Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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UTILISATION DE LA VITAMINE C OU ANALOGUES POUR STIMULER LA SYNTHESE DE
CELLULES DE LA PEAU
L'invention se rapporte à un procédé pour augmenter le taux de
s différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou
augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau en
appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace
d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
Elle a également trait à un procédé pour stimuler la synthèse de la vimentine
io cutanée en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité
efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues. Elle a en
outre trait à un procédé pour stimuler la synthèse de la kératine 10 cutanée
en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace
d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
is
La peau humaine est constituée de deux compartiments à savoir un
compartiment superficiel, l'épiderme, et un compartiment profond, le derme.
L'épiderme humain naturel est composé principalement de trois types de
2o cellules qui sont les kératinocytes, très majoritaires, les mélanocytes et
les
cellules de Langerhans. Chacun de ces types cellulaires contribue par ses
fonctions propres au rôle essentiel joué dans l'organisme par la peau,
notamment le rôle de protection de l'organisme des agressions extérieures
(climat, rayons ultraviolets, tabac, ...), appelé "fonction barrière". Un
mauvais
2s renouvellement de ces cellules et plus particulièrement des kératinocytes,
qui s'observe notamment avec l'âge, entraîne une mauvaise protection de la
peau, la peau présente alors un aspect sec et/ou terne.
Le derme fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son
3o élément nourricier. II est principalement constitué de fibroblastes et
d'une
matrice extracellulaire composée elle-méme principalement de collagène,
d'élastine et d'une substance, dite substance fondamentale, composants
synthétisés par le fibroblaste. On y trouve aussi des leucocytes, des
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mastocytes ou encore des macrophages tissulaires. II est également
traversée par des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses.
Les fibres de vimentine se trouvent de manière importante dans le derme,
s puisqu'elles correspondent au filament intermédiaire des fibroblastes. Ces
fibres de vimentine sont également présentes dans les mélanocytes et dans
les cellules de Langerhans de l'épiderme, elles peuvent être également
présentes dans les kératinocytes lorsque celles-ci sont dans un état
hyperproliférant.
io
Les kératines sont les filaments intermédiaires des cellules épithéliales,
telles que les kératinocytes dans la peau. Ainsi, il existe dans l'épiderme
quatre types de kératines, dont la kératine 10, appelée K10, spécifique de
l'état de différenciation des kératinocytes.
is
Avec l'âge, la qualité de la peau diminue, notamment on observe un
amincissement du derme. II est également admis que des facteurs
extrinsèques comme les rayons ultraviolets, le tabac ou certains traitements
(Glucocorticoïdes, vitamine D et dérivés par exemple) ont également un effet
2o négatif sur la peau.
On comprend alors l'importance du renouvellement cellulaire et de la qualité
de ce renouvellement, tant au niveau de l'épiderme qu'au niveau du derme,
pour ainsi lutter contre les agressions extrinsèques qui endommagent la
2s peau, notamment en diminuant sa fonction barrière, et contre les signes du
vieillissement cutané qu'il soit chronobiologique ou photo-induit.
Un des buts de la présente invention est donc d'augmenter le taux de
différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou
3o augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau pour
ainsi
lutter contre les agressions extrinsèques, qu'elles soient physiques ou
chimiques, qui endommagent la peau, notamment en diminuant sa fonction
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barrière, et contre le vieillissement cutané qu'il soit chronobiologique ou
photo-induit.
Or, la demanderesse a maintenant découvert que l'acide ascorbique
s appliqué topiquement sur la peau augmente le taux de différenciation etlou
de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmente le taux de
différenciation des kératinocytes de la peau en appliquant sur la peau une
composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au
moins un de ses analogues.
io
L'acide ascorbique (ou vitamine C) est connu pour stimuler la synthèse de
collagène, en empêchant, en tant que co-facteur, l'auto-inactivation des
enzymes lysine- ét proline- hydroxylases et en augmentant la synthèse des
ARNm de procollagènes. L'acide ascorbique (ou vitamine C) est également
is connu pour stimuler la synthèse de l'élastine de la peau. On peut citer à
cet
égard les brevets US 5801192, US 4983382 et EP 0717983. On peut
également citer un article intitulé "Pola to incorporate vitamin C in new
cosmetics line for skip care" du Japan Economic Journal du 5 juin 1984
(page 15). Ainsi, il a été décrit que l'acide ascorbique utilisé dans des
Zo compositions cosmétiques permet de traiter notamment les rides (Fragrance
Journal, Vol.B, N°6(45) (1980) pp38-43, "Cosmetic and vitamin -
action and
safety to dermatology").
L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide
2s ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la
préparation d'une composition destinée à étre appliquée sur la peau pour
augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes
de
la peau et/ou augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la
peau.
L'invention a pour troisième objet l'utilisation d'une quantité efficace
d'acide
ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la
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préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour
stimuler la synthèse de la vimentine cutanée.
L'invention a pour quatrième objet l'utilisation d'une quantité efficace
d'acide
s ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la
préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour
stimuler la synthèse de la kératine 10 cutanée.
L'invention a en outre pour objet un procédé pour augmenter le taux de
io différenciation etlou de prolifération des fibroblastes de la peau chez une
personne ayant un taux de différenciation et/ou de prolifération des
fibroblastes
anormalement bas, comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité
efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
is L'invention a encore pour objet un procédé pour augmenter le taux de
différenciation des kératinocytes de la peau chez une personne ayant un taux
de
différenciation des kératinocytes anormalement bas, comprenant l'application
topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses
analogues.
En effet, la demanderesse a découvert que l'acide ascorbique appliqué
topiquement sur la peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm de la
vimentine et ainsi d'augmenter le taux de synthèse de vimentine. Elle a
également découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la
2s peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm de la kératine 10 et ainsi
d'augmenter le taux de synthèse de la kératine 10.
Ces protéines, filaments intermédiaires de cellules de la peau, sont donc
représentatives de l'état proliférant et/ou différenciant des cellules de la
3o peau, plus particulièrement des cellules du derme et de l'épiderme. Plus
particulièrement, la vimentine, qui est le filament intermédiaire des
fibroblastes, est représentative de l'état proliférant et/ou différenciant des
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fibroblastes et la kératine 10 est représentative de l'état différenciant des
kératinocytes.
Ainsi, par application topique d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou
s de ses analogues, le renouvellement de cescellules de la peau est plus
rapide, l'aspect de la peau est amélioré, la peau est plus éclatante, moins
terne, plus ferme, plus tonique, plus élastique, les rides sont atténuées ou
leurs apparitions sont retardées, les signes cutanés du vieillissement sont
diminuées.
io
Avantageusement, le rapport de la synthèse des ARNm de la vimentine sur
celle de la kératine 10 due à l'application topique de l'acide ascorbique est
comparable à celui sans application topique de l'acide ascorbique. Ceci
indique que l'état de la peau, après application topique de l'acide
ascorbique,
is est maintenue dans un état normal (sans par exemple une hyper-
prolifération ou -différenciation d'un compartiment dermique ou épidermique
par rapport à l'autre).
Les analogues de l'acide ascorbique sont, plus particulièrement, ses sels,
2o tels que notamment l'ascorbate de sodium, l'ascorbylphosphate de
magnésium ou de sodium, ses esters, tels que notamment ses esters
acétique, propionique ou palmitique, ou ses sucres, tels que notamment
l'acide ascorbique glycosilé.
2s L'acide ascorbique est généralement sous forme L, car il est habituellement
extrait de produits naturels.
La quantité efficace d'acide ascorbique ou de ses analogues utilisable selon
l'invention est bien entendu celle qui est nécessaire pour obtenir les effets
3o attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de grandeur, cette
quantité
représente préférentiellement de 0,001 % à 20% du poids total de la
composition, préférentiellement de 0,1% à 15% du poids total de la
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composition et avantageusement de 3% à 10% du poids total de la
composition.
En outre, la composition de l'invention est utilisée pendant un temps
suffisant
s pour obtenir les effets attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de
grandeur, cette durée peut être au minimum de 15 jours, mais peut être
aussi de plus de 4 semaines, voire de plus de 8 semaines.
La composition de l'invention destinée à une application topique contient un
io milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau y
compris le cuir chevelu, les muqueuses etlou les yeux et peut constituer
notamment une composition cosmétique ou dermatologique.
Cette composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques
is normalement utilisées dans les domaines cosmétique et dermatologique, et
elle peut être notamment sous forme d'une solution aqueuse éventuellement
gélifiée, d'une dispersion du type lotion éventuellement biphasée, d'une
émulsion obtenue par dispersion d'une phase grasse dans une phase
aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou d'une émulsion triple (E/HlE ou
2o H/E/H) ou d'une dispersion vésiculaire de type ionique et/ou non ionique.
Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles.
La composition de l'invention peut constituer par exemple une lotion, un gel,
une crème ou un lait, et par exemple une lotion ou un lait de démaquillage
2s ou de nettoyage, un shampooing ou un gel douche.
L'exemple suivant illustre l'invention sans la limiter aucunement. Dans les
compositions les proportions indiquées sont des pourcentages en poids,
sauf mention contraire.
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Exemple
1. Méthode
On a appliqué sur le bas du cou de 10 femmes entre 55 et 60 ans pendant 3
s mois, une fois par jour, d'un côté une émulsion eau dans huile (Véhicule ou
Placébo) et d'un autre côté la même émulsion eau dans huile, mais
comprenant également 5 % de vitamine C (= Composition ou Actif).
Composition
lo Acide L-ascorbique 5,00
Hydroxyde de sodium 1,83
Acide citrique,1 H20 1,24
Disodium EDTA 0,05
Huile d'amandes d'abricot 3,00
is Huile de silicone 4
Cyclopentasiloxane et
dimethicone copolyol 20
Dimethicone et dimethiconol 3 %
Glycerin 23
2o Propylene glycol 4 %
Charges 7 %
Conservateurs 0,30
Eau
qsp 100,00
2s On procède ensuite à des biopsies de ces surfaces traitées.
2. Extraction et purification des ARN totaux.
Les biopsies sont broyées sous azote liquide dans un Mikrodismembrator S
30 (Braun). La poudre obtenue est récoltée dans la capsule de téflon par 2 ml
de solution de lyse (isothiocyanate de guanidine 5M, mercaptoéthanol, 0,1M,
laurylsucosyl de Na 0,017M, citrate Na 0,025M, pH7, antifoam 3 pl/ml). La
suspension est transférée dans un tube mis sous agitation à température
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ambiante durant 15 minutes. Le lysat est déposé à la surtace d'un coussin
de 1,4 ml de chlorure de Césium 5,7M, EDTA 0, 1M, pH 7 dans un tube de
polyallomer de 3,8 ml pour le rotor SW60 (Ultracentrifugeuse Beckman
L70M). Une ultracentrifugation à 35.000 RPM est réalisée durant 18 heures
s à 20°C. Le culot est rincé à féthanol absolu, centrifugé à 13.000
RPM, 4°C,
minutes et mis en solution dans 100 ~,I d'eau distillée.
3. Quantification de la concentration en ARN total et en ARNm spécifiques.
lo La quantité d'ARN récolté à partir des biopsies est estimée par la densité
optique de la solution à 260 nm puis mesurée en amplifiant par RT-PCR
TARN ribosomial 28S. La mesure des ARNm spécifiques est réalisée par
RT-PCR quantitative sur des aliquots de la même dilution d'ARN total,
conservées à -80°C jusqu'à leur utilisation.
Mesure de l'ARNm de la kératine 10 (K10) et de la vimentine
Les amorces oligonucléotidiques spécifiques des gènes étudiés
comportent 24 bases, ont un % de A - T proche de 50 % et sont choisies
2o sur deux exons différents afin d'éviter l'amplification d'éventuelles
traces
d'ADN présentes dans les échantillons. Les conditions optimales
d'amplification (température et nombre de cycles) ont été déterminées
pour chacun des gènes étudiés en tenant compte de leur niveau
d'expression dans la peau. La RT-PCR est réalisée à l'aide du kit Gene
Amp rTth de Perkin Elmer ou du kit Titam de Boehringer.
Chaque réaction de RT-PCR est réalisée en présence d'un nombre
connu de copies d'un ARN synthétique créé en laboratoire contenant les
séquences des amorces oligonucléotidiques spécifiques des ARNm
3o d'intérêt et dont le produit d'amplification a une taille moléculaire
permettant de le discriminer de fARNm endogène. Ce multistandard
permet de contrôler et de calculer le rendement de la transcription
réverse et de la réaction d'amplification.
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Les produits d'amplification sont analysés par électrophorèse en gel de
polyacrylamide suivie d'une coloration au CyberGreen. L'intensité des
signaux fluorescents est mesurée à l'aide d'un Fluoro S Multilmager.
s Les résultats sont corrigés pour te rendement de la RT-PCR et exprimés
en unités arbitraires par unité d'ARN 28 S ribosomial
4. Analyse statistique
lo L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du t-Test de Student
unilatéral sur
les rapports des valeurs Actif (Vitamine C)/Placebo (= A/P).
t(n-1)=(MA/P-1)Vn
M écarts - types
is
Pour un degré de liberté n-1 - 9, le rapport A/P est significativement
supérieur à 1 avec une probabilité supérieure à 95 % pour une valeur de t >
1,83 et une probabilité supérieure à 99 % pour une valeur de t > 2,82.
20 5. Résultats
Mesure de l'ARN total obtenu à partir des biopsies
La quantité totale d'ARN purifié à partir des biopsies est évaluée dans un
2s premier temps par mesure de la densité optique à 260 nm et leur qualité
estimée par la mesure du rapport des DO 260/290 nm.
Des quantités largement suffisantes d'ARN ont été obtenues à partir de
chacune des biopsies (entre 2,1 et 6,3 ~g) avec un degré de pureté (rapport
3o de D.O. 260/280) satisfaisant.
La concentration en ARN total est amenée par dilution à une valeur calculée
de 4 nanogrammes par ~I. Ce procédé permet de réaliser les réactions de
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transcription reverse et d'amplification sur des quantités similaires d'ARN
total pour tous les échantillons. La quantité d'ARN total présente dans la
solution diluée est déterminée de façon quantitative par mesure de l'ARN
ribosomial 28S, réalisée en triplicate.
s Cette même solution d'ARN sera utilisée pour toutes les mesures des ARNs
spécifiques dont les résultats sont exprimés par unité d'ARN 28S.
Mesure du taux à l'équilibre des ARNm de la vimentine et de la kératine 10
io Les résultats exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN 28S sont
détaillés dans les tableaux 1 et 2.
Tableau 1: ARNm de la vimentine
sujet Actif Placbo A/P
a 96,7 51,4 1,88
b 70,9 55,0 1,29
c 67,5 77,7 0,87
d 200,3 131,1 1,53
e 123,0 91,1 1,35
f 106,0 102,5 1,03
9 98,5 92,5 1,06
h 81,4 98,6 0,83
i 112,9 128,6 0,88
j 81,7 66,1 1,24
Moyenne 103,9 89,5 1,20*
Ecart-type 38,4 ~ 27,6 0,33
Is
Test de Student unilatéral : *t =2,02, P< 0,05
Sept sujets sur 10 présentent un taux à l'équilibre de l'ARNm de la vimentine
accru par l'acide ascorbique.
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Tableau 2 : ARNm de la kératine 10 (K10)
sujet Actif Placbo A/P
a 13,4 8,5 1,58
b 10,3 3,9 2,64
c 12,8 13,8 0,93
d 44,2 48,9 0,90
e 25,5 21,8 1,17
f 40,0 23,8 1,68
g 27,4 14,6 1,88
h 21,6 ~ 18,4 1,17
i 35,2 28,7 1,23
j 19,5 13,4 1,46
Moyenne 25,0 19,6 1,46**
Ecart-type 11,8 ~ 12,6 ~ 0,52
Test de Student unilatéral : **t = 2,95, p < 0,01
Huit sujets sur dix présentent un taux à l'équilibre de l'ARNm de la kératine
accru avec l'acide ascorbique.
lo Le rapport vimentine/kératine 10 est détaillé dans le tableau 3.
ls
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Tableau 3: Rapport vimentine / kératine 10 (VIM / KIO)
VIM / K10
sujet Actif Placbo
7,22 6,05
b 6,88 [14,10]
c 5,27 5,63
d 4,53 2,68
e 4, 82 4,18
f 2,65 4,31
g 3,59 6,34
h 3,77 5,36
i 3,21 4,48
j 4,19 4,93
Moyenne 4,61 ~ 4,88
s Ces résultats indiquent que les biopsies contiennent une proportion d'ARNm
de
la kératine 10 et de la vimentine, comparable du côté traité par l'acide
ascorbique
et le placebo. Les résultats indiquent également que les biopsies ont été
réalisées de manière uniforme chez les différents individus. L'échantillon b-
placebo est en dehors de la norme.
lo
Lorsque les mesures de la vimentine sont rapportées aux mesures équivalentes
faites pour l'ARNm procollagènes I ou III, la valeur moyenne de ces rapports
calculée sur la série des échantillons traités et des échantillons placebo est
très
proche indiquant une modulation coordonnée de l'expression des procollagènes
et
ls de la vimentine. En outre, si on considère que fa vimentine est
représentative du
compartiment dermique, puisqu'elle est le filament intermédiaire des
fibroblastes,
alors l'augmentation de l'expression des procollagènes I et III s'accompagne
d'un
accroissement parallèle de l'expression de la vimentine et suggère que l'acide
ascorbique induit soit un accroissement du nombre de cellules conjonctives du
2o derme soit l'activation de leur phénotype biosynthétique.
