Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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PRÉPARATION POUR COMPOSÉS SENSIBLES A L'OXYDATION
ET SON PROCÉDÉ DE FABRICATION
10 . La présente invention concerne un procédé pour éviter l'oxydation d'un
composé sensible à l'oxygène dans une préparation médicamenteuse et/ou
cosmétique. Elle concerne également une préparation obtenue conformément
au susdit procédé ainsi qu'un procédé de fabrication. Elle s'applique
notamment, mais non exclusivement, à des composés dérivés du 2,6-di-tert-
bntylphénol.
De nombreux composés réagissent avec l'oxygène. Lors de cette oxydation,
ces composés peuvent perdre les propriétés pour lesqùels ils sont utilisés.
C'est le cas des 2,6-di-tert-butylphénols qui ont été initialement utilisés
pour
leur propriété antioxydante dans les produits pétroliers puis comme additifs
alimentaires en raison de leur activité sur les graisses animales (J.C. Dacre,
Biochem J., 1961, vol. 78, n 4, pp 758-766).
. Par ailleurs, il est connu que les composés 2,6-di-tert-butylphénols
notamment
le 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluène aussi dénommé 2,6-di-tert-butyl-4-
méthylphénol ou BHT ( butylated hydroxytoluene ) ou encore ses dérivés
tels que l'acide 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzoïque (BG4), le 3,5-di-tert-
butyl-4-hydroxybenzoate d'octaoxyéthylèneglycol (AVF1) présentent des
propriétés antivirales à l'encontre des virus à enveloppes lipidiques (W.
Snipes
et al., Science, 1975, vol. 188, n 4183 ; R. Vachy et al., American Academy of
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Dermatology, 53rd Annual Meeting, New Orleans, 4-9 février 1995 ; R.
Vachy et al., Congress of The Society for Investigative Dermatology,
Washington, 23-27 avril 1997). Ces propriétés ont conduit à leur utilisation
pour l'obtention de médicaments destinés au traitement des maladies liées à
une infection d'un individu par des virus, notamment les virus de l'herpès
(FR 2 507 891, EP 0 804 408, WO 91 13626, WO 92 08450).
Cependant, il a été montré qu'en s'oxydant ces composés perdent leurs
propriétés antivirales.
Des solutions ont alors été proposées pour éviter le contact entre les
composés
sensibles à l'oxygène et des composés oxydants ou libérant de l'oxygène ou
encore simplement l'oxygène de l'air, par exemple, en les incorporant dans
une huile pour constituer une pommade, l'huile jouant un rôle d'isolant.
De surcroît, il a été envisagé un conditionnement dans des capsules de
gélatine
monodose afin de conserver la pommade à l'abri de l'air et des UV jusqu'à
son utilisation.
Cependant, il n'en demeure pas moins que cette présentation galénique n'est
pas la plus adéquate quant à son utilisation. En effet, une pommade est mal
absorbée et laisse la peau grasse.
La réalisation d'une micro-émulsion a abouti à une substance quasiment
liquide sans structure suffisante pour l'utilisation prévue.
Un procédé utilisant des phases multiples s'avère beaucoup plus compliqué
tant au niveau du mode opératoire que des appareils requis et avec un résultat
qui n'est pas toujours celui escompté et un coût relativement élevé.
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Enfin, l'usage de nanoparticules de manière à encapsuler le BHT n'est pas
satisfaisant car il s'agit d'un procédé complexe, coûteux et qui, dans le cas
présent,
ne permet pas d'encapsuler des produits actifs avec une concentration
suffisante.
L'invention concerne la suppression de ces inconvénients en proposant une
technique
souple, rapide et sans risque d'oxydation pour,le composé actif.
A cet effet, elle propose un procédé consistant à inclure dans une préparation
médicamenteuse et/ou cosmétique au moins un antioxydant plus réactif que le
composé actif afin que l'oxygène soit consommé avant de pouvoir réagir avec ce
dernier ainsi qu'au moins un antioxydant plus faible qui, une fois oxydé avec
l'oxygène résiduel, acquiert un fort pouvoir couvrant et va s'agréger par
micronisation autour du composé actif pour former un emplâtre protecteur.
Avantageusement, la micronisation pourra permettre l'obtention de particules
pour la
préparation dont la taille sera comprise entre 0,1 et 2 microns et de
préférence
inférieure à 0,2 micron.
Le composé actif pourra être un dérivé du 2,6-di-tert-butylphénol. Il pourra
être
présent en une quantité allant de 1 à 10 % de préférence .5 % en poids du
poids total
de la préparation.
Cette préparation pourra être biphasique. Dans ce cas, la phase huileuse
pourra
comporter le composé actif et l'antioxydant faible tandis que l'antioxydant
fort sera
soluble dans la phase aqueuse.
Cette combinaison est intéressante dans la mesure où la phase aqueuse contient
toujours un certain pourcentage d'oxygène. L'antioxydant fort va d'abord
réagir et
par conséquent, c'est une quantité résiduelle d'oxygène qui va traverser la
phase
huileuse et rencontrer les antioxydants faibles. Ces derniers vont, au fur et
à mesure
qu'ils fixent l'oxygène, s'agréger notamment autour des composés actifs en
formant
une pellicule protectrice. Ce processus permet alors de conserver le composé
actif sur
une longue période sans autre altération que celle, minime, qui a pu avoir
lieu avant
l'agrégation.
L'antioxydant fort pourra être le disulfite de sodium. Il pourra être présent
en une
quantité allant de 0,05 % à 0,1 % de préférence de 0, 05 % en poids du poids
total de
la préparation.
Les antioxydants faibles pourront être des oxydes métalliques tels que des
oxydes de
zinc, de titane, d'aluminium...
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La préparation pourra comprendre deux antioxydants faibles, par exemple
l'oxyde de zinc et
le dioxyde de titane.
L'oxyde de zinc pourra être présent en une quantité allant de 0,1 % à 2 % de
préférence de
0,5 % en poids du poids total de la préparation.
Le dioxyde de titane pourra être présent en une quantité allant de 5 % à 10 %
de préférence
de 5 % en poids du poids total de la préparation.
Plus généralement, la quantité globale d'antioxydant faible pourra être
comprise entre 5,1 et
12 %, de préférence 5,5 % en poids du poids total de la préparation.
Il est à noter que les oxydes de zinc et de titane présentent l'avantage de
posséder des
propriétés de filtre anti-UV. Ces propriétés peuvent être mises à profit non
seulement pour
protéger des brûlures solaires mais aussi notamment pour la prévention des
accès herpétiques
chez des sujets prédisposés, étant entendu que l'exposition au soleil est
reconnue comme un
des facteurs déclenchants de l'herpès.
La préparation pourra comprendre d'autres composés possédant des propriétés
thérapeutiques
tels que de la propolis, des extraits de tepescohuite ou encore des excipients
tels que des
antiseptiques.
L'invention propose, selon un aspect, une préparation médicamenteuse et/ou
cosmétique
contenant : un composé actif sensible à l'oxydation, le composé actif étant le
2,6-di-tert-
butylphénol, le 2,6-di-tert-butyl-4-méthylphénol, l'acide 3,5-di-tert-butyl-4-
hydroxybenzoïque, ou le 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzoate
d'octaéthylèneglycol ; un ou
plusieurs dérivés d'acides gras ; un antioxydant faible ; un ou plusieurs
conservateurs ; et un
antioxydant fort, caractérisée en ce qu'elle est telle qu'obtenue par :
- formation d'une émulsion de type eau dans l'huile (E/H), obtenue en
introduisant, sous
agitation à l'aide d'une turbine dans des conditions conduisant à la
micronisation des
particules de la phase lipidique, une phase aqueuse B, chauffée à une
température de 70-
75 C, à un mélange lipidique A+A', ce mélange lipidique étant obtenu en
ajoutant à une
phase A renfermant le ou les dérivés d'acides gras, chauffée à 70-75 C, le
composé actif,
puis l'antioxydant faible contenant un ou plusieurs oxydes métalliques, ledit
composé actif et
le ou les oxydes métalliques correspondant à une phase A' et étant solubilisés
dans la phase
lipidique, le ou les dérivés d'acide gras étant le stéarate de glycérole,
l'alcool cétéarylique, le
palmitate de cétyle, le cocoglycéride, le stéarate de polyéthylène glycol-6,
le stéarate de
polyéthylène glycol-32, un triglycéride caprylique, ou un triglycéride
caprique ;
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4a
inversion de phase par refroidissement à 60-65 C en maintenant une agitation
lente,
conduisant à une émulsion de type huile dans l'eau (H/E) par refroidissement ;
- addition d'une phase C comprenant le ou les conservateurs, le mélange étant
amené à
une température de 40-45 C, le ou les conservateurs étant le phénoxyéthanol,
le
méthylparahydroxybenzoate, l'éthylparahydroxybenzoate, le
proplyparahydroxybenzoate,
le butylparahydroxybenzoate, ou l'iso-butyl parahydrobenzoate ; et
- addition d'une phase aqueuse D contenant l'antioxydant fort.
Selon un autre aspect, l'invention propose un procédé d'obtention d'une
préparation
médicamenteuse et/ou cosmétique contenant un composé actif sensible à
l'oxydation, le
composé actif étant le 2,6-di-tert-butylphénol, le 2,6-di-tert-butyl-4-
méthylphénol, l'acide
3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzoïque, ou le 3,5-di-tert-butyl-4-
hydroxybenzoate
d'octaéthylèneglycol ; un ou plusieurs dérivés d'acides gras ; un antioxydant
faible ; un ou
plusieurs conservateurs ; et un antioxydant fort, caractérisé en ce qu'il
comprend :
la formation d'une émulsion de type E/H, en introduisant, sous agitation à
l'aide d'une
turbine pour obtenir la micronisation des particules, une phase aqueuse B,
chauffée à une
température de 70-75 C, à un mélange lipidique A+A', ce mélange lipidique
étant obtenu
en ajoutant à la phase A renfermant le ou les dérivés d'acides gras, chauffée
à 70-75 C, le
composé actif, puis l'antioxydant faible contenant un ou plusieurs oxydes
métalliques,
ledit composé actif et le ou les oxydes métalliques correspondant à la phase
A' et étant
solubilisés dans la phase lipidique, le ou les dérivé d'acide gras étant le
stéarate de
glycérole, l'alcool cétéarylique, le palmitate de cétyle, le cocoglycéride, le
stéarate de
polyéthylène glycol-6, le stéarate de polyéthylène glycol-32, un triglycéride
caprylique, ou
un triglycéride caprique ;
une inversion de phase par refroidissement à 60-65 C en maintenant une
agitation
lente, conduisant à une émulsion de type H/E par refroidissement ;
- l'addition d'une phase C comprenant le ou les conservateurs, le mélange
étant amené à
une température de 40-45 C, le conservateur étant le phénoxyéthanol, le
méthylparahydroxybenzoate, l'éthylparahydroxybenzoate, le
proplyparahydroxybenzoate,
le butylparahydroxybenzoate, ou l'iso-butyl parahydrobenzoate ; et
- l'addition d'une phase aqueuse D contenant l'antioxydant fort.
Des exemples de formulation de composition seront décrits ci-après, à titre
d'exemples non
limitatifs.
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Exemple 1 : La composition est la suivante
Dénomination usuelle Fournisseur Mélange A
Stéarate de glycéryle, alcool
Cutina CBSMc Prod'Hyg cétéarylique, palmitate de 4
cétyle et cocoglycéride
Tefose 1500Mc Gattefossé stéarate PEG-6*, stéarate 8 %
PEG-32
Superpolystate stéarate PEG-6 2%
Stéarate d'isocétyle 10 %
Triglycérides C8-C10 Triglycérides 6%
capryliques/capriques
Lécithine de soja o
Mactan SP65 MC Laserson 0,1 /o
Dénomination usuelle Fournisseur Mélange A' %
BHT 5 %
Oxyde de zinc
Gattefossé 0,5 %
Z cote HP 1
Dioxyde de titane
Degussa 5 %
T 805
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Dénomination usuelle Fournisseur Mélange B
Eau déminéralisée QSP**
Glycérol 2
Dénomination usuelle Fournisseur Mélange C
Phénoxyéthanol,
méthylparaben,
PhenonipMc SIPCA éthylparaben, 0,3-
(antiseptique) propylparaben, 0,5 %
butylparaben,
isobu l arabes***
Dénomination usuelle Fournisseur Mélange D %
Eau déminéralisée 3 %
Disulfite de sodium 0,05
* PEG : polyéthylène glycol
** Quantité suffisante pour 100 g
* * * paraben : parahydroxybenzoate
Dans une cuve, le mélange A est chauffé à 70-75 C. Une fois la température
stabilisée, les éléments du mélange A' sont ajoutés au mâange A un à un, sous
une forte agitation (5-10 000 tr/mn) générée par une turbine de manière à
éviter les risques d'oxydation liés à la phase transitoire d'élévation de
température de composés tels que le BHT. De plus, c'est à ce moment que se
fait l'enrobage du BHT par les oxydes de zinc et de titane et il est important
que les particules huileuses soient les plus fines possibles.
Dans un fondoir, le mélange B est chauffé à 70-75 C puis il est incorporé en
une seule fois au mélange réactionnel (phase huileuse chaude) sous agitation
lente afin d'opérer l'étape clé qui est une inversion de phase.
La micronisation doit alors être excellente avec des particules ayant une
taille
comprise entre 0,1 et 2 microns, de préférence inférieure à 0,2 micron.
.L'ensemble est alors refroidi à 60-65 C en maintenant une agitation lente
puis
le mélange. C est additionné.
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Le mélange est ensuite amené à une température de 40-45 C le plus
rapidement possible par un système de serpentin dans lequel circule de l'eau
et
placé autour de la cuve, et le mélange D est ajouté puis l'agitation se
poursuit
jusqu'à une température de 25-30 C pour obtenir l'émulsion souhaitée, c'est-à-
dire très fine et d'aspect brillant.
L'inversion de phase combinée à la vitesse de rotation de la turbine puis à
une
baisse rapide de la température permettent d'obtenir un enrobage du BHT par
les oxydes de zinc et de titane, résultat qui se rapproche de la micro-
encapsulation obtenue avec une émulsion multiple mais ici, au lieu de
nécessiter un mode opératoire complexe, une seule étape suffit.
On notera que l'incorporation de composés autres que ceux mentionnés ci-
dessus, par exemple des composés possédant des propriétés thérapeutiques
complémentaires, pourra entraîner une variation des pourcentages du mélange
A dans des proportions faibles mais suffisantes pour conserver la balance
hydrophilie/lipophilie choisie pour l'émulsion.
Exemple 2
Cet exemple permet d'obtenir une crème, dont les propriétés thérapeutiques ont
été présentées dans le brevet US 6 153 226: il a été montré que le BHT en
association avec de la propolis voit son activité antivirale potentialisée.
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La composition est la suivante :
Dénomination Fournisseur Mélange A %
usuelle
Stéarate de glycéryle,
Cutina CBS Mc Prod'Hyg alcool cétéarylique, 4
palmitate de cétyle et
coco 1 céride
Tefose 1500MC Gattefossé stéarate PEG-6*, 811/0
stéarate PEG-32
Sue o1 state stéarate PEG-6 2%
Stéarate d'isocé le 10 %
Triglycérides C8- Triglycérides 611/0
Cl0 ça liues/ca rz ues
Lécithine de soja a
Mactan SP65MC Laserson 0,1 /o
Dénomination Fournisseur mélange Å' %
usuelle
BHT 5%
Oxyde de zinc Gattefosse 0,5 0/0
Z cote HP I
Dioxyde de titane Degussa 5%
T 805
Dénomination Fournisseur Mélange B 0/0
usuelle
Eau déminéralisée Q SP**
Gl cétol 2 %
Dénomination Fournisseur Mélange C 0/0
usuelle
Phénoxyéthanol,
méthylparaben,
Phenonip Mc éthylparaben, 0,3-
(antiseptique) SIPCA . propylparaben, 0,5910
butylparaben,
isobu 1 araben
Dénomination Fournisseur Mélange D %
usuelle
Eau déminéralisée 3
Disuiûte de sodïmn 0,05 %-
Aspartam 0,1 %
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Dénomination Fournisseur Mélange E
usuelle
Aqua et propolis wax,
phénoxyéthanol,
Propolis liquide Gattefossé méthylparaben, 0,0 50
ethylparaben, /0
propylparaben,
bu l araben * * *
Extrait de
tepescohuite Laboratoire Mu Mimosa Tenuiflora 1,0 %
glycolique
Fragrance
Arôme fruit de la Agipal passionflower 0,2%
passion (Passiflora carnata) fruits
* PEG : polyéthylène glycol
* * Quantité suffisante pour 100 g.
*** paraben : parahydroxybenzoate
De même que dans l'Exemple 1, le mélange A est chauffé à 70-75 C, dans une
cuve. Une fois la température stabilisée, les éléments du mélange A' sont
ajoutés au mélange A un à un sous une forte agitation (5-10 000 tr/mn)
générée par une turbine de manière à éviter les risques d' oxydation liés à la
phase transitoire d'élévation de température de composés tels que le BHT.
Dans un fondoir, le mélange B est chauffé à 70-75 C puis il est incorporé en.
une seule fois sous agitation lente au mélange réactionnel (phase huileuse
chaude) afin d'opérer l'inversion de phase.
L'ensemble est alors refroidi à 60-65 C en maintenant une agitation lente puis
le mélange C est additionné.
Le mélange est ensuite amené à une température de 40-45 C le plus
rapidement possible par un système de serpentin dans lequel circule de l'eau
et
placé autour de la cuve et le mélange D est ajouté.
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Le refroidissement du mélange se poursuit et, à 35 C, les composants du
mélange E sont incorporés puis l'agitation se poursuit jusqu'à une température
de 25-30 C pour obtenir l'émulsion souhaitée, c'est-à-dire très fine et
d'aspect
brillant.
Des études de tolérance cutanée et oculaire aiguë ont été effectuées sur la
crème ainsi obtenue.
La première étude de tolérance cutanée aiguë a été menée sur un groupe de dix
volontaires adultes après application unique sur la peau de la face antérieure
d'un bras, sous pansement occlusif maintenu pendant quarante huit heures. Cet
essai a été réalisé selon la méthodologie des tests épicutanés sous occlusion.
Le groupe comportait sept sujets de sexe féminin et trois sujets de sexe
masculin âgés de 19 à 36 ans ne présentant aucun antécédent d'intolérance ou
d'allergie à un produit cosmétique, de pathologie cutanée et ne prenant pas de
traitement interférant avec le métabolisme cutané.
Le produit a été appliqué pur, une seule fois, sur une surface de 50 mm2 de
peau de la face antérieure d'un bras de chaque volontaire, à la dose d'environ
0,02 ml imprégnant une rondelle de papier filtre ' déposé dans la cupule du
pansement occlusif.
Le produit a été maintenu en contact avec la peau pendant quarante huit heures
consécutives.
Cette application a été effectuée parallèlement et dans les mêmes conditions
avec un pansement occlusif-test seul (sans produit) en tant que témoin négatif
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Les examens macroscopiques cutanés ont été réalisés immédiatement, trente
minutes après enlèvement des pansements occlusifs.
L'évaluation des réactions cutanées (érythème, oedème...) a été effectuée
5 selon la nomenclature proposée par l'International Contact Dermatitis
Research Group (I.C.D.R.G.) :
- NT : Non testé,
- ?+: Réaction douteuse : léger érythème seulement,
+ : Réaction positive faible (non vésiculeuse) : érythème,
10 infiltration, parfois quelques papules,
++ : Forte réaction positive : présence d'érythème, de papules, de
vésicules,
+++ : Réaction positive violente, avec présence de bulles,
- : Réaction négative,
- IR : Réaction d'irritation
^ E 0,5 : érythème très léger
^ El : érythème léger
^ E2 : érythème net
^ E3 : érythème important
En l'absence de toute réaction cutanée locale à la lecture trente minutes
après
enlèvement du pansement, l'essai est arrêté. Cependant, il est demandé à
chaque volontaire de vérifier le lendemain l'absence de réaction. Dans le cas
d'une réaction visible, le sujet doit revenir au centre.
Dans le cas de réactions nettes ou douteuses, une lecture est effectuée
quarante
huit heures et si nécessaire soixante douze heures après le traitement du
pansement.
L'interprétation des résultats s'est faite comme suit ( Les essais cliniques
en
dermatologie , Thérapie, 1991, Tome 46, pages 183-197):
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L'indice d'irritation moyen à chaque temps de lecture est calculé selon le
rapport :
I.I.M = E des cotations érythémateuses / nombre de sujets
Le barème d'interprétation de l'irritation cutanée est le suivant :
- si I.I.M < 0,20: non irritant,
- si 0>20:< I.I.M < 0,50: légèrement irritant,
- si 0,50 < I.I.M < 1 : moyennement irritant,
- si I.I.M > 1 : irritant.
Les résultats sont regroupés dans le tableau I ci-dessous
Tableau I :
SUJETS Produit à l'essai Témoin négatif
Age et Lecture Lecture 24 h Lecture 30 min Lecture 24 h
Identification sexe 30 min après après après après
(1) enlèvement enlèvement enlèvement du enlèvement
du patch du patch patch du patch
MA.LA 19F - - - -
NE. SA 25F - - - -
DE.JE 22 M - - - -
PO.JO 20 M - - -
PE.GU 24F * 0,5 - - -
DO.FA 33F - - -
BA.RA 19F
- - - -
AT.PH 30M
- - - -
SU.VE 36M
- - - -
LA.DE 20 F - - -
LI.M moyen 0,05 0 0 0
Résultats Non irritant Non irritant Non irritant Non irritant
* Volontaire 5 : Dessèchement cutané accompagné d'une légère desquamation
(1) : M = masculin
F = féminin
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Dans les conditions expérimentales retenues, un volontaire a présenté, au
niveau du site d'application du produit, trente minutes après l'enlèvement du
pansement occlusif, un dessèchement de la peau accompagné d'une légère
desquamation et d'un très léger érythème.
Après vingt quatre heures et quarante huit heures suivant l'enlèvement du
pansement occlusif, la peau de ce volontaire était normale et aucun effet
secondaire n'a été observé.
En conclusion, le produit appliqué pur et localement sous pansement occlusif
pendant quarante huit heures, sur la peau de dix volontaires adultes, s'est
révélé non irritant.
La tolérance oculaire aiguë a également été évaluée sur cornée reconstituée
modèle SKINETHIC et sur un oeil de lapin.
En premier lieu, le produit a été évalué quant à sa capacité à induire des
effets
cytopathiques sur des cornées reconstituées par culture cellulaire in vitro de
kératinocytes transformés.
La culture cellulaire est généralement reconnue dans la littérature
scientifique
comme une méthode très sensible et fiable pour étudier le potentiel
cytotoxique de produits pharmaceutiques, cosmétiques ou médicaux.
Lorsqu'ils sont cultivés à l'interface air-liquide en milieu défini, les
kératinocytes humains transformés de la lignée TR146 forment un tissu
épithélial sans couche cornée ressemblant à la cornée de l'oeil humain.
Un échantillon du produit à étudier (30 l) est déposé sur chacune de six
cultures de cornée reconstituée équivalentes et étalé à l'aide d'un pinceau
fin.
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Deux cultures sont alors incubées à 37 C, 5% C02 pendant dix minutes, une
heure, trois heures et vingt quatre heures.
Des substances contrôles négatif (solution A saline phosphatée tamponnée) et
positif (0,4 % de SDS pour sodium dodecyl sulfate dans la solution A) sont
préparées stérilement et déposées parallèlement sur deux autres cultures et
ces
cultures sont incubées pendant une et vingt quatre heures.
Une culture constituant un contrôle négatif n'ayant reçu aucun traitement est
incubée en parallèle.
La viabilité ou la nécrose des kératinocytes de la couche basale des cultures
est détectée par un test de viabilité cellulaire MTT.
La viabilité cellulaire est mesurée qualitativement après marquage par un
colorant vital.
Le système MTT mesure l'activité déshydrogénase mitochondriale des
cellules vivantes. La composante clef est le bromure de 3-[4,5-
diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényl tétrazolium (MTT).
Les solutions salines tamponnées de MTT, en l'absence de rouge de phénol,
sont de couleur jaune. Les déshydrogénases mitochondriales des cellules
vivantes coupent le cycle tétrazolium, induisant ainsi la formation de
cristaux
pourpres MTT formazan, insolubles dans les solutions aqueuses.
Les cristaux formés par les cellules viables sont piégés dans des filtres
polycarbonates servant de support aux cultures épithéliales.
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Les cultures deviennent uniformément de couleur bleu/pourpre intense
lorsqu'elles sont viables, mais restent de couleur blanche/j aune s'il y a
nécrose
cellulaire.
Les résultats sont comparés aux substances contrôles négatif et positif
Pratiquement, 0,15 ml de milieu de culture contenant 10 % vol/vol de solution
MTT sont ajoutés sous chacun des filtres/support de culture.
Après une incubation de trente minutes à température ambiante, la couleur des
différentes cultures est observée et notée :
- les cultures* contrôle négatif doivent être de couleur bleue/pourpre
intense, preuve de la viabilité des cellules de la couche basale après
vingt quatre heures de contact,
- les cultures contrôle positif doivent être de couleur blanche, preuve de
la nécrose cellulaire dès la première heure de contact.
L'interprétation des résultats se fait comme suit :
- non irritant (NI) : bleu à dix minutes, une heure, trois heures et vingt
quatre heures,
- très légèrement irritant (TLI) : bleu à dix minutes, une heure, trois
heures et blanc à vingt quatre heures,
- légèrement irritant (LI) : bleu à dix minutes, bleu/blanc à une heure et
trois heures et blanc à vingt quatre heures,
- irritant (I) : vingt quatre heures,
- très irritant (TI) : blanc à dix minutes, une heure, trois heures et vingt
quatre heures.
Les résultats sont regroupés dans le tableau II ci-dessous
CA 02475218 2010-03-31
Tableau II :
Couleur des deux cultures
Produit Toxicité
10 minutes 1 heure 3 heures 24 heures
Crème bleu bleu bleu blanc TLI
Contrôle
- Bleu NI
négatif
Contrôle
blanc - - TI
positif
La viabilité cellulaire des cellules constituant la cornée est apparue totale
après dix minutes,
une heure, trois heures de contact du produit étudié pur. Après vingt quatre
heures, il a été
5 noté une mortalité quasi-totale.
En conclusion, la crème étudiée, pure, est très légèrement irritante vis-à-vis
des cellules
constituant le modèle de cornée reconstituée in vitro.
10 Cette étude a été parachevée par un contrôle complémentaire faisant appel à
la méthode
décrite dans un arrêté du 9 juin 1992 publié dans le Journal Officiel de la
République
Française du 10 juillet 1992, sur lbeil de lapin (le Journal Officiel est
édité par l'État
français, Direction de l'information légale et administrative).
15 Un seul lapin a été utilisé.
Une heure après instillation du produit étudié pur aucune atteinte n'a été
observée : V il du
lapin était normal.
Compte tenu de ces résultats, le produit peut être retenu comme faiblement
irritant pour V il
du lapin.
Par conséquent, au vu de l'ensemble des résultats obtenus dans les différentes
conditions
expérimentales, la crème testée, mise en contact avec l'oril, ne présente pas
de risque
apparent vis-à-vis de l'oeil. Elle peut donc être retenue comme faiblement
irritante.
CA 02475218 2004-08-05
WO 03/066101 PCT/FR03/00386
16
Par ailleurs, les essais et études réalisés montrent que ce produit ne
contient
aucune matière première dont l'usage est prohibé, est conforme aux standards
en ce qui concerne en particulier les contaminants éventuels et est conforme
aux prescriptions de la Pharmacopée européenne en matière d'efficacité des
agents de conservation microbiens.
Les essais, réalisés en aiguë montrent que dans des conditions normales
d'utilisation, le produit ne doit pas induire de réaction d'intolérance
particulière.
Enfin, la stabilité du BHT dans une préparation selon l'invention a été testée
:
un tonneau contenant 40 Kg de préparation, fermé par un simple couvercle,
sans conditionnement particulier tel que l'introduction d'un gaz inerte comme
l'azote, a été stocké pendant trois ans.
L'analyse par chromatographie en phase liquide réalisée au terme de ces trois
années a permis de montrer que la concentration du BHT, compte tenu du
coefficient d'erreur de la technique utilisée, était restée la même.
Par conséquent, la stabilité du BHT dans une préparation selon l'invention est
excellente.
