Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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WO 2005/013690
PCT/FR2004/000712
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MILIEU DE CONSERVATION D'ORGANES, DE TISSUS BIOLOGIQUES OU
DE CELLULES VIVANTES
La présente invention concerne le domaine technique de la conservation de
cellules vivantes. Plus précisément, l'invention a pour objet un nouveau
milieu de
conservation d'organes, de tissus biologiques ou de cellules vivantes, en
particulier
de cornées humaines vivantes.
Dans le domaine des' greffes d'organes, lorsqu'un organe est prélevé sur un
donneur, en vue d'être greffé sur un receveur, il est nécessaire de posséder
un milieu
de conservation de l'organe apte à maintenir sa vitalité pour une bonne prise
du
greffon. En fait, bien souvent, différents milieux sont nécessaires. Dans le
cas de
cornées humaines notamment, on utilise généralement :
un milieu de transport pour l'acheminement des cornées du site de
prélèvement au centre de culture, d'une part, et du centre de culture au
site de la greffe, d'autre part,
un milieu de conservation: La conservation a lieu, le plus souvent, à
4 C ou 31 C. Ce milieu doit garantir une conservation optimale de la
viabilité cellulaire à moyen terme, soit environ 4 à 5 semaines, une
sécurité maximale en termes de qualité (contrôle endothélial), de
stérilité (contrôles bactériologiques, sérologiques et virologiques), et
un milieu de déturgescence, utilisé environ 24 heures avant la greffe,
afin de réduire l'épaisseur de la cornée et la rendre transparente.
La plupart des milieux utilisés actuellement contiennent des composants
d'origine animale : sérum albumine de veau foetal, protéine d'origine animale
de type
transferrine, insuline...
Du fait de la présence de composants d'origine animale dans ces milieux, il
est
difficile d'en garantir la sécurité sanitaire vis-à-vis des maladies à prions,
notamment
de la maladie de Creutzfeld Jacob. De plus, ces milieux sont susceptibles
d'être
contaminés par des agents infectieux et n'ont pas une composition parfaitement
reproductible.
Dans ce contexte, la présente invention a pour objectif de fournir un nouveau
milieu de conservation préservant la viabilité des cellules vivantes.
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Un autre objectif de l'invention est de fournir un milieu de conservation à
faible coût de revient, du fait des composants qu'il contient.
Le milieu de conservation selon la présente invention se doit également de
présenter une sécurité maximale en termes de qualité et de stérilité.
De plus, il présente l'avantage de pouvoir être préparé à partir de composants
entièrement synthétiques, c'est-à-dire issus de la synthèse chimique et
recombinante,
donc non immunogènes et non contaminés par des agents infectieux. Par
conséquent,
le milieu de conservation selon l'invention peut présenter une composition
définie
reproductible d'un lot à l'autre.
Plus précisément, l'invention concerne un milieu de conservation d'organes, de
tissus biologiques ou de cellules vivantes contenant une base nutritive
liquide,
caractérisé en ce qu'il contient un acide hyaluronique de haut poids
moléculaire et du
chlorure de sodium et en ce qu'il ne contient aucun composant d'origine
animale.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel milieu pour la
conservation, l'organoculture, la culture cellulaire, le transport ou la
déturgescence
d'organes, de tissus biologiques ou de cellules vivantes et en particulier de
cornées
humaines vivantes.
Par organes, cellules ou tissus biologiques vivants, on entend des composants
d'origine humaine ou animale comprenant des fibroblastes, des cellules
endothéliales
et/ou des cellules épithéliales vivantes.
Le milieu de conservation de l'invention peut être qualifié de produit
thérapeutique annexe.
Le milieu de conservation selon l'invention contient des substances
viscoélastiques (SVE) destinées à protéger les cellules endothéliales et les
tissus
environnants. Ces substances viscoélastiques sont notamment l'acide
hyaluronique
de haut poids moléculaire.
L'acide hyaluronique de haut poids moléculaire, c'est-à-dire de poids
moléculaire supérieur ou égal à 1 million de Dallons, peut être d'origine
animale,
extrait de la crête de coq ou du sang de cordon, d'origine bactérienne (de
cultures de
streptocoques) ou d'origine végétale. Bien entendu, le milieu de conservation
selon
l'invention contient de l'acide hyaluronique de haut poids moléculaire
d'origine
végétale, étant donné qu'il est exempt de tout composant d'origine animale. En
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particulier, pour la préparation du milieu de conservation de l'invention, on
utilisera
de l'acide hyaluronique de haut poids moléculaire issu du blé, sous forme de
poudre
et vendu sous le nom commercial Cristalhyal ou sous forme de solution aqueuse
à
1 % et vendu sous le nom commercial Vitalhyal par le laboratoire Bowman
(distributeur société Soliance), présentant un poids moléculaire supérieur ou
égal à
106 Dallons et une viscosité Brookfield à 20 C de 1 500 centipoises.
Le milieu de conservation selon l'invention contient également du chlorure de
sodium, en tant que cristalloïde. Le chlorure de sodium a notamment pour
fonction
d'éviter la précipitation de l'acide hyaluronique, mais aussi participe au
maintient de
l'osmolarité.
En particulier, le milieu de conservation selon l'invention contient :
de 80 à 4000 mg/1, de préférence 100 à 200 mg/1, préférentiellement de
100 à 160 mg/1 d'acide hyaluronique de haut poids moléculaire, et
de 4500 à 9000 mg/1, de préférence de 5500 à 9000 mg/1,
préférentiellement 7000 mga de chlorure de sodium.
De façon avantageuse, le milieu selon l'invention contiendra du poloxamer 188
qui a notamment pour fonction d'augmenter la viscosité du milieu.
Le poloxamer 188, également nommé Pluronic*F68 ou Lutrol F68 est un
polymère séquencé de polyoxyéthylène-polyoxypropylène de poids moléculaire
7680-950 g/mol et de formule générale :
HO-(CH2-CH2-0)x-[CH2-CH(CH3)-0VCI-12-CH2-0)x-H
où x est environ égal à 79 et y environ égal à 28.
La présence de poloxamer 188 est particulièrement avantageuse dans le milieu
selon l'invention, quand ce dernier est destiné à être utilisé pour la
déturgescence
d'organes et pour le transport et la conservation, de tissus ou cellules
vivantes, et, en
particulier, de greffons de cornées humaines. Le milieu selon l'invention
contiendra,
= de préférence, de 200 à 75000 mg/1, préférentiellement de 450 à 50000
mg/1 de
poloxamer 188.
Les milieux de conservation actuellement sur le marché, destinés à. la
déturgescence de cornées contiennent du dextran. Le dextran a pour fonction
d'affmer l'épaisseur de la cornée et pourra être utilisé dans les milieux
selon
l'invention destinés à la déturgescence de cornées. On lui préférera néanmoins
le
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poloxamer 188 qui a également pour effet d'affiner la cornée mais qui est
beaucoup
moins cytotoxique.
La méthylcellulose est une autre SVE que peut contenir le milieu de
conservation selon l'invention. La méthylcellulose est d'origine végétale et
est
obtenue à partir de fibres de cellulose provenant de bourres de coton ou de
pulpe de
bois. Ces fibres de cellulose sont traitées avec une solution de soude
caustique, pour
subir une éthérification avec du chlorure de méthylène. Le degré de
substitution,
correspondant au nombre de substituants méthoxylés par unité glucosidique est
compris entre 1,64 et 1,92. En particulier, on pourra utiliser pour préparer
le milieu
de conservation de l'invention la méthylcellulose commercialisée par la
société
SEPPIC sous le nom commercial Métolose SM 400 de viscosité Brookfield 4000
centipoises (2 % en eau à 20 C) et de poids moléculaire de 86000 Daltons. Le
milieu
selon l'invention contiendra, de préférence, de 210 à 5000 mg/1, de préférence
de
1900 à 2500 mg/1, préférentiellement 2205 mg/1 de méthylcellulose.
Les SVE utilisés permettent une hydratation des cellules par rétention d'eau
et présentent une certaine adhésivité ou attachement aux cellules et tissus
qu'elles
entourent, assurant ainsi la protection de ces derniers contre les attaques
chimiques
ou les effets toxiques de l'air.
Le milieu de conservation selon l'invention contient également d'autres
composants plus couramment utilisés dans le domaine de la conservation de
cellules
vivantes.
En particulier, le milieu de conservation contient une base aqueuse nutritive
chimique, classiquement utilisée dans les milieux de conservation d'organe ou
de
culture cellulaire. On pourra notamment se référer à l'article le Technoscope
de
biofutur , n 133, avril 1994, pages 3-16 qui indique qu'une base nutritive
contient :
- des acides aminés, dont le rôle dans le métabolisme cellulaire est de
fournir
- l'azote et le carbone. Certaines cellules, en plus des 13 acides aminés
essentiels, ont
des besoins spécifiques (la serine, par exemple, pour les cellules lymphoïdes)
;
- des sucres, le glucose est le plus généralement utilisé, bien qu'il
puisse être
remplacé par le galactose lorsqu'il est nécessaire de limiter l'accumulation
d'acide
lactique ;
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- des vitamines, essentiellement du groupe B, dont 8 sont considérées comme
indispensables ;
- des ions, apportés sous forme de solutions salines équilibrées, qui jouent
un
rôle important dans le maintien du potentiel membranaire et de la pression
5 osmotique, ce sont également les cofacteurs de nombreuses réactions
enzymatiques ;
- des métaux présents à l'état de trace, semblent jouer un rôle de plus en
plus
important, en particulier lorsque la culture est réalisée en milieu défini.
Les plus
importants sont le sélénium, le cadmium et le lithium.
Ce type de bases peut être préparé à partir de ces différents éléments
constitutifs. Certaines bases nutritives chimiques existent également dans le
commerce, soit sous forme liquide, soit sous forme solide : ces dernières
doivent
alors être reconstituées dans l'eau. En particulier, on pourra utiliser l'IMDM
(Iscove's Modified Dulbecco's Medium ref : Iscove, N.N. and Melchers (1978) J.
of
Exp. Med. 147: 923-933), le milieu MEM ALPHA de STAINERS, C.P. et al.,
Nature New Biol. 230,52 (1971), le milieu de Click RPMI de Click et al.,
Cell.
Immunol. 3, 264 (1972), le milieu CMRL1066 de PARKER, R.C., et al. Special
Publications, N.Y. Academy of Sciences, 5, 303, (1957), le milieu Leibovitz
L15 de
A. LEIBOVITZ, Am. J. Hyg. 78, 173 (1963) et H.J. MORTON, In vitro, 6, 89
(1970), le milieu M199 de MORGAN, J.F. et al., Proc.soc.Exp.Biol.Med.73, 1
(1950), le milieu DMEM/HAM F12, de D. BARNES and G. SATO, Anal. Biochem.
102, 255 (1980), bases nourricières aqueuses qui contiennent différentes
substances
nécessaires au maintien des cellules et tissus, notamment différents
oligoéléments,
des acides aminés, des vitamines, des électrolytes, un tampon stabilisateur de
pH, un
indicateur de pH (par exemple, le rouge de phénol), du glucose ou du galactose
(L15). Par oligoéléments, on entend tous sels inorganiques métalliques, à
l'exception
de NaC1, présents à l'état de trace ou en quantité plus importante.
De façon avantageuse, le milieu de conservation selon l'invention contient, -
donc, des acides aminés, des oligoéléments, des vitamines, des électrolytes,
un
tampon stabilisateur de pH, provenant en majorité de la base nutritive
utilisée. Si la
base utilisée ne contient pas ces éléments en quantité suffisante, ceux-ci
seront
complétés.
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Le milieu de conservation selon l'invention contient, avantageusement, et, de
façon indépendante, de 1 à 50 mg/1 de sulfate de chondroïtine, de 0,1 à 25
mg/1
d'héparane sulfate, de 500 à 2000 mg/1 d'acide alginique, de 1000 à 10000 mg/1
d'hydroxyéthylamidon.
Dans le cas, où le milieu de conservation est destiné à être utilisé sur des
greffons de cornées humaines, il contiendra de préférence des composants
présents
dans l'humeur aqueuse tels que le lactate de sodium, l'acétate de sodium, le
citrate de
sodium, l'ascorbate de fer II, le gluconate de fer II, le pyruvate de sodium
et le
chlorure de calcium.
De façon particulièrement avantageuse, le milieu de conservation selon
l'invention contient de façon indépendante ou en combinaison :
= de 0,01 à 350 mg/1 de vitamines, choisies de préférence parmi celles-ci :
- du tocophérol acétate
- du rétinol acétate
- de Phydroquinone
- de l'acide ascorbique
- de la thiamine B1-HCL
- de la riboflavine B2
- du D-pantoténate de Ca B5
- du pyridoxal HC1 B6
- de la biotine B8
- de l'acide folique B9
- de la cyancobalamine B12
- de la nicotinamide B3 PP
- de l'orotate de chrome B13
= de 0,01 à 650 mg/1 d'oligoéléments, choisis de préférence parmi ceux-ci :
- CaC12,2H20
- KC1
- CaH2PO4.2H20
- NaH2PO4.H20
- NaHCO3
- MgCO3.7H20
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- MgSO4.7H20
- FeSO4.7H20
- CuSO4.51120
- MnCO3.4H20
- MnC12.4H20
- Na2SiO3.9H20
- H2Se03
- NH4V03
- (NH4)6Mo7024.4H20
- SnC12.2H20
- ZnSO4.7H20
- Oxyde de Zinc
- NiC12.6H20
= de 0,005 à 150 mg/1 de nucléosides, choisis de préférence parmi ceux-ci :
-l'adénosine
- la cytidine
- la déoxyadénosine
- la déoxycytidine,
- la déoxyguanosine
- la guanosine
- l'uridine
- la thymidine
= de 800 à 4000 mg/1 d'acides aminés,
= de 500 à 9000 mg/1 d'oses, et de préférence du glucose et/ou du
galactose,
= d'autres éléments, à raison de 0,001 à 75000 mg/1 au total, et notamment :
- l'acétate de sodium (3H20)
- le citrate de sodium
- le lactate de sodium
- les pyruvates de sodium
- le gluconate de fer II,
- le sélénite de sodium
- le poloxamer 188
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- l'acide oléique
- l'acide linoléique
- l'acide linolénique
- l'acide palmitique
- le Tween*80.
Le milieu de conservation selon l'invention peut se présenter sous forme
liquide ou semi-solide. Il présente une viscosité assez importante pour
favoriser la
protection des cellules. De façon avantageuse, la viscosité Brookfield du
milieu de
conservation selon l'invention est comprise entre 1 et 15 centipoises (cps) à
20 C,
de préférence entre 2,5 et 10 cps. Le milieu de conservation selon l'invention
est
donc non injectable, de part sa viscosité.
L'osmolarité du milieu selon l'invention présente également une importance et
est, en particulier, comprise entre 300 et 465 mOsm 40. L'osmolarité du
milieu
dépend notamment de la concentration en NaCl. Lorsque le milieu selon
l'invention
est destiné à la conservation ou au transport, son osmolarité sera
avantageusement
comprise entre 300 et 360 mOsm 40, lorsqu'il est destiné à la déturgescence,
son
osmolarité est avantageusement comprise entre 350 et 465 mOsm 40.
L'osmolarité
des milieux de conservation actuellement sur le marché est moins importante.
Un des
avantages de l'invention est de pouvoir proposer un seul milieu pour le
transport, la
conservation et la déturgescence.
Le milieu de conservation selon l'invention est préparé par mélange des
différents constituants. De préférence, pour améliorer la dissolution de
l'acide
hyaluronique dans la base nutritive biologique liquide, ce dernier sera
mélangé au
chlorure de sodium, puis ajouté à la base nutritive contenant déjà la
méthylcellulose.
Le milieu de conservation selon l'invention ne contient aucun composant
d'origine animale. En effet, d'une part, contrairement à la plupart des
milieux utilisés
à ce jour pour la conservation d'organes, de tissus biologiques ou de cellules
vivantes, le milieu selon l'invention ne contient ni sérum albumine de veau
foetal, ni
lactoréfine, ni transférine, ni insuline, ni d'autres protéines d'origine
animale.
D'autre part, on utilise de l'acide hyaluronique de haut poids moléculaire et
de la
méthylcellulose, dont la synthèse ne fait intervenir aucune matière première
d'origine
animale.
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L'utilisation d'un milieu de conservation exempt de
composant d'origine animale permet d'améliorer la sécurité sanitaire des
cellules
conservées.
Le milieu de conservation selon l'invention pourra être utilisé pour la
conservation, l'organoculture, la culture cellulaire, la congélation, le
transport ou la
déturgescence d'organes, de tissus biologiques ou de cellules vivantes, et en
particulier de cornées humaines vivantes. Le milieu
de conservation selon
l'invention est utilisable à des températures comprises entre ¨196 C et 37 C
notamment.
En fonction de l'application envisagée, le milieu de conservation selon
l'invention pourra subir certaines adaptations.
Par exemple, dans le cas où le milieu selon l'invention est destiné à être
utilisé
pour la déturgescence préopératoire, il contiendra avantageusement du
poloxamer
188, à raison de 200 à 75000 mg/1, préférentiellement de 450 à 50000 mg/l.
Dans le cas, où le milieu est destiné à être utilisé pour la congélation de
cellules
vivantes, une partie de l'eau présente dans le milieu pourra être remplacée
par du
diméthylsulphoxide (DMSO) ayant un effet cryoprotecteur.
Les exemples ci-après illustrent l'invention, mais n'ont aucun caractère
limitatif. Dans les exemples ci-après, on utilise de l'acide hyaluronique sous
forme
de poudre, vendu sous le nom commercial Cristalhyal par le laboratoire Bowman
(distributeur société Soliance), de la méthylcellulose commercialisée par la
société
SEPPIC sous le nom commercial Métolose SM 4000 et du NaC1 commercialisé par
la société Sigma Aldrich. Les exemples 1 à 3 (milieux de conservation)
comprennent
74% en volume de base IMDM et les exemples 4 à 7 (milieux de déturgescence)
comprennent 88% en volume de base 1MDM.
Les osmolarités sont mesurées avec un osmomètre vendu par Fischer Bioblock
Scientific sous la référence M85501 (Calibration automatique zéro (eau
distillée) et
standard (300mOsm/kg) par pression d'une touche. Temps de réponse 1 minute).
Les viscosités sont mesurées avec un viscosimètre vendu par Fischer Bioblock
Scientific sous la référence M57571 avec un adaptateur faible viscosité à
partir de
1cps réf M57510 (Affichage simultané de la vitesse, mobile sélectionné,
viscosité en
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cps et en % de gamme et température. Compatible Brookfield. Les mobiles sont
plongés directement dans l'échantillon).
Exemple 1 : Le milieu de l'exemple 1 est avantageusement utilisé pour le
5 transport et la conservation.
Acide hyaluronique
de haut poids moléculaire 100 mg/1
Méthylcellulose 2 205 mg/1
NaC1 6 985 mg/1
10 Acides aminés 1 838 mg/1
Oligoéléments 5 390 mg/1
Glucose 4500 mg/1
Hydrates de carbone 1167 mg/1
Nucléosides 10 mg,/1
Vitamines 163 mg/1
Esters d'acide gras 46 mg/1
Tampon 8 982 mW1
pH 7,3
Osmolarité 394 mOsm
Viscosité 5cps (Brookfield 20 C)
Exemple 2: Le milieu de l'exemple 2 est avantageusement utilisé pour le
transport et la conservation.
Acide hyaluronique
de haut poids moléculaire 100 mg/1
Méthylcellulose 2 205 mg/1
NaCl 5 585 mg/1
Acides aminés 1 838 mg/1
Oligoéléments 5 390 mg/1
Glucose 4500 mg/1
Hydrates de carbone 1167 mg/1
Nucléosides 10 mg/1
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Vitamines 163 mg/1
Esters d'acide gras 46 mg/1
Tampon 8 982 mg/1
pH 7,3
Osmolarité 372 mOsm
Viscosité Seps (Brookfield, 20 C)
Exemple 3: Le milieu de l'exemple 3 est avantageusement utilisé pour le
transport et la conservation.
Acide hyaluronique
de haut poids moléculaire 160 mg/1
Poloxamer 188 2 205 mg/1
NaC1 5 585 mg/1
Acides aminés 1 838 mg/1
Oligoéléments 5 390 mg/1
Glucose 4500 mg/1
Hydrates de carbone 1167 mg/1
Nucléosides 10 mg/1
Vitamines 163 mg/1
Esters d'acide gras 46 mg/1
Tampon 8 982 mg/1
pH 7,3
Osmolarité 305 mOsm
Viscosité 1,5cps (Brookfield, 20 C)
Exemple 4: Le milieu de l'exemple 4 est avantageusement utilisé pour la
déturgescence.
Acide hyaluronique
de haut poids moléculaire 100 mg/1
Méthylcellulose 2 205 mg/1
Dextran 50 000 mg/1
NaCl 6 985 mg/1
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Acides aminés 1 838 mg/1
Oligoéléments 5 390 mg/1
Glucose 4500 mg/1
Hydrates de carbone 1167 mg/1
Nucléosides 10 mg/1
Vitamines 163 mg/1
Esters d'acide gras 46 mg/1
Tampon 8 982 mg/1
pH 7,3
Osmolarité 694 mOsm
Viscosité 10 cps (Brookfield, 20 C)
Exemple 5: Le milieu de l'exemple 5 est avantageusement utilisé pour la
déturgescence.
Acide hyal-uronique
de haut poids moléculaire 100 mg/1
Méthylcellulose 2 205 mg/1
Dextran 50 000 mg/1
NaC1 5 585 mg/1
Acides aminés 1 838 mg/1
Oligoéléments 5 390 mg/1
Glucose 4500 mg/1
Hydrates de carbone 1167 mg/1
Nucléosides 10 mg/1
Vitamines 163 mg/1
Esters d'acide gras 46 mg/1
' =
Tampon 8 982 mg/1
pH 7,3
Osmolarité 585 mOsm
Viscosité 10 cps (Brookfield, 20 C)
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Exemple 6: Le milieu de l'exemple 6 est avantageusement utilisé pour la
déturgescence.
Acide hyaluronique
de haut poids moléculaire 160 mg/1
Dextran 50 000 mg/1
NaC1 5 585 mg/1
Acides aminés 1 838 mg/1
Oligoéléments 5 390 mg/1
Glucose 4500 mg/1
Hydrates de carbone 1167 mg/1
Nucléosides 10 mg/1
Vitamines 163 mg/1
Esters d'acide gras 46 mg/1
Tampon 8 982 mg/1
pH 7,3
Osmolarité 595 mOsm
Viscosité 8,5 cps (Brookfield, 20 C)
Exemple 7 : Le milieu de l'exemple 7 est avantageusement utilisé pour la
déturgescence.
Acide hyaluronique
de haut poids moléculaire 160 mg/1
Poloxamer 188 50 000 mg/1
NaC1 5 585 mg/1
Acides aminés 1 838 mg/1
Oligoéléments 5 390 mg/1
Glucose 4500 mg/1
Hydrates de carbone 1167 mg/1
Nucléosides 10 mg/1
Vitamines 163 mg/1
Esters d'acide gras 46 mg,/1
Tampon 8 982 mg,/1
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PH 7,3
Osmolarité 376 mOsm
Viscosité 5 cps (Brookfield, 20 C)
MATERIEL ET METHODE
Déroulement de la conservation
Les cornées humaines scientifiques (dons du corps à la science) sont
prélevées dans les 24 heures suivant le décès du donneur. Les donneurs ne
doivent
pas avoir subi de chirurgie intra oculaire, afin de conserver la comparabilité
des deux
cornées, d'un même donneur. Lors du prélèvement, chaque cornée d'une même
paire
est immergée dans 50 ml d'un milieu de transport. Il s'agit soit du milieu de
référence
(Inosol , Chauvin-Opsia/Baush and Lomb, Toulouse, France) soit d'un milieu
selon
l'invention (exemples 1 à 3). Les flacons étanches contenant les cornées sont
immédiatement placés en étuve sèche à 31 C. Au deuxième jour de conservation
en
oragnoculture, la densité cellulaire endothéliale (DCE) est mesurée selon une
procédure décrite plus loin. La cornée est ensuite replongée dans un nouveau
flacon
de 100 ml du même type de milieu, suspendue à un fil de suture afin d'éviter
les
contact avec les parois et les sédiments déposés au fond du flacon. Au
quatorzième
jour de conservation, les cornées sont transférées dans un nouveau flacon de
100 ml.
Au trentième jour de conservation, durée correspondant au maximum préconisé en
Europe, une nouvelle mesure de la DCE est réalisée et la perte cellulaire
calculée
pour la période dite de conservation. La cornée est ensuite immergée dans 50
ml de
milieu dit "de déturgescence" destiné à réduire son épaisseur. Il s'agit
d'Exosol
(Chauvin-Opsia/Baush and Lomb) ou d'un milieu selon l'invention (exemples 4 à
7)
correspondant avec 50 000 mg/1 de DEXTRAN ou 50 000 mg/1 de Poloxamer 188.
Quarante huit heures après, les deux cornées de la même paire sont
photographiées
posées côte à côte sur un réseau de 8 traits noirs d'épaisseur croissante et
rétro
éclairé. Cette photographie sert à l'appréciation de la transparence
cornéenne.
L'épaisseur cornéenne est mesurée à l'apex par pachymétrie ultrasonore (Tomey
AL-
2000, Tokyo, Japon). Une troisième mesure de la DCE est réalisée, cette fois
après
incubation pendant 45 secondes avec du rouge alizarine (Sigma) 4% dans du
tampon
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phosphate pH 4,5 destiné à colorer les membranes cellulaires. Cette coloration
non
vitale ne peut être utilisée qu'en fin de conservation en raison de sa
toxicité cellulaire.
L'ensemble de la procédure est effectuée à l'aveugle concernant la nature du
milieu de conservation.
5
Procédure de respect de l'analyse en aveugle
Les deux milieux de conservation et de déturgescence sont conditionnés dans
les mêmes contenants (flacon Nalgène 125 ml) et numérotés par une personne ne
prenant part, ni à la conservation, ni aux déterminations de DCE. Un système
de
10 numérotation d'après une liste de randomisation rend non prévisible
l'attribution des
milieux en fonction des numéro portés sur les flacons.
Procédure de mesure de la DCE
Après rinçage de la cornée au BSS ( Balanced Salt Solution , Alcon,
Kaysersberg, France), l'endothélium est recouvert pendant 1 minute par du bleu
15 trypan 0,4% (Sigma), puis rincé pendant 4 minutes avec du chlorure de
sodium 0,9%.
L'endothélium cornéen est alors observé au grandissement x10 sous microscope
optique couplé au prototype d'analyseur de la mosaïque endothéliale décrit par
Gain
P. et al. dans Br J Ophthalmol 2002, 86, pages 306-11 et 531-6. Dix images de
zones
distinctes de l'endothélium sont saisies et archivées sur disque dur pour une
analyse
différée. Cette analyse porte à chaque fois sur plus de 300 cellules.
RESULTATS
Caractéristiques des donneurs
Il s'agit de 6 femmes et 10 hommes dont l'âge est compris entre 57 et 90 ans,
avec un âge moyen de 74,4 ans. Le délai entre décès et prélèvement est compris
entre
4,5 à 44 heures, avec un délai moyen de 20 heures.
Résultats
milieux Exemple 1 (conservation)
Opsia Exemple 4 (déturgescence)
DCE en début de conservation (J2) 1814 1848
DCE en fin de conservation (J30) 1600 1693
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16
perte cellulaire (%) - 11,8 - 8,4
DCE post déturgescence 1300 1542
perte cellulaire post déturgescence (%) -18.7 -8.9
épaisseur cornéenne après
déturgescence (um) 703 717
Perte totale en %: milieux Opsia: 30,5 et milieux des exemples 1 et 4 selon
l'invention : 17,3
milieux Exemple 2 (conservation)
Opsia Exemple 5 (déturgescence)
DCE en début de conservation (J2) 1373 1392
DCE en fin de conservation (J30) 1280 1300
perte cellulaire (%) - 6,8 - 6,7
DCE post déturgescence 980 1163
perte cellulaire post déturgescence (%)
-23,4 -10,5
épaisseur cornéenne après
déturgescence (un) 723 716
Perte totale en %: milieux Opsia: 30,2 et milieux des exemples 2 et 5 selon
l'invention : 17,2
Milieux Exemple 3
Opsia Exemple 6
DCE en début de conservation (J2) 2441 2190
DCE en fin de conservation (J30) 2239 2090
perte cellulaire (%) - 8,3 - 4,6
DCE post déturgescence 1573 2255
perte cellulaire post déturgescence (%) - 29,7 - 3
épaisseur cornéenne après
797 950
déturgescence (um)
Perte totale en %: milieux Opsia: 38 et milieux des exemples 3 et 6 selon
l'invention : 7,6
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Milieux Exemple 3
Opsia Exemple 7
DCE en début de conservation (J2) 2788 2602
DCE en fin de conservation (J30) 2239 2370
perte cellulaire (%) - 29,4 - 8,9
DCE post déturgescence 1928 2088
perte cellulaire post déturgescence (%) - 2,1 - 11,9
épaisseur cornéenne après 755 832
déturgescence (itm)
Perte totale en %: milieux Opsia : 31,5 et milieux des exemples 3 et 7 selon
l'invention : 20,8
DISCUSSION
Au terme de cette étude, les inventeurs ont mis au point un milieu défmi sans
composant d'origine animale capable d'assurer sur 30 jours une survie
endothéliale
significativement supérieure à celle obtenue avec le milieu de référence
utilisé dans
les banques de cornées. Ce point est primordial car un capital supplémentaire
en
cellules endothéliales de près de 16,9% en moyenne est obtenu, ce qui se
traduit par
une amélioration spectaculaire de la qualité de la conservation. Un tel gain
permettrait au receveur d'avoir une réserve endothéliale supérieure à ce qu'il
était
possible de lui assurer jusqu'à présent. Cette réserve signifie pour lui une
meilleure
résistance aux évènements intercurrents (traumatismes, rejets immunologiques,
chirurgie endoculaire) et également un allongement de la durée pendant
laquelle le
greffon reste transparent.
Le poloxamer 188 semble moins cytotoxique que le dextran d'après les
résultats obtenus.
