Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
1
NOUVELLES SÉQUENCES PHOSPHORYLÉES DE LA PHOSPHATASE
CDC25B, ANTICORPS DIRIGÉS CONTRE CES SÉQUENCES AINSI QUE
LEUR ~TILISATION
La présente invention a pour objet de nouvelles séquences phosphorylées de la
phosphatase CDC25B ainsi que des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés
contre ces séquences. La présente invention a également pour objet
l'utilisation de ces
nouvelles séquences phosphorylées notamment pour la mise en oeuvre d'une
méthode
l0 de diagnostic ih vitro de cancers chez l'homme ou l'animal.
Les mécanismes qui contrôlent la division des cellules mettent en jeu de
nombreux acteurs dont les activités sont régulées par des réactions de
phosphorylation
et de déphosphor~lation, impliquant des kinases et des phosphatases. Des
dérégulations
de ces mécanismes ont été identifiées dans de nombreux cancers. Leur
identification et
leur caractérisation ouvrent aujourd'hui de nouvelles perspectives pour le
diagnostic et
le traitement de la maladie cancéreuse.
CDC25B est une phosphatase régulatrice du cycle cellulaire essentielle pour le
contrôle de l' entrée en mitose. Elle appartient à une famille qui compte
trois membres
codés par des gènes différents (CDC25A, B et C) chez les mammifères. La
protéine
2o CDC25B est exprimée et active en fm de phase G2 du cycle cellulaire (Baldin
et al.,
1997 ; Gabrielli et al., 1996). Sa localisation intracellulaire est régulée
par des
séquences NES et NLS (Davezac et al., 2000) et par son interaction avec les
protéines
14-3-3 (Mils et al., 2000 ; Forrest et al., 2001). Il a été suggéré que CDC25B
puisse agir
comme un "starter" des évènements mitotiques précoces (N'ilsson et al., 2000).
Elle
pourrait jouer un rôle dans (activation initiale d'une population de
CDC2/cycline B au
niveau du centrosome avant sa translocation nucléaire (Kumagai et al., 1992 ;
Hoffinann et al., 1993). CDC25B active les complexes CDK/cycline pour
permettre les
remaniements architecturaux et biochimiques qui sont nécessaires pour
permettre le
processus de division cellulaire. Son activité est régulée par les variations
de son
3o expression, par son association à des partenaires régulateurs et par des
évènements de
phosphorylation.
La protëine kinase Aurora A, également connue sous le nom de STKS, est
surexprimée dans de nombreuses tumeurs du sein. Cette expression est corrélée
avec un
haut grade tumoral (Bischoff et al., 1998 ; Zhou et al., 1998). Cette kinase
est codée par
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
2
le gène STK15 localisé que le locus 20q13, un amplicon présent dans de
nombreuses
tumeurs. Cette protéine est localisée au niveau du centrosome (Dutertre et
al., 2002)._ Sa
fonction semble importante pour la séparation des centrosomes (Giet et al.,
2000), leur
duplication (Zhou et al., 1998) et (assemblage d'un fuseau mitotique bipolaire
(Giet et
al., 2000). L'inhibition de sa fonction par la technologie de TARN
interférence conduit à
la formation de fuseaux monopolaires et sa surexpression est responsable d'une
amplification centrosomale et d'une polyploïdisation (Meraldi et al., 2002 ;
Bischoff et
al., 1998 ; Zhou et al., 1998).
A ce jour, l'identification des substrats de la kinase Aurora A est encore
très
1o parcellaire. La phosphatase CDC25B est le premier substrat identifié qui
est également
co-localisé au niveau des centrosomes et joue un rôle clair dans le contrôle
du cycle
cellulaire et de la prolifération.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs du
site de
phosphorylation i~ vitro de la phosphatase CDC25B par la kinase Aurora A, et
de
l'identification de la séquence phosphorylée du variant d'épissage CDC25B3 de
CDC25B sur le résidu sérine en position 353.
L'un des buts de la présente invention consiste à fournir de nouvelles
séquences
phosphorylées des différents variants de la phosphatase CDC25B.
Un autre but de l'invention consiste à fournir un nouvel anticorps dirigé
contre
2o une phosphatase CDC25B phosphorylée, ledit anticorps pouvant être utilisé
dans le
cadre d'un diagnostic médical, ou pour la préparation de cribles pour
l'identification de
molécules liant ladite séquence phosphorylée et susceptibles de représenter de
nouveaux
agents utilisables en pharmacologie anti-tumorale.
Un autre but de l'invention consiste à fournir un nouvel outil pour l'étude
des
mécanismes moléculaires qui conduisent à la polyploïdisation et â la
transformation
cellulaire, ainsi qu'un nouvel outil permettant la mise en évidence de
l'activité de la
kinase Aurora A sur un de ses substrats physiologiques, et par conséquent
l'identification d'éventuelles perturbations quantitatives, temporelles et
spatiales de
cette activité.
3o La présente invention concerne une séquence peptidique caractérisée en ce
qu'elle
comprend ou est constituée par un fragment d'au moins environ 10 acides aminés
issus
de la séquence SEQ ID NO : 1 suivante
TPVQNKRRRSpVTPPEEQQE SEQ ID NO : 1
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
3
dans laquelle le résidu sérine en position 10 est phosphorylé, notamment par
traitement in vitro de la séquence SEQ m NO : 1 par la kinase Aurora A,
ledit fragment susmentionné contenant ledit résidu sérine phosphorylé.
L'expression "résidu phosphorylé" désigne un acide aminé porteur d'un
groupement phosphate.
La présente invention concerne également une séquence peptidique telle que
définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par
la séquence
SEQ ID NO : 2 suivante
QNKRRRSpVTPPEEQ SEQ m NO : 2
1o dans laquelle le résidu sérine en position 7 est phosphorylé.
La séquence SEQ ID NO : 2 correspond à un fragment de la séquence
SEQ ID'NO : 1 susmentionnée. Plus exactement, elle correspond au fragment de
SEQ ID NO : 1 délimité de l'acide aminé en position 4 à l'acide aminé en
position 17.
La présente invention .concerne également une séquence peptidique telle que
définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par
l'une des
séquences suivantes
- la séquence SEQ ID NO : 3, représentant le variant d'épissage CDC25B1 de la
protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu sérine en
position
339 est phosphorylé,
- la séquence SEQ m NO : 4, représentant un variant d'épissage CDC25B2 de la
protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu sérine en
position
312 est phosphorylé,
- la séquence SEQ ID NO : 5, représentant un variant d'épissage CDC25B3 de la
protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont lé résidu sérine en
position
353 est phosphorylé,
- la séquence SEQ ID NO : 6, représentant un variant d'épissage CDC25B4 de la
protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu sérine en
position
374 est phosphorylé,
- la séquence SEQ ID NO : 7, représentant un variant d'épissage CDC25B5 de la
3o protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu sérine
en position
361 est phosphorylé.
La présente invention concerne également un anticorps polyclonal ou monoclonal
susceptible de reconnaître une séquence peptidique telle que définie
précédemment.
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
4
Un anticorps polyclonal avantageux de l'invention est caractérisé en ce qu'il
est
susceptible de reconnaître la séquence SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-
dessus.
Un tel anticorps dirigé contre l'épitope phosphorylé de séquence SEQ ff~ NO :
2
est généré en immunisant des lapins avec ledit épitope.
Plus précisément, ledit épitope est couplé de façon covalente avec une
protéine
porteuse telle que l'hémocyanine, le BSA ou l'ovalbumine. Les lapins sont
alors
immunisés pendant 3 mois (4 injections au total) et la saignée finale permet
la
récupération d'environ 50 ml de sérum. Le sérum est ensuite doublement purifié
par
affinité sur une colonne de peptide phosphorylé puis sur une colonne de
peptide non
1o phosphorylé.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un
anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, dirigé contre la séquence
peptidique
SEQ ID NO : 2 télle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend
les étapes
suivantes
- l'immunisation d'un animal par injection de la séquence peptidique
SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-dessus,
- la fusion entre des myélomes d'un animal et des splénocytes d'un animal afin
d'obtenir des hybridomes,
- la mise en culture des hybridomes ainsi obtenus,
- la récupération et purification par clonage d'un hybridome, choisi parmi
ceux
obtenus à l'étape précédente et sécrétant un anticorps dirigé contre la
séquence
peptidique SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-dessus.
L'animal utilisépour l'étape d'immunisation est notamment une souris.
Les myébmes utiliséspour la fusion proviennent notamment une souris.
Les splénocytes utilisés pour la fusion proviennent d'un animal de la méme
espèce que pelle dont provient les myélomes, à savoir notamment une souris.
On choisit les hybridomes qui sécrètent les anticorps contre la séquence
peptidique SEQ ID NO : 2 sur la base de la production d'anticorps capables de
reconnaître dans un test ELISA le peptide phosphorylé utilisé pour
l'immunisation mais
3o pas le peptide non phosphorylé.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique
caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active une séquence
peptidique
telle que définie précédemment, un anticorps tel que défini ci-dessus, ou un
anticorps
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
anti-idiotypique tel que défini ci-dessus, en association avec un vecteur
pharmaceutiquement acceptable.
Une composition pharmaceutique avantageuse selon l'invention est caractérisée
en ce qu'elle contient à türe de substance active la séquence peptidique
représentée par
5 1a séquence SEQ D7 NO : 2.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une séquence
peptidique
telle que définie ci-dessus, d'un anticorps tel- que défini ci-dessus, ou d'un
anticorps
anti-idiotypique tel que défini ci-dessus, pour la préparation de médicaments
destinés au
traitement de cancers, tels que les cancers du sein.
1o La présente invention concerne également l'utilisation d'un anticorps tel
que
défini ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro
de cancers
chez l'homme ou l'animal, notamment de cancers du sein.
Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne
l'utilisation d'un anticorps polyclonal tel que défini ci-dessus, dirigé
contre I'épitope
phosphorylé de séquence SEQ m NO : 2, pour la mise en oeuvre d'une méthode de
diagnostic in vitro de cancers chez l'homme ou l'animal, notamment de cancers
du sein
La présente invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro de
cancers, notamment de cancers du sein, chez l'homme ou l'animal, caractérisée
en ce
qu'elle comprend
- la mise en prësence d'un anticorps tel que défini ci~dessus, avec un
échantillon
biologique prélevé chez un individu, ledit anticorps étant le cas échéant fixé
sur un
support solide,
- la détection d'une séquence peptidique telle que définie ci-dessus,
susceptible
d'être présente dans l'échantillon biologique à l'aide de réactifs marqués,
notamment
d'anticorps marqués, reconnaissant soit l'anticorps lié à ladite séquence
peptidique, soit
la séquence peptidique liée audit anticorps dans les complexes formés lors de
l'étape
précédente entre l'anticorps et la séquence peptidique susceptible d'être
présente dans
l'échantillon biologique, et ce, le cas échéant, après rinçage approprié du
support solide.
La présente invention concerne également une méthode de pronostic in vitro de
3o cancers, notamment de cancers du sein, chez l'homme ou l'animal,
caractérisée en ce
qu' elle comprend
- la mise en prêsence d'un anticorps tel que défini ci~dessus, avec un
échantillon
tumoral prélevé chez un individu, ledit anticorps étant le cas échéant fixé
sur un support
solide,
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
6
- la détection d'une séquence peptidique telle que définie ci-dessus,
susceptible
d'être présente dans l'échantillon biologique à l'aide de réactifs marqués,
notamment
d'anticorps marqués, reconnaissant soit l'anticorps lié à ladite séquence
peptidique, soit
la séquence peptidique liée audit anticorps dans les complexes formés lors de
l'étape
précédente entre .l'anticorps et la séquence peptidique susceptible d'être
présente dans
l'échantillon biologique, et ce, le cas échéant, après rinçage approprié du
support solide.
La présente invention concerne également l'utilisation des anticorps
susmentionnés de l'invention dirigés contre une séquence phosphorylée de
CDC25B
dans le cadre de la mise en oeuvre d'un test de diagnostic visant à détecter
sur des
lo prélèvem,ents tumoraux la présence ou non de cette séquence phosphorylée,
ceci dans
un but diagnostique ou pronostique.
La présente invention concerne également un procédé de criblage d'une molécule
capable de se lier à une séquence peptidique telle que définie ci-dessus,
ladite molécule
étant susceptible d' être utilisée comme agent anti-tumoral ou agent anti-
prolifératif tant
sur les cellules en culture que chez un organisme vivant ou encore contre des
agents
infectieux (parasites, champignons pathogènes), caractérisé en ce qu'il
comprend
- la mise en présence de ladite molécule avec la séquence peptidique
susmentionnée, et
- la dëtection de la liaison de ladite molécule par l'utilisation de méthodes
de
2o compétition appropriées, notamment par .la compétition vis-à-vis de la
liaison d'un
anticorps tel que défini ci-dessus.
La liaison entre ladite molécule avec la séquence peptidique phosphorylée peut
être détectée selon le procédé suivant : la séquence phosphorylée (substrat
phosphorylé)
est liée à un support solide ; (incubation avec (anticorps susmentionné en
solution
permet ensuite sa fixation qui est révélée par (utilisation d'un anticorps
secondaire
porteur d'un chromophore ou par le marquage direct de (anticorps primaire
(anticorps
de l'invention dirigé contre la séquence phosphorylée). L'incubation
simultanée avec un
composé capable de lier ladite séqûence phosphorylée entraîne sa fixation et
le
masquage du site reconnu par l'anticorps. La visualisation de cette
interaction pourra
3o donc être réalisée et quantifiée pax la baisse de liaison de (anticorps.
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
7
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente un spectre de masse du peptide monophosphorylé, 353-
S~p~VTPPEEQQEAEEPK-367. L'axe des abscisses correspond au rapport m/z et l'axe
des ordonnées correspond au pourcentage d'abondance relative.
Les Figures 2A, 2B et 2C représentent les résultats d'analyses western blot
avec
l' anticorps monoclonal SE96 (Figure 2A), avec l' anticorps anti-aMBP (New
England
Biolabs)(Figure 2B) et avec l'anticorps anti-aAurora A (voir demande de brevet
1o français 02/07212)(Figure 2C). Dans ces Figures, la première colonne
correspond à la
protéine kinase Aurora A ; la seconde colonne à une protéine recombinante MBP-
CDC25B ; la troisième colonne correspond à la protéine kinase Aurora A et à la
protéine recombinante MBP-CDC25B et la quatrième colonne correspond à MBP
seule.
Les Figures 3a à 3h représentent des images d'immunofluorescence indirecte
réalisées sur des cellules HeLa avec l' anticorps SE96.
Dans les Figures 3a, 3c, 3e et 3g, les cellulés HeLa ont été fixées et
utilisées pour
effectuer une analyse par ixnmunofluorescence avec les anticorps SE96 et elles
ont
également été colorées avec du DAPI.
2o Dans les Figures 3b, 3d, 3f et 3h, les cellules HeLa ont été fixées et
utilisées pour
effectuer une analyse par immunofluorescence avec les anticorps SE96.
Les cellules HeLa des Figures 3c et 3d ont été mises en compétition avec le
peptide phosphorylé ayant servi à (immunisation (SEQ m NO : 2) ; les cellules
HeLa
des Figures 3e et 3f ont été mises en compétition avec le 'peptide non
phosphorylé
z5 (QNKRRRSVTPPEEQ) ; et les cellules HeLa des Figures 3g et 3h ont été mises
en
compétition avec un peptide phosphorylé sans rapport avec la serine 353
(MEVEELS~,}PLALGR).
Ces Figures démontrent que le marquage observé avec l'anticorps SE96 est bien
éliminé par le peptide immunogène sous sa forme phosphorylée, mais pas par le
même
3o peptide non phosphorylé. Par ailleurs, un peptide phosphorylé irrelevant
n'a aucun effet
compétiteur, démontrant la spécificité vis-à-vis de la séquence phosphorylé et
non de la
présence du groupement phosphate uniquement.
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
MÉTHODES ET RÉSULTATS
La kinase Aurora A recombinante phosphoryle CDC25B3 sur la sérine 353
La protéine recombinante CDC25B3 est phosphorylée in vitro par la kinase
recombinante Aurora A. Le produit de Ia réaction de phosphorylation a été
analysé par
spectrométrie de masse après excision du gel d'électrophorèse et digestion
tryptique. Le
spectre MS/MS du peptide monophosphorylé, 353-SVTPPEEQQEAEEPK-367 est
présenté en Figure 1. Son analyse indique que c'est la sérine 353 qui est
phosphorylée
par la kinase.
i o De même, il a été montré que la kinase Aurora A recombinante phosphoryle
CDC25B1 sur la sérine 339, CDC25B2 sur la sérine 312, CDC25B4 sur la sérine
374 et
CDC25B5 sur la sérine 361.
Production d'anticorps contre la protéine CDC25B phosphorylée par la
kinase Aurora A
Le peptide de séquence QNKRR'RS(p)VTPPEEQ (SEQ ID NO : 2) a été utilisé
pour (immunisation de lapins. Après sacrifice des animaux, le sérum a été
purifié par
chromatographie en deux étapes : la première sur une colonne de peptide
phosphorylé
pour retenir les anticorps spécifiques, puis la deuxième sur une colonne du
même
2o peptide non phosphorylé de séquence QNKRR1ZSVTPPEEQ, de manière à purifier
dans
féluat les anticorps spécifiques de la forme phosphorylée. La reconnaissance
du peptide
phosphorylé par les anticorps a été validée dans un test ELISA. Dans la suite
du
document, ces anticorps seront désignés sous Ie nom de SE96.
L'anticorps SE96 reconnaît CDC25B phosphorylé par Aurora A
Des protéines recombinantes CDC25B-MBP (Maltose Binding protein) ou MBP
seule ont été incubées en présence ou non de kinase Aurora A. Les échantillons
ont
ensuite été analysés par transfert de protéines (western blot) avec
l'anticorps SE96 et
des anticorps permettant la reconnaissance de la MBP et d'Aurora A. Comme le
montre
3o la Figure 2, la protéine CDC25B phosphorylée par Aurora A est reconnue par
SE96, ce
qui valide l'utilisation de cet anticorps~dans un test Western blot.
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
9
La protéine CDC25B phosphorylée sur la sérine 353 est localisée au niveau
du centrosome
Des cellules HeLa ont été fixées et utilisées pour effectuer une analyse par
immunofluorescence avec les anticorps SE96. Les cellules ont également été
colorées
avec le 4'-6 diamino-2-phenylindole (DAP17 pour localiser le noyau. Les images
présentées à la Figure 3 sont représentatives d'observations sur un grand
nombre de
cellules. Elles indiquent que la protéine CDC25B phosphorylée sur la sérine
353 est
localisée au niveau des centrosomes des cellules en mitose. Ce marquage est
aboli
lorsqu'une compétition est réalisée avec le peptide phosphorylé ayant servi à
lo (immunisation (SEQ ID NO : 2), mais pas avec le peptide non phosphorylé
(QNKRRRSVTPPEEQ) ni avec un peptide phosphorylé sans rapport avec la serine
353
(MEVEELS(p)PLALGR). Ces observations valident l'utilisation de ce réactif en
immunofluorescence.
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
RÉFÉRENCES
- Baldin, V., Cans, C., Superti-Furga, G. & Ducommun, B (1997) Alternative
splicing of the human CDC25B tyrosine phoshatase. Possible implications for
growth
5 control? Oncogene,14, 2485-2495,
- Bischoff, J. R. et al. (1998) A homologue of Drosophila aurora kinase is
oncogenic and amplified in human colorectal cancers, EMBO J,17, 3052-65,
- Davezac, N. et al. (2000) Regulation of CDC25B phosphatases subcellular
localization, Oncogene,19, 2179-85,
lo - Dutertre, S., Descamps, S. & Prigent, C. (2002) On the role of aurora-A
in
centrosome fonction, Oncogene, 21, 6175-83,
- Forrest, A. & Gabrielli, B. (2001) Cdc25B activity is regulated by 14-3-3,
Oncogene, 20, 4393-401,
- Gabrïelli, B. G. et al. (1996) Cytoplasmic accumulation of CDC25B
phosphatase in mitosis triggers centrosomal microtubule nucleation in HeLa
cells, J.
Cell. Science,109, 1081-1093,
- Giet, R. & Prigent, C. (2000) The Xenopus laevis auroralIpl lp-related
kinase
pEg2 participates in the stability of the bipolar mitotic spindle, Exp Cell
Res, 258, 145-
51,
- Giet, R. et al. (2002) Drosophila Aurora A kinase is required to localize D-
TACC to centrosomes and to regulate astral microtubules, JCell Biol, 156, 437-
51,
- Hoffinann, L, Clarke, P., Marcote, M. J., Karsenti, E. & Draetta, G. (1993)
Phosphorylation and activation of human cdc25-C by cdc2-cyclin B and its
involvement
in the self amplification of MPF at mitosis, EMBO J, 12, 53-63,
- Kumagai, A. & Dunphy, W. (1992) Regulation of the; cdc25 protein during the
cell cycle in Xenopus exiracts, Cell, 70, 139-151,
- Meraldi, P., Honda, R. & Nigg, E. A. (2002) Aurora-A overexpression reveals
tetraploidization as a major route to centrosome amplification in p53-/-
cells, Embo J,
21, 483-92,
- Mils, V. et al. (2000) Specific interaction between 14.3.3 isoforms and the
human CDC25B phosphatase, Oncogene, l9, 1257-1265,
- Nilsson, I. & Hoffinann, I. (2000) Cell cycle regulation by the Cdc25
phosphatase family, Prog Cell Cycle Res, 4, 107-14,
- Zhou, H. et al. (1998) Tumour amplified kinase STK15BTAK induces
centrosome amplification, aneuploidy and transformation, Nat Genet, 20, 189-
93.
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
1/11
LISTE DE SÉQUENCES
<110> CNRS
UNIVERSITÉ DE RENNES I
UNIVERSITÉ PAUL SABATIER TOULOUSE III
<120> NOUVELLES SÉQUENCES PHOSPHORYLEES DE LA PHOSPHATASE CDC25B,
ANTICORPS DIRIGES CONTRE CES SÉQUENCES AINSI QUE
LEUR UTILISATION
<130> wOB 03 BH CNR CD25
<150> FR 03/07095
<151> 2003-06-12
<160> 7
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> PHOSPHORYLATION
<400> 1
Thr Pro Val Gln Asn Lys Arg Arg Arg Ser Val Thr Pro Pro Glu Glu
1 5 10 15
Gln Gln Glu
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7) .(7)
<223> PHOSPHORYLATION
<400> 2
G1n Asn Lys Arg Arg Arg Ser Val Thr Pro Pro Glu Glu Gln
1 5 10
<210> 3
<211> 566
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES
<222> (339)..(339)
<223> PHOSPHORYLATION
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
2/11
<400> 3
Met Glu Val Pro Gln Pro Glu Pro Ala Pro Gly Ser Ala Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ala Gly Val Cys Gly Gly Ala Gln Arg Pro Gly His Leu Pro Gly Leu
20 25 30
Leu Leu Gly Ser His Gly Leu Leu Gly Ser Pro Val Arg Ala Ala Ala
35 40 45
Ser Ser Pro Val Thr Thr Leu Thr Gln Thr Met His Asp Leu Ala Gly
50 55 60
Leu Gly Ser Arg Ser Arg Leu Thr His Leu Ser Leu Ser Arg Arg Ala
65 70 75 80
Ser Glu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ala Gly
85 90 95
Leu Cys Met Asp Ser Pro Ser Pro Met Asp Pro His Met Ala Glu Gln
100 105 110
Thr Phe Glu G1n Ala Ile Gln A1a Ala Ser Arg Ile Ile Arg Asn Glu
115 120 125
Gln Phe Ala Ile Arg Arg Phe Gln Ser Met Pro Val Arg Leu Leu Gly
130 135 140
His Ser Pro Val Leu Arg Asn Ile Thr Asn Ser Gln Ala Pro Asp Gly
145 150 155 160
Arg Arg Lys Ser Glu Ala Gly Ser Gly Ala Ala Ser Ser Ser Gly Glu
165 170 175
Asp Lys Glu Asn Asp Gly Phe Val Phe Lys Met Pro Trp Lys Pro Thr
180 185 190
His Pro Ser Ser Thr His Ala Leu Ala Glu Trp Ala Ser Arg Arg Glu
195 200 205
Ala Phe Ala Gln Arg Pro Ser Ser Ala Pro Asp Leu Met Cys Leu Ser
210 215 220
Pro Asp Arg Lys Met Glu Val Glu Glu Leu Ser Pro Leu Ala Leu Gly
225 230 235 240
Arg Phe Ser Leu Thr Pro Ala Glu Gly Asp Thr Glu Glu Asp Asp Gly
245 250 255
Phe Val Asp Ile Leu Glu Ser Asp Leu Lys Asp Asp Asp Ala Val Pro
260 265 270
Pro Gly Met Glu Ser Leu Ile Ser Ala Pro Leu Val Lys Thr Leu Glu
275 280 285
Lys Glu Glu Glu Lys Asp Leu Val Met Tyr Ser Lys Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Phe Arg Ser Pro Ser Met Pro Cys Ser Val Ile Arg Pro Ile Leu Lys
305 310 315 320
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
3/11
Arg Leu Glu Arg Pro Gln Asp Arg Asp Thr Pro Val Gln Asn Lys Arg
325 330 335
Arg Arg Ser Val Thr Pro Pro Glu Glu Gln Gln Glu Ala Glu Glu Pro
340 345 350
Lys Ala Arg Val Leu Arg Ser Lys Ser Leu Cys His Asp Glu Ile Glu
355 360 365
Asn Leu Leu Asp Ser Asp His Arg Glu Leu Ile Gly Asp Tyr Ser Lys
370 375 380
Ala Phe Leu Leu Gln Thr Val Asp Gly Lys His Gln Asp Leu Lys Tyr
385 390 395 400
Ile Ser Pro Glu Thr Met Val Ala Leu Leu Thr Gly Lys Phe Ser Asn
405 410 415
Ile Val Asp Lys Phe Val Ile Val Asp Cys Arg Tyr Pro Tyr Glu Tyr
420 425 430
G1u Gly Gly His Ile Lys Thr Ala Val Asn Leu Pro Leu Glu Arg Asp
435 440 445
Ala Glu Ser Phe Leu Leu Lys Ser Pro Ile Ala Pro Cys Ser Leu Asp
450 455 460
Lys Arg Val Ile Leu Ile Phe His Cys Glu Phe Ser Ser Glu Arg Gly
465 470 475 480
Pro Arg Met Cys Arg Phe Ile Arg Glu Arg Asp Arg Ala Val Asn Asp
485 490 495
Tyr Pro Ser Leu Tyr Tyr Pro Glu Met Tyr Ile Leu Lys Gly Gly Tyr
500 505 510
Lys Glu Phe Phe Pro Gln His Pro Asn Phe Cys Glu Pro Gln Asp Tyr
515 520 525
Arg Pro Met Asn His Glu Ala Phe Lys Asp Glu Leu Lys Thr Phe Arg
530 535 540
Leu Lys Thr Arg Ser Trp Ala Gly Glu Arg Ser Arg Arg Ghi Leu Cys
545 550 555 560
Ser Arg Leu Gln Asp Gln
565
<210> 4
<211> 539
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES
<222> (312)..(312)
<223> PHOSPHORYLATION
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
4/11
<400> 4
Met G1u Val Pro Gln Pro Glu Pro Ala Pro Gly Ser Ala Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ala G1y Val Cys Gly Gly Ala Gln Arg Pro Gly His Leu Pro Gly Leu
20 25 30
Leu Leu Gly Ser His Gly Leu Leu Gly Ser Pro Val Arg Ala Ala Ala
35 40 45
Ser Ser Pro Val Thr Thr Leu Thr Gln Thr Met His Asp Leu Ala Gly
50 55 60
Leu G1y Ser Glu Thr Pro Lys Ser Gln Val Gly Thr Leu Leu Phe Arg
65 70 75 80
Ser Arg Ser Arg Leu Thr His Leu Ser Leu Ser Arg Arg Ala Ser Glu
85 90 95
Ser Ser Leu Ser Ser Glu Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ala Gly Leu Cys
100 l05 110
Met Asp Ser Pro Ser Pro Met Asp Pro His Met Ala Glu Gln Thr Phe
115 l20 125
Glu Gln Ala Ile Gln Ala Ala Ser Arg Ile Ile Arg Asn Glu Gln Phe
130 135 140
Ala Ile Arg Arg Phe Gln Ser Met Pro Asp Gly Phe Val Phe Lys Met
145 150 155 160
Pro Trp Lys Pro Thr His Pro Ser Ser Thr His Ala Leu Ala Glu Trp
165 170 175
Ala Ser Arg Arg Glu Ala Phe Ala Gln Arg Pro Ser Ser Ala Pro Asp
180 185 190
Leu Met Cys Leu Ser Pro Asp Arg Lys Met Glu Val Glu Glu Leu Ser
195 200 205
Pro Leu Ala Leu Gly Arg Phe Ser Leu Thr Pro Ala Glu Gly Asp Thr
210 215 220
Glu Glu Asp Asp Gly Phe Val Asp Ile Leu Glu Ser Asp Leu Lys Asp
225 230 235 240
Asp Asp Ala Val Pro Pro Gly Met Glu Ser Leu Ile Ser Ala Pro Leu
245 250 255
Val Lys Thr Leu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Asp Leu Val Met Tyr Se,r
260 . 265 270
Lys Cys Gln Arg Leu Phe Arg Ser Pro Ser Met Pro Cys Ser Val Ile
275 280 285
Arg Pro Ile Leu Lys Arg Leu Glu Arg Pro Gln Asp Arg Asp Thr Pro
290 295 300
Val G1n Asn Lys Arg Arg Arg Ser Val Thr Pro Pro Glu Glu Gln Gln
305 310 315 320
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
5/11
Glu Ala Glu Glu Pro Lys Ala Arg Val Leu Arg Ser Lys Ser Leu Cys
325 330 335
His Asp Glu Ile Glu Asn Leu Leu Asp Ser Asp His Arg Glu Leu Ile
340 345 350
Gly Asp Tyr Ser Lys Ala Phe Leu Leu Gln Thr Val Asp Gly Lys His
355 360 365
G1n Asp Leu Lys Tyr Ile Ser Pro Glu Thr Met Val Ala Leu Leu Thr
370 375 380
Gly Lys Phe Ser Asn Ile Val Asp Lys Phe Val Ile Val Asp Cys Arg
385 390 395 400
Tyr Pro Tyr Glu Tyr Glu Gly Gly His Ile Lys Thr Ala Val Asn Leu
405 410 415
Pro Leu Glu Arg Asp Ala Glu Ser Phe Leu Leu Lys Ser Pro Ile Ala
420 425 430
Pro Cys Ser Leu Asp Lys Arg Val Ile Leu Ile Phe His Cys Glu Phe
435 440 445
Ser Ser Glu Arg Gly Pro Arg Met Cys Arg Phe Ile Arg Glu Arg Asp
450 455 460
Arg Ala Val Asn Asp Tyr Pro Ser Leu Tyr Tyr Pro Glu Met Tyr Ile
465 470 475 480
Leu Lys Gly Gly Tyr Lys Glu Phe Phe Pro Gln His Pro Asn Phe Cys
485 490 495
Glu Pro Gln Asp Tyr Arg Pro Met Asn His Glu Ala Phe Lys Asp Glu
500 505 510
Leu Lys Thr Phe Arg Leu Lys Thr Arg Ser Trp Ala Gly Glu Arg Ser
515 520 525
Arg Arg Glu Leu Cys Ser Arg Leu Gln Asp Gln
530 535
<210> 5
<211> 580
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES
<222> (353)..(353)
<223> PHOSPHORYLATION
<400> 5
Met Glu Val Pro Gln Pro Glu Pro Ala Pro Gly Ser Ala Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ala Gly Val Cys Gly Gly Ala Gln Arg Pro Gly His Leu Pro Gly Leu
20 25 30
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
6/11
Leu Leu Gly Ser His Gly Leu Leu Gly Ser Pro Val Arg Ala Ala Ala
35 40 45
Ser Ser Pro Val Thr Thr Leu Thr Gln Thr Met His Asp Leu Ala Gly
50 55 60
Leu Gly Ser Glu Thr Pro Lys Ser Gln Val Gly Thr Leu Leu Phe Arg
65 70 75 80
Ser Arg Ser Arg Leu Thr His Leu Ser Leu Ser Arg Arg Ala Ser Glu
85 90 95
Ser Ser Leu Ser Ser Glu Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ala Gly Leu Cys
100 . 105 110
Met Asp Ser Pro Ser Pro Met Asp Pro His Met Ala Glu Gln Thr Phe
115 120 125
Glu Gln Ala Ile Gln Ala Ala Ser Arg Tle Ile Arg Asn Glu Gln Phe
130 135 140
Ala Ile Arg Arg Phe,Gln Ser Met Pro Val Arg Leu Leu Gly His Ser
145 150 155 160
Pro Val Leu Arg Asn Ile Thr Asn Ser Gln Ala Pro Asp Gly Arg Arg
165 170 175
Lys Ser Glu Ala Gly Ser Gly Ala Ala Ser Ser Ser Gly Glu Asp Lys
180 185 190
Glu Asn Asp Gly Phe Val Phe Lys Met Pro Trp Lys Pro Thr His Pro
195 200 205
Ser Ser Thr Hïs Ala Leu Ala Glu Trp Ala Ser Arg Arg Glu Ala Phe
210 2l5 220
Ala Gln Arg Pro Ser Ser Ala Pro Asp Leu Met Cys Leu Ser Pro Asp
225 230 235 240
Arg Lys Met Glu Val Glu Glu Leu 5er Pro Leu Ala Leu Gly Arg Phe
245 250 255
Ser Leu Thr Pro Ala Glu Gly Asp Thr Glu Glu Asp Asp G1y'~Phe Val
260 265 270
Asp Ile Leu Glu Ser Asp Leu Lys Asp Asp Asp Ala Val Pro Pro Gly
275 280 285
Met Glu Ser Leu Ile Ser Ala Pro Leu Val Lys Thr Leu Glu Lys Glu
290 295 300
Glu Glu Lys Asp Leu Val Met Tyr Ser Lys Cys Gln Arg Leu Phe Arg
305 310 315 320
Ser Pro Ser Met Pro Cys Ser Val Ile Arg Pro Ile Leu Lys.Arg Leu
325 330 335
Glu Arg Pro Gln Asp Arg Asp Thr Pro Val Gln Asn Lys Arg Arg Arg
340 345 350
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
7/11
Ser Val Thr Pro Pro Glu Glu Gln Gln Glu Ala Glu Glu Pro Lys Ala
355 360 365
Arg Val Leu Arg Ser Lys Ser Leu Cys His Asp Glu Ile Glu Asn Leu
370 375 380
Leu Asp Ser Asp His Arg Glu Leu Ile Gly Asp Tyr Ser Lys Ala Phe
385 390 395 400
Leu Leu Gln Thr Val Asp Gly Lys His Gln Asp Leu Lys Tyr Ile Ser
405 410 415
Pro Glu Thr Met Val Ala Leu Leu Thr Gly Lys Phe Ser Asn Ile Val
420 425 430
Asp Lys Phe Val Ile Val Asp Cys Arg Tyr Pro Tyr Glu Tyr Glu Gly
435 440 445
Gly His Ile Lys Thr Ala Val Asn Leu Pro Leu Glu Arg Asp Ala Glu
450 455 460
Ser Phe Leu Leu Lys Ser Pro Ile Ala Pro Cys Ser Leu Asp Lys Arg
465 470 475 480
Val Ile Leu Ile Phe His Cys G1u Phe Ser Ser Glu Arg Gly Pro Arg
485 490 495
Met Cys Arg Phe Ile Arg Glu Arg Asp Arg Ala Val Asn Asp Tyr Pro
500 505 510
Ser Leu Tyr Tyr Pro Glu Met Tyr Ile Leu Lys Gly Gly Tyr Lys Glu
515 520 525
Phe Phe Pro G:ln His Pro Asn Phe Cys Glu Pro Gln Asp Tyr Arg Pro
530 535 540
Met Asn His Glu Ala Phe Lys Asp Glu Leu Lys Thr Phe Arg Leu Lys
545 550 555 560
Thr Arg Ser Trp Ala Gly Glu Arg Ser Arg Arg Glu Leu Cys Ser. Arg
565 570 575
Leu Gln Asp Gln
580
<210> 6
<211> 601
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES
<222> (374)..(374)
<223> PHOSPHORYLATION
<400> 6
Met Glu Val Pro Gln Pro Glu Pro Ala Pro Gly Ser Ala Leu Ser Pro
1 5 10 15
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
8/11
Ala Gly Val Cys Gly Gly Ala Gln Arg Pro Gly His Leu Pro Gly Leu
20 25 30
Leu Leu Gly Ser His Gly Leu Leu Gly Ser Pro Val Arg Ala Ala Ala
35 40 45
Ser Ser Pro Val Thr Thr Leu Thr Gln Thr Met His Asp Leu Ala Gly
50 55 60
Leu Gly Ser Arg Ser Arg Leu Thr His Leu Ser Leu Ser Arg Arg Ala
65 70 75 80
Ser Glu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ala Gly
85 90 95
Leu Cys Met Asp Ser Pro Ser Pro Met Asp Pro His Met Ala Glu Gln
100 105 110
Thr Phe Glu Gln Ala Ile Gln Ala Ala Ser Arg Ile Ile Arg Asn Glu
115 120 125
Gln Phe Ala Ile Arg Arg Phe Gln Ser Met Pro Val Arg Leu Leu Gly
130 135 140
His Ser Pro Val Leu Arg Asn Ile Thr Asn Ser Gln Ala Pro Asp Gly
145 150 155 160
Arg Arg Lys Ser Glu Ala Gly Ser Gly Ala Ala Ser Ser Ser Gly Glu
165 170 . 175
Asp Lys Glu Asn Val Arg Phe Trp Lys Ala Gly Val Gly Ala Leu Arg
180 185 190
Glu Glu Glu Gly Ala Cys Trp Gly Gly Ser Leu Ala Cys Glu Asp Pro
195 200 205
Pro Leu Pro Ser Trp Leu Gln Asp Gly Phe Val Phe Lys Met Pro Trp
210 215 220
Lys Pro Thr His Pro Ser Ser Thr His Ala Leu Ala Glu Trp Ala Ser
225 230 235 240
Arg.Arg Glu Ala Phe Ala Gln Arg Pro Ser Ser Ala Pro Asp~Leu Met
245 250 255
Cys Leu Ser Pro Asp Arg Lys Met Glu Val Glu Glu Leu Ser Pro Leu
260 265 270
Ala Leu Gly Arg Phe Ser Leu Thr Pro Ala Glu Gly Asp Thr Glu Glu
275 280 285
Asp Asp Gly Phe Val Asp Ile Leu Glu Ser Asp Leu Lys Asp Asp Asp
290 295 300
A1a Val Pro Pro Gly Met Glu Ser Leu Ile Ser Ala Pro Leu Val Lys
305 310 315 320
Thr Leu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Asp Leu Val Met Tyr Ser Lys Cys
325 330 335
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
9/11
Gln Arg Leu Phe Arg Ser Pro Ser Met Pro Cys Ser Val Ile Arg Pro
340 345 350
Ile Leu Lys Arg Leu Glu Arg Pro Gln Asp Arg Asp Thr Pro Val Gln
355 360 365
Asn Lys Arg Arg Arg Ser Val Thr Pro Pro Glu Glu Gln Gln Glu Ala
370 375 380
Glu Glu Pro Lys Ala Arg Val Leu Arg Ser Lys Ser Leu Cys His Asp
385 390 395 400
Glu Ile Glu Asn Leu Leu Asp Ser Asp His Arg Glu Leu Ile Gly Asp
405 410 415
Tyr Ser Lys Ala Phe Leu Leu Gln Thr Val Asp Gly Lys His Gln Asp
420 425 430
Leu Lys Tyr Ile Ser Pro Glu Thr Met Val Ala Leu Leu Thr Gly Lys
435 440 445
Phe Ser Asn Ile Val Asp Lys Phe Val Ile Val Asp Cys Arg Tyr Pro
450 455 460
Tyr Glu Tyr Glu Gly Gly His Ile Lys Thr Ala Val Asn Leu Pro Leu
465 470 475 480
Glu Arg Asp Ala Glu Ser Phe Leu Leu Lys Ser Pro Tle Ala Pro Cys
485 490 495
Ser Leu Asp Lys Arg Val Ile Leu Ile Phe His Cys Glu Phe Ser Ser
500 505 510
Glu Arg Gly Pro Arg Met Cys Arg Phe Ile Arg Glu Arg Asp Arg A1a
515 520 525
Val Asn Asp Tyr Pro Ser Leu Tyr Tyr Pro,Glu Met Tyr Ile Leu Lys
530 535 540
Gly Gly Tyr Lys Glu Phe Phe Pro Gln His Pro Asn Phe Cys Glu. Pro
545 550 555 560
Gln Asp Tyr Arg Pro Met Asn His Glu Ala Phe Lys Asp Glu~Leu Lys
565 570 575
Thr Phe Arg Leu Lys Thr Arg Ser Trp Ala Gly Glu Arg Ser Arg Arg
580 585 590
Glu Leu Cys Ser Arg Leu Gln Asp Gln
595 600
<210> 7
<211> 588
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES
<222> (361)..(361)
<223> PHOSPHORYLATION
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
10/11
<400> 7
Met Glu Val Pro Gln Pro Glu Pro Ala Pro Gly Ser Ala Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ala Gly Val Cys Gly Gly Ala Gln Arg Pro Gly His Leu Pro Gly Leu
20 25 30
Leu Leu Gly Ser His Gly Leu Leu Gly Ser Pro Val Arg Ala Ala Ala
35 40 45
Ser Ser Pro Val Thr Thr Leu Thr Gln Thr Met His Asp Leu Ala Gly
50 55 60
Leu Gly Ser Glu Thr Pro Lys Ser Gln Val Gly Thr Leu Leu Phe Arg
65 70 75 80
Ser Arg Ser Arg Le~i Thr His Leu Ser Leu Ser Arg Arg Ala Ser Glu
85 90 95
Ser Ser Leu Ser Ser Glu Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ala Gly Leu Cys
100 105 110
Met Asp Ser Pro Ser Pro Met Asp Pro His Met Ala Glu Gln Thr Phe
115 120 125
Glu Gln Ala Ile Gln Ala Ala Ser Arg Ile Ile Arg Asn Glu Gln Phe
130 135 140
Ala Ile Arg Arg Phe Gln Ser Met Pro Val Arg Leu Leu Gly His Ser
145 150 155 160
Pro Val Leu Arg Asn Ile Thr Asn Ser Gln Ala Pro Asp Gly Arg Arg
165 170 175
Lys Ser Glu Ala Gly Ser Gl~y Ala Ala Ser Ser Ser Gly Glu Asp Lys
180 185 190
Glu Asn Val Arg Phe Trp Lys Ala Gly Val Gly Ala Leu Arg Glu Glu
195 200 205
Glu G1y Ala Cys Trp Gly Gly Ser Leu Ala Cys Glu Asp Pro Pro Leu
210 215 220
Pro Ser Trp Leu Gln Asp Gly Phe .Val Phe Lys Met Pro Trp Lys Pro
225 230 235 240
Thr His Pro Ser Ser Thr His A1a Leu Ala Glu Trp Ala Ser Arg Arg
245 250 255
Glu Ala Phe Ala Gln Arg Pro Ser Ser Ala Pro Asp Leu Met Cys Leu
260 265 270
Ser Pro Asp Arg Lys Met Glu Val Glu Glu Leu Ser Pro Leu Ala Leu
275 280 285
Gly Arg Phe Ser Leu Thr Pro Ala Glu Gly Asp Thr Glu Glu Asp Asp
290 295 300
Gly Phe Val Asp Ile Leu Glu Ser Asp Leu Lys Asp Leu Val Met Tyr
305 310 315 320
CA 02528844 2005-12-09
WO 2004/111215 PCT/FR2004/001416
11/11
Ser Lys Cys Gln Arg Leu Phe Arg Ser Pro Ser Met Pro Cys Ser Val
325 330 335
Ile Arg Pro Ile Leu Lys Arg Leu Glu.Arg Pro Gln Asp Arg Asp Thr
340 345 350
Pro Val Gln Asn Lys Arg Arg Arg Ser Val Thr Pro Pro Glu Glu Gln
355 360 365
Gln Glu Ala Glu Glu Pro Lys Ala Arg Val Leu Arg Ser Lys Ser Leu
370 375 380
Cys His Asp Glu Ile Glu Asn Leu Leu Asp Ser Asp His Arg Glu Leu
385 390 395 400
Ile Gly Asp Tyr Ser Lys Ala Phe Leu Leu Gln Thr Val Asp Gly Lys
405 410 415
His Gln Asp Leu Lys Tyr Ile Ser Pro Glu Thr Met Val Ala Leu Leu
420 425 430
Thr Gly Lys Phe Ser Asn Ile Val Asp Lys Phe Val Ile Val Asp Cys
435 440 445
Arg Tyr Pro Tyr Glu Tyr Glu Gly Gly His Tle Lys Thr Ala Val Asn
450 455 460
Leu Pro Leu Glu Arg Asp Ala Glu Ser Phe Leu Leu Lys Ser Pro Ile
465 470 475 480
Ala Pro Cys Ser Leu Asp Lys Arg Val Ile Leu Ile Phe His Cys Glu
485 490 495
Phe Ser Ser Glu Arg Gly Pro Arg Met Cys.Arg Phe Ile Arg Glu Arg
500 505 510
Asp Arg Ala Val Asn Asp Tyr Pro Ser Leu Tyr Tyr Pro Glu Met Tyr
515 520 525
¿le Leu Lys Gly G1y Tyr Lys Glu Phe Phe Pro Gln His Pro Asn Phe
530 ' 535 540
Cys Glu Pro Gln Asp Tyr Arg Pro Met Asn His Glu Ala Phe Lys Asp
545 550 555 560
Glu Leu Lys Thr Phe Arg Leu Lys Thr Arg Ser Trp Ala Gly Glu Arg
565 570 575
Ser Arg Arg Glu Leu Cys Ser Arg Leu Gln Asp Gln
580 585
