Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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SYSTEME D'EXPRESSION CONDITIONNEL
La présente invention concerne un nouveau système pour
I'expression conditionnelle de gènes. Elle concerne également l'utilisation de
ce système en thérapie génique ou cellulaire, pour cibler de manière très
5 sélective l'expression de gènes d'intérêt.
Les thérapies génique et cellulaire consistent à corriger une
déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) ou à
assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction
d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette
10 information génétique peut être introduite soit ex vivo dans une cellule
~ extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans
l'organisme (thérapie cellulaire), soit directement in vivo dans le tissu
approprié (thérapie génique). Différentes techniques existent pour effectuer
le transfert de gènes, parmi lesquelles des techniques diverses de
transfection impliquant des vecteurs chimiques ou biochimiques, naturels ou
synthétiques tels que des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et
al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al.,
Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987)
7413),1'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431),
lipides cationiques, etc. Une autre technique repose sur l'emploi de virus
comme vecteurs pour le transfert de gènes. A cet égard, différents virus ont
été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En
particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus
adéno-associés et les adénovirus. L'une des difficultés majeures pour le
développement de ces thérapies génique et cellulaire réside cependant dans
la sélectivité du traitement. Selon les applications, selon le gène à transférer,
il est important de pouvoir cibler certains tissus ou certaines parties
seulement de l'organisme afin de concentrer l'effet thérapeutique et de limiter
la dissémination et les effets secondaires. Ce ciblage peut être réalisé en
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utilisant des vecteurs présentant une spécificité cellulaire donnée. Une autre
approche consiste à utiliser des signaux d'expression spécifiques de certain
types cellulaires. A cet égard, des promoteurs dits spécifiques ont été décrits
dans la littérature, tels que le promoteur des gènes codant pour la pyruvate
5 kinase, la villine, la GFAP, le promoteur de la protéine intestinale de liaison
des acides gras, le promoteur de l'actine a des cellules du muscle lisse, ou le
promoteur des gènes de l'apo-AI, I'apo-AII, I'albumine humaine, etc.
Cependant, ces promoteurs présentent certains inconvénients et en
particulier ils présentent un certain bruit de fond transcriptionnel qui peut être
10 génant pour l'expression de gènes toxiques et ils sont limités à certaines
cellules et ne peuvent donc être utilisés pour toute application.
La présente invention décrit maintenant un nouveau système
d'expression conditionnel de gènes, particulièrement sélectif et efficace. Une
des caractéristiques avantageuses du système de l'invention réside dans sa
15 capacité à exprimer un gène non pas en fonction d'un type cellulaire, mais enfonction de la présence d'un élément cellulaire particulier ou d'une situation
physiologique particulière. Ce système fait en effet appel à des molécules
chimériques bispécifiques comprenant un domaine capable de lier
sélectivement une séquence définie d'ADN et un domaine détecteur capable
20 de lier spécifiquement un transactivateur ou un complexe transactivateur.
Un premier aspect de la présente invention réside plus
particulièrement dans la création et l'expression de molécules chimériques
bispécifiques comprenant un domaine capable de lier sélectivement une
séquence définie d'ADN et un domaine capable de lier spécifiquement un
25 transactivateur ou transrépresseur ou un complexe transactivateur ou
transrépresseur.
Un autre aspect de la présente invention réside dans une séquence
d'acide nucléique codant pour une molécule chimérique telle que définie ci-
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avant, ainsi que tout un vecteur d'expression comprenant ladite séquence
nucléique.
Un autre aspect de l'invention consiste en un système conditionnel
d'expression de gènes comprenant (i) une molécule chimérique telle que
5 définie ci-avant et (ii) une cassette d'expression comportant une séquence de
régulation, un promoteur minimal (dont l'activité dépend de la présence d'un
transactivateur) et ledit gène.
.
Un autre aspect de l'invention réside également dans un vecteur
d'expression comprenant
- une séquence nucléique codant pour une molécule chimérique telle
que définie ci-avant et
- ladite cassette d'expression.
Le système d'expression conditionnel de l'invention est
particulièrement approprié pour une utilisation en thérapie génique ou
15 cellulaire, pour cibler de manière très sélective l'expression de gènes
d'intérêt.
L'une des composantes du système de l'invention consiste donc en
des molécules chimériques bispécifiques particulières comprenant un
domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN et un
20 domaine capable de lier spécifiquement un transactivateur ou un complexe
transactivateur. La bispécificité des molécules de l'invention réside d'une partdans leur capacité à lier une séquence d'ADN définie (généralement
désignée séquence régulatrice ou opérateur) et d'autre part dans leur
capacité à recruter spécifiquement un domaine protéique transactivateur ou
25 transrépresseur permettant d'induire ou de réprimer l'expression de gènes.
L'invention porte particulièrement sur la mise au point de molécules
chimériques bispécifiques permettant le recrutement de tout facteur
transcriptionnel dont l'activation ou i'inactivation conduit à une situation
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physiopathologique. Les molécules chimériques bispécifiques selon
l'invention permettent ainsi le recrutement sélectif de transactivateurs
transcriptionnels spécifiques d'un état physiopathologique, la fixation de ces
facteur transcriptionnels à des promoteurs par l'intermédiaire d'une fixation
5 de ces molécules à des séquences d'ADN définies localisées près de ces
promoteurs (séquences régulatrices ou opérateur), et ainsi i'expression
conditionnelle de gènes (Figure 1).
L'invention porte également sur la mise au point de molécules
chimériques bispécifiques permettant le recrutement non pas d'une molécule
10 portant un domaine transactivateur mais d'un complexe transactivateur
transcriptionnel, c'est à dire d'un complexe formé entre une molécule cible
présente dans une cellule et une molécule portant un domaine
transactivateur (Figure 2). Dans ce cas, le complexe transactivateur est
préférentiellement formé au moyen d'une deuxième molécule chimérique
15 bispécifique comprenant un domaine transactivateur et un domaine de liaison
séléctif à ladite molécule cellulaire. La fixation de cette deuxième molécule
permet la formation d'un complexe binaire transactivateur transcriptionnel,
lequel complexe étant alors recruté par le système détecteur de l'invention.
La fixation de ce complexe ternaire à proximité de promoteurs permet ainsi
20 I'expression régulée de gènes. Ce type de construction permet
avantageusement d'élargir les conditions d'utilisation du système de
l'invention à la détection de toute molécule intracellulaire dépourvue de
domaine transactivateur, qu'il s'agisse d'une molécule endogène ou d'une
molécule d'origine infectieuse par exemple.
Le système de l'invention permet ainsi, grace à un système de
détection tres sélectif ("sensor") d'activer l'expression de gènes d'intérêt
uniquement en présence de protéines cibles. Il peut s'agir de facteurs
transcriptionnels apparaissant lors de situations physiologiques ou
physiopathologiques, ou de toute molécule endogène ou d'origine infectieuse
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par exemple. Le système de l'invention contient en effet un élément
~ détecteur très sensible et très séiectif permettant de conditionner l'expression
d'un gène à la présence, I'apparition ou la disparition de toute molécule dans
~ une cellule.
Dans le cadre de la présente invention, le terme transactivateur
désigne tout facteur transactivateur de la transcription ou toute protéine
comportant un domaine transactivateur transcriptionnel. Le complexe
transactivateur désigne le complexe formé entre une molécule présente
dans une cellule et une molécule bispécifique de l'invention comprenant un
domaine transactivateur et un domaine de liaison spécifique à ladite
molécule. Le système d'expression de l'invention peut être utilisé pour
recruter toute protéine transaetivatrice ou portant un domaine
transactivateur, et en particulier toute protéine d'origine virale, parasitaire,mycobactérienne ou cellulaire possédant une activité transactivateur
transcriptionnel. Parmi les facteurs transcriptionnels d'origine virale on peut
citer notamment la protéine Tat du virus VIH, les protéines E6/E7 du virus du
papillome ou encore la protéine EBNA du virus d'Epstein Barr. Ces protéines
possèdent un domaine transactivateur transcriptionnel et sont présentes
uniquement dans les cellules infectées par ces virus, c'est-à-dire dans des
conditions physiopathologiques particulières. Le système d'expression
conditionnel selon l'invention permet avantageusement une détection de
cette situation physiologique (I'apparition de ces transactivateurs spécifiques
de l'infection virale) et l'induction d'une expression sélective de gène(s)
donné(s). Parmi les protéines cellulaires, on peut citer préférentiellement la
protéine p53 mutée ou sauvage. La protéine p53 est constituée de 393
acides aminés. Sous sa forme sauvage, elle est un suppresseur de tumeur
capable de réguler négativement la croissance et la division cellulaire. Cette
activité est liée à la présence d'un domaine transactivateur transcriptionnel
dans la structure de la protéine p53, localisé dans la région N-terminale de la
protéine (résidus 1-100 environ). Dans certaines situations, p53 sauvage est
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également capable d'induire l'apoptose (Yonish-Rouach et al., Nature, 352,
345-347, 1991). Ces propriétés se manifestant en situation de stress où
l'intégrité de l'ADN cellulaire est menacée, p53 a été suggérée être un
"gardien du génome". La présence de p53 mutées dans environ 40 % des
tumeurs humaines, tous types confondus, renforce cette hypothèse et
souligne le rôle probablement crucial que jouent les mutations de ce gène
dans le développement tumoral (pour revues, voir Montenarh, Oncogene, 7,
1673-1680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992; Zambetti and
Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993). Dans le cadre de la présente
invention, il est possible de recruter sélectivement le domaine transactivateur
de la protéine p53 et ainsi d'induire l'expression controlée de gène(s)
uniquement dans les cellules contenant cette protéine. ll est particulièrement
intéressant selon l'invention de recruter spécifiquement les formes mutées
de la protéine p53 qui, comme indiqué ci-avant, apparaissent dans des
situations physiopathologiques d'hyperprolifération cellulaire (type cancer).
Ce ciblage peut être réalisé préférentiellement au moyen d'un domaine de
liaison spécifique aux formes mutées de la protéine p53. Il existe toutefois
une spéclficité de fait liée à l'accumulation des formes mutées qui possèdent
une demi-vie très supérieure à la forme sauvage.
Le système de l'invention peut également être utilisé pour induire
l'expression sélective de gène(s) par détection de toute molécule cible
présente dans une cellule. La protéine détectée est préférentiellement une
protéine apparaissant dans une cellule dans des situations anormales
(infection, hyperprolifération, etc). Il peut s'agir en particulier de protéinesvirales telles que des protéines de structure ou de fonction d'un virus, et
notamment du virus VIH, hépatite, herpès, etc. Il peut s'agir également de
protéines spécifiques d'un état d'hyperprolifération cellulaire telles que
notamment les protéines myc, fos, jun, les cyclines, etc.
L'une des propriétés des molécules chimériques de l'invention réside
donc dans leur capacité à se lier à des régions spécifiques d'ADN (régions
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régulatrices ou opérateur). Cette liaison permet d'apporter ie domaine
- transactivateur à proximité du promoteur et de ce fait d'activer l'expression
d'un gène placé sous contrôle dudit promoteur.
Le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN
5 présent dans les molécules de l'invention est essentiellement d'origine
protéique. Plus préférentiellement, ce domaine dérive d'une protéine
procaryote ou eucaryote capable d'interagir avec des séquences d'ADN. De
nombreuses études génétiques et structurales ont aujourd'hui permis de
définir précisément, au sein de protéines interagissant avec des séquences
10 d'ADN double brin, les domaines responsables de ces interactions.
Parmi ies protéines procaryotes interagissant avec des séquences
d'ADN double brin, on peut citer notamment des represseurs bactériens et,
préférentiellement, le répresseur tetracycline d'E. Coli et le répresseur Cro dubactériophage Lambda.
Le represseur tetracycline (tetR) de E.coli est une protéine de 210
acides aminés environ. Chez E.coli, tetR controle négativement la
transcription de gènes médiant la résistance à cet antibiotique au sein de
l'opéron tet. En absence de tétracycline, le répresseur tetR se fixe à l'ADN au
niveau d'une séquence spécifique (désignée séquence opérateur ou Tetop)
et réprime la transcription du gène de résistance. Au contraire, en présence
de tétracycline, le répresseur tetR ne se fixe plus à l'opérateur tetop
permettant une transcription constitutive du gène (Hillen.W and Wissmann.A.
(1989) in Protein-Nucleic Acid Interaction. Topics in Molecular and Structural
Biology.eds, Saenger.W. and Heinemann.U. (Macmillan, London), Vol.10. pp.
143-162). La séquence de tetR a été publiée (elle est reproduite notamment
dans W094/04682). La séquence d'ADN double brin spécifique de liaison de
tetR à l'ADN (Tetop) est composée du motif suivant:
TCTCTATCACTGATAGGGA (SEQ ID n~ 1).
Ce motif peut etre répété plusieurs fois pour augmenter l'affinité et
I'efficacité du système. Ainsi, La séquence régulatrice peut comprendre
-
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jusqu'à 10 motifs et, de préférence, contient 2 motifs (Tetop2) ou 7 motifs
(Tetop7) (voir Figure 3).
La protéine Cro a été définie à l'origine comme un régulateur de
l'expression du répresseur Cl (Eisen.H. et coll. (1970) PNAS 66, pp855). Le
clonage du gène cro a permis l'identification d'une protéine de 66 acides
aminés (SEQ ID n~ 21; Roberts;T et coll. (1977) Nature 270, pp274). Cro
exerce son role physiologique en se fixant préférentiellement à l'opérateur
OR3 de Lambda.
La séquence d'ADN double brin spécifique de liaison de Cro à l'ADN (région
désignée OR3) est composée des bases suivantes:
TATCACCGCAAGGGATA (SEQ ID n~ 2)
Cette région peut également être répétée plusieurs fois pour augmenter
l'affinité et l'efficacité du système (voir Figure 4).
Parmi les protéines eucaryotes interagissant avec des séquences
d'ADN double brin, on préfère utiliser pour la construction des molécules de
l'invention les protéines ou domaines dérivés des protéines STAT, p53 ou
NFkB (Inoue et al., PNAS 89 (1992) 4333). Concernant la protéine p53, son
domaine de liaison à l'ADN est localisé dans la région centrale de la protéine
et, plus précisément, dans la région comprise entre les acides aminés 102 à
292 (Pavletich et al., Genes & Dev. 7 (1993) 2556).
Comme indiqué ci-avant, le domaine capable de lier sélectivement une
séquence définie d'ADN présent dans les molécules de l'invention est
préférentiellement dérivé d'une protéine procaryote ou eucaryote capable
25 d'interagir avec une région d'ADN double-brin. Le domaine utilisé pour la
construction des molécules de l'invention peut être constitué de l'ensemble
de la protéine ou d'un fragment de celle-ci comportant la région d'interaction
avec l'ADN. Ce domaine a été identifié pour différentes protéines et
notamment TetR (voir par exemple Berens et al., J. Biol. Chem. 267 (1992)
30 1945). Il peut également être constitué d'un dérivé de cette protéine ou du
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fragment ayant conservé les propriétés de laison à l'ADN. De tels dérivés
sont notamment des protéines présentant des modifications d'un ou plusieurs
acides aminés, par exemple pour permettre leur fusion avec les autres
domaines des molécules de l'invention, préparées selon les techniques
5 classiques de la biologie moléculaire. Des dérivés des protéines TetR et Cro
par exemple ont été décrits dans la littérature, possédant des mutations
ponctuelles eVou des délétions (Hecht et al., J. Bact. 175 (1993) p. 1206;
Altschmied et al., EMBO J 7 (1988) 4011; Baumeister et al., Proteins 14
(1992) 168; Hansen et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 14030). La capacité de
10 liaison de ces dérivés à une séquence définie d'ADN peut ensuite être testée
par incubation du dérivé préparé avec la séquence régulatrice et détection
des complexes formés. En outre, les dérivés peuvent également être-des
protéines ayant des propriétés améliorées de liaison à l'ADN (spécificité,
affinité, etc).
Selon un mode préféré de mise en oeuvre, le domaine capable de lier
sélectivement une séquence définie d'ADN présent dans les molécules de
l'invention est dérivé d'une protéine procaryote. Ce type de construction est
particulièrement avantageux puisque ces protéines, d'origine non-humaine,
20 reconnaissent des sites d'ADN double brin d'au moins 14 nucléotides. La
probabilité de trouver la même séquence au sein du genome humain est
quasi nulle et donc le système d'expression obtenu est d'autant plus s~lectif.
Dans un mode de réalisation préféré, le domaine capable de lier
sélectivement une séquence définie d'ADN présent dans les molécules de
25 I'invention est dérivé des protéines tetR ou Cro. Il est tout particulièrement
avantageux d'utiliser les protéines tetR ou Cro (SEQ ID n~ 21) complètes.
Le domaine capable de lier spécifiquement le transactivateur
transcriptionnel ou le complexe transactivateur transcriptionnel présent dans
les molécules de l'invention peut être de différents types. Il peut s'agir en
30 particulier d'un domaine d'oligomérisation dans le cas où le transactivateur
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ou le complexe transactivateur ciblé comporte également un tel domaine. Il
peut également s'agir de tout domaine synthétique ou naturel connu pour
interagir avec ledit transactivateur ou complexe transactivateur. Il peut
encore s'agir d'un anticorps ou d'un fragment ou dérivé d'un anticorps dirigé
5 contre le transactivateur ou complexe transactivateur.
Parmi les domaines d'oligomérisation utilisables dans le cadre de
l'invention on peut citer plus particulièrement les leucine-zipper, les domainesSH2 ou les domaines SH3 par exemple. Les leucine-zipper sont des hélices
cc amphipatiques qui contiennent 4 ou 5 leucines tous les 7 acides aminés.
10 Cette périodicité permet la localisation des leucines à peu près à la même
position sur l'hélice c~. La dimérisation est sous tendue par des interactions
hydrophobes entre les chaines latérales des leucines de deux domaines
zipper contigus (Vogt et al., Trends In Bioch. Science 14 (1989) 172). Les
domaines SH2 sont connus pour interagir avec des séquences peptidiques
15 spécifiques phosphorylées en tyrosine. Les domaines SH3 peuvent être
utilisés pour former un oligomère avec tout transactivateur ou complexe
transactivateur comportant le peptide riche en proline correspondant
(Pawson et al., Current Biology 3 (1993) 434). On peut également utiliser des
régions de protéines connues pour induire une oligomérisation, telles que
20 notamment la région C-terminale de la protéine p53. L'utilisation de cette
région permet de recruter de manière sélective les protéines p53 présentes
dans une cellule. On utilise préférentiellement dans le cadre de l'invention
une région de p53 comprise entre les acides aminés 320-393 (SEQ ID n~ 3),
302-360 ou 302-390.
Parmi les domaines synthétiques ou naturels connus pour interagir
avec la molécule comportant l'élément transactivateur ciblé, on peut citer par
exemple la région de la protéine MDM2 interagissant avec la protéine p53.
Ce type de construction permet ainsi de recruter comme transactivateur la
protéine p53 sauvage ou mutée.
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Un domaine de liaison spécifique au transactivateur transcriptionnel
- préféré de l'invention est constitué par un anticorps ou un fragment ou dérivé
d'anticorps. Les fragments ou dérivés d'anticorps sont par exemple les
fragments Fab ou F(ab)'2, les régions VH ou VL d'un anticorps ou encore
5 des anticorps simple chaine (ScFv) comprenant une région VH liée à une
région VL par un bras. Ce type de domaine est particulièrement avantageux
puisqu'il peut être dirigé contre toute molécule.
Les anticorps, molécules de la superfamille des immunoglobulines,
sont constitués de différentes chaines (2 lourdes (H) et 2 légères (L)) elles
10 memes composées de différents domaines (domaine variable (V) domaine
de jonction (J), etc). Le domaine de liaison au transactivateur ou complexe
transactivateur présent dans les molécules de l'invention est
avantageusement constitué d'un fragment ou dérivé d'anticorps comprenant
au moins le site de liaison de l'antigène. Ce fragment peut être soit le
15 domaine variable d'un chaine légère (VL) ou lourde (VH), éventuellement
sous forme de fragment Fab ou F(ab')2 ou, préférentiellement, sous forme
d'anticorps simple chaine (ScFv). Les anticorps simple chaine utilisés pour la
construction des molécules de l'invention sont constitués d'un peptide
correspondant au site de liaison de la région variable de la chaine légère d'un
20 anticorps relié par un bras peptidique à un peptide correspondant au site de
liaison de la région variable de la chaine lourde d'un anticorps. La
construction de séquences d'acides nucléiques codant pour de tels anticorps
modifiés selon l'invention a été décrite par exemple dans le brevet
US4,946,778 ou dans les demandes WO94/02610, W094/29446. Elle est
25 illustrée dans les exemples.
Une construction préférée selon la présente invention comprend un
domaine de liaison à une protéine p53. Il s'agit plus préférentiellement d'un
dérivé d'anticorps dirigé contre une protéine p53. Un mode de réalisation
particulier est constitué par un anticorps simple chaine dirigé contre p53. A
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titre d'exemple particuiier, on utilise le ScFv de séquence SEQ ID n~ 4 dont la
construction est décrite dans les exemples.
Le domaine de liaison à l'ADN et le domaine de liaison au
transactivateur sont généralement reliés entre eux par l'intermédiaire d'un
bras. Ce bras est généralement constitué d'un peptide conférant une
flexibilité suffisante pour que les deux domaines des molécules de l'invention
puissent être fonctionnels de manière autonome. Ce peptide est
généralement composé d'acides aminés non chargés, n'interférant pas avec
l'activité des molécules de l'invention, tels que par exemple la glycine, la
serine, le tryptophane, la Iysine ou la proline. Le bras comprend
généralement de 5 à 30 acides aminés et, de préférence, de 5 à 20 acides
aminés. Des exemples de bras peptidiques utilisables pour la construction
des molécules de l'invention sont par exemple:
- GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID n~ 5)
- PKPSTPPGSS (SEQ ID n~ 6) dont la séquence codante est
CCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCA (SEQ ID n~ 6).
Des exemples préférés de molécule selon l'invention sont notamment
les molécules suivantes:
a) ScFv-tag-Hinge-TET ou Cro (Figure 5A)
Ce type de molécule comporte:
- un domaine de liaison à un transactivateur constitué d'un anticorps
simple chaine,
- une séquence peptidique tag reconnue par un anticorps monoclonal
permettant la détection immunologique de la molécule. Cette séquence peut
être par exemple l'épitope VSV de séquence MNRLGK (SEQ ID n~ 7) dont la
séquence codante est ATGAACCGGCTGGGCAAG (SEQ ID n~ 7), ou
I'épltope myc de séquence EQKLISEEDLN (SEQ ID n~ 8) dont la séquence
codante est GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAT (SEQ ID n~
8), reconnu par l'anticorps 9E10.
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- un bras peptidique de séquence SEQ ID n~ 6 (Hinge) et
- un domaine de liaison à l'ADN constitué de la protéine TET ou Cro.
Préférentiellement, le ScFv est dirigé contre une protéine p53.
b) ScFv-Hinge-TET ou Cro (Figure SB)
Ce type de molécule comporte les mêmes éléments que la molécule
a) à l'exception de la séquence tag qui est absente.
c) ScFv-TET ou Cro (Figure 5C)
Ce type de molécule comporte simplement un domaine de liaison à
un transactivateur constitué d'un anticorps simple chaine et un domaine de
liaison à l'ADN constitué de la protéine TET ou Cro. Il ne comporte ni bras, ni
séquence tag. Dans cette construction, le domaine de liaison au
transactivateur est localisé dans la partie N-terminale de la molécule et le
domaine de liaison à l'ADN dans la partie C-terminale.
d) TET ou Cro-ScFv (Figure 5D)
Ce type de molécule est similaire au type c) ci-dessus. La différence
réside essentiellement dans l'agencement des domaines: le domaine de
liaison au transactivateur est maintenant localisé dans la partie C-terminale
de la molécule et le domaine de liaison à l'ADN dans la partie N-terminale.
e) TET ou Cro-Hinge-ScFv (Figure 5E)
Ce type de molécule comporte les mêmes éléments que la molécule
b) ci-dessus. La différence réside essentiellement dans l'agencement des
domaines: le domaine de liaison au transactivateur est maintenant localisé
dans la partie C-terminale de la molécule et le domaine de liaison à l'ADN
dans la partie N-terminale.
f) Oligom-tag-Hinge-TET ou Cro (Figure 5A)
Ce type de molécule est semblable au type a), à l'exception du
domaine de liaison au transactivateur qui est remplacé par le domaine
d'oligomérisation à la protéine p53 de séquence SEQ ID n~ 3. Cette molécule
permet de recruter les protéines p53 mutées apparaissant dans les cellules
tumorales.
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g) Oligom-Hinge-TET ou Cro (Figure 5B)
Ce type de molécule est semblable au type b), à l'exception du
domaine de liaison au transactivateur qui est remplacé par le domaine
d'oligomérisation à la protéine p53 de séquence SEQ ID n~ 3.
h) Oligom-TET ou Cro (Figure 5C)
Ce type de molécule est semblable au type c), à l'exception du
domaine de liaison au transactivateur qui est remplacé par le domaine
d'oligomérisation à la protéine p53 de séquence SEQ ID n~ 3.
i) TET ou Cro-Oligom (Figure 5D)
Ce type de molécule est semblable au type d), à l'exception du
domaine de liaison au transactivateur qui est remplacé par le domaine
d'oligomérisation à la protéine p53 de séquence SEQ ID n~ 3.
j) TET ou Cro-Hinge-Oligom (Figure 5E)
Ce type de molécule est semblable au type e), à l'exception du
15 domaine de liaison au transactivateur qui est remplacé par le domaine
d'oligomérisation à la protéine p53 de séquence SEQ ID n~ 3.
Par ailleurs, dans chacune de ces molécules, le bras peptidique peut
être aisément remplacé par la séquence (G4S)3 (SEQ ID n~ 5).
Un autre objet de la présente invention réside dans une séquence
20 d'acide nucléique codant pour une molécule chimérique telle que définie ci-
avant. Il s'agit avantageusement d'une séquence d'ADN, notamment d'ADNc.
Il peut également s'agir d'un ARN. Les séquences de l'invention sont
généralement construites par assemblage, au sein d'un vecteur de clonage,
des séquences codant pour les différents domaines selon les techniques
25 classiques de la biologie moléculaire. Les séquences d'acides nucléiques de
l'invention peuvent éventuellement être modifiées par voie chimique,
enzymatique ou génétique, en vue de générer des domaines stabilisés, eVou
multifonctionnels, eVou de taille réduite, eVou dans le but de favoriser leur
localisation dans tel ou tel compartiment intracellulaire. Ainsi, les séquences
30 d'acides nucléiques de l'invention peuvent comprendre des séquences
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codant pour des peptides de localisation nucléaire (NLS). En particulier, il est~ possible de fusionner les séquences de l'invention avec la séquence codant
pour le NLS du virus SV40, dont la séquence peptidique est la suivante:
PKKKRKV (SEQ ID n~ 9) (Kalderon et al, Cell 39 (1984) 499).
Les séquences nucléiques selon l'invention font avantageusement
partie d'un vecteur d'expression, qui peut être de nature plasmidique ou
virale.
Un autre objet de la présente invention réside dans une protéine de
fusion comprenant un domaine transactivateur transcriptionnel et un domaine
de liaison spécifique à une molécule donnée, éventuellement reliés par un
bras peptidique, ainsi que toute séquence d'acide nucléique codant pour une
telle fusion. Le domaine transactivateur peut être issu de toute protéine
transactivateur transcriptionnel, tel que p53, VP16, EBNA, E6/E7, Tat, etc.
Un autre objet de l'invention consiste en un système conditionnel
d'expression de gènes comprenant:
- une molécule chimérique telle que définie ci-avant et
- une cassette d'expression comportant une séquence régulatrice, un
promoteur transcriptionnel minimal et ledit gène.
La cassette d'expression contient les éléments nécessaires à
I'activation de l'expression du gène par le transactivateur ou complexe
transactivateur recruté par la molécule bispécifique. Ainsi, la séquence
régulatrice est la séquence de liaison à l'ADN de la molécule chimérique
exprimée. Lorsque le domaine de liaison à l'ADN de la molécule chimérique
- est représenté par tout ou partie de TetR, la séquence régulatrice comprend
la séquence SEQ ID n~ 1 ou un dérivé de celle-ci, éventuellement répétée
plusieurs fois. Il s'agit préférentiellement de la séquence op2 (comprenant 2
motifs Tetop répétés) ou Op7 (comportant 7 motifs Tetop répétés telle que
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décrite par exemple dans Weinmann et al., The Plant Journal 5 (1994) 559).
De même, lorsque le domaine de liaison à l'ADN de la molécule chimérique
est représenté par tout ou partie de Cro, la séquence régulatrice comprend la
séquence SEQ ID n~ 2 ou un dérivé de celle-ci, éventuellement répétée
5 plusieurs fois. Il s'agit préférentiellement de la séquence OR3. Les dérivés
des séquences SEQ ID n~ 1 et 2 peuvent être toute séquence obtenue par
modification de nature génétique (mutation, délétion, addition, répétition, etc)et conservant la capacité de lier spécifiquement une protéine. De tels dérivés
ont été décrits dans la littérature (Baumeister et al précitée, Tovar et al., Mol.
Gen. Genet. 215 (1988) 76, W094/04672).
Concernant le promoteur transcriptionnel minimal, il s'agit d'un
promoteur dont l'activité dépend de la présence d'un transactivateur. De ce
fait, en l'absence de la molécule chimérique, le promoteur est inactif et le
gène n'est pas ou peu exprimé. En revanche, en présence de la molécule
15 chimérique, le transactivateur ou complexe transactivateur recruté permet
d'induire l'activité du promoteur minimal et ainsi l'expression du gène
d'intérêt. Le promoteur minimal est constitué généralement d'une boite TATA
ou INR. Ces éléments sont en effet les éléments minimum nécessaires à
l'expression d'un gène en pr~sence d'un transactivateur. Le promoteur
20 minimal peut être préparé à partir de tout promoteur par modification
génétique. A titre d'exemple préféré de promoteur candidat on peut citer le
promoteur du gène de la thymidine kinase. Des résultats interessants ont
plus précisément été obtenus avec un promoteur minimal dérivant du
promoteur TK composé des nucléotides -37 à +19. Le promoteur minimal
25 peut également dériver du CMV humain. En particulier, il peut être constitué
du fragment compris entre les nucléotides -53 à +75 ou -31 à +75 du CMV.
Tout promoteur conventionnel peut toutefois être utilisé tel que par exemple
le promoteur des gènes codant pour la chloramphénicol acétyle transférase,
la ~-galactosidase ou encore la luciférase.
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La cassette d'expression est avantageusement constituée des
éléments suivants:
- Comme séquence régulatrice, une séquence comprenant la
séquence SEQ ID n~ 1 ou 2 ou un dérivé de celles-ci, éventuellement
5 répétée piusieurs fois,
- Comme promoteur minimal, un promoteur dérivé du promoteur du
gène de la thymidine kinase (TK),
- une séquence codante d'intérêt.
Encore plus préférentiellement, le promoteur minimal est constitué de
10 la région -37 à +19 du promoteur du gène de la thymidine kinase.
Avantageusement, la cassette d'expression est choisie parmi les
cassettes de structure Tetop2.TK-Gène; Tetop7.TK-Gène et OR3.TK-Gène.
Un autre aspect de l'invention réside dans un vecteur d'expression
comprenant une séquence d'acides nucléique codant pour une molécule
15 chimérique et une cassette d'expression telles que définies ci-avant. Dans les
vecteurs de l'invention, la séquence d'acides nucléiques codant pour la
molécule chimérique et la cassette d'expression peuvent être insérées dans
la même orientation ou dans les orientations opposées. Par ailleurs, le
vecteur peut être de nature plasmidique ou virale.
Parmi les vecteurs viraux, on peut citer plus préférentiellement les
adénovirus, les rétrovirus, les virus de l'herpès ou encore les virus adéno
associés. Les virus selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire
incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible.
Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans !e cadre de la
25 présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires
à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être
- soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit
substituées par d'autres séquences et notamment par les séquences de
l'invention. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les
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séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des
particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes,
dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été
5 caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la
présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5)
ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi
les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente
invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine,
(exemple: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine,
aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, I'adénovirus
d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un
adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par
exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des
15 adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, le génome des adénovirus recombinants de
l'invention comprend au moins les ITR et la région d'encapsidation d'un
adénovirus, et la séquence d'acides nucléiques codant pour une molécule
chimérique et une cassette d'expression telles que définies ci-avant. Plus
20 préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la
région E1 au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut
être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du
métier, et notamment par suppression totale, substitution (par exemple par
les séquences de l'invention), délétion partielle, ou addition d'une ou
25 plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications
peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple,
au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement
au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être
modifiées, et notamment la région E3 (WO 95/02697), E2 (WO 94/28938),
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E4 (W0 94/28152, W0 94/12649, W0 95/02697) et L5 (W0 95/02697).
- Selon un mode préféré de mise en oeuvre, I'adénovirus selon l'invention
comprend une délétion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de
~ réalisation préféré, il comprend une délétion dans région E1 au niveau de
laquelle sont insérées la région E4 et les séquences de l'invention (Cf
FR 94 13355).
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent
être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero
et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMB0 J. 3 (1984)
2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison
homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre les
séquences d'ADN de l'invention (séquence codant pour la molécule
chimérique + cassette d'expression). La recombinaison homologue se
produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une
lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence
(i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences
capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif,
de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de
recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée
de rein embr,vonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977)
59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche
du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de
complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans
les demandes n~ W0 94/26914 et W095/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et
purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme
illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à
ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des
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cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont
capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la
croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils
ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le
5 génome des MV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend
environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée
inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour
le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant
les fonctions d'encapsidation: la partie gauche du génome, qui contient le
10 gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes
viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les
protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des MV pour le transfert de
gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment
WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528).
Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des MV, dans
lesquelles les gènes rep eVou cap sont délétés et remplacés par un gène
d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture)
ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV
20 recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-
transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire
humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant les
séquences nucléiques de l'invention (séquence codant pour la molécule
chimérique + cassette d'expression) bordée de deux régions répétées
25 inversées (ITR) d'MV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation
(gènes rep et cap) d'MV. Les AAV recombinants produits sont ensuite
purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction
de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir
notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242,
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EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick,
~ BioTechnology 3 (1985) 689, etc.
En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant
sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs
d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus
comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et
trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants
dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement
délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide
nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir
de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine
moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine
moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV
("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus
de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention, un
plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et
les séquences de l'invention (séquence codant pour la molécule
chimérique + cassette d'expression) est généralement construit, puis
utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable
d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide.
Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer
les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été
décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719);
la lignée PsiCRlP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12
(WO89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent
- comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité
transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues,
comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987)
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1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des
techniques classiques.
Un exemple de construction d'un virus recombinant défectif selon
l'invention (rétrovirus) est décrit sur la figure 8. Cette figure souligne un
5 deuxième avantage des constructions selon l'invention qui réside dans
l'absence d'expression du gène d'intérêt dans les lignées d'encapsidation.
Ces lignées étant dépourvues du transactivateur ou complexe
transactivateur recruté par le système de l'invention, le promoteur est
inactif et le gène n'est pas exprimé dans la cellule de production ffigure
10 8A). Ce n'est que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule cible,c'est-à-dire une cellule dans laquelle est présent le transactivateur ou
complexe transactivateur recruté par le système de l'invention, que le
gène est effectivement exprimé (Figure 8B). Ceci est particulièrement
avantageux pour la construction de virus contenant des gènes dont
15 I'expression serait toxique pour les cellules (gènes Grb3-3, IL-2, Toxine
diphtérique, etc).
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout
particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus
recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés
20 particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes dans les cellules
tumorales.
Différents types de vecteurs non-viraux peuvent également être
utilisés dans le cadre de l'invention. Le système d'expression conditionnel
selon l'invention peut en effet être incorporé dans un agent non viral
25 capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques
dans des cellules eucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques
représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier
pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de
limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter.
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Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales,
- compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation
cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le
cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature
5 polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent
tous des charges polycationiques.
Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères
cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyéthylène immine et
DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants sont les
10 plus avantageux. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de
promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces
derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc)
et différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc).
Plus récemment, il a été développé le concept de la transfection ciblée,
15 médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN
grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la
membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et
le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type
cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à
20 I'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi
été décrit.
La présente invention a également pour objet toute composition
pharmaceutique comprenant un vecteur tel que défini ci-avant. Ces
compositions peuvent être formulées en vue d'une administration par voie
25 topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-
cutanée, intraoculaire, etc. Préférentiellement, la composition selon
l'invention contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une
- formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines
(phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium
30 ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou
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de compositions sèches, notamment Iyophilisées, qui, par addition selon le
cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de
solutés injectables. S'agissant des rétrovirus, ils peut être avantageux
d'utiliser directement les cellules d'encapsidation ou des cellules infectées ex5 vivo en vue de leur réimplantation in vivo, éventuellement sous forme de néo-
organes (WO 94/24298).
Les doses de vecteur utilisées pour l'injection peuvent être
adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction
du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de
10 la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus
recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de
doses comprises entre 104 et 1014 pfulml. Pour les MV et les
adénovirus, des doses de 106 à 101~ pfu/ml peuvent également être
utilisées. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir
15 infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une
culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures,
du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de
détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées
dans la littérature.
Le système d'expression selon l'invention et les vecteurs
correspondants sont particulièrement utiles pour controler l'expression de
gènes d'intérêt dans le cadre de thérapies cellulaire ou génique. Ils
peuvent ainsi être utilisés pour contrôler l'expression de toute séquence
25 codante d'intérêt, et notamment d'une séquence codant pour un produit
thérapeutique, qu'il s'agisse d'un peptide, polypeptide, protéine, acide
ribonucléiques, etc. Plus particulièrement, le gène est une séquence
d'ADN (ADNc, ADNg, ADN synthétique, humain,animal, végétal, etc)
codant pour un produit protéique tel que des enzymes, les dérivés
30 sanguins, les hormones, les Iymphokines: interleukines, interférons, TNF,
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etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou
Ieurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques:
BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les
apolipoprotéines : ApoAI, ApoAlV, ApoE, etc (FR 93 05125), la
dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes
suppresseurs de tumeurs: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93
04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation
: Facteurs Vll, Vlll, IX, etc, ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline
naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), un ARN ligand (W091/19813) etc.
Le gène d'intérêt peut également être une séquence antisens,
dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de
gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent
par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN
complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en
protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308.
La présente invention est particulièrement adaptée à l'expression
de séquences codant pour des facteurs toxiques. Il peut s'agir en
particulier de poisons pour les cellules (toxine diphtérique, toxine
pseudomonas, ricine A, etc) de produit induisant une sensibilité à un agent
externe (gènes suicides :Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc) ou
encore de gènes tueurs capables d'induire la mort cellulaire (Grb3-3
(PCT/FR94/00542), ScFv anti-ras (W094/29446), etc). Le système de
l'invention permet en effet de produire des vecteurs notamment viraux
contenant ces séquences sans toxicité pour les cellules de production,
puis ensuite d'induire l'expression de ces molécules toxiques
sélectivement dans des cellules cibles présentant le transactivateur ou
complexe transactivateur désiré. Ce type de construction est donc
particulièrement adapté à des stratégies de thérapies antitumorales par
exemple, dans lesquelles l'objectif est de détruire sélectivement les
cellules affectées. Ce système est également particulièrement intéressant
-
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pour l'expression de cytokines, interférons, TNF ou TGF par exemple, dont
une production incontrôlée peut avoir des effets secondaires très
marqués.
La présente demande sera décrite plus en détail à l'aide des
5 exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non
limitatifs.
Légende des Figures
Fi~ure 1: Représentation du système d'expression conditionnel selon
l'invention permettant le recrutement sélectif d'un transactivateur au moyen
10 d'un domaine d'oiigomérisation (A) ou d'un ScFv (B).
Fi~ure 2: Représentation du système d'expression conditionnel selon
l'invention permettant le recrutement sélectif d'un complexe transactivateur.
Fi~ure 3: Représentation d'une cassette d'expression selon l'invention
comportant une séquence régulatrice Tetop7, un promoteur minimal (boite
15 TATA) et un gène (CAT).
Figure 4: Représentation d'une cassette d'expression selon l'invention
comportant une séquence régulatrice OR3, un promoteur minimal (boite
TATA) et un gène (CAT).
Fi~ure 5: Représentation de molécules chimériques bispécifiques selon
20 I'invention.
Fi~ure 6: Construction de séquences d'ADN codant pour des molécules
chimériques bispécifiques selon l'invention.
Fiqure 7: Représentation de constructions chimériques contrôle.
Fiqure 8: Structure et fonctionnement d'un vecteur viral (rétrovirus) selon
25 I'invention.
Fi~ure 9: Etude de l'interaction entre les molecules hybrides de l'invention et
une sequence regulatrice.
Fi~ure 10: Etude de l'interaction entre les molecules hybrides de l'invention etdifferentes formes de la proteine p53.
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Fi~ure 11: Mise en evidence de l'activation de la cassette Tet-Luc dans les
~ cellules SAOS-2.
Fi~ure 12: Mise en evidence de l'activation de la cassette Tet-Luc dans les
cellules H358.
5 Techniques générales de Biologie Moléculaire
Les méthodes classiques de biologie moléculaires telles que la
centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium-bromure
d'éthidium, les digestions par les enzymes de restriction, l'électrophorèse sur
gel,la transformation dans E.coli, la précipitation des acides nucléiques etc,
10 sont décrites dans la littérature (Maniatis et al.,1989).
Les enzymes ont été fournies par New-England Biolabs (Beverly, MA).
Pour les ligatures les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des
gels d'agarose de 0,8 à 1,5 %, purifiés par GeneClean (Bl0101, LaJolla CA)
et incubés de nuit à 14~C dans un tampon Tris-HCI pH 7.4 50 mM, MgCI2 10
15 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4.
L'amplification par PCR, (Polymerase Chain Reaction), a également
été réalisée selon Maniatis et al.,1989, avec les spécifications suivantes:
- Concentration en MgCI2 portée à 8mM.
- Température de dénaturation 95~C, température d'hybridation 55~C,
20 température d'allongement 72~C. Ce cycle a été répété 25 fois dans un
PE9600 Thermalcycler (Perkin Elmer, Norwalk CO).
Les oligonucléotides sont synthétisés en utilisant la chimie des
phosphoramidites protégés en B par un groupement cyanoéthyl, (Sinha
al.,1984, Giles 1985), avec le synthétiseur automatique d'ADN Applied
25 Biosystem modèle 394, (Applied Biosystem, Foster City CA), selon les
- recommandations du fabricant.
Le séquencage a été éffectué sur des matrices double-brin par la
méthode de terminaison de chaînes en utilisant des amorces fluorescentes.
Nous avons utilisé le kit se séquencage Taq Dye Primer Kit de chez Applied
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Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA) selon les spécifications du
fabricant.
Exemples
Exem~le 1: Constrùction de cassettes d'expression com~ortant une
5 sé~uence de ré~ulation. un Dromoteur transçri,otionnel minimal et un ~ène.
1.1. Construction du plasmide pTETop7/CAT
Le plasmide pTETop7/CAT contient les éléments suivants (Figure 3):
- Une séquence de régulation constituée d'une séquence d'interaction
avec le répresseur tétracycline tetR composée de 7 motifs Tetop (SEQ ID
10 n~ 1) répétés;
- un promoteur minimal dérivé du promoteur du gène de la thymidine
kinase (région -37 à + 19 portant la boite TATA);
- la séquence codant pour la chloramphénicol acétyl transférase (CAT)
sous contrôle dudit promoteur minimal.
Ce plasmide a été construit par clonage du fragment Smal-Bglll du
plasmide pUHD10-7 (WO 94/29442) dans le plasmide pKK232-8
(Pharmacia) préalablement digéré par Smal et BamHI.
1.2. Construction du plasmide pOR3/CAT
Le plasmide pOR3/CAT contient les éléments suivants (Figure 4):
- Une séquence de régulation constituée d'une séquence OR3
d'interaction avec le répresseur Cro (SEQ ID n~ 2);
- un promoteur minimal dérivé du promoteur du gène de la thymidine
kinase (région -37 à + 19 portant la boite TATA);
- la séquence codant pour la chloramphénicol acétyl transférase (CAT)
25 sous contrôle dudit promoteur minimal.
Ce plasmide a été construit de la manière suivante: La séquence OR3
d'interaction avec le répresseur Cro a été synthétisée artificiellement. Pour
cela, les deux oligonucléotides suivants ont été synthétisés:
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Oligo 5533 (SEQ ID n~ 22): 5'-GATCCTATCACCGCMGGGATAA-3'
~ Oligo 5534 (SEQ ID n~ 23): 3'-GATAGTGGCGTTCCCTA I I I CGA-5'
Ces deux oligonucléotides ont ensuite été hybridés pour reconstituer
la séquence double brin OR3 bordée de séquences permettant son clonage
5 orienté comme suit:
GATCCTATCACCGCAAGGGATAA
GATAGTGGCGTTCCCTATTTCGA
1.3. Construction de cassettes d'expression de gènes toxiques
Les cassettes d'expression de gènes toxiques sont obtenues à partie
10 des plasmides décrits ci-dessus (1.1. et 1.2.) par remplacement de la
séquence CAT par la séquence codant pour le produit toxique, de préférence
le gène Grb3-3 (PCT/FR94/00542), le gène de la thymidine kinase, le gène
codant pour la toxine diphtérique ou pseudomonas, etc.
Exem~le 2: Construction d'un anticorDs simple chaine sDécifique de D53
Cet anticorps simple chaine a été construit selon le protocole suivant:
- Les cDNA codant pour les régions VH et VL ont été obtenus à partir
de l'hybridome pAb421 produisant un anticorps anti-p53. Pour cela, les ARN
totaux de l'hybridome ont été extraits et soumis à une réaction de
transcription inverse en utilisant des hexamères random comme amorces.
20 L'utilisation de ce type d'amorce permet d'éviter l'emploi d'amorces
spécifiques des immunoglobulines. Les clones d'ADNc obtenus ont une
longueur suffisante pour cloner les régions V. Toutefois, dans la mesure où
ils représentent une faible fraction des cDNA totaux présents, une réaction
préalable d'amplification doit être réalisée pour produire suffisamment de
25 DNA pour le clonage. Pour cela, les ADNc codant pour les régions VH et VL
ont été amplifiés séparément. Les amorces utilisées sont des
oligonucléotides hybridant au niveau des extrémités opposées des régions
variables de chaque chaine (H et L). Le produit d'amplification utilisant les
amorces spécifiques des chaines lourdes est un fragment de 340 paires de
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bases environ. Le produit d'amplification utilisant les amorces spécifiques des
chaines légères est un fragment de 325 paires de bases environ.
- Après purification, les ADNc codant pour les régions VH et VL de
I'anticorps ont été assemblés en une chaine unique au moyen d'un bras
5 nucléotidique (L). Le bras nucléotidique a été construit de telle sorte que
l'une des extrémités se lie à l'extrémité 3' de l'ADNc codant pour la région VH
et l'autre à l'extrémité 5' de l'ADNc codant pour la région VL. La séquence du
bras code pour le peptide SEQ ID n~ 5. La séquence assemblée de 700 pb
environ contient, sous forme d'un fragment Ncol-Notl, I'enchainement VH-L-
VL dont la séquence est représentée SEQ ID n~ 4 (acides aminés 9 à 241).
Cette séquence inclut également en C-terminal la séquence tag de myc
(résidus 256 à 266).
FxemDle 3: Construction de séquences d'acides nucléiques codant pour des
molécules chiméri~ues bispécifi~ues contant un domaine de liaison à un
15 transactivateur constitué d'un anticorDs simple chaine (ScFv).
3.1. Construction d'un plasmide comportant une séquence ScFv-myc-
Hinge-TetR ou Cro (Figures 5A et 6)
Le fragment Ncol-Notl contenant l'ADNc codant pour le ScFv anti-p53
a tout d'abord été cloné dans un plasmide de type pUC19. La séquence
20 codant pour l'épitope VSV (SEQ ID n~ 7) ou myc (SEQ ID n~ 8) est insérée
en aval du fragment (Figure 6).
Les séquences codant pour les protéines TetR et Cro ont ensuite été
obtenues comme suit:
- La séquence codant pour TetR a été obtenue par amplification à
25 partir d'un plasmide matrice portant la séquence tetR au moyen des
oligonucléotides suivants:
Oligo 5474 (SEQ ID n~ 10):
GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAACGCG
TGGATCCATGTCCAGATTAGATAAAAGTAAAG
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Oligo 5475 (SEQ ID n~ 11):
CGTACGGAATTCGGGCCCTTACTCGAGGGACCCACI I ICACAI l I
AAGTTG
Ces oligonucléotides apportent également la séquence codant pour le
5 bras peptidique Hinge reliant les deux domaines fonctionnels de la
molécules.
Le fragment amplifié contient donc la séquence codant pour le bras
peptidique et pour le domaine de liaison à l'ADN tetR. Ce fragment a été
cloné aux sites Xbal-EcoRI du plasmide obtenu ci-dessus pour générer un
10 plasmide contant la séquence codant pour la molécule ScFv-myc-Hinge-TetR
(Figure 6).
- La séquence codant pour Cro a été obtenue par amplification sur
une matrice d'ADN du bactériophage Lambda au moyen des oligonucléotides
suivants:
Oligo 5531 (SEQ ID n~ 12):
GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAACGCG
TGGATCCATGGAACAACGCATAACCCTGAAAG
Oligo 5532 (SEQ ID n~ 13):
CGTACGGAATTCGG GCCCTTACTCGAGTGCTGTTG ~ GTT
20 ACTCGG
Ces oligonucléotides apportent également la séquence codant pour le
bras peptidique Hinge reliant les deux domaines fonctionnels de la
molécules.
Le fragment amplifié contient donc la séquence codant pour le bras
25 peptidique et pour le domaine de liaison à l'ADN Cro. Ce fragment a été
cloné aux sites Xbal-EcoRI du plasmide obtenu ci-dessus pour générer un
plasmide contant la séquence codant pour la molécule ScFv-myc-Hinge-Cro
(Figure 6).
3.2. Construction d'un plasmide comportant une séquence ScFv-
30 Hinge-TetR ou Cro (Figure 5B)
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Cet exemple décrit la construction de plasmides portant une séquence
codant pour une molécule chimérique bispécifique selon l'invention
dépourvue de séquence tag.
Ces piasmides ont été obtenus à partir des plasmides décrits en 3.1.
ci-avant par digestion par les enzymes Notl et Xbal. Cette digestion permet
d'exciser le fragment portant la région codant pour le tag myc.
3.3. Construction d'un plasmide comportant une séquence ScFv-TetR
ou Cro (Figure 5C)
Cet exemple décrit la construction de plasmides portant une séquence
codant pour une molécule chimérique bispécifique selon l'invention
dépourvue de bras et de séquence tag.
Ces plasmides ont été obtenus à partir des plasmides décrits en 3.1.
ci-avant par digestion par les enzymes Notl et BamHI. Cette digestion permet
d'exciser le fragment portant la région codant pour le tag myc et pour le bras
peptidique Hinge.
Exemple 4: Construction de séquences d'acides nucléiques codant pour des
molécules chimériques bispécifiques contant un domaine de liaison à un
transactivateur constitué d'un domaine d'oli~omérisation.
4.1. Clonage de la région d'oligomérisation de la protéine p53
(fragment 320-393).
L'ADNc codant pour la région d'oligomérisation de la protéine p53
(SEQ ID n~ 3) a été obtenu par amplification par PCR sur un plasmide
portant le cDNA de la p53 sauvage humaine à l'aide des oligonucléotides
suivants:
Oligo 5535 (SEQ ID n~ 14):
CAGGCCATGGCATGAAGAAACCACTGGATGGAGAA
(la partie soulignée représente un site Ncol)
Oligo 5536 (SEQ ID n~ 15):
CGTCGGATCCTCTAGATGCGGCCGCGTCTGAGTCAGGCCCTTC
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(Partie soulignée: site BamHI; Double-souligné: site Xbal: Gras: site
Notl) .
4.2. Les plasmides p53 320/393-myc-Hinge-TetR ou Cro (Figure 5A)
ont été obtenus par clonage du fragment amplifié ci-dessus sous forme d'un
fragment Ncol-Notl dans les sites correspondants des plasmides décrits dans
l'exemple 3.1., en substitution de la région codant pour le ScFv.
4.3. Les plasmides p53 320/393-Hinge-TetR ou Cro (Figure 5B) ont
été obtenus par clonage du fragment amplifié en 4.1. sous forme d'un
fragment Ncol-Xbal dans les sites correspondants des plasmides décrits
dans l'exemple 3.1., en substitution de la région codant pour le ScFv et le
tag.
4.4. Les plasmides p53 320/393-TetR ou Cro (Figure 5C) ont été
obtenus par clonage du fragment amplifié en 4.1. sous forme d'un fragment
Ncol-BamHI dans les sites correspondants des plasmides décrits dans
I'exemple 3.1., en substitution de la région codant pour le ScFv, le tag et le
Hinge.
4.5. Les plasmides tetR ou Cro- p53 320/393 (Figure 5D) ou tetR ou
Cro-Hinge-p53 320/393 (Figure 5E) ont été obtenus par clonage de
fragments amplifiés par PCR sur un plasmide portant le cDNA de la p53
humaine sauvage à l'aide des oligos 5537/5539 ou 5538/5539 digérés par
Xhol/EcoRI dans les plasmides décrits en 3.1., préalablement digérés par
Xhol/EcoRI.
Oligo 5537 (SEQ ID n~ 16):
CAGGCTCGAGAAGAAACCACTGGATGGAGAA
Oligo 5538 (SEQ ID n~ 17):
- CAGGCTCGAGCCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAAAGA
AACCACTGGATGGAGAA
Oligo 5539 (SEQ ID n~ 18):
GGTCGAATTCGGGCCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC
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Exemple 5: Construction d'un plasmide contrôle Dortant un séquence codant
pour une molécule chimérique comportant un domaine de liaison à l'ADN
(TetR ou Cro) et le domaine transactivateur de la protéine D53 (ré~ion 1-73).
Les plasmides p53 1/73 - TetR ou Cro avec ou sans tag (myc ou VSV) et
5 Hinge (Figures 7 A, B et C) ont été obtenus par clonage de fragments
amplifiés par PCR à partir d'un plasmide portant le cDNA de la p53 sauvage
humaine à l'aide des oligos 5661/5662 puis digérés par Ncol/Notl, Ncol/Xbal,
Ncol/BamHI dans les plasmides décrits en 3.1., préalablement digérés par
Ncol/Notl, Ncol/Xbal ou Ncol/BamHI.
Oligo 5661 (SEQ ID n~ 19):
CAGGCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCC
Oligo 5662 (SEQ ID n~ 20):
CGTCGGATCCTCTAGATGCGGCCGCCACGGGGGGAGCAGCCTC
TGG
15 ExemDle 6: Construction de Dlasmides d'expression de différentes
molécules hybrides de i'invention
Les plasmides utilisés pour l'expression de molécules hybrides ont été
obtenus par clonages des fragments contenant les cDNA codant pour ces
molécules aux sites Ncol/EcoRI du vecteur d'expression eukaryote pcDNA3
20 (Invitrogen). Les différentes constructions ainsi effectuées sont les suivantes:
- ScFv 421: SEQ IDn~4
- TET19: protéine hybride contenant l'enchainement ScFv421-VSV-Hinge-
TetR décrite en figure 6 suivant l'exemple 3.1
- TET02: protéine hybride contenant l'enchainement p53(320/393)-VSV-
25 Hinge-TetR décrite en figure 5A suivant l'exemple 4.3
- TET03: protéine hybride contenant l'enchainement p53(320/393)-Hinge-
TetR décrite en figure 5B suivant l'exemple 4.4
.
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- TET04: protéine hybride contenant l'enchainement p53(320/393)-TetR
décrite en figure 5C suivant l'exemple 4.4
- TET07: protéine hybride contenant l'enchainement p53(1/73)-VSV-Hinge-
TetR décrite en figure 7A suivant l'exemple 5
Fxemple 7: Reconnaissance de séquences d'ADN double brin sDécifiques
par les molécules hybrides de l'invention
7.1. Production des molécules hybrides
Les différentes molécules utilisées dans cette expérience ont été obtenues
par traduction in vitro en Iysat de réticulocytes des molécules décrites dans
I'exemple 6 en utilisant le kit TNT Coupled Reticulocyte Iysate Systems
(Promega) suivant le protocole expérimental décrit par le fournisseur pour un
volume réactionnel total de 50,ul.
7.2 Construction de la séquence d'ADN double brin spécifique
La séquence d'ADN double brin spécifique utilisée dans cette expérience est
constituée de deux oligonucléotides de synthèse dont la séquence est la
suivante:
Oligo 5997 (SEQ ID n~24):
GATCCGACTTTCAC ~ CTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA
Oligo 5998 (SEQ ID n~25):
AGCTTGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCG
Ces deux oligonucléotides de synthèse ont été marqués au phosphore 33
par incubation de 30min à 37~C de 10 pmole de chaque oligonucléotide dans
10 ,ul du milieu réctionnel suivant:
Tris-HCI pH7,6 50mM
MgCI2 1 OmM
dithiothréitol 5mM
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Spermidine 1 00,uM
EDTA 1 00,uM
ATP~ P (Amersham) 50,uCi (1000-3000 Ci/mmole)
T4 kinase (Boehringer) 10U
Puis les deux oligonucléotides ainsi marqués ont été hybridés en présence
de de 400mM NaCI pour reconstituer la séquence double brin TetO suivante
(SEQ ID n~26):
GATCCGACTTTCACTTTTCTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA
CTAGGCTCAAAGTGAAAAGAGATAGTGACTATCACTCACCATTTGAGT
7.3 Reconnaissance de la séquence double brin TetO par les différentes
molécules hybrides de l'invention
La réaction de liaison à l'ADN est effectuée dans 50 ~I de milieu réactionnel
(Tris-HCI pH7,4 10mM, MgC12 10mM, KCI 10mM, ~-mercaptoéthanol 6mM,
EDTA 0,1mM, BSA 0,5mg/ml) par addition de la séquence TetO (10-'~M)
préparée selon l'exemple 7.2, de 10 ,ul du produit de traduction préparé selon
l'exemple 7.1 et de 1 0~M de l'oligonucléotide compétiteur froid AP2
(Promega) utilisé pour éliminer la fixation non spécifique. La spécificité de
l'interaction est vérifiée par déplacement de l'équilibre par addition de
tétracycline 10 ,uM (Sigma) dans le milieu réactionnel. Les mélanges
réactionnels sont incubés 15min à 20~C puis additionné de 10 ~I de glycérol
à 50 %, et les mélange finaux sont soumis à une électrophorèse native sur
gel de polyacrylamide à 5 % avec migration à 200V et 16~C. Le gel est
ensuite séché et autoradiographié.
Le résultat de cette expérience effectuée avec les molécules hybrides
TET19, TET02 et TET07 est présenté sur la figure 9. Dans ces conditions,la
liaison de ces trois molécules à la séquence d'ADN spécifique double brin
TetO est observée par un retard de migration de celle-ci, et la spécificité de
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cette interaction est mise en évidence par l'inhibition de ce retard par addition
de tétracycline.
Ce résultat confirme donc que les molécules hybrides de l'invention sont
capables de se lier de façon spécifique à la séquence nucléotidique TetO
5 Exemple 8 ~ ison spécifique des molécules hybrides de l'invention à une
molécule présentant un domaine transactivateur transcriptionnel.
8.1. Production des molécules hybrides de l'invention et de molécules
présentant ou non un domaine transactivateur transcriptionnel.
Pour cette expérience, les molécules hybrides de l'invention ScFv 421,
TET19 et TET02 selon l'exemple 6 ont été produites par traduction in vitro en
utilisant le protocole expérimental selon l'exemple 7.1 en présence de 44,uCi
de 35S-methionine (Amersham) (1175 Ci/mmole) pour générer ces molécules
hybrides radioactivement marquées.
Les cDNA des molécules présentant ou non un domaine
15 transactivateur transcriptionnel ont été clonés dans le vecteur pBlueBaclll
(Invitrogen) au site BamHI. A partir de ces vecteurs, des baculovirus
recombinants ont été produits et purifiés suivant les instructions du fabricant.Les molécules sont produites par infection avec le baculovirus recombinant
de cellules d'insecte sf9 suivant le protocole expérimental du fabricant. Des
20 extraits protéiques à la concentration protéique finale de 1 Omg/ml sont
préparés suivant le protocole décrit par K. Ory et al. (K. Ory, EMBO J., 13,
3496-3504,1994). Ces molécules sont les suivantes:
- p53 (1/393): protéine p53 sauvage
= - p53 (1/320): protéine p53 sauvage limitée à sa séquence en acide aminé 1
25 à 320 et donc dépourvue de son domaine d'oligomérisation et du domaine
reconnu par l'anticorps monoclonal pAb421.
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8.2. Liaison des molécules hybrides de l'invention aux molécules présentant
ou non un domaine transactivateur transcriptionnel
5 1ll de chacun des produits de traduction in vitro préparés selon l'exemple
8.1 ont été incubés avec 5111 de l'extrait baculovirus préparé selon l'exemple
5 8.1 et 2119 de l'anticorps monoclonal DO1 (Oncogene Sciences) qui reconnait
l'extrémité N-terminale de la protéine p53 pendant 16 heures à 4~C dans
100111 de tampon RIPA modifié ((K. Ory, EMBO J., 13, 3496-3504, 1994).
L'immunoprécipitation est réalisé comme décrit par K. Ory et al. (K. Ory,
EMBO J., 13, 3496-3504, 1994). Les complexes retenus par l'anticorps sont
10 élués par incubation de 10min à 80~C en présence de 30,u1 de tampon de
migration (Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970) et soumis à
électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% en milieu dénaturant à 200V
suivant le protocole précédemment décrit (Laemmli U.K., Nature, 227, 680-
685, 1970). Le gel est ensuite séché et révélé à l'aide d'un instantimager
15 (Packard instruments) qui permet de quantifier les quantités de molécules
hybrides liées à la molécule présentant ou non un domaine transactivateur
transcriptionnel. Les résultats de cette expérience sont représentés sur la
figure 10.
Dans ces conditions, il apparaît nettement que la molécule hybride
20 présentant le ScFv 421 (TET19) reconnait bien la molécule p53 (1/393) de
façon équivalente au ScFv 421 seul, et la molécule hybride présentant le
domaine 320/393 (TET02) présente les mêmes propriétés mais avec un
pouvoir de rétention de la p53(1/393) beaucoup plus important. De plus,
I'absence de signal observé lors de l'incubation avec la molécule p53(1/320)
25 montre que ces intéractions sont bien spécifiques et médiées par l'extrémité
C-terminale de la protéine p53 (acides aminés 320 à 393) comme attendu.
Ces résultats confirment donc que les molécules hybrides de l'invention sont
bien capables de recruter un domaine transactivateur transcriptionnel porté
par une molécule dont elles sont des partenaires spécifiques.
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ExemDle 9: Recrutement fonctionnel d'un domaine transactivateur
tr~nscriDtionnel Dar les molécules hybrides de l'invention
Le recrutement fonctionnel d'un domaine transactivateur transcriptionnel par
les molécules hybrides de l'invention a été évalué dans un système de
5 transactivation in vivo dans les cellules SAOS-2 (ostéosarcome humain)
déficientes pour les deux allèles de la protéine p53, dans la lignée tumorale
H358 déficiente pour les deux allèles de la protéine p53 (Maxwell & Roth,
Oncogene 8, 3421, 1993) et dans la lignée tumorale HT29 déficiente pour un
des deux allèles de la protéine p53 et présentant un allèle muté (mutation
10 H273). Ce svtème repose sur l'utilisation d'un gène rapporteur dosable
enzymatiquement et placé sous la dépendance d'un promoteur contenant les
motifs nucléotidiques de reconnaissance spécifique par le répresseur Tet.
(Opérateur Tet).
Dans ce test, le gène rapporteur LUC (luciférase) placé sous contrôle de
15 I'opérateur Tet est contenu dans le plasmide pUHC13-3 (Gossen M. & Bujard
H.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5547-5551,1992).
9.1 Lignées cellulaires utilisées et conditions de culture
Les lignées cellulaires utilisées dans ces expériences ainsi que leur génotype
lié à la protéine p53 et les milieu de culture utilisés pour leur croissance sont
20 reportés dans le Tableau ci-dessous:
Tableau: li~nées cellulaires
Lignée p53Milieu de culture n~ATCC
milieu DMEM (Gibco BRL) additionné de
SAOS-2 -/-10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL) HTB 85
milieu RPMI1640 (Gibco BRL) additionné de
H358 -/-10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL)
milieu DMEM (Gibco BRL) additionné de
HT29 -/H27310% de sérum de veau foetal (Gibco BRL)
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9.2. Plasmides d'expression des molécules présentant un domaine
transactivateur transcriptionnel
Les molécules présentant un domaine transactivateur transcriptionnel
5 utilisées dans cette expérience sont la protéine p53 sauvage (wt) et les
mutant G281 et H175 de cette protéine. Les cDNA codant pour ces trois
protéines ont été insérés au site BamHI du vecteur pcDNA3 (Invitrogen).
9.3. Expression intracellulaire des molécules hybrides de l'invention
Les molécules hybrides de l'invention sont exprimées dans les cellules en
10 culture par transfection transitoire en utilisant le protocole suivant:
Les cellules (3,5 105) sont ensemencées dans des plaques 6 puits contenant
2 ml de milieu de culture, et cultivées sur la nuit dans un incubateur à CO2
(5 %) à 37~C. Les différentes constructions sont alors transfectées en
utilisant la lipofectAMlNE (Gibco BRL) comme agent de transfection de la
façon suivante: 1,5 llg de plasmide total sont incubés ( dont 0,25 ,ug du
plasmide reporter) avec 5 ,ul de lipofectAMlNE pendant 30 min avec 2 ml de
milieu de culture sans sérum (mélange de transfection). Pendant ce temps,
les cellules sont rincées deux fois au PBS puis incubées 4 h à 37~C avec le
mélange de transfection, après quoi celui-çi est aspiré et remplacé par 2 ml
20 de milieu culture additioné de 10 % de sérum de veau foetal inactivé à la
chaleur et les cellules remises à pousser pendant 48 h à 37~C.
9.4. Détection de l'activation de la transcription
L'activation de la transcription liée au recrutement fonctionnel du
transactivateur transcriptionnel est détectée et quantifiée par la mesure de
25 I'activité luciférase codée par le gène LUC en utilisant le kit Luciferase Assay
System (Promega) selon le protocole expérimentale du fabricant.
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9.5. Recrutement fonctionnel d'un domaine transactivateur transcriptionnel
par les molécules de l'invention
Cette expérience a été effectuée en utilisant les molécules TET02, TET03 et
TET07 selon l'exemple 6. Dans cette expérience la molécule TET07 sert de
contrôle positif puisqu'elle possède son propre domaine transactivateur
transcriptionnel .
Les résultats obtenus dans les cellules SAOS-2 et présentés dans la figure
11 montrent que la molécule TET07 est bien capable à elle seule d'activer la
transcription du gène LUC placé sous le contrôle de l'opérateur Tet
contrairement à la construction TET02. Ceci est en accord avec le fait que
cette lignée cellulaire ne contient pas de protéine p53 endogène qui ne peut
donc être recrutée par la molécule TET02. Par contre, I'introduction de la
protéine p53 sauvage ou de son mutant G281 qui ne produisent pas de
signal à elles seules, est capable de générer une activité transcriptionnelle enprésence de la molécule TET02. Un tel résultat n'est pas observable avec le
mutant H175 décrit dans la littérature comme présentant un domaine
transactivateur transcriptionnel non fonctionnel.
Ce résultat obtenu dans la lignée cellulaire SAOS-2 avec la molécule TET02
a pu être reproduit dans une lignée tumorale ne contenant pas non plus de
p53 endogène (cellules H358) et a pu être étendu aux molécules TET03 et
TET04 ffigure 12).
Dans le but de confirmer ces deux résultats dans un contexte cellulaire
différent, la molécule TET02 ainsi que le contrôle positif TET07 ont été
exprimées dans les cellules HT29 qui présentent une protéine p53 endogène
mutante (H273), le contrôle négatif de cette expérience consistant à
transfecter le vecteur pcDNA3 vide. Le résultat de cette expérience, présenté
dans le Tableau ci-dessous, montre que la molécule TET02 est bien capable
CA 022144~1 1997-09-22
W O 96/30512 PCTA~R96/00477
42
de recruter le domaine transactivateur transcriptionnel de ia protéine p53
endogène.
Tableau: Activation transcriptionnelle des molécules hybrides de l'invention
dans les cellules HT29
pcDNA3 TET07 TET02
59 10
L'ensemble de ces expériences montre donc que les molécules hybrides de
l'invention sont bien capables de lier à la fois des séquences d'ADN double
brin spécifiques et des protéines présentant un domaine transactivateur
10 transcriptionnel, et que ces molécules sont capables d'induire de manière
conditionnelle l'expression de gènes d'intérêt.
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W O 96/30512 PCT~R96/00477
43
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: (1) 40.91.70.36
(H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.91
(ii) TITRE DE L' INVENTION: SYSTEME D'EXPRESSION CONDITIONNEL
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 26
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
( A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: 1; n~ ire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TCTCTATCAC TGATAGGGA 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: 1in~ire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
CA 022l445l l997-09-22
W 096/30512 PCTn~R96/00477
44
TATCACCGCA AGGGATA 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 74 acides amin,s
(B) TYPE: acide amin,
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
( iii ) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg
1 5 10 15
Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys
~ 20 25 30
Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser
35 40 45
His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu
50 55 60
Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp
65 70
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 768 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4;
TTAC~CGCGG CCCAGCCGGC CATGGCCCAG GTGCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAGCTT 60
' CA 022144~1 1997-09-22
W O96/30512 PCTA~R96/00477
GTAAGGTCAG GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC 120
TACTATATGC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT TGGATGGATT 180
GATCCTAAGA ATGGTGATAC TGAATATGCC CCGAAGTTCC AGGGCAAGGC CACTATGACT 240
GCAGACACAT CCTCCAATAC AGCCTACCTG CAGCTCAGCA GCCTGGCATC TGAGGACACT 300
GCCGTGTATT ATTGTAATTT TTACGGGGAT GCTTTGGACT ATTGGGGCCA AGGGACCACG 360
GTCACCGTCT CCTCAGGTGG AGGCGGTTCA GGCGGAGGTG GCTCTGGCGG TGGCGGATCG 420
GATGTTTTGA TGACCCAAAC TCCACTCACT TTGTCGGTTA CCATTGGACA ACCAGCCTCC 480
ATCTCTTGCA AGTCAAGTCA GAGCCTCTTG GATAGTGATG GAAAAACATA TTTGAATTGG 540
TTGTTACAGA GGCCAGGCCA GTCTCCAAAG CGCCTAATCT ATCTGGTGTC TAAACTGGAC 600
20 TCTGGAGTCC CTGACAGGTT CACTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAC ACTTAAAATC 660
AACAGAGTGG AGGCTGAGGA TTTGGGAGTT TATTATTGCT GGCAAGGTAC ACATTCTCCG 720
CTTACGTTCG GTGCTGGCAC CAAGCTGGAA ATTAAACGGG CGGCCGCA 768
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides amin,s
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: 1;n~Ai re
( ii ) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nuclèotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: l; n~A; re
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
:: :
CA 022144~1 1997-09-22
W 096130512 PCT~R96/00477
46
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..30
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CCC AAG CCC AGT ACC CCC CCA GGT TCT TCA 30
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser
1 5 10
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
20 - (A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
_ (D) CONFIGURATION: lin~re
( i i ) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..18
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
ATG AAC CGG CTG GGC AAG 18
Met Asn Arg Leu Gly Lys
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: 1 in~i re
(ii) TYPE DE MOT~ECTTT.T': ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
CA 022144~1 1997-09-22
W 096/30512 PCTA~R96/00477
47
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..33
( xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT 33
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn
1 5 10
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 7 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
35 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: li n~i re
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
GGCTCTAGAC CCAAGCCCAG TACCCCCCCA GGTTCTTCAA CGCGTGGATC CATGTCCAGA 60
TTAGATAAAA GTAAAG 66
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
CA 022l44~l l997-09-22
W 096/30512 PCT~R96/00477
48
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 51 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: l inéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
CGTACGGAAT TCGGGCCCTT ACTCGAGGGA CCCACTTTCA CATTTAAGTT G 51
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION l; n é~ire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii~ HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
GGCTCTAGAC CCAAGCCCAG TACCCCCCCA GGTTCTTCAA CGCGTGGATC CATGGAACAA 60
CGCATAACCC TGAAAG 66
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 51 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: l; n~ i re
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
CA 022l44~l l997-09-22
W O 96/30S12 PCTA~R96/00477
49
' (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
CGTACGGAAT TCGGGCCCTT ACTCGAGTGC TGTTGTTTTT TTGTTACTCG G
. (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
~ (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
tA) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
CAGGCCATGG CATGAAGAAA CCACTGGATG GAGAA 35
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 43 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
tD) CONFIGURATION: 1in~ire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
50 CGTCGGATCC TCTAGATGCG GCCGCGTCTG AGTCAGGCCC TTC 43
-
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
~ (D) CONFIGURATION: lin~ire
CA 022l44~l l997-09-22
W 096/30512 PCTn~R96/00477
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
CAGGCTCGAG AAGAAACCAC TGGATGGAGA A 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 61 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: 1in~;re
( i i ) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
35 CAGGCTCGAG CCCAAGCCCA GTACCCCCCC AGGTTCTTCA AAGAAACCAC TGGATGGAGA 60
A 61
40 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
( c ) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: 1; n~; re
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
GGTCGAATTC GGGCCCTCAG TCTGAGTCAG GCCCTTC 37
CA 022144~1 1997-09-22
W O96/30512 PCTA~R96/00477
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
-
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
~D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
CAGGCCATGG AGGAGCCGCA GTCAGATCC 29
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
GGTCGAATTC GGGCCCTCAG TCTGAGTCAG GCCCTTC 37
( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 46 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(c) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
CGTCGGATCC TCTAGATGCG GCCGCCACGG GGGGAGCAGC CTCTGG 46
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: 1; n~ i re
CA 022l44~l l997-09-22
W 096/30512 PCTn~R96/00477
52
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gln
1 5 10 15
Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala Ile Asn Lys
Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly
Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr
50 55 60
Thr Ala
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: 1;n~;re
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
GATCCTATCA CCGCAAGGGA TAA 23
50 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(c) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: 1; n ~ i re
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
CA 022144~1 1997-09-22
W O 96/30512 PCTAFR96/00477
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
10 GATAGTGGCG TTCCCTATTT CGA 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 48 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
GATCCGACTT TCACTTTTCT CTATCACTGA TAGTGAGTGG TAAACTCA 48
( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 48 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: l;n~; re
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
AGCTTGAGTT TACCACTCCC TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCG 48
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA 02214451 1997-09-22
W O96/30512 PCTn~R96/00477
(A) LONGUEUR: 96 palres de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
GATCCGACTT TCACTTTTCT CTATCACTGA TAGTGAGTGG TAAACTCACT AGGCTCAAAG 60
TGAAAAGAGA TAGTGACTAT CACTCACCAT TTGAGT 96
