Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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COMPOSIT~ON PHAT~MACF.UTIQUF Ul~ F POUR LA
TR~NSF F.CTION D'ACIDES NUCT FTQUES ET SES UT~T T~TIONS
La pré~..le invention con~rn~ le ~lo~ e de la thérapie génique et
~inLe~e plus partic~ au L~dl~rell in vitro, ex vivo et/ou in vivo du m~t~f~]
5 génétique. Elle propose n..L~ une nouvelle cu,.,~silion pl-A....A.ei-~;que utile
pour L ~rwL~r ~ . ~.n~ des C~ Elle se ~al.~po~le e~l/?m~nt aux ~Iti1;.~ ;nn.
de cette conlposiLion.
Des ~iefi~ nr~ et/ou ~nnm~lif~ (mnt~tinn, ~A~ ion ~l~..,.nl~, etc)
chrnmosnmirl~les sont à l'origine de nom~reuses m~ s, à caractère héréditaire ou10 non. Pendant longt~mrs~ la ...~lf-f~;..e co,lv~ ;nnnf~lle est dt~ eul~ce ;~r~ e à leur
égard. Aujourd'hui, avec le dévelop~,.,t:"l de la thérapie gPni~le on espère pOuvol-
déso..-.~i~ corriger ou pl~ven ce type d'~ til~n cl~ru.... ~ ue. Cette nouvelle
m~ii-~ti~)n c~ c~ ~ à ull~ dui~e une ..,~ n génétique, dans la cellule ou l'organe
affecté, en vu de corri~r cette ~IPfiri~n~e ou ~nnm~ ou encore, d'y ~i"~er une
15 protéine d'intérêt thf3...pei.l;que.
L'obst~cle majeur à la pé~L,~lion d'un acide ml~ q~le dans une cellule ou un
organe cible, repose sur la taille et la nature polyanionique de cet acide nucléique qui
s'o~>po~enl à son passage à travers les membranes c~ ires.
Pour lever cette ~liff~ lté~ diverses techniques sont aujourd'hui ~naposées
20 dont plus particuli~:-e-,*-,~ la L.~r~Lion d'ADN nu à travers la membrane plasmique
in vivo(WO90/11092) et la transfection d'ADN via un vecteur de transfection.
En ce qui con~e~ ne, la transfection d'ADN nu, son ~ffica~ite~ demeure encûre
très faible. Les acides m~ iq1l~c nus pt~ nt une derni vie pl~m~hque courte en
raison de leur dégradation par les ~y--~s et de leur ~limin~hon par les voies
25 u~ai~es.
Pour ce qui est de la seconde technique, elle propose prinr1p~lem~?nt deux
~ stratégies:
La première met en oeuvre les vecteurs de transfection naturels que sont les virus. Il
est ainsi propûsé d'utiliser les adénovirus, les herpès virus, les .~LIVviluS et plus
30 réCç~-----~nl les virus adéno associés. Ces vecteurs :j'av~-e~t ~ru-l--~-LS sur le plan de
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la ~ r~l;~ n mais on ne peut mAlh~ ..~.nt~.ll exclure totAl~m~nt à leur égard
certains risques de pathogénicité, r~p1ic~ti~n et/ou irnmlm~ onicit~, inhérents à leur
nature virale.
La seconde strat~gie csn.~;~L~ avAnt~r- -~. . .~ à utiliser des agents n~ viraux5 ~'~p~hl~ de promouvoir le ~ L~ et l'~ion d'ADN dans des oellules
euc~ y~Les.
L'o~et de la p~se ,l~ illvel~Lioll s'inscrit plus particulièlt:-~-e ~L dans cette
secon~e stratégie.
Les v~;~eu.~ c~imiques ou hisrhimiqll~s ~t:p~ une alle~ndlive
10 avAnt~ ee aux virus naturels en particulier pour cette ~h~nc e de réponse
immlm~lo~ e et/ou reco...l~ A;~n virale. Ils ne possèdent pas de pouvoir
pAthogf~n~, le risque de mllltip~ tion de rADN au sein de ces vecteurs est nul et il ne
leur est attaché aucune limite théorique en ce qui c--n~ f~rnç la taille de rADN à
transfecter.
Ces vecteurs ~y~lL~iques ont deux fonctions ~;.. ';p~l~, c~n~i~n~r l'ADN à
transfecter et promouvoir sa fixation oelllll~ire ainsi que ssn passage à travers la
membrane plasmique et, le cas é~h~nt les deux m~mhr~nee nll~ ires.
De part sa nature poly~nioni~ç, rADN n'a natur~llçm~nt aucune affinité pour
la membrane r1~mi~ e des oellules de nature ég~ m~nt polyanionique. Pour pallier à
20 cet inconvénient, les vecteurs non viraux p-).eeè-l~nt génér~lPm~nt tous des charges
polycationiques.
Parmi les vecL~ y--lll~iques développés, les polymères cationiques de type
polylysine et DEAE dextran ou encore les lipides c~ti~niql1çe ou lipofectants sont les
plus avantageux ns p~)e.ee~l~nt la propriété de con-1~neçr l'ADN et de promouvoir son
25 association avec la membrane coelllll~ire. Plus récemm~nt il a été développé le concept
de la transfection ciblée, médiée par un récepteur. Cette tech~ique met à profit le
principe de con~ne~r l'ADN, grâce au polymère c~ti~)niflue~ tout en dirigeant lafixation du complexe à la membrane à l'aide d'un couplage chimique entre le polymère
cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type30 oe~ ire que l'on veut greffer. Les criblages du récepteur à la lLdl~r~llille, à l'insuline
ou du récepteur des asialo~lycol?lo~ es des hépatocytes ont ainsi été décrits.
- =
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Touler~,is, les ve~;le~ Jes proposés aujou.~llli sont encore loin
d'être aussi pelr~,....,-..lx que les vecteurs viraux. Ceci peut ~l~J~ nt être la
conséquence d'une c~)nf~n~tiC~n ~ rr;.~e de l'ADN à tranfecter et/ou des riiffi~llt~s
rencontrées par l'ADN ~ansfecté pour sor~r de l'~n~ Qme et pél~éL~ n~ le noyau
5 c~ ire. En effet, le transport d'ADN dans le noyau d'une cellule eucaryote au repos
pose un problème évident puis~le les liimPn~;~ n~ des pores nllrl~ireS ne pçrmett~nt
que la diffusion de protéines de poids molé~ ire illÇeliel,r à 60 OOODa. (I. Davis et
al., Ann. Rev. Riorh~m 1995; 64; 865-896). Un ADN pl~miriique possédant un poidsmf~lé~ll~ire s l~ri~lr à 106 ne peut donc natur?~ mf~nt pénétrer dans le noyau
10 c~ ire par simple diffusion.
La présente illv~3l1ioll a préri~çm~nt pour objectif de proposer une solution
av~nt~gn~ au problème précité.
Plus ~ér:~ . ~ .~nt la présente illv~lliun propose une composition
pharm~ e~ti~e utile pour la h~r~;Lion d'au moins un acide nucléique caractérisée en
15 ce qu'eUe cnnhent outre ledit acide mlrl~iq~e et au moins un agent de L-~l~t~Lion, au
moins un composé ~ nt des propriétés de fixation de l'ADN à une c~p~cité de
ve~ m m-r.lé~ire de cet ADN.
Au sens de l'invention, un composé p~ éA~nt des propriétés de fixation de
l'ADN, couvre tout composé capable de se fixer au moins parti~ m~nt à l'ADN à
20 vectoriser. En ce qui concerne plus particuli~lelllellL son aptitude à vectoriser cet
ADN, elle se traduit au sens de l'invention par une efficacité à diriger cet ADNqr~m~nt à travers les difré ~ es membranes ~~ ires et/ou m1rlé~ires pour le
conduire j~qu'au sein du noyau de la cellule à traiter. Le composé selon l'invention
peut ég~l~mrnt se présenter par exemple sous l'aspect d'une m~lerl~l~ chimère
25 ~ nt un domaine de fixation à l'ADN, à un domaine permettant l'import mlrle~ire.
Dans ce cas particulier, on peut sélectinnner parmi des ~om~in~ de fixation à l'ADN,
ceux issus de protéines régulatrices capables de se lier par exemple à des séquences
spécifiques ou au contraire de protéines connues pour posséder une affinité non
séquence dépendante pour l'ADN. En ce qui concerne plus particulièrement le
30 domaine impliqué dans l'import m~ ire, il peut être par exemple figuré par une
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séquence dites nls (Nuclear k r~li~ti~ n Sequence). De telles séqll~nces pOuLlo-lL être
a~p&~ Lées ou dérivées au c ~ bil)A-~iL~ déduit de la n~ 4O~ mine ou au
cr-n~.qn~ de l'~nt f~ne T de SV40.
Selon un mode de ré~li~ti. n particulier, rinvention cn.-~ une composition
5 ~ . ..-P~el)tiqtle utile pour la L,~ .;Lion d'au moins un acide nucléique c~rarPri~e en
ce qu'elle con~ outre ledit acide mt~ t~e et au moins un agent de transfection, au
moins un cc.. ~ ~po~ al~parLel~ à la famille des HMG ou l'un de ses dérivés.
Les protéines de type HMG, pour "Hign Mobility Group" sont des protéines
riches en acides aminés c~argés et p( .~ér1~nt une masse molé~-l~ire inférieure à 30000
10 Da. Solubles dans l'acide perchlorique 2-5~, elles sont classiqu~m~nt ~xLLailes de la
dlL~...nl;nepar0,35 MNaCl.
Cla~iqu~....~.-~ on ~ hn~-e 3 f~mill~s de protéines HMG: les protéines de
type HMGl/2 de masse molé~ re voisine de 25000, HMG14/17 de masse
mr~lé~l-lAire voisine de 10-12000, et HMGI/Y de composition voisine des protéines de
15 type HMG14/17 mais dont la l~alLiLion tissulaire et au cours de l'ontogénèse est
di~r~l~llL~. On sait que la séquence prilnA r~ des protéines est conservée au cours de
l'évolution au sein de çhA~lm~ de ces trois f~mill~
En ce qui c-)ncefne plus particulièrement les protéines de la famille HMGl/2,
elles se caractérisent par la présence d'une séquence de 80 acides aminés à
20 pré~o.~ AIl~ e basique (charge nette +20), dite "boîte HMG", qui c-)n~titl1e un
rl~)m~in~ de liaison à rADN. Dans cette famille on distingue les protéines r~p~hl-~ de
se lier à des séquences spécifiques de l'ADN double brin et les protéines dont la
spe~ificité de liaison réside dans une stucture ~-lim~n~ionn~lle particulière de l'ADN.
Dans la ~lellli~r~ catégorie on trouve les protéines, UBF, SRY, TCFl, ABF2, qui
25 stiml-l~nt la transcription de gènes spécifiques (Greiss E.A. et al. J. Mol. Evol. (1993)
37:204-210). La séquence de ~hA-~lm.o de ces protéines contient une ou plusieurs"boites HMG". La deuxième catégorie est représentée par les protéines HMGl et
HMG2. Leur séquence primaire est caractérisée par la présence de deux "boites
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HMG" et d'une séquence acide en C-tf~rminAl (Bustin M. B.B.A. (1990~ 1049:231-
243). Ces protéines se lient de facon s~ifi~e sur les séquences d'ADN
pali~ iq -~s e~c~udées en structure f~ lciÇfJ~ e (appariement in1rAhrin au niveau du
pal.ncl~ll.e) ou sur les séquences d'ADN qui p ~sf~ .l une forte coul~u~e. Ces deux
types de structure ont en co.. l-- d'élargir le petit sillon de l'ADN qui devient alors
capable d~arcnm~ylf~ la liaison des ploléil-es de type HMGI/2. Le rôle phy~if~logiq~le
des pr~éincs HMGl et HMG2 est à ce jour peu élucidé. Il a ~ rois été montré que
la protéine HMGl de veau est ~ ée de n~ active dans le noyau des oellulesde ..~ r~es. (L. Kuehl e~ al; J. Biol. Chem. 1985; 260, 10361-10368).
10De Il~ iel~ inAttf~n~llle~ la DrmA-~le.~se a mis en évidence qu'il était possible
de mettre à profit ces f~A~-Ttf~s des protéines HMG, à savoir leurs Artit-.~lf~s à fixer
l'ADN et à être ~anspol~ées de Ill~licr~ active dans le noyau, pour promouvoir
f~ffi~ Aoe.~ la transfection dans le noyau de cellules à traiter de séquences nucléiques
hétérologues, A5.59rie~,5 à au moins un agent tran~fe~;~,~.
15Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne tout peptide,
pseudopeptide (peptide incorpor_nt des Pl~mf~nt.s non biochimiques) ou protéine
dirfé a-l~ du composé tel que défini prece~lPmmfr~nt obtenu par une ou p~ rs
mn lificAtinns de nature génétique et/ou chimique. P_r mn~lifirAtion de nature
génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutAtic)n, s~hstittltion~ délétion,
20 A(1flitjnn et/ou molific~Aton d'un ou plusieurs résidus par exemple de la protéine
cnn~i~erée. Plus pre-~isPm~n~ par morlifi~Ation chimique, on entend toute mc~ifirAtif)n
du peptide ou protéine générée p_r réaction chimique ou par greffage rhimiqlle de
molécule(s), biologique(s) ou non, sur un nombre qu~lcnnfl~le de résidus de la
protéine. Par modification génétique, on entend toute séquence peptidique dont l'ADN
25 hybride avec ces séq~lellces ou des fnA~n~nt.s de celles-ci et dont le produit possède les
activités in~ éf,~s De tels dérivés peuvent être générés dans des buts Lffé~ ~, tels
que notAmm~nt celui d'~Al~ f l' ffinité du polypeptide correspondant pour son
ligand d'ADN, oelui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'Allgmtont~r sa
~rPsi~Anre à des protéases, celui d'Angl~ Pl et/ou de modifier l'une de ses activités,
30 ou celui de lui conf~ ~r de nouvelles propriétés ph~rmzlcocinétiques et/ou biologiques.
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Parmi les dérivés r~slllt~nt d'une a~ ;ml~ on peut citer par I .~...pl~ les s~ nr~?
pepti~ t-e,s ~ ~s comportant une partie hétérologue s~rple~.~e~ln;~ liée à une
lliLé. Le terme dérivé ccl~ d e~ll?ment les ~q~ re~ protéiques hr~molo~l.?
à la ~quellce cnn~ rée, issues d'autres sources ce1~ ires et n~ de oellules
6 d'origine htlm~in~, ou d'autres o~ ;s...~s, et ~s~ une activité du même type. De
telles séquences h~mo1cl~1e~s peuven~ être oblP.~ par des ~ ?. ;~rt?S d~yhr~ tif)n
de l'ADN cc,..es~ndiant. Les hykri~ t nn~ peuv~ être r~li~ à partir de banques
d'acides nucléiques, en l~ti1i~nt comme sonde la seq~ nre native ou un f~grnl?nt de
oelle-ci, dans des cnn-litinn~ de stringence c~ /ellLinnnfe1lf~ (Maniatis et al.), (Cf
10 techniques générales de biologie mol~..l~ire), ou, de p.~c~érel~ce, dans des c<)nf1itinn~
de slringence élevées.
En outre, il est ég~lrmPnt envi~ hle dans le cadre de la présente i lv~-~io
de mettre à profit la forte affinité de certaines des protéines de la famille HMG, ou de
leurs d~-ivées pour des structures secolldail~s ~ ~isel-~es sur de l'ADN double brin. n
peut notament s'agir de structures à quatre brin pour lesquelles il a nol;.. ~.ll été
montré que l'HMG1 de rat possède une très forte affinité (~i~nrhi et al. ~iPnrPs,
1989, 243, 1056-1059). De telles structures ~uv~ é~lem~nt être obtenues à partirde séquences naturelles telles que le,s ITRs du virus associé aux adénovirus ou bie,n
être completem~nt synthétiques obtenues à partir de palyndromes artifirie1~.
Selon un mode de ré,~ ti- n préféré de l'invention, le composé mis en oeuvre
est choisi parmi le,s protéines de type HMG 1, 2, I, Y, 14 et 17 et leurs dérivés. Il est
plus p~ ../;Pllem~Pnt le~l~sel.~é par tout ou partie de la protéine HMG1 hnm~imP ou
l'un de ses dérivés ou homologues tels que définis précé~emm.~nt
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le~s compositions
26 de la présente invention colllpl~lmell~ en outre un éléme,nt de ciblage permettant
d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être un élfim~n~
de ciblage extr~rPllt-l~ire, permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers
certains types cPll~ ires ou certains tissus souhaités (cellule,s tumorales, cellules
hépatiques, cellules hématopoiétiques, etc). Il peut ég~lPm~nt s'agir d'un ~lfiment de
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ciblage int~~ pel~ Lkul~ d'orienter le lla,~rè l de l'acide n~cl~ue vers
certains colnp&L~nell~ c~llnl~ires privilégiés (~ o~ )nrlrie~s~ noyau, etc).
Plus ~rw~ m~nt l'~4m~nt de ciblage est lié, de Illani~le covalente ou
non covalente, au composé selon l'inventioIL L'el~mPnt de ciblage peut é~ m~nt être
5 lie à l'acide ~ q-,e. Selon un mode privilégié de l'invention, ledit composé est
~ié, via une par~ie hétérologue supl le-..f ..l,.;~e liée à une de ses eAkél~ és~ à un
ligand de r~ re présent à la surface du type c~ ire comme par
~Y~mple un sucre, la ll~rénllle~ rinsul;ne ou la protéine asialo-o ~so~ o~ . Il peut
ég~l.o,ment s'agir d'un ligand de type intr~ ire comme une séquence signal de
10 loc~tion m~clé~ire~ nls, qui privilégie l'~ tion de l'ADN transfecté au sein du
noyau.
Parmi les él~m-~nt.c de ciblage l~tili~hl~e dans le cadre de l'invention, on peut
citer les sucres, les pepti~l~e~ les oliE -nt1cléoti~1.?,s ou les lipides. E~t:îé~ m.-nt il
s'agit de sucres et/ou peptiA~s tels que des ~ ico~ps ou fr~ nte d'anticorps, des
15 ligands de récepleul~ lnl~ires ou des fr~grn~nt.e de ceux-ci, des récepleu~s ou
fr~gm~nte de récepleuls~ etc. En particulier, il peut s'agir de ligands de réce~leul~ de
f~ctell~ de cn~ e, de léceple~u~ de cyt~-kin~s, de léceple~ de lectines cellulaires
ou de réce~èul~ de protéines d'a-lh~eif~n On peut ég~l~ment citer le récepteur de la
li~relline, des HDL et des LDL. L'él~m~nt de ciblage peut eg~l~m~nt être un sucre
20 permettant de cibler des lectines tels que les réce~euls asialo~lyc~ éiques, ou
encore un fragment Fab d'ainticorps permettant de cibler le récepteur du fragment Fc
des immlm~lc)bulines.
Av~nt~el-~mçnt, le con~posé selon l'invention peut être en outre
polyglycosylé, sulfoné et/ou phosphorylé et/ou greffé à des sucres complexes ou à un
25 composé lipophile comme par exemple une châîne polycarbonée ou un dérivé du
cholestérol.
La composition selon l'invention peut bien ~nt~nlltl comprendre plusieurs
composés selon l'invention, de nature dirréle,l~t:. De même, il s'avère possibled'associer au composé selon l'invention, outre le composé de ciblage mlrlé~ire
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pr~l~ l décrit, un second co,l.posé car~çri~é par sa c~l-A~;Ie à comr~cter
l'ADN. De tels c~ ~s~,s sont no~ l décrits dans la (lf~m~n-le FR 95/01865.
Le co.~ selon l'..~v~lLicm est présent en qu&--LiLé s~rli~n~ pour agir avec
l'acide nllrl~ e selon l'invention. C'est ainsi que le f~po-~ c-----l~.~./acide n~ iql-
~xprimé en poids) peut être co...l,. ;.~ entre 0,01 et 5 et plus p~éré~ em~nt entre
0,25 et 0,5.
En ce qui c~ --f e. ..e l'agent de transfection présent dans la cu~ o~;iLion selon
rinvention, il est p~ren~llLielIement choisi parmi les polyl-lè es c~h~niq~lçs et les
f~L~-l~.
Selon la ~ invention, le polymère ~-~hc-nique est de ~lefi~ ce un
composé de formule générale I,
--Nl -(CH2)n--
R (I)
dans laquelle
- R peut être un atome d'hydrogène ou un groupe de formule
(CH2~n-N
- n est un nombre entier compris entre 2 et 10;
- p et q sont des nombres entiers,
étant ~ que la somme p+q est telle que le poids molec~ ire moyen du polymère
soit compris entre 100 et 107 Da.
Il est ~nt-~n~ que, dans la formule (I) la valeur de n peut varier enke les
dir~ ~ motifs p. Ainsi, la formule (I) regroupe à la fois les homopolymères et les
hétéropolymères .
Plus p~ llçm~nt, dans la formule (I~, n est compris entre 2 et 5. En
particulier, les polymères de polyéthylène imine (PEI) et poly~b~.ylène imine (PPI)
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pl~ des propri~t~s tout à fait av~ntag~~ . Les poly--~les p..ifé~és pour la mise
en oeuvre de la plt'~ e invention sont ceuY dont le poids mc leclll~ire est co~
entre 103 et 5.106. A titre d'rYemp'~, on peut citer le polyéthylène imine de poids
mol~l1~ire moyen 50 000 Da (PEI50K) ou le polyéthylène imine de poids mol~ll~iremoyen 800 000 Da (PEI800K).
Le PEI50K ou Le PEI800K sont accç~.~ihl~s c~ ~c;~lrm~nt Quant aux
autres poly..,._~ ~~sel.L~s par la formule ~nr~le I, ils ~uv~"l être ~I~_par~s selon
le procédé décrit dans la ~em~n~le de brevet FR 94 08735.
Pour obtenir un effet c~Lu~.ull, des co...posiLions de l'invention, les
10 proportions respectives du polymère et de l'acide nucléique sont de pr~re~nce....;n~s de sorte que le rapport molaire R = amines du polymère/ph~ hn~P~ de
l'acide n11rl~le soit co~ is entre 0,5 et 50, plus ~l~çél~ mf!nt entre 5 et 30.
Des résultats tout particulit ~ avantageuY sont obtenus en lltili~nt de 5 à 15
équivalents d'amines de polymère par charge d'acide nucléique.
En ce qui conrrrne plus particuliel~-nen~ les Lpor~L~lL~, il s'agit de
molec~lles ~...plliphil~s colll~ nant au moins une région hycL~hile cationique, par
exemple polyamine, et une région lipophile. La région cationique, yl~re~nLiellement
polyamine, chargée c~t ~ni~ ement est capable de s'associer de manière réversible
avec l'acide nucléique, chargé négativement. Cette interaction compacte fortement
l'acide nucléique. La région lipophile rend cette interaction ionique in~r~ihle au
milieu aqueux externe, en recouvrant la particule nucléolipi~ e formée d'une
pPni~ll? lipidique.
Av~nt~ .ent ces lipofectants peuve"~ ég~lrmrnt être choisis parmi des
lipopolyamines dont la région polyamine répond à la formule générale II
~ H2N~ H)m-NH-)n-H II
dans laquelle m est un nombre entier supérieur ou égal à 2 et n est un nombre entier
supérieur ou égal à 1, m pouvant varier entre les différents groupes de carbone
~ ~A 02i3io64 1998-03-24~ -- =v; r~
~ ln
cornp~i~ en~re d~ux amin~ ~ref~ ticll~mcnt, rn ~st cornpris ~nrr~ 2 ~t
inc~u~ rrl~rlt ~t ~1 est compris entre I et 'i inclusi~ement. ~nc~r,~ plu~
pr~férent;ellement, la ~gion pol-amine es. représentée par la ~p~rrnine, la th~rrnine ou
un de leurs anak~gues ~vant conservé de~ propriétes ~Le ]iaison a 1'.4DlN. Quant ~ la
5 regic~n li~3phil~, elle est reL~resent~ par ~u moins rLrLe chaine hy<lroc3rborlée, saturé~
ou non, du cholest~rol, un lil~ide naturel ou un lipide synthétique capable de fcrrner dc~;
phases 13mell,~ires ou hexa~onales, liée dc maniere co~ aLent~ à la région hydrciph le.
La der~ande de bre~et EP 3~ 111 décrit d'au~res ]ipopcLyamines cle tc~rrnu!e
g~;nerlle 111 ~u.sce~tibles ;i'~tre ntises en oeuvre dan~ le cadre d~ la ,orésente in~ention
1I N~f~l1m Ht~ ILl
R
d~n~ uelle R représente nc,~mment un radi(:~l de rormule génér~le ~R1R2) N-CO-
CH - I'iH-CO- .
A titre représen~ati~ ces lipop~l~,-a~nines on l?~ut pius }~arricu1ièrerncnt citer
!a dioe~adécyl.lmidoglyc~l s,~elm~r.e ~DOGS~ e- !a :~-earboxyvp~rTrl-ilvmide dc la
l ~i palrl~itc ~ Ipilosphatidyl~th~lr.ol~ ine (DPPES).
Le~ lipopol~2mine~s ~éerite~; d~n~ L;l ~iemand~ de br~,et F~ ~4 1~96 ~ u~en~
é~lement ~t~e uti1i~ées ~.~antageu:;ement a titre d'agcnt de tr~ns~e~tic)n ~k,n
l'in~cntion. Elle.~i :;ont représer.~ees par la forrnule ,~énér~le 111 ci-de~i~us d~-ls laquell~ R
représente
,. R3
/X--~1 ~ ,~y--R6 IV
'~0 ~5
a~
- X et X' représentant, indeper~d~mrnent I'm c~ l'autre, un ~tome d'oxygène, LLn
groupement rn.~hylène -(C1~2)9- ave~ q e~al ~ ~, 1, 2 ou i3, ou urL groupement ~mino
-I~'EI- ou -~ '- a~ ~ R' repré~nt~nt un ~roupemenl alkyle en C I a C 1,
".~ - Y et ~' réprésentant ind~pend~mment l'un de l'~utre un gn~uperr.ent rn~lh~lene. un
~rour~meTIt carbon~le ou un ~r~upe!nent C=S,
FEUILLE ~ E
' ' Y ~ CA 02231064 1998-03-24~
- R3, RS ~ r~pr~ ntant in~ieT~cndamrn~nt l'un ;le l'~utr~ Lll~ ~t~me d'h~droc ne ~u
un r;~clic31 ~l~yle, ~ubs~itue oll n~)n, en C] à C~ ec p p~uvant ~ ri~r ~ntre 0 et ~,
R6 repre~ent~nt un dcri~ du chol~st~rol C)'l un gro~lF~ment ;311~1e amino -.~R11~2
aYec Rl et R2 rcpresent~nt in~i~pendamm~nt l'un de l'~utr~ u,l radioal aliFh~lhq5 ~ature ou n~n, liné3i~ ou rlmifi~ en C12 a ~22.
A titre repré~sentatif de c~ pol~amir.e~ on peut tout par~iculi~rement citer
le (Diocwdé~yl-carbatnoylméth< ~ acétale c:e 2-~i-bis-(3-amino-prop~larr.ino)-pent~
et ]e (~ioctad~cy~-czrbamcylmethox~)-2cétate de 1 ,3-bis-t3-:1minc~-prc~p~ l~lmino)-
~~ropyle .
Les d~mandes dc bre~et EP 3~ 111 et FR ~ 59~ decri~,erLt é~,~lemer.t
proc~éde utili~ab]e pOW' la pl~par~tion des liFop~lyarnirles corr~s~n~ nt~s.
~ )~ r;larLi~e ~aniculi~rrln~nt a-~nt~eu.e, c)n F~ut util ~r daJls '~ ca~lre de
l'in~ent;on la dicct~:décylamidogl~-c~i spermine ~DO~Sj k 5-car~ox~s?crmylarnid~ de
1.1 ?:~lrrtitGylpho~ph~t!id~,lethanollmine (DPPE~;~ le ~Di~ade~ e;lr:~amo~ the~
15 acetate de _-5-bia-(3-:~mino-p~-t~pylamino)-pentvle <)u le ~Dioctacl~,l-carb2mo~ 1-
rnet~to.~ c~t~Lte de 1 3-bis-(3-amino-propylarnin~>)-2 pro?yle.
PoUI ob~.enir Wl et-t~'t optimum clea comx~i iclna ~1~ l'in~enti~n 'ea
proForei~ns respe~cti~es de la ~ Yam~ne et de l'acide nucl~ique sont dc prcferenc~
dét~mnin&s de sorte que le r~ppc)rt R ch~rges positilies -'e l'a~ent de ~r~tn.slection/
'>O char~ea negati~ej cte- l'acictè nucLeic~u~ soit cr~mpr;s ~ntr~ e~ l~) et prc~ferentielle7r.enl entre 0 S et -'.
I a r)re~ence d'un composé selon l'in~ention LtU ~in d'une compositicjn
~ra~ ;fec~ante est aYantage-i-~e 'a pllLsieurs ~iIre.~. L'n p ~rticulier i: s'cn ~uit un~ t xicilé
nettement ~tmoincir.e 4 ~i fend dc~e)rrn~ia pu~aible ptr e~rr.p]e la trLtns.fecti- n de
25 cellu!~s sensibles à l'ori~ine ~ I' a ent de transtection cornme ?ar e.~mple l~s celLulea
hém~atctp<)ïéti;~u~a ~l~ ec les Li~ap~ rrtines.
_ ,,
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Dans les c~-...po~ de la p~sell~ inv~ io.~, l'acide mlr,lPi~lt~P peut être
aussi bien un acide déso~ylibo~ clPilue qu'un acide rihnmlclP;lue. Il peut s'agir de
s~uPnrP-~ d'origine naturelle ou artifiri~pllp~ et n. ~ d'ADN f~Pnomiq1l~, d'ADNc,
d'ARNm, d'ARNt, d'ARNr, de séquences hybrides ou de séquences sy}-ll,.,liques ou5 semi-synthétiques. Ces acides nl~c1PJql1PS ~u~ l être d'origine l~ nim~le,
vé~t~le ~ctériPnnP, virale, etc. ns peu~ être obtenus par toute technique connuede l'}-ol.,ll,e du métier, et n~ ....P..I par rrihlagP de banques, par synthèse rhimiql1e
ou encore par des m~th~les mixtes in~ nt la m~ifir~tiQn rhimicltlp ou ~y...~l;qv~P-
de séquences obtenues par ~rihl~ge de banques. ~s peuv~lll par ailleurs être illcor~L~s
10 dans des V~;leUL:j, tels que des vecteurs pl~mitliques.
Conl Prn~nt plus particuliè~ les acides désoxyribonllrl~ ues~ ils peuvenL
être simple ou double Wn. Ces acides d~so~cy,ibt nnrlPi~lues peuvel.L coder pour des
gènes thérape~t qtnP.s, des séquences rég ll~trirP~ de la transcription ou de laréplic~t on, des séquences ~nti~Pn~, des régions de liaison à d'autres composants
cp~ ires~ etc.
Au sens de rinvention, on entend par gène thérapeutique lloli-.. ent tout
gène codant pour un produit protéique ayant un effet thé-d~uLique. Le produit
protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, etc. Ce produit protéique peut
être homologue vis-à-vis de la oellule cible (c'est-à-dire un produit qui est
20 norm~lement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucunepathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une
expression ;n~rr~ dans la oellule ou l'e~p.e~ion d'une protéine inactive ou
f~ ment active en raison d'une mo lific~tion~ ou encore de suL~Lilller ladite
protéine. Le gène théldpeuLique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine
25 oell~ ire~ ayant une st~hilité accrue, une activité morlifiée etc. Le produit protéique
peut ég~lem~Pnt être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine
exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité ~leficiente dans lacellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse
imml Init~ire.
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Parrni les produits ll ~in~ l;ques au sens de la ~l~s~,le i~-ve:"liOn, on peut
citer plus particulii;~~ nl les enzymes, les dérivés ~An~-in~A, les hormones, les
ly~ s intf~rl~lkin-~..s, ~ e~re~ s, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de
~ Ç~ les ne,n;)1,n~ ttellr~ ou leurs precllr~ellrs ou ~,L~y,l~s de ~y~ ~se~ les
5 facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5,
HARP/pléic"Luplline, etc; les apoli~ot~ es: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc
(FR9305125), la dy jLlu~ e ou une mini-ly:~lLo~lLLle (FR 9111947), la protéine
C~lR A~A~iPe à la IIIUCUVi~ les gènes ~pp~:~eu-~i de lul~leuLs p53, Rb,
RaplA, DCC, k-rev, etc (FlR 93 04745), les gènes cod_nt pour des ra-;L~u,~ imrlir~
10 dans la Co5lgll1Atil-)n Facteurs VII, VIII, IX, les gènes illl~ vell~lL dans la réparation
de l'ADN, les gènes s~ e~A (thy~nidine kinase, ~;yLosi~,e .1 ~Amin~Ae), etc
Le gène l},c.a~..lique peut e~lf~m~nt être un gène ou une séquence AntiA~n~,
dont l'~_~p,~ion dans la cellule cible permet de contrôler l'~,e~sion de gènes ou la
LLan ion d'ARNm c~ llAires De telles séquences pe~Lv~L, par ~Y~mple être
15 trAn~ritf~s dans la cellule cible en ARN compl~ ~ d'ARNm c~ llAires et
bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet
EP 140 308. Les Anti~ns cc, ~,p-c~ ent ég~lem~nt les séquences codant pour des
ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut ég~l~m~nt co--,po-L~ un ou
20 p11lsiellr~s gènes codant pour un peptide ~ntigé.nique, capable de générer chez l'homme
ou l'animal une l~pollse immlmit~ire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre,
l'invention permet donc la ré~li.s~ti- n soit de vaccins soit de tr~it~m~.nt.s
immlmc~thç.rapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notAmment contre des
microorg~nism~s, des virus ou des cancers. Il peut s'agir not~mm~nt de peptides
25 ~nti~niques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hep~7tite B
(EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou eneore spécifique~s de tumeurs
(EP 259 212).
I~lr.~;el1~m~.nt, I'acide nucléique comprend ég~1em~nt des séquences
permettant l'expression du gène thérapeutique etjou du gène codant pour le peptide
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~ntigi~nique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont
naturell~m~nt ~s~ hles de l'expression du gène con~ ré lorsque ces séq1~ n~
sont s~epl;h~ de fon vh~)nn-~r dans la cellule infe~, Il peut e~ mPnt s'agir de
séquences d'arigine dirr~ e (~-s~ hles de l'~ion d'autres pn)le~ s, ou
même synthPfiTI~oc). Not~mm~?nt il peut s'agir de séquences prom~tri~ de gènes
euc~y-,~s ou viraux. Par ~Yemrle, il peut s'agir de sequeJ-ces promotrices issues du
~nome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences
prc~mot~ices issues du ~nom-~ d'un virus. A cet égard, on peut citer par PY~mrle les
promoteurs des gènes ElA, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences
d'expression peuvt~ être moflifif~s par a(l-7iticn de séquellces d'activation, de
ré~]l~ticn, etc.
Par ~ill~ms, l'acide m~ iq1~? peut é~ll~-m~nt coln~L~er, en particulier en
amont du gène thel~pe~,lique, une séquence signal r~irigptqnt le produit IL~ euLique
synth~ti~e dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut
être la séquenoe signal naturelle du produit th~. 2.p.eul ;que, mais il peut é~lem~-nt s'agir
de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d~une séquence signal arhficiell~
Plus p~îé~.-l;f llemf~nt les compositions de l'invention comp~llllell~ en outre,un ou plusieurs lipides neutres. De telles compositions sont particulièrement
avantageuses, n~t~mm~nt lorsque le rapport R est faible. La ~l~m~n-l~resse a en effet
montré que l'~fitlition d'un lipide neutre permet d'améliorer la fonnation des particules
nuclé- liri~iques et, de mani~le su,p.~na,~e, de favoriser la pénétration de la particule
dans la cellule en rl~lst~hili~nt sa membrane.
Plus ~c~ ,l;ell~m~nt les lipides neutres utilisés dans le cadre de la présente
invention sont des lipides à 2 chaînes grasses.
De manière particulièrement av~nt~ e, on utilise des lipides naturels ou
synthétiques, ~wiLLe.ioniques ou dépourvus de charge ionique dans les c~)n~liti(~n~
physiologique. Il pellve~lL être choisis plus particuliè,~,l~~lL parmi la dioleoylrhosph~-
tidyléth~nf~l~min~ (DOPE), le oléoyl-palmitoylphos-phatidyléthanolamine (POPE), le
di-stéaroyl, -palmitoyl, -miLy~uyl phosphatidyléthanolamine ainsi que leurs dérivé N-
30 méthylés 1 à 3 fois; les pho~rh~ ylglycérols~ les diacylglycérols, les ~ly~o~yldiacyl-
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glycérols, les cé~ebl~sides (tels que no~ e~l les ~ oc~ebr~)sides)~ les sphingo-lipides (tels que ~ les srhin~nmyélines)ou encore les ~Qi~lo~ng~ Q (tels
~ que n.. l~.. ~.. ~r,.. ~ les asialoGMl et GM2).
Ces dirre~.L~, lipides peuvellL être obtenus soit par .,yll~lèse, soit par
5 extraction à partir d'organes ~el~ le: le celvea~l) ou d'oeufs, par des techniques
cl~Q~Q;qve~Q, bien ~nm1eQ de l~omme du métier. En particulier, l'extraction des lipides
naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir e~lem~nt r Phnin~,
Bio~h~", ;~,~, y)
~ éré~.~ lhm~nt les compositions de rinvention, mettant en oeuvre à titre
10 d'agent de transfection un lipofe~;kul~ col~ e~ ent de 0,1 à 20 équivalents de lipide
neutre pour 1 équivalent de lipopolyamine, et, plus ~éçe~ nlf~nt~ de 1 à 5. Dans
le cas où l'agent de LL~u~,re~;lion est un polymère c~tioni~lue~ les co,llposilions de
l'illYellliOn co~llprel~nellL~ en plus du polymère cationique dans les la~)ol~, cités ci-
avant, de 0,1 à 20 équivalents molaires de lipide neutre pour 1 équivalent molaire de
15 phoQ,ph~t~ de l'acide nucléique, et, plus préré~ llem~nt de 1 à 5.
Les compositions selon l'invention peuvè"l être formulées en vue
d'2~ 1. dlions par voie topique, cutanée, orale, rectale, v~gin~le, p~enLeldle,
jl~L~ le, u~ veilleuse, illLl~ ire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique,
etc... De préférence, les compositions phar~-elltiques de l'invention conti~nn~nt un
20 véhicule pharm~e..l;qlle.,~lll acceptable pour une formulation injectable, n~ ..,...ent
pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une ~ . dlion par
voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions
stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notam~ent lyoI~hili~" qui, paraddition selon le cas d'eau st~rili~ée ou de sérum physiologique, permettent la
25 constihution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique llhli~?~ pour l'injection
ainsi que le nombre d'~lmini.etrations peuve~ll être adaptées en fonction de dirrélellL~
paramètres, et notamment en fonction du mode d'~ dlion utilisé, de la
pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement
~ recherchée.
CA 0 2 i 3 i o 6 4 19 9 8 - 0 3 - 2 4 __ r . -
,. 1~;
ELl~ peu~eJlt etre a~ln~t~usemcnt ut~ rts pour rrsr~;f~t~r Ir.~ ~r~ndevariétt de t~pe cellulaire comme par ~.;t rn,n,e ~'t~i cellulL~ nemalo,~t~iétiques les
l~mphoe~tes, les hepatGcytes, les cellules enclothcliale~, L~i cellul~s L~e rnelano~nes ~e
carcinc~rnes et dc ~iarcomes 1~ cellul~s rnu~.ul~ire~s lisses. Ie~ n~u.one.Y ~t lt- s
5 astr-oc~-tes.
La présente in~ention ~ournit ~in~ ne méth~xl~ particu]ierement a~nta~,eu~
pvur le uaitement de rnaladies uti]i.sant 1LS tra~1~t~eC.;<)n 1n V;tr~ ), eX V;-rO I)U irl vi~.v d'un
acid2 nucleit,ue ~,t,at~ n~_er ladite rnal~d e en ~a~;oclatiorl 3~e~ un a~en~ t e
transt~ectinn de ~pe E~ rr.ère cationique ou ]ipofectr~nt. et un corn~ ;e tel que de.~illi
10 ci-a~nt. Plu~ particuli~rem.ent. cette mérhode es~ a~tyl.cable au-;~ malacies re~u~taJI;
d'une déticience en un produit protéiqlle ou nucleique et l'~c de r.ucleique v.dnniri~lre
code pour ledi~ produit yrotéique ou c~nt;ent la jeou~nce c~tresyor~dan~ audit prG~ui~
nucléique. L,e~ compo~ition~ s~elor: I'in~,eTltt~n .~ont p2rticuliere.rl1~rt intér~sanre~ pour
leur ~)iodisE)on e et leur ni~e~u de T~an~fectivn.
-ésente inverltion c:~ncerne éc !llement ~ou~e utilisatic;rl d'un c~mpose
selon l'in~enti~n couple à un li~,~Ln~l de recepIeur cellul .ir~, un ant;c~rps ou d~ri- e
d'anticcrps~ pour cil~ler un acide nL~ciéique ~,ers ~es eeUuLe~s e~prirnanl l~s récepte~.~
<~u ~ti-gene~ co~resp(~ndams Dans cette perspecti~e, un lig~n~, an;ic~rps o~ dénvé
d'~nticcrps p~tentiel est cou~ audit ccrrtElc,~;c et i'orL a?precie le r~u~3ir de
70 trarstecti(an de eet~e mclecule chimèr~ c~mpa~ativement au com~>sé se~l.
L.a prc~cnte ir~nt;on ser~ plus compl~tem~nt dec..te à l'aic~e des e~;er,~ple~
qui sui~ent, 4ui doi~ent etr2 c.~nsideré~s comm~ illustraLit's ~t nc~n lirr.i~atifs.
~IC~'RE~
Fie,ure 1 ~e~ré~entation ~ intensités lumineuse~ de l efficacité d~ nsf~ctiens
25 r~a]isees selon l'invention dani dift~renLs t~pes cellulaires.
Fi~ur~ 2: ~.ppréci~t;~n ~le l'e~f;caci~é de iran~;f~ ti~7ns réalisées en Frc.sencr, et er.
;lb~;~nc~ ~e }I~IGl.
l~ElJlLL-~ ,r~ "~; ,r,'r
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MATERIEL FT METHQDES:
- La construction utilisée pour mettre en évidence l'activité des cv~ n~ de
l'invention est un pl~mitleco~ o~l~ll le gène codant pour la luciÇ~.~ (Luc), pCMV-
Luc.
Le pl~ni-l~ pCMV-luc comporte le promoteur du Cyt mé~lovirus (CMV),
extrait du rl~mi.le vecteur pcDNA3 (Invit,rogen) par collp~ avec les ~y-l-es de
restriction Mlu I et ~in~1m, situé en amont du gène codant pour la luciférase, inséré
aux sites MluI et Hindm dans le vecteur pGL basic Vector (Promega).
EXEMPLE l: PREPARATION DE LA PRO l~;INE HMGl DE RAT
1.1 Fxpression de la protéine HMG1 chez E. coli
Cette protéine rec-)mhin~nte provenant d'un r~ ele a été préparée par
s~ piession chez E. coli.
Le pl~mi~l~ T7-RNHMG1 codant pour la protéine HMG1 de rat (M. E. Ri~nrhi,
Gene, 104 (1991) 271-275) est introduit dans la souche d'E. coli BL21(DE3). La
1~ souche est par la suite cultivée à 37~C en milieu LB+~mr illin~? (25 mg/L). Une
préculture est obtenue à partir d'une colonie isolée. Elle permet d'ensemencer une
culture de 500 ml. Lorsque l'absorbanoe à 600nm de la culture atteint la valeur de 0,7,
la synthèse de HMG1 est induite par addition d'I~G à 0,5 mM ~mal. La souche
productrice de HMG1 est encore cultivée 2h30 en présence d'IPTG. Les oellules sont
ensuite récoltées par centrifugation (5000 x g, 20 minlltes), rincées par 200 ml d'eau
~ till~,e centrifugées de nouveau. Le culot de oellules est conservé à -80~C jusq'à
purification.
1.2: purification de la protéine HMG1 recombinante
La purification de la protéine HMG1 peut être effectuée par chrom~tographie à partir
2~; d'une culture de la souche de E. coli décrite dans l'exemple 1.1, par exemple en
utili~nt le protocole suivant:
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Sauf in~ t1r~n col.h~ hl~ de la pl1rifir~ti~n décrite ci-dessous est effectuée
à 4~C. Les cellules ol~ es à partir de 500 ml de culture sont ~-S~ p~ t1es dans
15tml de tampon 50 mM Tris/HCl pH 7,7 cont~n~nt 500 ~ EDTA, 5 rnM DTT,
200t~M Pefabloc SC [4(2-~min-çthyl)-b~n7~n~-1fonyl fl-~ le lly-ll~hlori-le]~ et5 10 ~o (poids/volume) glycérol. Après cassage des cellules par soni~t~c-n durant
15tmin, les débris u~ ires sont séparés par centrifugation (50 000 x g; 1 h)
L'ex~ait ~c~11l11~ire est ensuite clk.. ~ hié à travers tme coknn~ de ~'~eph~ x G-
25 (Pharmacia) e~ 1ilihrée et éluée avec du tampon A [20 mM Hepes pH 7,9 co.,~
400 mM chlorure de ~li~ , 200 mM EDTA, 1 mM DTI', 200 ~lM Pefabloc SC,
0,2 ~o Nonidet P40, et 10 ~ glycérol]. La fraction contf~n~nt les protéines est récoltée
et chromatographiée à travers une c~ nne de gel DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia)
équilibrée dans le tampon A. La fraction protéique non retenue sur cette colonne est
m~l~n~ pro~e~iv~ ent avec du sulfate d~mm~ni11m solide jusqu'à une
c-)n-~.ontration finale de 2,8 M. Après 2 h, cette s~ ion est centrifugée (30 000 x g;
15 15 min). Le surn~nt est dh J.na~ographié à 20~C à travers une colonne Phényl-Superose HR 5/5 (Pharmacia) équilibrée dan~ du tampon 20 mM Hepes pH 7,9
c-nten~nt 200 mM EDTA, 500 ~I DTr, et 2,8 M sulfate ~l';..-~.l-.~ni~ Les protéines
sont éluées de la colonne avec un gradient linéaire décroissant de sulfate d';~
(2,8 M à 0 M) dans le même tampon. Les fractions contenant la protéine HMGl sont20 regroupées et dialysées extensivement contre du tampon 50 mM Tris/HCI pH 7,7
c~nt~n~nt 1 mM EDTA et 500 ,uM DTT. Cet e~h~ntillon est ensuite injecté sur une
colonne MonoQ HR 5/5 (Ph~ ci~) qui est ensuite éluée avec un gradient linéaire de
O à 0,5 M de chlorure de sodium dans du tampon 50 mM Tris/HCI pH 7,7-500 ,uM
DTT. La protéine HMG1, qui forme un pic d'abso~ballce symétrique à 280 nm, est
25 collectée dans ce tampon. La protéine HMGl est ensuite reprise dans du tamponlOmM Mes pH6,2-140 mM NaCl-500,uM DTT après c-~nc~ntration par centrifugation
dans Centrikon 10. La protéine HMG1 est stockée à -80~C jusqu'à llfili~tinn. Cette
pl~pa-a~ion présente une seule bande protéique migrant à un poids molé~-l~ire
appare~lL de 31 000 lorsqu'elle est analysée par électrophorèse en c- n~itionC
30 dén~ les (SDS) et révélation au Coomassie. Le r~ntl~m~nt global de la purification
est de 850 ~g de protéine HMG1 pure pour 500 ml de culture de départ.
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EXEMPLE 2: TRANSFERT D'ACIDE NUCLEIQUE IN VITRO DANS DES
CELLULES DE MAMMIlFERE
Cet exemple montre cc-.. rn~ une protéine, de type HMG1, se liant à l'ADN et étant
ée dans le noyau de manière active, peut être utilisée pour shmt~l~r la
5 lla~re~lion d'ADN p1~ que.
La construction utilisée pour mettre en évidence l'activité des compositions de
rinvention est le p~ ie comportant le gène codant pour la luciférase (Luc) décrit
préc~1el....~
Le protocole est établi pour des plaques de 24 puits (0 16mm) à recolter 2 jours après
transfection (c~ s à cr~flll~n~e). Tous les paramètres ~llv~ être m~ifi~c
~)lupO~ l;onnf~llf?mf~.nt.
Le jour J les oellules NIH 3T3 (ATCC: CRL1658), 3LL (Isakov N.et al., JNCI
71(1983) 139-145) H460 ~Maxwell et al., Oncogene 8 (1993), 3421-3429) sont
~.n~çm~nl~.ée.~ à 105 cellules par puits.
Le jour J+2 les cellules sont rincées avec du PBS (pour elimine.r les traces de serum) et
reprises dans 250 ml de RPMI (3LL et H460) ou DMEM (NIH3T3), supplémenté ou
non par 10 ~o Serum Fetal de Veau (SFV)
Composition mise en oeuvre pour la transfection:Par équivalent puits, dans un tube on
ajoute:
- H2O qsp 20 ml
- NaCl qsp 140 mM final
- 0,5 mg d'ADN pl~mi~ique
- 125 ng HMG1
puis on vortexe modérément et on incube à ~ a~ule ~mbi~ntl? 15 mimlt~ avant
25 d'ajouter 1,5 nmole de lipofectant DOGS. On vortexe à nouveau modérément et
incube à lel,-~la~,l,e ambiante 15 minllteS
Les cellules sont transfectées par ajout de 20 ml du mélange ADN/HMG1/lipofectant
au milieu de culture, inc~ s pendant 2 à 4 heures à 37~C. Ce milieu est ensuite
remplacé par du milieu complet.
CA 02231064 1998-03-24
WO 97/12051 PCTAFR96/01516
Le jour J+4 les oellules sont rinc~es à ~~ e ~mhisnte par 250 ml de PBS, lysées
dans 100 ml de tampon ad hoc (Reporter (Promega)+TCK et A~)Linill). 10 rnl de
lysat et 50 ml de su~ Ll~L (Promega) sont utilisés pour Ines.l-~ l'activité de la
l--cir~ ~y.,~
5 Les ré.s--h~ts p~senL~s en figures 1 et 2 sont la moyenne de quatre ~A~fiences,
répétées ;.~lp~n~l~ m~nt 2 fois. Pour ce faire on apprécie les Unitées r ...~ ..~ (UL~
obtPn1les par ~A~l~s~ion du gène Luc dans les cellules transfectées.
La figure 1 r~emhle les valeurs obtPn~ s pour les trois types c~ ires
préceA~.. ~.. I cités, en ~ sell~e de qu~lLi~e variable de protéine HMGl.
10 La figure 2 ~ hlP~ de ll,a~iè.~ synoptique les r~.;~s de stimulation de la
transfection obtenus par ajout de dirre ._llles qt~ de protéines HMGl.
L'~ n de l'Pffl~ i~ de ll~rt:~;Lion par la protéine HMG1 est variable selon
les types cellulaires.
On observe ainsi qu'elle est Ind~llale lorsque le rnilieu co..~ ..l la composition
15 nPcç~ à la transfection est supplPmPntP par 10~o SFV. Ceci est ~ e~ car la
présence de SFV représente les c~n~liti-)n~ rencontrées in vivo. D'autre part il est
notable que la présence de SF V ~limin11P l'Pffic~ite de transfection, particuliè~ el-~ en
l'~bsPnc~e de protéine HMGl. On peut penser que la présence de SFV dans le milieu de
culture ~ e la ~ LiL~ d'ADN susceptible d'être in~Prn~ e par les c~ IPS. Dans
20 ce cadre on peut conclure que HMG1 est particulièrement avantageuse pour la
transfection dans des c~n~iti~n~ OU la quantité d'ADN est li...;l~..le,
Le rapport HMGl/ADN (en masse) optimal pour la transfection est 0,25 à 0,5. De
telles conditions ne sont pas décrites comme étant capable de compa~er l'ADN
(Bottger M. et al., B.B.A. 950 (1988), 221-228); Stros M. et al., N.A.R. 22 (1994),
1044-1051). En effet le pl~mi~P n'est pas saturé par HMGl (~hl~taP-lt L.A. et al.,
Bio(~hPmi~ry 33 (1994), 12702-12707). L'effet de la protéine HMG1 est donc
expliqué par sa c~pacité à lier l'ADN et à être transportée vers le noyau de la cellule.
