Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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WO 96/31611 PCTtl;~96/00523
NOUVEAU~ PROMOTEURS POUR L'EXPRESSION DE PROTÉINES
D'INTÉRET DANS LA LEVURE
La présente invention se rapporte au domaine des biotechnologies, notamment à
15 un perfectionnement apporté à la production d'un polypeptide d'intéret commercial
ou thérapeutique dans la levure et, en particulier, dans Saccharomyces cere~isiae.
Elle conceme, en premier lieu, de nouveaux fr~gment.c d'acide nucléique isolés de
l'ADN genomique de Saccha)on?~ce.s cere~isiae et présentant une activité de
promoteur transcriptionnel et, en second lieu, des cassettes d'expression, vecteurs
'0 d'expression et cellules hotes les contenant ainsi que leur utilisation pour la
production de polypeptides d'intérêt.
La levure Saccharon?~ces cere~isiae est consideree comme l'un des hôtes préféréspour la production de protéines recombinantes pour de nombreuses raisons. D'une
2~ part, cet organisme est non pathogène et il est couramment utilisé dans l'industrie
agro~liment~ire. D'autre part, il peut être cultivé à grande échelle et à haute densité
dans un milieu relativement bon marché et peut être facilement adapté à un
environnement industriel. De plus, il a été particulièrement étudié de sorte que de
~ multiples données concernant sa génétique et sa physiologie sont disponibles.
30 Enfin, il est capable d'effectuer certaines modifications typiquement eucaryotes
(glycosylation, ponts disulfure...).
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Bien que de nombreux promoteurs transcriptionnels fonctionnels dans les levures
aient été decrits dans la littérature, seuls quelques uns d'entre eux s'avèrent
efficaces pour la production de polypeptides par voie recombinante. On peut citer
5 notamrnent les promoteurs des gènes PGK (3-phosphoglycérate kinase; Hitzeman
et al., 1983, Science, 219, 620-625), TDH codant pour la GAPDH (glycéraldéhyde
phospl1ate deshydrogénase; Holland et Holland, 1979, J. Biol. Chem., ~, 9839-
9845), T~rl (Facteur d'élongation 1; Cottrelle et al., 1985, J. Biol. Chem., 260,
3090-3096), Ml; al (précurseur de la phéromone sexuelle ~; Inokuchi et al., 19~7,
Mol. Cell. Biol., ~, 3185-3193) qui sont considérés comme des promoteurs
constitutifs forts ou encore le promoteur régulable CYCI réprime en présence de
,lucose(GuarenteetPtashne, 19~1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7~, 2199-2203)
ou PHO~ régulable par la thiamine (Meyhacl; et al., 1982, EMBO J., 1, 675-680).
Cependant, pour des raisons souvent inexpliquees, ils ne permettent pas toujours15 l'expression efficace des gènes qu'ils contrôlent et donc la production de
polypeptides à des niveaux importants. Dans ce contexte, il est toujours
avantageux de pouvoir disposer de nouveaux promoteurs afin de générer de
nouveaux systèmes hôtes/vecteurs efficaces pour la production de grande quantitéde protéines d'intéret. De pius, avoir un choix de promoteurs efficaces dans une20 cellule donnée permet également d'envisager la production de multiples protéines
dans cette même cellule (par exemple plusieurs enzymes d'une meme chalne
metabolique) tout en évitant les problemes de recombinaison entre séquences
homologues.
25 D'une manière générale, une région promotrice est située dans la région 5' des
gènes et comprend l'ensemble des éléments permettant la transcription d'un
fragment d'ADN placé sous leur dépendance, notamment:
(1) une région promotrice dîte minim~le comprenant la TATA box et le site
30 - d'initiation de la transcription, qui détermine la position du site d'initiation
ainsi que le niveau basal de la transcription. Chez S'accharomyces
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c~re-~isiae, la longueur de la région promotrice minim~le est relativement
variable. En effet, la localisation exacte de la TATA box varie d'un gène à
l'autre et peut se situer de -40 à -IZ0 nucléotides en amont du site
d'initiation (Chen et Struhl, 19g5, E~1~30 J., .~, 3273-32~0)
s
(2) des sçquçnc~c situées en amont de la TATA box (immediatement en amontjusqu'à plusieurs centaines de nucléotides) qui permettent d'assurer un
niveau efficace de transcription soit de maniere constitutive (niveau de
transcription relativement constant tout au long du cycle cellulaire, quelles
que soient les conditions de culture) soit de manière régulable (activation
de la l,~nscl;pLion en présence d'un activateur et/ou repression en présence
d'un répresseur). Ces séquences désignées par la suite modulatrices,
peuvent être de plusieurs types: activatrice, inhibitrice, enhancer,
inductible, répressible et répondre à des facteurs cellulaires ou des
conditions de culture variés.
On a m~int~ t isolé et caractérise trois séquences génomiques de Sacc~taro/77~ces
c~r~ is-iae et mis en evidence leur fonction de promoteur de la transcription. Placée
en amont d'un gène reporteur (gène de la résistance à la phléomycine ou gène GUS20 codant pour la ~-glucuronidase), chacune de ces séquences permet son expression
chez la levure 5acc~." o~ ces c~revfsiae et, dans le cas de deux d'entre elles, a un
niveau élevé puisque supérieur ou à peu près équivalent à celui détecté avec desrégions promotrices réputées fortes, comme celles des gènes PGK et M~ccl. La
comparaison avec les banques de données indiquent que deux des séquences
25 clonées sont nouvelles et ne fi~3urent pas dans les banques de données accessibles
au public (SEQ ID NO: 1 et 2). En ce qui concerne la troisième (SEQ ID NO: 3),
elie correspond à une séquence localisée en 3' du gène de levure COX~ dans une
région où la présence d'un promoteur est in~ttend~ La présente invention apporteune solution avantageuse au probleme de la production de protéines d'intérêt par30 voie recolllbinallLe.
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Par conséquent, la présente invention a pour objet un fragment d'acide nucléiqueisolé comprenant tout ou partie d'une séquence nucléotidique homologue à la
sequence montrée dans l'identificateur de séquence NO: 1, 2 ou 3 ou homologue
à son complPmçnt~ire, ledit fragment présentant une activité de promoteur
5 transcriptionnel.
Par "fragment d'acide nucleique", on entend un polymere de nucléotides pouvant
être de type ADN ou A~N. Ces termes sont définis dans tous les ouvrages de base
de biologie moléculaire. PléférenLiellement, un fragment d'acide nucléique selon10 I'invention est un fragment d'ADN double brin.
D'une façon génerale, tout ou partie de l'une des séquences nucléotidiques
spécifiées dans les SEQ ID NO: 1, 2 et 3, son complémentaire ou un de ses
homologues peut être utilisé dans le cadre de la présente invention. Le terme
15 "partie" désigne un fragment comportant une porfion d'au moins 17 nucléotidescontinus identiques à une portion d'une longueur equivalente de l'une des
séquences nucleotidiques indiquées dans les identificateurs de séquence ou de son
complementaire. Mais, bien entendu, un fragment d'acide nucléique selon
l'invention n'est pas limité aux séquences décrites et peut s'etendre au délà.
~7o
Le terme "homologue" signifie une séquence capable de s'hybrider dans des
conditions string~-ntçc avec tout ou partie de la sequence reportée dans la SEQ iD
NO: 1, ~ ou 3. Il fait plus particulièrement référence a tout acide nucléique retenant
la fonction promotrice et présentant une ou plusieurs modification(s) de séquence
25 par rapport à une de ces séquences. Ces modifications peuvent être obtenues par
mutation, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs nucleotide(s) par rapport à la
séquence native. Elles peuvent etre introduites notamment pour améliorer l'activité
promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, rendre un
promoteur constitutif régulable ou vice versa, introduire un site de restriction30 f~cilit"nt les étapes de clonage ultérieures, éliminer les séquences non essentielles
à l'activité transcriptionnelle...etc. Dans ce contexte, on pléfè-el~ un degré
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d'homolotJie de 70% par rapport à la séquence native, avantageusement de 80%
et, de préférence, de 90%. L'homme du métier sait où effectuer les modificationsafin de ne pas alterer de manière drastique la fonction de promoteur de la
transcription et il évitera en particulier le site d'initiation de la transcription et la
5 TATA box. Il connâît également les techniques permettant d'évaluer si l'homologue
généré a une activité promotrice, par exemple par insertion en amont d'un gène
reporter dont l'expression est facilement détectable (~-;,alactosidase, cathéchol-
oxygénase, luciférase ou encore un gène conférant la résistance à un antibiotique).
Mais tout autre technique conventionnelle peut également être employée.
Suivant un mode de réalisation préféré, un fragment d'acide nucléique selon
l'invention est identique à tout ou partie de l'une des séquences nucléotidiquesmoritrees dans l'identificateur de séquence NO: 1, 2 ou 3 ou de son
complémentaire.
A titre d'e~emples préférés mais non limitatifs, on peut envisager d'employer unfragment d'acide nucléique ayant une séquence telle que montrée dans:
(i) l'identificateur de sequence NO: 1, débutant au nucléotide en
position 462 et se terminant au nucléotide en position 1016, ou
(ii) l'identificateur de séquence NO: 1, débutant au nucléotide en
position 197 et se tel.llillalll au nucléotide en position 1016, ou
(iii) l'identificateur de séquence NO: 3, débutant au nucléotide en
position 5 et se terminant au nucléotide en position 523.
Aux fins de la présente invention, un fragment d'acide nucléique selon l'invention
~ peut être constitué par l'assemblage d'éléments d'origines diverses pour former un
promoteur dit hybride fonctionnel dans la cellule hôte considérée. En particulier,
un tel promoteur hybride peut comprendre:
(i) un fragment d'acide nucléique selon l'invention, comprenant une
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région promotrice minim~le; ladite region promotrice minim~le
étant placée en aval d'une ou plusieurs séquence(s) modulatrice(s)
hétérologue(s) à ladite région promotrice minimale, ou
S (ii) un fragrment d'acide nucleique selon llinvention, comprenant au
moins une séquence modulatrice; ladite séquence modulatrice étant
placée en amont d'une région promotrice minimale hétérologue à
ladite séquence modulatrice.
10 Selon un mode de réalisation de la premiere variante, on peut avoir recours à une
ou plusieurs séquence(s) modulatrice(s) régulable(s) afin de générer un promoteur
hybride regulable à partir duquel la transcription peut ~,tre induite ou réprimée
selon les conditions mises en oeuvre. Ce mode de réalisation spécifique est
particulièrement avantageux dans le cadre de la production de protéines d'intérêt
1~ presentant une certaine toxicité vis à vis de la cellule hôte. On choisira depréférence des séquences modulatrices régulables permettant de faire varier la
transcription en fonction des conditions de culture ou de la phase de croissance.
D'une maniere génerale, de telles séquences sont issues ou derivent de gènes
regulables et sont connues de l'hornrne de l'art. A titre indicatif, on peut citer celles
~O issues du gène CYCl regulable par le glucose, du gène l'~HC)~ régulable par la
thiamine, ou des ~,ènes GALI, GAL7 et GAL10 régulables par le galactose. Il va
de soi que ces séquences peuvent comporter des modifications (mutation~ délétionet/ou substitution dlun ou plusieurs nucléotides) par rapport à la séquence native,
du moment qulelles n'altèrent pas leur fonction modulatrice de manière drastique.
On indique également qu'un fragment d'acide nucléique selon l'invention peut être
employé à titre de promoteur bi-directionnel capable d'exercer sa fonction
indépen~l~mment de son orientation vis à vis du gène à transcrire (dans une
orientation sens de 5' vers 3' comme indiqué dans les SEQ ID ou inversée).
~0
Bien entendu, un fragment d'acide nucléique selon l'invention peut être obtenu par
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toute technique en usage dans le domaine de l'art, par exemple par clonage,
hybridation à l'aide d'une sonde ap,~l ~.p. ;ee, par PCR (Polymerase Chain Reaction)
à l'aide d'amorces adéquates ou encore par synthèse cllimique.
5 Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, un fragment d'acide
nucléique selon l'invention est destiné à permettre l'expression d'un gène d'intérêt
dans une cellule hôte et, à cet effet, est lié d'une maniere opérationnelle à celui-ci
dans une cassette d'expression. C'est pourquoi la présente invention s'etend
également à une cassette d'expression comprenant un fragment d'acide nucléique
10 selon l'invention et un gène d'intérêt placé sous son contrôle. Il va de soi qu'une
cassette d'expression selon l'invention peut contenir plusieurs oènes d'intérêt soit
dans le cadre d'une cassette multicistronique (schématisée par l'agencement
"promoteur-;,ène 1-~,ène 2...") dans laquelle les différents gènes sont placés en aval
d'un ~agment d'acide nucléique selon l'invention et sont sépares les uns des autres
par des séquences adequates, comme les élements IRES (pour Internal Ribosome
Entry Site en anglais) permettant la reinitiation de la traduction ou encore dans le
cadre d'une cassette bidirectionnelle ("gène l-promoteur-gène 2") dans laquelle un
fragment d'acide nucléique selon l'invention est insére entre deux crènes d'intéret
pour gouverner simultanément leur expression.
~0
Aux fins de la présente invention, un gène d'intéret peut etre issu d'un organisme
eucaryote, procaryote ou d'un virus. Il peut être isolé par toute technique
conventionelle de biologie moléculaire ou peut être synthétisé par voie chimique.
Par ailleurs, il peut coder pour une protéine d'intérêt (i) intracellulaire, (ii)
menlb~ aile ou ancrée à la membrane cellulaire ou (iii) secrétée dans le milieu de
culture. Il peut donc comprendre des éléments additionnels comme, par exemple,
une séqu~n~e codant pour un signal de secrétion. A titre d'exemples, on indique la
séquence signal BGL2 (EP 0 423 302), les séquences pré ou pré-pro MFal
(Kurjan et Herskowitz, 1982, Cell, 30, 933-943) et encore la sequence pro de la
défensine A (EP 0 607 080). On peut également avoir recours aux signaux de
secretion endogènes du gène considéré. Le choix des signaux de sécrétion
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envisa~eables dans le cadre de la présente invention est à la portée de l'homme de
l'art.
Par ailleurs, un gène d'intérêt peut coder pour un polypeptide d'intérêt
5 correspondant à tout ou partie d'une protéine telle que trouvée dans la nature(protéine native ou tronquée). Il peut egalement s'agir d'une protéine chimérique,
par exemple provenant de la fusion de polypeptides d'origines diverses ou d'un
mutant présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. Un tel
mutant peut être obtenu par les techniques conventionnelles de biologie
10 moleculaire. Parmi les protéines ou polypeptides d'intérêt, on peut citer à titre
d'exemples non limit~tif~:
- les cytokines et notamment les interleukines (IL-2, 4, 5, 6, 12...), les
interfërons c~ et y, les facteurs de stim~ tion des colonies (GM-CSF, C-
CSF, M-CSF~;
- les facteurs de croissance (hormone de croissance, érythropoïetine, insuline....)
ou les récepteurs cellulaires ou nucleaires;
'O - les anticoagulants, de préfërence l'hirudine et, notamment les variants de
l'hirudine décrits dans la dem~n~e europeenne EP 273 800 et, de manière tout
à fait préfëree le variant HV2 Lys47;
- les enzymes (trypsine, ribonucléases, P450 cytochromes, lipases, amylases....);
- les protéines de structure (albumine...);
- les inhibiteurs d'enzymes (~-1 antitrypsine, antithrombine III, inhibiteurs de protéases virales...);
- les polypeptides capables d'inhiber l'initiation ou la pro;,ression de tumeurs ou
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cancers (inhibiteurs ~oi.C~nt au niveau de la division cellulaire ou des signauxde tr~ncd-lctiQn, produits d'expression des ~,ènes suppresseurs de tumeur, par
exemple p53 ou Rb....); et
5 - les polypeptides capables d'inhiber une infection virale, bactérienne ou
parasitaire et/ou son développement (polypeptides antigéniques ayant des
propriétés immllnogènes, anticorps, variants trans-domin~nts susceptibles
d'inhiber l'action de la protéine native par compétition..).
10 Bien entendu, une cassette d'expression selon l'invention peut, en outre,
co~ ndle des éléments additionnels nécessaires à l'expression du gène d'intérêt
(séquence intronique, séquence terminatrice de la transcription...) ou encore à sa
maintenance dans la cellule hote considerée (ori(Jine de replication telle que ARS
ou 2,u, gène codant pour un marqueur de sélection phénotypique tel que URa3 ou
15 LEU~, gène codant pour un produit conférant une résistance à un antibiotique par
exemple à l'hygromycine, la cycloheximide, la néomycine, la phléomycine....). Detels éléments sont connus de l'homme de l'art.
L'invention concerne egalement un vecteur d'expression comprenant une ou
20 plusieurs cassette(s) d'expression selon l'invention. Il peut s'a~ ir d'un vecteur
plasmidique multicopie ou centromerique, d'un cosmide ou d'un vecteur de type
YAC. Enfin, il peut être intégratif ou autoréplicatif.
La présente invention a également trait à une cellule hôte comprenant une cassette
25 d'expression ou un vecteur selon l'invention. Elle peut être générée par toute
méthode permettant d'introduire un ADN étranger dans une cellule
~ (transformation, transfection, microinjection, électroporation, liposomes.. ). On
indique que toute cellule hôte, eucaryote ou procaryote, peut être utilisée dans le
cadre de la présente invention dans la mesure où elle possede les facteurs
30 appropriés pour permettre à un fragment d'acide nucléique selon l'invention
d'exercer sa fonction de plolllot~LIr. Il est à la portée de l'homme de l'art de vérifier
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si une cellule particulière peut être employée comme hôte en mesurant l'activitépromotrice comme indiqué précédemment
Une cellule hôte selon l'invention peut être dérivée d'une cellule animale (CHO,S Véro, BHK..) ou d'une bactérie comme Lsch~richia coli mais on préférera avoir
recours à un eucaryote inférieur et, not~mment, une levure. A cet égard, on peututiliser une levure du genre Saccharolt~yces, 5~chiAosaccharomyces, Pichia,
Kll/yveron1yces, Ha~7se~tl/la, -Phaffa ou Yarro~ia. Avantageusement, elle est
choisie parmi les espèces Schizosaccharon~yces pombe, Pichia pas~oris,
10 Kll/yl~eromyces lacfis, Ha~l.se~ a polyntorpha, Yarro~t~ia lipoly~ica et, de manière
préférée, Saccharonl3 ces cerevisiae. On préfère tout particulièrement mettre enoeuvre une levure d~fici~nte en protéase(s) comme TGY73.4 ou celle décrite dans
la demande europeenne EP 390 676. Un grand nombre de ces souches sont
disponibles commercialement dans des or~anismes tels que l'AFRC (Agriculture
15 and Food Research Council, Norfolk, UK) et l'ATCC (Rockville, MA, USA).
Enfin, la présente invention a également pour objet un procéde de production d'un
polypeptide d'intérêt co~ ellant la culture d'une cellule hote selon l'invention dans
des conditions de culture appropriées permettant la production dudit polypeptide20 d'intéret et sa récuperation dans la culture cellulaire. On utilise de préférence un
milieu de culture défini comprenant du glucose comme source de carbone.
Dans le cadre de la présente invention, ce procédé est de pr~fé,~nce applicable à
la production d'une protéine d'interêt thérapeutique et, notamment de l'hirudine,
25 dans une levure Saccharontyces cerevisiae. La proteine peut être récupérée
directement dans le milieu de culture ou après Iyse des cellules selon la
méthodologie classique. Elle peut être purifiée en appliquant les techniques
standards connues de l'homme de l'art, par exemple la chromato~raphie échangeused'ions, la p~écipilalion diff ;lel,lielle, I'immllnopurification ou encore la filtration sur
30 oel à haute ou basse pression.
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EXEMPLES
Les exemples ci-apres permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques
et avantaoes de la présente invention. Ces exemples sont illustrés par reférence aux
figures suivantes:
La Figure 1 est une representation schématique du vecteur pTG9852 pour la
sélection de fragments d'ADN présent~nt une activité de promoteur
transcriptionnel. Il col"~lend le gène U~A3-~, un site multiple de clonage (issu de
M13tgl31; Kieny et al., 1983, Gene, 26, 91-99), le gène ble conférant la
résistance à la phléomycine, le terminateur de transcription du gène ~'GK (PGKt),
un fragment de pBR322 portant une origine de replication bacterienne et le gène
Arnp conférant la résistance à l'ampicilline et l'origine de replication 2~1 (indiquée
2m).
La Figure 2 est une représentation schematique du vecteur pTG10231(vecteur
multicopie) comprenant le gène Ul~A3-d, le prormoteur du gène C~YCI (pCYCI),
la partie codante du gène GUS, le termin~tellr ~G Y, un fragment de pBR3'72 et les
origines de replication phagique F.ori et de levure 2u.
~0
La Figure 3 est une représentation schématique du vecteur pTG8795 (vecteur
monocopie) similaire à pTG10231, mis à part que le gène marqueur est constitué
par le gène UR~3 complet et que l'origine ARSH4-CEN6 remplace la plus grande
partie du fragment 2~ inr~.u dan~ çe v~Gte~r.
La Figure 4 est un diagramme schém~ic~nt les activités promotrices des inserts
~ D64, R13, J1, et leurs sous-fragments (Jl.2, R13.2 et R13.3) par rapport au
promoteur du gène KEX2. Les barres représentent le niveau d'activité de la
protéine GUS dans la souche Saccharon?yces cerel~isiae TGY74.3 testée en
- système multicopie.
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La Figure 5 est un diagramme schém~tic~nt les activités promotrices des inserts
D64, R13, J1, et leurs sous-fr~gmentc (J1.2, R13.2 et R13.3) par rapport aux
promoteurs des genes KEX7, PGK, MI~a~l (pMF 1 ) et CYCI . Les barres
représentent le niveau d'activité de la protéine GUS dans la souche Saccharomyces
5 ce~el~isiae TGY74.3 testée en système monocopie.
La Figure 6 est un diagramme schem~tic~nt l'influence du milieu de culture sur les
activités promotrices des inserts D64, J1.2, R13 et, à titre de contrôle, du
promoteur TEFI. Les valeurs indiquées représentent une moyenne de deux
10 prélèvements effectués en phase de croissance.
La Figure 7 est une représentation schématique des sous-fragments R13 génerés
par délétion de la région 5' et de l'activité GUS mesurée pour chacun d'entre eux
en système d'expression monocopie et en début de croissance.
Les techniques décrites ci-après sont réalisées selon les techniques générales de
génie génétique et de clonage moléculaire détaillées dans Maniatis et al. (1989,Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY) ou selon les recommandations du fabriquant lorsqu'on utilise un kit
70 commercial. Les étapes de clonage en bacterie sont effectuées dans la souche
Lschel ichia coli (~: coli) 5K (Hubacek et Glover, 1970, J. Mol. Biol., 50, 1 1 1-
127). Les techniques d'amplification par PCR sont connues de l'homme de l'art
(voir par exemple PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, 1990,
ed Innis, Gelfand, Sninsky et White, Academic Press Inc). S'~P;CS~nt de la
25 réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un
remplissage des ex~ ~ilés 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN
polymérase I d'E;: coli ~Klenow).
En ce qui concerne la technologie appliquée aux levures, celle-ci est abondamment
30 décrite dans Rose et al. (1990, Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Course
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Les
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souches de Saccharom~ces C~r~ isia~ sont transfomlées par électroporation. Mais
toute autre technique standard peut être utilisée. Quant au:~ conditions de culture,
les levures non transformées sont generalement cultivées à 2S~C en milieu YPG
non sélectif (Yeast Extract 1%, Bactopeptone 1% et Glucose 2%) alors que les
5 cellules transformées sont maintenues en conditions selectives selon la nature du
gène de sélection contenu dans la construction. Par exemple lorsque le marqueur
de sélection est constitue par le gène bl~ conférant la résistance à la phleomycine,
la culture est effectuée en milieu YEG (Yeast Extract 0,5%, Glucose ~%)
tamponné a pH7 par addition de MOPS 0, l M et en présence de phléomycine à
10 une concentration minimale de 50 ,ug/ml. Lorsqu'on utilise le ,ène U~A3 ou
A3~ (complémentation de l'au~otrophie à l'uracile), le milieu de culture est
composé par du YNBG~cas (Yeast nitrogen base 0,675%, Glucose 1% et
casaminoacides 0,5%).
E.YEMPLE 1: Clonage de fr~(~ments d'ADN de levure presentant une açtivité
promoteur.
A. l'r~ara~iof~ ~'A.DN Chl 0~0..0/~ /tl~ l Y.
~0
Une banque d'ADN enrichie en fragments d'ADN provenant du chromosome IX
est constituée à partir de la levure Sacchal on,~ccs cer~ isia~ TGY73.4 (MA 1~,
l~ra3, his3, pra~, prb/, prcl, c~7sl) traitée par la technique dite en agarose solide
(Rose et al; l990, slrpra, Preparation of chromosome-size yeast DNA molecules
25 in solid agarose). Brièvement les levures traitées à la zymolyase sont incluses dans
de l'agarose qui est ensuite solidifié. Puis, les chromosomes sont séparés par
électrophorèse en champs pulsés (CHEF-DRII, Biorad) sur gel d'agarose 1%
(Biorad chromosomal grade agarose) dans du tampon TBE 0,5x (Tris-HCI 45 mM,
Borate 45 mM et EDTA 2 mM). L'électrophorèse se déroule pendant une durée
30 totale de 24 heures (h) en appliquant les paramètres suivants: pulses de 40 sec
pendant 16 h puis de 90 sec pendant 8 h avec un voltage de 200 volts. Ces
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conditions sont optimales pour la séparation des chrorl1osomes de petite taille (I,
VI, III et IX). La bande correspondant au chromosome I~ (le quatrième en partantdu bas) est découpee du ~,el et l'ADN extrait de l'agarose (kit Gene Clean, Bio 101
Inc). Il a été nécessaire de réaliser plusieurs éléctrophorèses de ce type afin de
5 pouvoir disposer d'environ 1 ,u~, d'ADN chromosomique.
L'analyse par Southem (Southem, 1974, J. Mol. Biol., 9S, ~03-517) en testant unealiquote marquée de cette préparation (kit DIG DNA labelling and detection,
Boehringer) sur une réplique du gel de chromosomes de levure confirme
l O l'enrichissement en chromosome IX.
B. Co~lsl~ lrctio~ e ba~lql/e ~f '~DN ch~ omosomicllle IX ~e le~ rf~.
La preparation enrichie en chromosome IX est digéree partiellement par l'enzyme
I ~ 5all3A (10 digestions de 100 ng d'ADN par 0,2 unite d'enzyme pendant I h à 37~C
dans un volume réactionnel de 50 111). La reaction enzymatique est arrêtée par
addition de I 1ll d'EDTA 0,5 M à pH8. Après précipitation alcoolique, les
fragments d'une taille comprise entre 0,5 et 1,~ ~;b sont isoles sur gel d'agarose
LMP I % (Low Melting Point, BRL) et elues par la methode du Gene Clean.
~7o
Les fragments isolés sont clonés dans le plasmide pTG9852 (Figure 1) linéarisé par
BanlH~ et traité par la phosphatase alcaline de veau (Boehringer). Ce dernier derive
des plasmides pTG6888 et pUT332 (Gatignol et al., 1987, Mol. Gen. Genet., ~07,
342-348). Le premier correspond au vecteur pTG3828 (Achstetter et al., 1992,
Gene, 110, 25-31) modifié par suppression du site XbaI contenu dans l'origine 2,u
(par digestion partielle ,YbaI et traitement a la Klenow). En parallèle, la partie
codante du gene ble est purifiée de pUT332 sous forme d'un fragment Ban?HI-
~coRI lequel est soumis à l'action de la Klenow avant d'être introduit dans le site
BglII (rendu franc par traitement à la Klenow) du vecteur pTG6888. L'insertion de
fi~gmP.nt~ d'ADN dans pTG9852 au niveau du site Ban7HI unique placé en amont
des séquences codantes du gène ble, permettra de sélectionner ceux qui présentent
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une activité de promoteur transcriptionnel (par sélection des levures transformees
sur phléomycine).
Quinze séries de transformations par électroporation de la souche E;: co/i SK ont
S été réalisées et ont permis de générer 10930 clones réci~t~nt~ à l'ampicilline donc
transformés. Etant donné la taille des inserts sélectionnés (0,5 à l,S kb) et la taille
du chromosome IX (450 kb), le nombre de clones obtenus est laro,ement
représentatif de la banque d'~DN (facteur d'environ 20 fois). Un échantillon de
colonies est analysé par PCR. On met en oeuvre les amorces oTGS427 et
oTGS42~ (SEQ ID NO: 4 et 5) dans les conditions suivantes (30 cycles:
dénaturation 30 sec à 90~C, hybridation 2 min à 54~C et élongation 2 min à 72~C).
En absence d'insert (vecteur parental pTG9852), I'amplification génère une bandede 269 pb. En revanche, après insertion d'un fragment de levure, la taille de labande amplifiée est augmentée de la taille de l'insert. Les résultats indiquent une
l S ~équence d'insertion de 90% et une taille moyenne des inserts voisine de 700 pb.
Une banque est constihlée par extraction du contenu plasmidique de l'ensemble des
clones c~,enérés.
')0 C S~ 'CtiO~l c~e pt-0~770tel/~-s pote~7tiel.~fo~lc.tio~l~7els cla~ls la le,~o e S~acc~7aro~77~ ces
cere3!isiae.
La banque obtenue à l'étape précédente est transformée dans la souche de levure
TGY74.3 par électroporation dans des cuves de 2 mm d'interface (système Cellject,
Euroo,entec; voltage 1000 V, résistance 412Q et capacité 40~1F en pulse unique).
Les cellules électroporées sont étalées en parallèle sur deux milieux di~érents afin
d'évaluer, d'une part, si elles sont transformées (étalement sur milieu YNBG + cas
pour la sélection du phénotype Ura+) et, d'autre part, si l'insert présente une
30 activité de promoteur transcriptionnel (étalement sur milieu YEG additionné de
250 ~g/ml de phléomycine). On indique que la souche TGY73.4 non transformée
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F
ou transformée par le vecteur pTG9852 (portant le gène ble dépourvu de
promoteur) est incapable de croître au delà d'une concentration en phleomycine de
20 ~Lg/ml. A titre de comparaison, le vecteur pTG9851 comprenant une cassette
d'expression fonctionnelle du gène ble (sous le contrôle du promoteur ~ 1) peut
S résister à une concentration en antibiotique de 2 mglml. Celui-ci est obtenu par
introduction du fragment BamHI isolé du vecteur pUT332 dans le site BglII de
pTG6888. Par contre, lorsque le promoteur utilisé est faible (pTG9895 comportantle <gène ble sous le contrôle du promoteur du gène K~-X2; voir exemple 2), les
cellules poussent jusqu'à 50 ~lg/ml. Ainsi la concentration retenue de 250 ~lg/ml est
intermediaire afin de pouvoir sélectionner des fragments promoteurs de force
variable.
On génère 9300 transformants (UraT) dont environ 1% présentent une résistance
à une concentration de phleomycine de 250 ,ug/rnl (106 clones). L'analyse par PCR
avec les amorces précédentes indique une fréquence d'inserts de 80%, leur taillevariant de 0,5 à 1,6 lib avec une moyenne vers 0,7-0,8 kb.
Des répliques de ces 106 candidats ont été réalisées sur milieu sélectif à
concentration croissante en phléomycine et 20 clones résistent à 2 mg/ml. Afin de
~0 vérifier que leur résistance n'est pas due à une mutation spontanée, le contenu
pl~mi~ ue des 20 Lldn~ lallls retenus est électroducté dans ~: coli SK (Nacken
et al., 1994, Nucleic, Acids Res., 22, 1509- 1510) avant d'être reintroduit dans la
levure TGY73.4. Quatre clones présentent encore une bande amplifiable par PCR
et une capacité de croissance en presence de phléomycine. Trois d'entre eux ont été
caracterises. Il s'agit des clones transformés par les plasmides pTG8732, pTG8733
et pTG8734 portant respectivement les inserts DG4, R13 et Jl.
L'analyse par Southern d'une réplique d'un gel de chromosomes de levure (exemplelA) à l'aide des inserts marqués indique que R13 est issu du chromosome IX.
D. A~7alyse a'es i~7se~ ts sélectio~t~7es.
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Leur séquence a été déterminée directement sur les plasmides double brin selon la
technique de Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ~, 5463-5467).
L'analyse des données montre !a présence d'éléments consensus transcriptionnels
- (voir Tableau 1).
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La ~_O~ ~ dison avec les séquences de la banque de données Genbank montre que
les inserts D64 et R13 portent une séquence jusqu'alors non repertoriée. En ce qui
concerne Jl, il correspond à des séquences situées en 3' du gène COX~ de
Sacchnromyces cere~isia~, dans une région où la présence d'un promoteur est
5 in~ttendlle puisque située en aval de séquences codantes.
S'a ,issant de rechercher les cadres de lecture putatifs (ORF), on note la présence
d'un ORF de 96 acides aminés (aa) dans la premiere moitié 5' de D64 et de deux
ORFs de petite taille (57 et 25 aa) couvrant respectivement les extrémités 5' et 3'
10 de Jl.
EXEMPLE 2: Vecteur d'expression du gène GUS sous le contrôle des
inserts précédents.
15 L'activité de promoteur transcriptionnel est évaluée vis à vis du gène GUS dont le
produit d'expression est facilement mesurable. En effet, son activité enzymatique
peut être détectée par colorimétrie, dosa~e fluorométrique sur des extraits
cellulaires (Jeffèrson et al., 1987, Molecular Biolo~,y Reporter, 5, 387-405) ou par
test histochimique sur filtres Nylon (Hirt, 1991,Current Genetics, 20, 437-439).
A. Isoleme~f des i~l.serts selectio~7és:
Les inserts sont isolés par PCR à partir des vecteurs pTG8732 (portant D64),
pTG8733 (R13) et pTG8734 (Jl) et à l'aide d'amorces munies d'un site de
2~ restriction ClaI en 5' de l'amorce sens et Sall en 5' de l'antisens. Celles-ci sont
indiquées dans les identificateurs de séquence 6 à 9 (oTG6302 et oTG6293 pour
D64; oTG6292 et oTG6293 pour R13 et oTG6298 et oTG6293 pour J 1).
30 ~. Caracférisatio~7 de sot~s-frag~7?enfs des i~serfs sélectio~7~7és.
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L'insert R13 dépassant 1 l~b, il peut être utile de disposer de sous-fr~gment.c de
taille réduite donc plus facilement manipulables et retenant neanmoins une activité
de promoteur transcriptionnel. Les régions 5' et ~' de R13 sont isolees de
pTG8733 à l'aide des amorces oTG6292 et oTG6294 (SEQ ID NO: 10) et
oTG6301 (SEQ ID NO: 11) et oTG6293 respectivement. Le fragment de 416 pb
recouvrant la partie 5' est désigné R13.2 alors que celui correspondant à la moitié
3' d'une longueur de 599 pb est nommé R13.3. D'autres sous-fragments ont été
crées par délétion progressive de la région 5' (voir exemple 5 ci-après).
Dans le cas de J l, l'insert est délété en 3' afin d'éliminer l'ORF putatif de 25 aa et,
notamment, son ATG initiateur susceptible d'inte~ferer avec la traduction de la
proteine d'intérêt. On isole un fragment de 547 pb (J 1.2) dépourvu de séquencescodantes putatives par amplification à partir de pTG~374 et des amorces oTG6298
et oTG6299 (SEQ ID NO: 12).
C'. ~ctetlrsc~'expr~ssio~ tllltiCOpi~s
Le vecteur de base designe pTG10231 (Figure 7; Degryse et al., Yeast, sous
presse) est issu de pTG3828 (Achstetter et al., 1992, s~lpra). Il comprend troisorigines de replication, de levure (2~1), bacterienne (ori) et enfin phagique (f.ori
permettant la production d'ADN simple brin) ainsi que deux marqueurs de sélection
(gènes URA3-a~ et Amp). A titre indicatif, le gène UR,43-cl correspond au gène
UR43 délété de son promoteur assurant de ce fait un grand nombre de copies de
~5 plasmide dans le cellule. Enfin, il porte une cassette d'expression dans laquelle les
séquences codant pour la protéine GUS (Jefferson et al., 1986, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 83, 8447-8451) sont placées sous le contrôle du promoteur du gène
CYC1 et du terminateur PGK (~it7em~n et al., 1983, sllpra). Il est à la portée de
l'homme de l'art de générer un tel vecteur à partir des données de la littérature.
Le vecteur pTG10231 est digéré par ClaI et SalI afin d'éliminer le fragment portant
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le promoteur CYCI. Les fr~oment~ amplifiés (correspondant aux inserts et leurs
sous-fr~gmçnt.~ respectifs) sont clonés dans le vecteur linéarisé. On selectionne des
clones présentant des plasmides ayant un profil de restriction correct nommés
respectivement pTG8784 (portant D64), pTG8781 (R13), pTG8785 (Jl),
pTG8782(R13.2),pTG8783(R13.3) et pTG8786(JI.2).
Un témoin négatif est généré par digestion de pTG10231 par ClaI et SalI,
traitement à la Klenow et religation. Ce temoin dépourvu de promoteur est désigné
pTG8793 .
Il est également utile de comparer les séquences promotrices de la présente
invention à d'autres promoteurs, soit réputés forts comme ceux des gènes ~Fc~l
et PGK ou plus faibles comme le promoteur du ;,ène K~X~ (Fuller et al., 1989,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,1434-1438). Les séquences correspondantes sont
obtenues par PCR:
pour le promoteur du gSène K~,~2: amplification d'un fragment de 524 pb à partirde pTG9895 et des amorces oTG6304(SEQID NO:13) et oTG6293. A titre
indicatif, pTG9895 est obtenu par insertion dans le site b~a~lHI de pTG9852
(exemple I ) d'un fragment PCR portant le promoteur du gène K~X2. Ce dernier
est amplifié à partir de la matrice pTG4812 (décrite dans EP396 436) et des
oligonucléotides oTG5739 et oTG5740 (SEQ ID NO: 14 et 15),
pour le promoteur du gène MFccl: amplification d'un fragment de 974 pb à partir
d'une p.é,.,al~Lion d'ADN génornique de la souche de levure FL100 (ATCC28383)
et des amorces oTG6929 et oTG6930 (SEQ ID NO: 16 et 17), et
pour le promoteur du gene PGK: amplification d'un fragment de 779pb à partir
d'une pl ~al ~lion d'ADN génomique de la souche de levure FL 100 et des amorces
o-TG7002 et oTG6928 (SEQ ID NO: 18 et 19).
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Les fir~om~nt~ amplifiés sont ensuite insérés entre les sites ClaI et Sa/I du vecteur
pTG10231 à la place du promoteur CYCl, pour donner respectivement pTG8780
(KEX2), pTG8789 (MFal) et pTG8791 (PGK).
S D. ~!ec~el~rs d'~xpl essio~l mo~locopies.
Le vecteur pTG8795 (Figure 3) est l'équivalent du vecteur pTG10231 mis à part
qu'il comprend une unité de replication autonome ARSH6-CEN4 (Sikorski et
Hieter, 1989, Genetics, l22, 19-27) à la place de l'origine 2~,1 et le gene U~43 à la
place de Ul~A3-~.
Les fragments promoteurs sont introduits dans pTG8795 par recombinaison
horriologue en remplacement du promoteur CYCl. Pour ce faire, la souche E co/i
BJ5183 (~ ~, sbcBC, galK, mef, t~'?i~ iol, hsdR, s~rR) est co-transformée par
1~ un des plasmides obtenus à l'etape précédente (plasmides donneurs pTG8781 à
pTGg786) digérés par 5~uI et, d'autre part, le vecteur de base pTG8795 (plasmidereceveur) linearisé par No~I. Une première analyse du profil de restriction est faite
sur les clones générés afin de sélectionner ceux présentant le pro~ll attendu
(désigTnés pTG9704 (D64), pTG9701 (R13), pTG9705 (Jl), pTG9702 (R13.2),
pTG9703 (R13.3) et pTG9706 (Jl.2)). Leur contenu plasmidique est ensuite
transféré dans la souche SK afin d'obtenir des quantites supérieures d'ADN
plasmidique.
On procède de même pour générer les témoins positifs en ~Itili~nt les vecteurs
25 témoins précédents (pTG8780) à titre de vecteurs donneurs. On génère
pTG9700 (KEX2), pTG8799 (PGK) et pTG9711 (MFo~). Le témoin negatif
pTG9713 provient de pTG8795 clivé par les enzymes ClaI et SalI, traité par la
Klenow et religué sur lui-même.
E~EMPEE 3: Evaluation de l'expression du gène GUS.
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Les constructions de l'exemple 2C et D sont utilisé~s pour transformer la soucheTGY73.4 ou W303a (~ 4Tc~ n3, lel~, his3, trpl, ac~; Crivellone et al., 198~,
J. Biol. Chem., 263, 14323-14333). On peut évaluer l'expression du gène GUS
- directement sur les colonies résultant de la transformation par une technique semi-
5 quantitative décrite par Hirt ( 1991, sllpra) dont le protocole a été modifié comme
indiqué ci-après. Une portion de colonie est prélevée au cure-dent et déposée sur
membrane Nylon N (Amersham). Après congélation 10 min à -80~C, les colonies
sont décongelées sur papier 3M Whatman imbibé de tampon Na,HPOI 50 rnM pH7
contenant du réactif 5-bromo-4-chloro-3-indolylglucuronide (X-gluc) à 50 !lg/ml
10 (dilution d'une solution stock à 5 mg/ml dans du DMSO, diméthylsulfoxide). Laréaction se déroule dans l'obscurité à 37~C. Les colonies produisant la protéineGUS apparaissent en bleu, I'intensité et la rapidité d'apparition de la coloration
étant d'autant plus fortes que le niveau d'expression est elevé.
15 Afin de disposer de mesures plus qu~ntit~tives, les levures transformées sontcultivées en milieu liquide (YNBG + cas) à ~~C. On prelève un échantillon de
culture (10 ml) au cours de la croissance, les cellules sont récupérées par
centrifugation et reprises dans 500 ul de tampon d'extraction GUS additionné de
I m~vI de Péfabloc (Jefferson et al., 19~7, supra), avant d'être broyées pendant 15
~0 min (broyeur Retsch). Le broyat est ensuite centrifugé 10 min à 10000 rpm à 4~C.
La concentration protéique est dosee sur le surnageant (l~it Biorad) et l'activité
enzymatique de la protéine GUS déterminée par fluorimétrie en utilisant le substrat
méthyl umbelliferyl ,~-glucuronide. On note généralement une différence dans lesrendements d'extraction en protéines entre les souches TGY73.4 et W303a.
25 Cependant les activités GUS r~m~n~es à la quantité de protéines sont comparables
dans les deux souches.
La Figure 4 présente les niveaux d'activité de la protéine GUS produite dans la
souche TGY73.4 Ll~n~r~ llée par les vecteurs multicopies de l'exemple 2C. A titre
30 indicatif, les prélèvements sont effectués en phase stationnaire de croissance et
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l'activité GUS est donnée en nmoles de méthyl umbelliférone (MU) produite par
min et mg de protéine. L'insert R13 a une activité promotrice nettement supérieure
à celle mesuré avec tous les fr~gm~ntc testés ainsi que le promoteur KL;X7 (facteur
5~). L'insert D64 peut également être considéré comme un promoteur fort aux
vues des niveaux de protéine GUS produits sous son contrôle (28 fois supérieurs
a ceux obtenus avec le promoteur KLX7). En revanche, les capacités promotrices
de l'insert complet J I sont du même ordre de grandeur que KE~Y~ (à un facteur 2près). Cependant la délétion de l'ORF de 25 aa situé en son e,~L,él"ilé 3' s'avère
avantageuse puisque l'activite promotrice du sous-fragment Jl.2 est nettement
ameliorée. Quant au sous fragment R13.3, il conserve une activité promotrice
importante bien qu'inférieure à l'insert complet dont il dérive alors que le sous-
fragment R13.~ constitue un promoteur très faible. Bien que les données ne soient
pas représentées, aucune activite GUS n'est mesurée avec les témoins négatifs
(souche TGY73.4 non transformée ou transformée par le plasmide pTG8793).
La Figure 5 résume les données concernant les vecteurs monocopies de l'exemple
7D (prélèvement à une D0600nm d'environ 1). On retrouve un profil à peu près
comparable. Les niveaux d'activite GUS obtenus sous le contrôle de l'insert Rl3
complet dépassent largement ceu~ produits à partir des clones testés ainsi que des
promoteurs PGK et A~ l reputés forts. L'activité promotrice des inserts D64 et
Jl.2 est du même ordre de grandeur que celle des promoteurs de reférence PGK
et M~al. Enfin, la capacité transcriptionnelle de R13.3, bien que notable, est
inférieure à celle determinée avec l'insert complet. Dans cette e~cpérience, la faible
activité du promoteur CYCl s'explique par la quantité importante de glucose dansle milieu de culture car les prélèvements sont effectués en phase exponentielle.
La caractérisation de la protéine GUS produite par les différentes levures
l~dn~ro"~lées a été réalisée par gel SDS PAGE 7,5% (système mini-protean II dualslab cell, Biorad). On met en évidence dans les levures contenant pTG8784,
pTG8781 et pTG8786, après coloration au bleu de Comassie, une bande d'un poids
moléculaire attendu (68 kDa) correspondant au produit d'expression du gène GUS,
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qui représente environ 5% des protéines totales de l'extrait.
-
La capacité de régulation de ces fragmentc promoteurs peut être étudiée enfonction des conditions de croiss~nce et de culture (mesure de l'activité à différents5 temps de culture, addition de nutriments spécifiques dans le milieu de culture,
comme le glucose, la thiamine...). En particulier, le niveau d'activité GUS produit
par des souches TGY73.4 transformées par les vecteurs monocopies a été
déterminé en fonction de la croissance des levures en milieu minimnm L'insert R13
est actif en tout début de phase exponentielle et son activité décroit au fur et à
mesure que la DO 600 nm ~nt~mente. Le sous-fragment J.12 présente un
comportement similaire. S'~oiss~nt de D64, son activité promotrice est égalementmoindre en phase stationnaire mais le profil observé est légèrement di~érent dans
le sens où l'activité maximale se situe au milieu de la phase exponentielle (profil en
cloche). Par contre, I'activité promotrice du sous-fragment R13.3 est augmentée
15 en phase stationnaire (comme cela est observé avec le promoteur CYCI).
En conclusion, ces expériences ont permis d'isoler et de caractériser des
promoteurs de levure de force et de régulation variables capables de promouvoir
l'expression de gènes hétérologues
~0
EXEMPLE 4 Influence du milieu de culture sur les activités promotrices
Les vecteurs monocopies pTG9704 (D64), pTG9706 (Jl.2) et pTG9701 (R13) ont
25 été cultivés dans 3 milieux di~éleuts, en parallèle avec le plasmide pTG9707
équivalent aux precédt~nts mis à part que c'est le promoteur TLrl (Cottrelle et al.,
1985, s~rpra) qui dirige l'expression du gène GUS. L'étude est réalisée sur milieu
défini YNBG+cas à base de glucose, milieu riche YPG et milieu défini oxydatif
~ YNBGly+cas dont la source de carbone est le ~,lycerol. Deux prélèvements sont
30 effectués en phase exponentielle de croissance (DO600~ 1). Les activités GUS sont
mesurées en fluorimétrie sur les extraits protéiques acellulaires de chaque
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échantillon (Figure 6).
Les extraits protéiques des clones correspondant aux trois inserts promoteurs del'invention présentent tous une activité GUS réduite de 50% sur milieu
S YNBGly+cas, en comparaison avec le milieu glucose YNBG+cas. En revanche,
l'activité GUS contrôlee par le pT~;Fl est identique sur les milieux YNBG+cas etYNBGly+cas, confirmant que ce promoteur est efficace sur les deux sources de
carbone contenues dans ces milieux de culture. En outre, indépendamment de la
construction (y compris pTG9707),1'activité GUS est moindre sur YPG que sur
I O YNBG+cas.
L'activité optimale des fragments promoteurs D64, J1.2 et R13 semble être
obtenue en milieu défini avec du glucose comme source de carbone. Cependant,
comme indiqué precédemment (e~emple 3), l'activité décroît régulièrement au
cours de la croissance au fi~r et à mesure que le glucose disparait du milieu deculture, (réduction du niveau de production GUS d'un facteur 2 en phase
stationnaire). On indique que sur milieu défini glycérolé (YNBGly+cas), une telle
~,ariation d'activité n'est pas observée durant la croissance cellulaire (niveau GUS
constant) .
EXEMPLE S Etude de sous-fragments de l'insert R13
Des délétions progressives en 5' ont éte realisées à partir du fragment R13 dans le
but d'identifier un insert promoteur de taille minim~le et d'activité optimale. Le
fragment R13.9 est amplifié par PCR à partir du pTG9701 (Exemple 2D) à l'aide
des oTG 7659 et 7234 (SEQ ID No: 20 et 21) et permet de générer pTG9754
après clonage sous forme d'un fragment ClaI-Sall dans le vecteur d'expression
monocopie du gène GUS. R13.9 correspond à R13 délété de 80 pb en 5'. L'insert
R13.5 est é;,alement amplifié par PCR à partir de la matrice pTG9701 à l'aide des
oligonucléotides oTG7422 (SEQ ID No: 22) et oTG7234, et donne lieu au vecteur
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dlexpression GUS pTG9719. Rl3.5 correspond à une délétion de 190 pb en 5' de
l'insert R13. Le sous-fra~gment R13.6, qui est obtenu à l'aide des amorces oTG7423
(SEQ ID NO: 23) et oTG7234 résulte d'une délétion de 300 pb en 5' du R13. Son
clonage dans le plasmide d'expression monocopie GUS g~énère pTG9720. Enfin,
le fragment R13.3, déjà décrit, comprend une déletion de 450 pb en 5' de R13.
Les levures TGY73.4, respectivement transformées par les plasmides pTG9701
(R13), pTG9754 (R13.9), pTG9719 (R13.5), pTG97~0 (R13.6) et pTG9703
(Rl3.3), sont cultivées en milieu défini YNBG~cas et récoltées à D06""-l. La
Figure 7 représente les activités GUS correspondant aux moyennes des mesures
fluorimétriques à DO60o~ 1 (trois clones testés par contruction).
L'insert d'origine R13 présente une activité GUS de 225 U/mg en phase
exponentielle de croissance. La delétion d'environ 100 pb en 5' générant R13.9
s'accompagne d'une perte d'activite d'environ ~0% (140 U/mg). Par contre,
I'activité promotrice augmente de manière significative après une délétion
supplementaire d'environ lO0 pb (Rl3.~) (activité GUS de 290 U/mg dépassant
celle obtenue avec R13 et Rl3.9), ce qui laisse supposer que la région déletée
comprend un élément potentiel de régulation négative de l'expression génique.
Enfin, des délétions supplémentaires en S' (R13.6 et R13.3) réduisent
considérablement l'activité promotrice (95% de perte par rapport à R13.5). En
effet, la zone délétee contient les motifs de séquences consensus de fixation duproduit activateur / répresseur codé par le gene RAPI de 5: cerel~isia~. En
conclusion, le fragment Rl3.5 présente une activité promotrice maximale qui peutetre utilisée pour l'expression du gène d'interet.
CA 0221840~ 1997-10-06
W 096/31611 PCTn~R96/00523
-28-
LISTE DE SEQUENCES
(l) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Transgene S.A.
(B) RUE: ll rue de Molsheim
(C) VILLE: Strasbourg
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 67082
(G) TELEPHONE: (33) 88 27 9l 00
(H) TELECOPIE: (33) 88 22 58 07
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Nouveaux promoteurs pour l'expression de
proteines d'interet dans la levure
(iii) NOMBR- DE SEQUENCES: 23
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTE~E D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #l.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: l:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1016 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
CA 0221840~ 1997-10-06
W O96/31611 PCT~R96/00523
-29-
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Saccharomyces cerevisiae
(C) INDIVIDUEL ISOLE: R13
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GATCAATTGT GATTCCATGA ACTCAGAAAC AACTCGCCTA AGAAACTGTC TAAATTTTTA 60
TGCACTAAAT AGACCACAAA TGAGAACGTA AAGAGAAGCT TTTATCATTT TA~ ~ll 120
CTCCTTAGGA GGAAATACAA ATATCTTTTC TACATTTAAT TCA~TCTGAC AGTCAAAGTT 180
ATACATATAC ATTATACCGA TTACCAAGTT TTCAGACTAG AACCCATACA TTATTTTACA 240
AACCCAGACA GTACACTATA CAAAAACCCA AGCAATTGCA ATCAATTTTT TTGCACGAAA 300
ATTTTATTCG AAATCGCCAA CCCGCTAGGA GAAAAAGAAG GAATTCTCAA AGGAGAGGCT 360
GG~C.~GAGAG GTCGTCCCAG TCTACCGCCT ACGAGTAATG TTGGATACTA AGCAGTTCCC 420
AGCCTGAACG CTCTGCTGGA TGGGTGGAGA TTTCCCTCCA GGCGGGAACA CTCCTGGTGG 480
ATTCTGCTCT GGAAACTATG CCTGTGCATG CTACCAGGTT CAAATAATCT TTCAATACTT 540
GACAAAAGTA GATATACATA TTTTAAAAGA TTAGATTACT ATTGATAAAT CTACTATTTG 600
TCATAAACTC ACCAAGAAAC CACAAAGTTA TTGAACAATG GGTATGTTTT TATTATATCG 660
CATAATTATG GCAAATGTTA TGAAGGATTC CTCTATGACT TAGATGTTTT GAATCGGTAC 720
ATTTTATTTT CAGTATCCTT CTGCATATTA CAAGGCAACA TAGCAGCGGA CAAGAAAGCG 780
~ llGATG TTCGTCTTCG AAACGATTAC TATCAGGGTC TTTTAAATGC TATATCGGGA 840
CTTATTGAAA TTGACATATT ACACTTATGA ATGACGTTGG CTATCAAAGT ATGAGAATAA 900
GCCTTTCCTA CTATTTTGTA TCATGACAAC AGGGll~l~l CGCTTTGAAT GCGGCCTTTT 960
ACTTTGCCAT ATTTTGATAA TGAAAAAACT TTCGAGAAAT ATTTACTAAC AGGATC 1016
CA 0221840~ 1997-10-06
WO 96/31611 PCT/1;~96/00523
- 30 -
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 617 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Saccharomyces cerevisiae
(C) INDIVIDUEL ISOLE: D64
(.~i) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
GATCTTGATG TCTATACCA~ CCATGCATGA TTTCCTATTG TGCGTGCCTT ATTTACGCAC 60
GTTTTTCAAC ATACGGCTCT ATCACCGAAG GCGCTCAAGA GCAGAATAAT ATGACCGTCA 120
TTCATTTCAA ACCCATACAC AATGA~CCTT ATCACACCCA AACATATGAT ATGGTATTAA 18C
A~AATGA~AA AAATTCATTA TTCTTTAGCG TAATTATTGA AGA~AAAACA GTGCGCGCGG 240
TAATTTTTTG TCACTCAGTA ACTAGAGAGA AGCCGAATGT ACTCCCCCGG CTAGCTGGAG 300
ACCATGGCTC TGCCTAGGAT ~ llATG CTTTCCTTTC ACCAATCACT TTGTTCCGGC 360
GAGGCTCCGC GGAGCTCGCT TTCTTTCAGC CTAGCAATCA T~l~ GCC AGCGTCGTAG 420
ACTACTGTAT GGCAGTTGCT GCACTTGCCA TGAATATCCT AGTGAAGCCT CTATGCAATA 480
ATCCAGTTAC TGCGTTAGAA TCCTGGTA~A ATGTCTAATC TTATTACATT ACAGCAACGT 540
ATTAGATTTT GATTGA~AAT TAGTCCTTGC GACTTGGTAT ATATCTTATT TTAAGA~AGC 600
TGA~AGGAAG AAAGATC 617
CA 0221840~ 1997-10-06
W O 9Gt31611 PCTA~R96/00523
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 609 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Saccharo~yces cerevisiae
(C) INDIVIDUEL ISOLE: Jl
(xi) DESCRIPTION Dr LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GATCGAGAAA AGGTCGAGAT ATATTTTTAT TTAAAAATTC TTATTAATAT TAGTACTATT 60
CATGTCATAA CTGATTACTA TTTCTATCTC TGTCAGAGAT GGCTAGCTAG AGGTTGTTGC 120
GAAGTTACTT CCAAAAGATT CTAGACTGTG CTTACAGCAT CCATACACCC ACCCATACAT 180
ACTGATTTCT '~ lAAAG ACGTCGATTT TTCGAAAAAA GTAAATTCTC GGCACAGGGA 240
GTTGAATTGA ACTTCCCTGC CCCGACGGTA AGCAGCTTAC CGGTATTGCT TCGTTCTCCT 300
TGGGAGATGT TCTCGGCTCT GGAAGGAAAA AACCTTCGTG GGGGGAGGGC TCATATCCAG 360
TAACATAGGC GGAACTCGAA GTGTCAGCTT ACACCGCTTC GTTCTCATTG AGTGTTGAGG 420
GATTACTTGG TATTTGAAAT ACCTACTAGA TTTAATGTTC GTTATAGTAA ATGATTTAAT 480
TTGTTCGCTA TTACAGATAA AAGAACCATA GTCTTAAGTA GTATGTTAAC GACACAAAAG 5~0
TGTGAAAGTA GAGAAGGGAA GAACGATGAG ATCCGTCGAC CTGCAGATCA ATTCGAAATG 600
ACCGAGATC 609
CA 0221840~ 1997-10-06
W 096/31611 PCT~R96/00523
-3~-
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG5427
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GG~GCATAT TTGAGAAGAT GCGGCCAGCA 30
(2) lN_ORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: s imple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG5428
-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CA 02218405 1997-10-06
W O 96131611 PCT~R96/00523
ATTCCGAAGC CCAACCTTTC ATAGAAGGCG 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: slmple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECUL~: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6302
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
GAAGCTATCG ATTTTGATGT CTATACCA~.C CATGC 35
(2) IN-ORMATION POUR L.~ S-Q ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
- (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6293
CA 0221840~ 1997-10-06
W O96/31611 PCT~R~6/0~Ç~
-34-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
TGGTCGGTCG ACTCGAATTG ATCTGCAGGT CG 32
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6292
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CTTGGCATCG ATTTGTGATT CCATGAACTC AC 32
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
tC) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(i-ii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6298
CA 0221840~ 1997-10-06
W O 96/31611 PCTA~R96/00~23
-3~-
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
..
GAAGCTATCG ATTGAGAAAA GGTCGAGATA TATTT 35
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: l0:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomigue)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG629
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: l0:
TTAGTAGTCG ACATTACTCG TAGGCGGTAG ACTG 34
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: ll:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
-
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
-
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
CA 0221840~ 1997-10-06
W O96/31611 PCTn~R96/00523
-J6-
tC) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6301
(xi~ DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
ATTTCCATCG ATGCGGAACA CTCCTGGTGG ATTCTG 36
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: s imple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
tvi) ORIGINE:
(C) INDIVIDU_L ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6299
(xi) DESCRIPTION D_ LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
TGTGTCGTCG ACTTACTACT TAAGACTATG GTTCT 35
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
CA 0221840~ 1997-10-06
W O96/31611 PCT~R96/00523
(vi) ORIGINE:
tC) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6304
- (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
GTAGCTATCG ATACGTAATA TATTTCCTCA CTTTC 35
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléi~ue
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: 1 inéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG5739
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1~:
TCTTCGGATC CTTTTATTTT TACTATACAT ACATA 35
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases
- (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
CA 0221840~ 1997-10-06
W 096/31611 PCT~R96/00523
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG5740
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
TACTTGGATC CGTAATATAT TTCCTCACTT TCAT 34
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
tA) LONGUEUR: 39 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6929
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
GAATTCTATC GATAAGATTT AAAGGTATTT GACAAGTAG 39
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
- (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ( génomique)
CA 0221840~ 1997-10-06
W O 96131611 PCT~R96/00523
-39-
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6930
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
GGAAATGTCG ACCTTTTAAT CGTTTATATT GTGTATG 37
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: l8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 40 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(c) NO~BRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
~iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG7002
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
CCTGACATCG ATTCAAGACG CACAGATATT ATAACATCTG 40
- (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: l9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 paires de bases
- (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
CA 0221840~ 1997-10-06
W 096/31611 PCTn~R96/00523
-40-
tii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG6928
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: l9:
GATAAAGTCG ACGTTTTTAT A~ ~TA AAAAGTAG 38
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE Dr BRINS: simple
(D) CONFIGUP~TION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG7659
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
GACCACAAAT CGATACGTAA AGAGAAGC 28
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2l:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA 0221840~ 1997-10-06
W O96/31611 PCT~R96/00523
-41-
~A) L~N~U~U~: 25 paires de bases
tB) TYPE: acide nucléigue
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG7234
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
CACGGGTTGG GGTTTCTACA GGACG 25
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE D_ BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG7422
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
CATTATATCG ATTACCAAGT TTTCAGACTA G 3l
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 23:
CA 02218405 1997-10-06
WO 96t31611 PCT/l~R96100523
- 42 -
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
~iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SEN5: NON
(vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese oTG7423
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
ATTCGA~TC GATAACCCGC TAGGAGAAAA AGAAGG 36
