel génétique à
transférer.
1/ pROTOCOL~ D'OBTENTION DE PLANTES TRANS~ TOUES DE
COT~ EXPRIMANT UN GENE DE LIPASE
a~ Matériel végétal
On utilise des graines de colza (Brass~ca
napus, Var Tapidor) qui sont obtenues dans le commerce.
Les qraines sont semées en serre et
cultivées dans des conditions standard. L'état sanitaire
des plantes est rigoureusement surveillé.
- Les ~eunes bourgeons (taille inférieure
à 3,5 mm) sont prélevés, stérilisés dans l'hypochlorite de
WO96/03511 P~/rl_ ~JI
-?~ ~irF~ 16 2~ 9556~
sodium pendant 30 minutes et Les microspores sont extraites
des anthères par broyage au Waring Blendor dans le milieu
de Huang et al (Huang et al 1990, Plant. Cell. Rep. 8,
594-597). Après filtration sur un tamis métallique de 50 um
de vide de maille, les microspores sont récupérées par
centrifugation 5 minutes à 100xg (Protocole décrit dans :
Jardinaud et al., 1993, Plant. Sci. 93, 177-184).
b) Construction génétique
- La construction génétique retenue met en
oeuvre le promoteur de la napine, le cDNA de la lipase de
Rhizopus ni veus et le terminateur NOS. Le promoteur de la
napine dirige l'expression de cette protéine dans un
compartiment protéique de la graine différent de celui où
s'accumulent les lipides. L'ensemble est introduit dans le
plasmide pRT1 contenant le gène de sélection pat utilisé
pour cribler les transformants en vue de former la
construction pRT1L.
Le détail de la construction est donné à la
figure 1 du dessin.
Le promoteur napine désigné "Prom. Nap" a
été isolé par l'équipe du Professeur Rask (Stalberg K. et
al, 1993, Plant Molecular Biology, 23 : 671-683). Le cDNA
de la lipase de Rhizopus niveus, désigné "Lip", a été isolé
par le Central Research Institute (Kugimiya et al., 1992,
Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716-719). Un codon
d'initiation, désigné "start codon", compatible avec
l'extrémité 5' du cDNA (disponible sur le marché) est
greffé sur cette extrémité. Sur l'extrémité 3' de
l'ensemble obtenu, désigné "lip", on greffe un terminateur
désigné NOS extrait du plasmide pRT1 ci-après évoqué et,
sur l'extrémité 5', le promoteur Nap.
La cassette d'expression ainsi obtenue est
introduite dans un plasmide désigné. "Blue-Script" (nom
commercial) en vue d'en réaliser:l'amplification.
La cassette d'expression amplifiée est
ensuite extraite de "Blue-Script" et introduite d~ns un
plasmide désigné pRT1 qui a été préparé en greffant le
promoteur désigné CaMV35S sur l'extrémité 5' du gène "pat"
WO 96/03511 ~ rl~
/~ r~ , 17 ~ ~ 9 5 5 6 0
codant pour la phosphinothricine acétyl transférase (gène
de sélection) et le terminateur NOS sur l'extrémlté 3'.
On obtient un plasmlde désigné pRT1L
r contenant la cassette d'expression visée.
c) Transfert de gène et production des plantes
transgéniques
Les microspores isolées en a)
(1o6 microspores ml 1) sont mises en suspension dans le
- milieu de Brewbaker et Kwack (J.L. Brewbaker et B.H. Kwack,
1963, Am. J. Bot. 50, p. 859-865) contenant 13 ~ de
saccharose et a~usté à pH 5,9. 50~g par ml du
plasmide pRTlL sont a~outés au milieu et des lmpulsions
electriques de 400 V/cm pendant 10 ms sont appliquées à la
suspension à l'aide d'un électroporateur "Jouan" (marque
déposée) (TRX, GHT) délivrant des impulsions en vague
carrée. Après 20 minutes de repos, le milieu de culture
(Huang et al.) contenant 100 mg/l de phosphinothricine est
ajouté aux microspores. Les microspores sont cultivées à
l'obscurité 24 h à 35~ C puis à 25~ C. Après 2 semaines de
culture un volume égal de milieu neuf est a~outé et les
microspores placées à la lumière sous photopériode 16 h
~our / 8 h obscurité.
Après environ 1 mois les embryons sont
transférés~en milieu Bs (Gamborg et al., 1979, Exp. Cell.
Res. 50, 151-158) contenant G3A3 1 ml/g, 20g/l saccharose
et solidifié par 8/l de gélifiant "Bacto Agar" (marque
déposée).
Les plantes régénérées rasistantes à la
phosphinothricine sont analysées en "southern" de façon à
vérifier la présence dans leur génome de la séquence codant
pour la lipase. Le stock chromosomique des plantes retenues
est doublé par la colchicine (0,1 g/l plus quelques gouttes
de teepol) et les plantes diploïdes fertiles produites sont
autofécondées.
--- -- Sur un nombre restreint de graines, on
recherche l'activité de la lipase. Les plantes présentant
des graines dont l'activité lipase est la plus élevée sont
retenues et les graines utilisées pour la multiplication
WO96/03511 ~ 18 2 1 9S5~O
des plantes jus~u'à obtention d'un stock de graines
suffisant pour réaliser les expérlences d'hydrolyse des
lipides de la graine par les lipases endogènes.
2/ HYDROLYSE ENZYMATIOUE DES LIPIDES DES GRAINES DE COLZA
OBTENUES
Les ~raines sont broyées, le broyat placé
dans un incubateur malntenu à la température constante
de 40~. Le broyat est soumis à une agitation permanente de
façon à augmenter le contact entre les lipides et la
lipase
Après 48 h d'hydrolyse, les acides gras
sont extraits par le chloroforme. Le chloroforme est
évaporé et les acides~gras récupérés.
