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GENES IMPLIQUES DANS LA REGULATION DE
L'ANGIOGENESE, PREPARATIONS PHARMACEUTIQUES LES
CONTENANT ET LEURS APPLICATIONS.
La présente invention appartient au domaine des
compositions pharmaceutiques utiles pour le traitement de
pathologies résultant d'une dérégulation du mécanisme de
l'angiogenèse.
Elle concerne en particulier de nouveaux gènes dont la
fonction n'était pas identifiée à ce jour ainsi que des
gènes connus mais dont l'implication dans le mécanisme de
l'angiogenèse a été mis en évidence pour la première fois
par la Demanderesse.
Ces gènes sont identifiés par leurs séquences
nucléotidiques dans le listage de séquences en annexe.
La présente invention concerne également les séquences
polypeptidiques des facteurs codés par lesdits gènes qui
trouvent leur application dans l'étude clinique du processus
de l'angiogenèse, le pronostic, le diagnostic et le
traitement de pathologies liées à ce processus ainsi que
dans la mise en oeuvre des essais pharmacologiques,
pharmacogénomiques, ou pharmacosignalitiques.
L'angiogenèse est un processus fondamental par lequel
de nouveaux vaisseaux sanguins se forment. Ce processus est
essentiel dans plusieurs phénomènes physiologiques normaux
tels que la reproduction, le développement ou encore la
cicatrisation. Dans ces phénomènes biologiques normaux,
l'angiogenèse est sous contrôle strict, c'est-à-dire qu'elle
est déclenchée pendant une période courte, quelques jours,
puis complètement inhibée. Cependant, plusieurs pathologies
sont liées à une angiogenèse invasive et incontrôlée.
L'arthrite, par exemple, est une pathologie due à
l'endommagement des cartilages par les néovaisseaux
invasifs. Dans la rétinopathie diabétique, l'invasion de la
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rétine par les néovaisseaux conduit à l'aveuglement des
malades; la néovascularisation de l'appareil oculaire
présente la cause majeure de l'aveuglement et cette
néovascularisation domine une vingtaine de maladies de
l'oeil. Enfin, la croissance et la métastase des tumeurs sont
directement liées à la néovascularisation et sont
dépendantes de l'angiogenèse. La tumeur stimule la
croissance des néovaisseaux pour sa croissance elle-même. De
plus, ces néovaisseaux présentent les voies d'échappement
des tumeurs pour joindre la circulation sanguine et
provoquer les métastases dans des sites à distance comme le
foie, le poumon ou l'os.
Dans d'autres pathologies telles que les maladies
cardio-vasculaires, les maladies d'artères périphériques,
les lésions vasculaires ou cérébrales, l'angiogenèse peut
présenter une base thérapeutique importante. En effet, la
promotion de l'angiogenèse dans les endroits endommagés peut
conduire à la formation de néovaisseaux sanguins latéraux et
alternatifs aux vaisseaux endommagés fournissant ainsi le
sang et par conséquent l'oxygène et d'autres facteurs
nutritifs et biologiques, nécessaires à la survie des tissus
concernés.
La formation de néovaisseaux par les cellules
endothéliales implique la migration, la croissance, et la
différentiation des cellules endothéliales. La régulation de
ces phénomènes biologiques est directement liée à
l'expression génétique. En matière d'angiogenèse, un nombre
sans cesse grandissant d'études montre que la régulation de
l'angiogenèse se fait à travers un équilibre entre des
facteurs agissant directement sur la cellule endothéliale.
Ces facteurs peuvent être stimulants, d'une part, tels que,
entre autres, le VEGF, le FGFs, l'IL-8, le HGF/SF, le PDGF.
Ils peuvent aussi être inhibants, comme, entre autres, l'IL-
10, l'IL-12, le gro-a et (3, le facteur plaquettaire 4,
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l'angiostatine, l'inhibiteur dérivé de chondrocyte humaine,
la thrombospondine, le facteur inhibiteur de la
leucémie.(Jensen, Surg. Neural., 1998, 49, 189-195 ;
Tamatani et al., Carcinogenesis, 1999, 20, 957-962 ; Tanaka
et al., Cancer Res., 1998, 58, 3362-3369 ; Ghe et al.,
Cancer Res., 1997, 57, 3733-3740 ; Kawahara et al.,
Hepatology, 1998, 28, 1512-1517 ; Chandhuni et al., Cancer
Res., 1997, 57, 1814-1819 ; Jendraschak et Sage, Semin.
Cancer Biol., 1996, 7, 139-146 ; Majewski et al., J. Invest.
Dermatol., 1996, 106, 1114-1119).
Le contrôle de l'angiogenèse représente donc un axe
stratégique, à la fois de recherche fondamentale, afin
d'améliorer notre compréhension des nombreux phénomènes
pathologiques liés à l'angiogenèse, mais aussi une base pour
l'élaboration des nouvelles thérapies destinées à traiter
les pathologies liées à l'angiogenèse.
Afin de contrôler l'angiogenèse, plusieurs groupes
pharmaceutiques ont développé des stratégies thérapeutiques
basées directement sur l'utilisation de signaux paracrines,
les facteurs stimulateurs et inhibiteurs, comme agents pour
promouvoir ou inhiber l'angiogenèse. Ces stratégies sont
basées essentiellement sur l'utilisation de ces facteurs
sous leur forme polypeptidique comme agents stimulateurs ou
inhibiteurs de l'angiogenèse, ou encore plus récemment sous
la forme de vecteurs d'expression codant pour les facteurs
choisis.
Un procédé permettant l'identification de nouveaux
gènes impliqués dans la régulation de l'angiogenèse a été
mis au point. Il a fait l'objet d'une demande de brevet
français publiée sous le n FR 2798674 et d'une demande de
brevet internationale PCT publiée sous le n WO 01/218312.
Cette méthode a la particularité de traduire fidèlement le
mécanisme intime régulant l'angiogenèse en prenant en compte
tous les facteurs extracellulaires décrits comme agents
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régulateurs de l'angiogenèse, c'est-à-dire les facteurs
angiogéniques, les facteurs angiostatiques, ainsi que les
différents composants de la matrice extracellulaire. Cette
méthodologie consiste à mettre en oeuvre ces différents
facteurs extracellulaires à travers quatre conditions
expérimentales bien définies. Les cellules endothéliales
sont cultivées sur une composante et/ou un mélange bien
défini de plusieurs composantes de la matrice
extracellulaire et placées sous les quatre conditions
expérimentales à savoir :
- une condition contrôle où les cellules endothéliales
ne sont pas stimulées ;
- une condition angiogénique où les cellules
endothéliales sont stimulées par un ou plusieurs
facteurs angiogéniques ;
- une condition d'inhibition de l'angiogenèse où les
cellules endothéliales sont stimulées par un ou
plusieurs facteurs angiogéniques et mises en
présence d'un ou plusieurs facteurs angiostatiques ;
et
- une autre condition de contrôle où les cellules
endothéliales sont stimulées par un ou plusieurs
facteurs angiostatiques.
Ces quatre conditions permettent d'obtenir des
préparations d'ARNm spécifiques de l'angiogenèse à savoir de
l'état angiogénique et/ou l'inhibition de l'angiogenèse et
permettent de déceler les gènes codant pour les constituants
cellulaires impliqués dans la régulation de l'angiogenèse,
incluant des régulateurs positifs et des régulateurs
négatifs.
Donc, le procédé ci-dessus décrit permet le criblage
systématique de tous les facteurs angiogéniques et
angiostatiques ainsi que des différentes composantes de la
matrice extracellulaire dans le but de mettre en évidence et
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identifier les gènes codant pour les constituants
cellulaires impliqués dans la régulation de l'angiogenèse.De
plus, étant donné que l'expression génique peut être
analysée tout au long de la cinétique de la formation des
5 néovaisseaux par les cellules endothéliales, cette approche
constitue une méthodologie in vitro permettant de relier
l'expression génique aux paramètres fonctionnels biologiques
de l'angiogenèse.
L'identification des 34 gènes rapportés ci-dessous a
été effectuée selon la méthodologie décrite ci-dessus, en
utilisant les facteurs angiogéniques et angiostatiques,
ainsi que le collagène type I comme composant de la matrice
extracellulaire pour reproduire les quatre conditions
expérimentales.
La Demanderesse a par ailleurs prouvé l'implication de
ces 34 nouveaux gènes identifiés par les séquences SEQ ID
No. : 1 à SEQ ID No. : 34 dans la liste de séquences en
annexe, dans le mécanisme de régulation de l'angiogenèse.
Ainsi l'invention concerne une molécule d'acide
nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend ou qu'elle
consiste en
i) une des séquences nucléotidiques identifiées dans la
liste de séquences fournie en annexe sous les
numéros SEQ ID n 1, 2, 4, 5, 9 à 11, 13, 17 à 19,
27 à 29 et 34 ou son complémentaire ou un fragment
desdites séquences ou une séquence équivalente ;
ii) une séquence antisens de l'une des séquences de i),
identifiées dans la liste de séquences fournie en
annexe sous les numéros SEQ ID 62, 63, 65, 67, 69,
73, 74, 81, 82 et 85 ou son complémentaire ou un
fragment desdites séquences ou une séquence
équivalente ;
iii) la séquence antisens identifiée dans la liste de
séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID
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N 86 ou son complémentaire ou un fragment de ladite
séquence ou une séquence équivalente.
Au sens de la présente invention, doivent être
considérées comme des séquences équivalentes aux séquences
ci-dessus décrites, des séquences nucléotidiques présentant
une ou des modification(s) structurelle(s), mineure(s), ne
modifiant pas leur fonction, telle(s) que délétion, mutation
ou addition de bases, dont l'identité est d'au moins de 90%
avec les séquences nucléotidiques identifiées sous les
numéros SEQ ID No. : 1 à 34 dans la liste de séquences en
annexe.
Au sens de la présente invention, on entend par
fragment une séquence de type 10mers, de préférence de type
15mers et de manière particulièrement préférée de type
20mers.
L'intérêt de toutes les séquences décrites dans le
présent texte, réside dans le fait qu'un antisens de ces
séquences, lorsque qu'il est introduit dans une cellule,
influence les phénomènes de l'angiogenèse, c'est-à-dire que
son introduction dans la cellule conduit à une activation ou
une inhibition de l'angiogenèse.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un
polypeptide ou fragment dudit polypeptide, caractérisé en ce
qu'il est codé par une des séquences nucléotidiques
identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe
sous les numéros SEQ ID n 1, 4, 5, 13, 17, 18, 19 et 29.
Sous une forme de mise en oeuvre particulière de
l'invention, ledit polypeptide comprend ou consiste en une
des séquences polypeptidiques identifiées dans la liste de
séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 35,
37, 38, 43, 47, 48, 49 ou 57.
Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet
un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend
i) une molécule d'acide nucléique telle que décrite
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précédemment;
ii) une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce
qu'elle comprend ou qu'elle consiste en
a) une des séquences nucléotidiques identifiées
dans la liste de séquences fournie en annexe
sous les numéros SEQ ID n 3, 6, 7, 8, 12, 14 à
16, 20 à 26 et 30 à 33 ou son complémentaire ou
un fragment desdites séquences ou une séquence
équivalente;
b) une séquence antisens de l'une des séquences de
a), identifiées dans la liste de séquences
fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 64,
66, 67, 68, 70 à 72, 75 à 81 et 84 ou son
complémentaire ou un fragment desdites séquences
ou une séquence équivalente ;
c) la séquence antisens identifiée dans la liste de
séquence fournie en annexe sous le numéro SEQ ID
n 86 ou son complémentaire ou un fragment de
ladite séquence ou une séquence équivalente.
Plus particulièrement ledit vecteur est choisi parmi le
groupe de vecteurs GS-V1 à GS-V23, identifiés par leur
séquence, portant les numéros SEQ ID N 87 à SEQ ID N 109
dans la liste de séquences en annexe.
Lesdits vecteurs peuvent être construits par toute
méthode connue de l'homme du métier. Particulièrement on
citera la méthode décrite dans la demande de brevet WO
03/074073 avec les séquences amorces, décrites dans ce
brevet, GS-PGS-F et GS-PGM-R pour des fragments clonés en
orientation sens dans le plasmide bactérien, soit les
amorces GS-PGS-F et GS-PGM-R pour des fragments clonés en
orientation sens dans le plasmide bactérien.
Ces constructions sont utiles d'une part pour préparer
des compositions thérapeutiques destinées au traitement, par
thérapie cellulaire, de désordres angiogéniques et d'autre
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part pour vérifier l'efficacité d'un traitement d'un
désordre angiogénique chez un mammifère, notamment chez un
être humain, ou encore pour vérifier la fonctionnalité des
gènes éventuellement impliquées dans le mécanisme de
l'angiogenèse, dans ledit mammifère.
Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un
anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité pour une
des séquences polypeptidiques codées par une des séquences
nucléotidiques identifiées dans la liste de séquences
fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1 à 34, ou un
fragment desdites séquences, particulièrement codées par une
des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste de
séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n 1, 4,
5, 13, 17, 18, 19 et 29 ou un fragment desdites séquences,
ou ayant une affinité pour un polypeptide comprenant ou
consistant en une des séquences polypeptidiques identifiées
dans la liste de séquences fournie en annexe sous les
numéros SEQ ID N 35 à 61, ou un fragment desdites
séquences, particulièrement pour un polypeptide comprenant
ou consistant en une des séquences polypeptidiques
identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe
sous les numéros SEQ ID n 35, 37, 38, 43, 47, 48, 49 ou 57
ou un fragment desdites séquences.
Lesdits anticorps peuvent être obtenus par toute
méthode d'immunisation in vivo ou in vitro, d'un animal,
notamment d'un vertébré et de préférence d'un mammifère avec
l'une quelconque des séquences polypeptidiques selon
l'invention, ou l'un de leurs fragments conservant
l'immunogénicité de la protéine totale.
Les anticorps peuvent être des anticorps polyclonaux ou
monoclonaux. (Kohler G. and Milstein C. Nature. 1975 Aug
7;256(5517):495-7.)
L'introduction desdites séquences nucléotidiques
identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les
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numéros SEQ ID No. 1 à 34 et SEQ ID No. 62 à 86 (sens et
antisens) ou desdits vecteurs identifiés dans la liste de
séquences en annexe sous les numéros SEQ ID N 87 à SEQ ID
N 109 ou de l'un de leurs homologues, et l'insertion
ultérieure desdits vecteurs dans des cellules de mammifère
permet l'obtention de lignées cellulaires sur-exprimant ou
sous-exprimant les gènes intervenant dans le mécanisme de
l'angiogenèse.
Ainsi, selon encore un autre aspect, l'invention
concerne une cellule génétiquement modifiée, caractérisée en
ce qu'elle sur-exprime ou sous-exprime au moins un gène
impliqué dans l'angiogenèse choisi parmi les gènes
identifiés dans la liste de séquences en annexe sous les
numéros SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 34, particulièrement les
gènes identifiés dans la liste de séquences en annexe sous
les numéros SEQ ID No. n 1, 2, 4, 5, 9 à 11, 13, 17 à 19,
27 à 29 et 34.
Lesdites cellules génétiquement modifiées peuvent être
construites par toute méthode connue de l'Homme du Métier.
Particulièrement, elles peuvent être construites par la
méthode décrite dans la demande de brevet WO 03/074073 et
qui comprend :
(a) l'introduction d'un gène de résistance à au moins
un antibiotique dans ladite cellule génétiquement
modifiée,
(b) la culture des cellules obtenues à l'étape (a) en
présence dudit antibiotique,
(c) la sélection des cellules viables.
Selon encore un autre aspect, l'invention a pour objet
l'utilisation à titre de médicament d'une molécule d'acide
nucléique, d'un polypeptide, d'un vecteur d'expression, d'un
anticorps, ou d'une cellule génétiquement modifiée tels que
décrits précédemment.
Selon encore un autre aspect, l'invention concerne une
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composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent actif
au moins une substance choisie parmi :
i) une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce
qu'elle comprend ou qu'elle correspond à
5 a) une des séquences nucléotidiques identifiées
dans la liste de séquences fournie en annexe
sous les numéros SEQ ID n 1 à 34 ou son
complémentaire ou un fragment desdites
séquences ou une séquence équivalente ;
10 b) une séquence antisens de l'une des séquences de
a), identifiées dans la liste de séquences
fournie en annexe sous les numéros SEQ ID n
64, 66, 67, 68, 70 à 72, 75 à 81 et 84, ou son
complémentaire ou un fragment desdites
séquences ou une séquence équivalente ;
c) la séquence antisens identifiée dans la liste
de séquence fournie en annexe sous le numéro
SEQ ID n 86 ou son complémentaire ou un
fragment de ladite séquence ou une séquence
équivalente.
ii) un polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par
une des séquences nucléotidiques identifiées dans
la liste de séquences fournie en annexe sous les
numéros SEQ ID n 1 à 34 ou qu'il comprend ou
consiste en un polypeptide identifié dans la liste
de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ
ID n 35 à 61 ou un fragment desdits polypeptides ;
iii) un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il
comprend une molécule d'acide nucléique selon i) de
la présente revendication ;
iv) un anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité
pour une des séquences polypeptidiques identifiées
dans la liste de séquences fournie en annexe sous
les numéros SEQ ID n 35 à 61 ou pour l'une des
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séquences codées par les séquences en acide
nucléiques identifiées dans la liste de séquence
fournie en annexe sous les n SEQ ID N 2, 9 à 11,
27, 28 et 34;
v) une cellule génétiquement modifiée caractérisée en
ce qu'elle sur-exprime ou sous-exprime au moins un
gène choisi parmi ceux identifiés dans la liste de
séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à
34.
Particulièrement, la composition pharmaceutique selon
l'invention, peut être destinée au diagnostic, au pronostic
et/ou au traitement de pathologies liées à l'angiogenèse.
Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, la
composition pharmaceutique peut être destinée au traitement
des pathologies liées à l'angiogenèse choisie parmi: les
cancers, particulièrement au travers de la vascularisation
et/ou de la proliférations des tumeurs, les rétinopathies,
l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn,
l'athérosclérose, l'hyperstimulation de l'ovaire, le
psoriasis, l'endométrie associée à la néovascularisation, la
resténose due à l'angioplastie du ballon, la superproduction
tissulaire due à la cicatrisation, la maladie vasculaire
périphérique, l'hypertension, l'inflammation vasculaire, la
maladie et les phénomènes de Raynaud, l'anévrisme, la
resténose artérielle, la thrombophlébite, la lymphagyte, le
lymphodème, la cicatrisation et la réparation tissulaire,
l'ischémie, l'angine, l'infarctus de myocarde, la maladie
chronique du caeur, les insuffisances cardiaques telles que
l'insuffisance cardiaque congestive, la dégénération
maculaire liée à l'âge et l'ostéoporose.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet
l'utilisation dans la préparation d'une composition
pharmaceutique destinée à inhiber l'angiogenèse,
caractérisée en ce qu'elle comprend un agent actif
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inhibiteur de l'angiogenèse choisi parmi :
i. une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce
qu'elle comprend ou qu'elle correspond à
a. une séquence nucléotidique identifiée dans la
liste de séquences fournie en annexe sous les
numéros SEQ ID n 4 ou 5 ou un fragment de
ladite séquence ou une séquence équivalente;
b. une séquence antisens des séquences
nucléotidiques identifiées dans la liste de
séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ
ID n 1 à 3, 6 à 34, séquences nucléotidiques
identifiées dans la liste de séquences fournie
en annexe sous le numéro SEQ ID n 62 à 64 ou
66 à 85 ou un fragment de ladite séquence ou
une séquence équivalente ;
c. ou la séquence antisens identifiée dans la
liste de séquences fournie en annexe sous le n
SEQ ID N 86 ou un fragment de ladite séquence
ou une séquence équivalente ;
ii. un polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par
une séquence nucléotidique identifiée dans la liste
de séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ ID
n 4 ou 5 ou qu'il comprend ou consiste en un
polypeptide identifié dans la liste de séquences
fournie en annexe sous le numéro SEQ ID n 37 ou 38
ou un fragment desdits polypeptides ;
iii. un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il
comprend une molécule d'acide nucléique selon i) de
la présente revendication ;
iv. un anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité
pour l'une des séquences polypeptidiques identifiées
dans la liste de séquences fournie en annexe sous les
numéros SEQ ID n 37 ou 38 ou un fragment desdits
polypeptides ;
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v. une cellule génétiquement modifiée caractérisée en ce
qu'elle sur-exprime au moins le gène identifié dans
la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID
No. 4 ou 5 ou qu'elle sous-exprime au moins un gène
choisi parmi ceux identifiés dans la liste de
séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No. 1 à 3
et 6 à 34.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet
l'utilisation dans la préparation d'une composition
pharmaceutique destinée à activer l'angiogenèse,
caractérisée en ce qu'elle comprend un agent actif
activateur de l'angiogenèse choisi parmi :
i) une molécule d'acide nucléique caractérisée en ce
qu'elle comprend ou qu'elle correspond à
a) une des séquences nucléotidiques identifiées
dans la liste de séquences fournie en annexe
sous les numéros SEQ ID n 1 à 3 ou 6 à 34 ou
un fragment de ladite séquence ou une séquence
équivalente ;
b) la séquence antisens de l'une des séquences
nucléotidiques identifiées dans la liste de
séquences fournie en annexe sous le numéro SEQ
ID n 4 ou 5, séquence identifiée dans la liste
de séquences fournie en annexe sous le numéro
SEQ ID n 65, ou un fragment de ladite séquence
ou une séquence équivalente ;
ii) au moins un polypeptide caractérisé en ce qu'il est
codé par une des séquences nucléotidiques
identifiées dans la liste de séquences fournie en
annexe sous le numéro SEQ ID n 1 à 3 ou 6 à 34 ou
qu'il comprend ou consiste en un des polypeptides
identifiés dans la liste de séquences fournie en
annexe sous les numéros SEQ ID n 35, 36, 39 à 61 ou
un fragment desdits polypeptides ;
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iii) un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il
comprend une molécule d'acide nucléique selon i) de
la présente revendication ;
iv) un anticorps caractérisé en ce qu'il a une affinité
pour la séquence polypeptidique identifiée dans la
liste de séquences fournie en annexe sous les
numéros SEQ ID n 35, 36, 39 à 61 ou un fragment
desdits polypeptides ;
v) une cellule génétiquement modifiée caractérisée en
ce qu'elle sur-exprime au moins un gène choisi parmi
ceux identifiés dans la liste de séquences en annexe
sous les numéros SEQ ID No. 1 à 3 et 6 à 34 ou
qu'elle sous-exprime un gène ou sous-exprime au
moins le gène identifié dans la liste de séquences
en annexe sous le numéro SEQ ID No. 4 ou 5.
Selon un aspect particulier, un autre objet de
l'invention concerne toute séquence d'acides nucléiques
(sous forme d'ADN ou d'ARN), comprenant ou consistant en au
moins 10 mers d'une séquence nucléotidique choisie parmi les
séquences identifiées par les numéros SEQ ID No. 1 à SEQ ID
No. 34 dans la liste de séquences en annexe, ou
complémentaire d'une telle séquence, de préférence au moins
15 mers.
Tout préférentiellement l'invention a pour objet les
séquences ayant une identité d'au moins 85%, de préférence
de 95% et de manière particulièrement préférée de 100% avec
une séquence choisie parmi les séquences identifiées sous
les numéros SEQ ID N 62 à SEQ ID N 86 dans la liste de
séquences en annexe.
L'invention concerne en particulier le RNAi (ARN
interfêrence) et plus spécifiquement un siRNA (small
interfering RNA) comprenant ou consistant en une séquence
nucléotidique double brin sous forme d'ARN, d'au moins 10
mers, complémentaire d'un ARNm correspondant à l'une des
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séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID
No : 1 à SEQ ID No : 34.
Ainsi l'invention a pour objet l'utilisation d'un tel
siRNA d'au moins 10 mers, de préférence d'au moins 15 mers
5 comprenant ou consistant en un ARN complémentaire d'une des
séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID
No : 1 à SEQ ID No : 34 dans la liste de séquences en annexe
pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de
pathologies liées à l'angiogenèse.
10 La présente invention concerne également une méthode de
diagnostic d'une pathologie angiogénique chez un mammifère,
notamment chez un être humain, consistant à détecter dans
les cellules dudit mammifère la surexpression ou la sous-
expression d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques
15 identifiées par les numéros SEQ ID N 1 à SEQ ID N 34 dans
la liste de séquences en annexe.
Une telle méthode de diagnostic comprend les étapes
suivantes :
- la détection de l'expression d'une ou plusieurs
desdites séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à SEQ ID N 34,
par une population cellulaire d'un mammifère,
- la détection de l'expression de celle(s) même(s)
séquence(s) par une population cellulaire de référence dont
l'état angiogénique est connu,
- l'identification des différences éventuelles du
niveau d'expression de celle(s) même(s) séquence(s) par les
deux populations cellulaires.
La présente invention concerne également une méthode de
diagnostic et de pronostic d'une pathologie angiogénique
chez un mammifère, notamment chez un être humain, consistant
à détecter dans les cellules dudit mammifère la
surexpression ou la sous-expression d'une ou plusieurs
séquences polypeptidiques identifiées par les numéros SEQ ID
No. : 35 à SEQ ID No. : 61 dans la liste de séquences en
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annexe.
Selon un mode de mise en aeuvre préféré, ladite méthode
comporte les étapes suivantes :
a) la détection de l'expression d'une ou plusieurs
desdites séquences polypeptidiques SEQ ID No. : 35 à SEQ ID
No. : 61 par une population cellulaire d'un mammifère,
b) la détection de l'expression de celle(s) même(s)
séquence(s) polypeptidique(s) par une population cellulaire
de référence dont l'état angiogénique est connu,
c) l'identification des différences éventuelles du
niveau d'expression de celle(s) même(s) séquence(s)
polypeptidique(s) par les deux populations cellulaires.
Selon un mode particulier de mise en oeuvre, dans la
méthode de diagnostic de l'invention la détection de
l'expression des séquences est effectuée après avoir mis les
cellules endothéliales en présence d'un fluide biologique
issu d'un patient.
La présente invention concerne également une méthode de
vérification de l'efficacité thérapeutique d'un traitement
angiogénique chez un mammifère, notamment chez un être
humain, caractérisée en ce qu'elle comporte l'identification
in vit.r-o dans une population cellulaire dudit mammifère,
de la surexpression ou de la sous-expression d'au moins un
gène impliqué dans un désordre angiogénique identifié par
une des séquences nucléotidiques identifiées dans la liste
de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ ID N 1
à SEQ ID N 34.
Une telle méthode de vérification de l'efficacité
thérapeutique comprend les étapes suivantes :
- la détection de l'expression par une population
cellulaire isolée d'un mammifère auquel est
administrée une composition thérapeutique destinée à
traiter un désordre angiogénique, d'au moins une des
séquences nucléotidiques identifiées dans la liste
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de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ
ID N 1 à SEQ ID N 34 ;
- la détection de l'expression ladite séquence
nucléotidique par une population cellulaire de
référence dont l'état angiogénique est connu,
- l'identification d'une éventuelle différence du
niveau d'expression de ladite séquence par les deux
populations cellulaires.
Selon des modes de réalisation préférés, la méthode de
vérification est effectuée sur une population cellulaire
d'un mammifère in vivo, ex-vivo, ou bien sur une population
cellulaire isolée dudit mammifère in vitro
Selon un mode particulier de mise en oeuvre, dans la
méthode de vérification de l'invention la détection de
l'expression des séquences est effectuée après avoir mis les
cellules, particulièrement les cellules endothéliales, en
présence d'un fluide biologique issu d'un patient.
La présente invention concerne également une méthode de
criblage de composés utiles pour le traitement angiogénique
d'un mammifère, notamment d'un être humain.
Selon un mode de mise en aeuvre préféré, une telle
méthode de criblage comprend les étapes suivantes :
a) la détection de l'expression par une population
cellulaire isolée d'un mammifère mise en
présence d'un composé susceptible d'avoir un
effet thérapeutique sur un désordre
angiogénique, d'au moins une des séquences
nucléotidiques identifiées dans la liste de
séquences fournie en annexe sous les numéros
SEQ ID N 1 à SEQ ID N 34,
b) la détection de l'expression de la même
séquence nucléotidique par une population
cellulaire de référence dont l'état
angiogénique est connu,
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c) l'identification des différences éventuelles du
niveau d'expression de(s) celle(s) même(s)
séquences nucléotidiques par les deux
populations cellulaires.
Selon un autre mode de mise en aeuvre préféré, une telle
méthode de criblage comprend également les étapes
suivantes :
- la détection de l'expression d'une ou plusieurs
desdites séquences polypeptidiques identifiées par les
numéros SEQ ID No. : 35 à SEQ ID No. : 61 dans la liste de
séquences en annexe par une population cellulaire mise en
présence d'un composé susceptible d'avoir un effet
thérapeutique sur un désordre angiogénique,
- la détection de l'expression de celle ou celles mêmes
séquences polypeptidiques par une population cellulaire de
référence dont l'état angiogénique est connu,
- l'identification des différences éventuelles du
niveau d'expression de celle(s) même(s) séquence(s)
polypeptidique(s) par les deux populations cellulaires.
Selon un mode particulier de mise en oeuvre, dans la
méthode de criblage de l'invention la détection de
l'expression des séquences est effectuée après avoir mis les
cellules, particulièrement les cellules endothéliales en
présence d'un fluide biologique issu d'un patient.
Parmi les désordres angiogéniques, susceptibles d'être
diagnostiqués ou traités avec les compositions
pharmaceutiques de l'invention on peut citer : les cancers,
particulièrement au travers de la vascularisation et/ou de
la proliférations des tumeurs, les rétinopathies, l'arthrite
rhumatoïde, la maladie de Crohn, l'athérosclérose,
l'hyperstimulation de l'ovaire, le psoriasis, l'endométrie
associée à la néovascularisation, la resténose due à
l'angioplastie du ballon, la superproduction tissulaire due
à la cicatrisation, la maladie vasculaire périphérique,
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l'hypertension, l'inflammation vasculaire, la maladie et les
phénomènes de Raynaud, l'anévrisme, la resténose artérielle,
la thrombophlébite, la lymphagyte, le lymphodème, la
cicatrisation et la réparation tissulaire, l'ischémie,
l'angine, l'infarctus de myocarde, la maladie chronique du
caeur, les insuffisances cardiaques telles que l'insuffisance
cardiaque congestive, la dégénération maculaire liée à l'âge
et l'ostéoporose.
L'invention a également pour objet un dispositif
comprenant un support comprenant une ou plusieurs sondes
spécifiques d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques
identifiées sous les numéros SEQ ID No : 1 à SEQ ID No: 34
dans la liste de séquences en annexe pour la mise en oeuvre
de la méthode de criblage de l'invention, particulièrement
d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques identifiées dans
la liste de séquences fournie en annexe sous les numéros SEQ
ID n 1, 4, 5, 13, 17, 18, 19 et 29 ou son complémentaire
ou un fragment desdites séquences.
Dans le cadre de la présente invention on entend par
sonde tout fragment d'ADN simple brin dont la séquence est
complémentaire à une séquence recherchée : celle-ci pourra
par exemple ainsi être décelée par hybridation avec une
sonde marquée (par exemple par incorporation d'atomes
radioactifs ou de groupements fluorescents), qui joue le
rôle d'un "hameçon" moléculaire.
Selon des modes de mise en aeuvre préférés, le support
dudit dispositif est choisi parmi une membrane de verre, une
membrane métallique, une membrane polymère, une membrane de
silice.
De tels dispositifs sont par exemple des puces à ADN
comprenant une ou plusieurs séquences nucléotidiques
identifiées sous les numéros SEQ ID No : 1 à SEQ ID No: 34
dans la liste de séquences en annexe.
L'invention a aussi pour objet une trousse destinée à
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la mesure de l'affichage différentiel de gènes impliqués
dans des désordres angiogéniques comprenant un dispositif
tel que précédemment décrit, des amorces spécifiques et les
accessoires nécessaires à l'amplification des séquences
5 extraites d'un échantillon, leur hybridation avec les sondes
du dispositif et la réalisation des mesures de l'affichage
différentiel.
L'invention a aussi pour objet une trousse destinée à
la mesure de l'affichage différentiel de gènes impliqués
10 dans des désordres angiogéniques comprenant une lignée de
cellules génétiquement modifiées exprimant de manière stable
le vecteur exprimant au moins une des séquences
nucléotidiques identifiées sous les numéros SEQ ID No : 1 à
SEQ ID No: 34 dans la liste de séquences en annexe, ou un de
15 leurs fragments en tant que population cellulaire de
référence et les moyens nécessaires pour la mesure dudit
affichage différentiel.
L'invention a aussi pour objet une trousse destinée à
la mesure de l'affichage différentiel de gènes impliqués
20 dans des désordres angiogéniques comprenant une lignée de
cellules génétiquément modifiées exprimant de manière stable
le vecteur exprimant au moins une séquence antisens d'une
des séquences nucléotidiques identifiées sous les numéros
SEQ ID No : 1 à SEQ ID No: 34 dans la liste de séquences en
annexe, ou un de leurs fragments, en tant que population
cellulaire de référence et les moyens nécessaires pour la
mesure dudit affichage différentiel.
La vérification de l'implication des 34 gènes
identifiés et de leurs homologues dans le mécanisme de
l'angiogenèse a été effectuée selon la méthodologie décrite
dans la section Matériel et méthodes.
Cette implication est illustrée à l'aide des figures 1
â 11 en annexe, dans lesquelles :
La figure 1 montre que l'expression de GS-V1, GS-V2,
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GS-V3 et GS-V5 dans les cellules endothéliales humaines
inhibe la formation des tubes capillaires et que
l'expression de GS-V4 chez les cellules endothéliales
humaines stimule la formation des tubes capillaires :
cellules endothéliales transfectées avec 1A) GS-V1 codant
pour le transcrit antisens spécifique de GS-N1; 1B) GS-V2
codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N2; 1C)
GS-V3 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N3;
1D) GS-V4 codant pour le transcrit antisens spécifique de
GS-N4 et son homologue GS-N5; lE) GS-V5 codant pour le
transcrit antisens spécifique de GS-N6 et son homologue GS-
N7, et le transcrit antisens spécifique de GS-N8 et ses
homologues GS-N9, GS-N10 et GS-N11; 1F) le vecteur vide
(Contrôle).
La figure 2 montre que l'expression de GS-V6, GS-V7,
GS-V8, GS-V9 et GS-V10 chez les cellules endothéliales
humaines inhibe la formation des tubes capillaires :
cellules endothéliales transfectées avec 2A) GS-V6 codant
pour le transcrit antisens spécifique de GS-N12; 2B) GS-V7
codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N13; 2C)
GS-V8 codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-
N14; 2D) GS-V9 codant pour le transcrit antisens spécifique
de GS-N15; 2E) GS-V10 codant pour le transcrit antisens
spécifique de GS-16; 2F) le vecteur vide (Contrôle).
La figure 3 montre que l'expression de GS-V11, GS-V12,
GS-V13, GS-V14, GS-V15, chez les cellules endothéliales
humaines inhibe la formation des tubes capillaires :
cellules endothéliales transfectées avec 3A) GS-V11 codant
pour le transcrit antisens spécifique de GS-N17; 3B) GS-V12
codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N18 et
son homologue GS-N19; 3C) GS-V13 codant pour le transcrit
antisens spécifique de GS-N20; 3D) GS-V14 codant pour le
transcrit antisens spécifique de GS-N21; 3E) GS-V15 codant
pour le transcrit antisens spécifique de GS-N22; 3F) le
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vecteur vide (Contrôle).
La figure 4 montre que l'expression de GS-V16, GS-V17,
GS-V18, GS-V19, GS-V20 chez les cellules endothéliales
humaines inhibe la formation des tubes capillaires :
cellules endothéliales transfectées avec 4A)GS-V16 codant
pour le transcrit antisens spécifique de GS-N23; 4B)GS-V17
codant pour le transcrit antisens spécifique de GS-N24;
4C)GS-V18 codant pour le transcrit antisens spécifique de
GS-N25; 4D)GS-V19 codant pour le transcrit antisens
spécifique de GS-N26 et ses homologues GS-N27 et GS-N28;
4E)GS-V20 codant pour le transcrit antisens spécifique de
GS-N29 et 4F) le vecteur vide (Contrôle).
La figure 5 montre que l'expression de GS-V21, GS-V22,
GS-V23 chez les cellules endothéliales humaines inhibe la
formation des tubes capillaires : cellules endothéliales
transfectées avec 5A)GS-V21 codant pour le transcrit
antisens spécifique de GS-N30; 5B)GS-V22 codant pour le
transcrit antisens spécifique de GS-N31, et ses homologues
GS-N32 et GS-N33; 5C)GS-V23 codant pour le transcrit
antisens spécifique de GS-N34; 5D)le vecteur vide
(Contrôle).
MATERIEL ET METHODES
1.Culture des cellules et test d'angiogenèse
Des cellules endothéliales de veines ombilicales
(HUVEC) sous lesdites quatre conditions de culture sont
alors utilisées pour identifier les gènes codant pour les
constituants cellulaires impliqués dans la régulation de
l'angiogenèse.
Les cellules endothéliales sont maintenues en milieu
complet (EGM-2 de Clonetics).
Pour l'identification des gènes impliqués dans
l'angiogenèse dans les test in vitro de l'angiogenèse selon
le modèle de Montesano et al.(1986, Proc Natl Acad Sci U S
A, 83(19):7297-301). Les cellules sont tout d'abord
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ensemencées sur un gel de Collagène type I en milieu complet
jusqu'à confluence. Puis, les cellules HUVEC de référence
sont cultivées en milieu appauvri en sêrum et sans facteurs
de croissance : EBM-2 + 2% de sérum et différents facteurs
sont ajoutés dans les conditions test.
Le FGF2 : à des concentrations comprises entre 5 ng/ml
et 60 ng/ml, de préférence entre 10 et 40 ng/ml ; du VEGF :
à des concentrations comprises entre 10 ng/ml et 60 ng/ml,
de préférence comprises entre 30 ng/ml et 50 ng/ml ; du
PF4 : à de concentrations comprises entre 0,1 et 5Mg/ml, de
préférence comprises entre 0,5 pg/ml et 1,ug/ml ; du TNF-a à
des concentrations comprises entre 20 ng/ml et 100 ng/ml, de
préférence comprises entre 30 ng/ml et 60 ng/ml ; du IFN-y :
à des concentrations comprises entre 50 ng/ml et 200 ng/ml,
de préférence comprises entre 80 ng/ml et 120 ng/ml ; de
l'Ang-2 : à des concentrations comprises entre 20 ng/ml et
800 ng/ml, de préférence comprises entre 200 ng/ml et
400ng/ml ;
Les cellules endothéliales humaines placées sous les
quatre conditions de culture précitées sont alors utilisées
pour identifier des gènes codant pour les constituants
cellulaires impliqués dans la régulation de l'angiogenèse.
2. Facteurs angiogéniques et angiostatiques.
Des facteurs angiogéniques et angiostatiques, ayant un
effet sur l'expression des gènes identifiés en corrélation
avec la formation de néovaisseaux ou l'inhibition de
néovaisseaux respectivement, utilisés, à titre d'exemple,
dans le cadre de la présente invention, sont illustrés ci-
dessous.
VEGF = Facteur de croissance endothélial vasculaire.
FGF2 = Facteur de croissance basique du fibroblaste.
PF4 = Facteur plaquettaire 4.
Ang-2 = Angiopoiètine 2
IFN-y = Interféron gamma.
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TNF-a = Facteur de nécrose tumorale alpha
Le TNF-a qui est un régulateur de l'angiogenèse, il
peut induire l'angiogenèse in vivo mais également inhiber la
formation des vaisseaux in vitro (Frater-Schroder et ai,
1987 , Proc Natl Acad Sci U S A,84(15):5277-81; Fajardo et
al, 1992, Am J Pathol Mar,140(3):539-44; Niida et al, 1995,
Neurol Med Chir (Tokyo),35(4):209-14. Dans notre modèle
d'angiogenèse in vitro, le TNF-a est utilisé dans des
conditions d'inhibition de l'angiogenèse.
3. Comparaison des expressions géniques.
Les expressions géniques peuvent être alors comparées
en utilisant les puces d'ADN, le SAGE, une réaction
d'amplification par PCR quantitative, les vecteurs viraux
pour construire des banques soustractives, ou encore
l'analyse par affichage différentiel.
Dans le cadre des travaux expérimentaux ayant conduit à
la présente invention, la Demanderesse a utilisé
préférentiellement la technique d'affichage différentiel
pour l'identification desdits gènes.
Affichage différentiel
Les ARN totaux sont préparés à partir des cellules
HUVEC cultivées sur un gel de collagène en présence des
différents facteurs utilisés, selon la méthode RNeasy Mini
kit (Qiagen) en intégrant une étape de digestion à la DNase
I selon le protocole préconisé par le fabricant.
L'affichage différentiel à partir des ARNs totaux est
réalisé selon la méthode décrite par Liang et Pardee (1992,
Science, 14;257(5072):967-7)en utilisant l'aP33-ATP en
dilution isotopique au cours de l'amplification par PCR pour
la visualisation des bandes par autoradiographie des gels
d'électrophorèse.
Ainsi, les fragments d'ADN différentiellement présents
sur le gel en fonction des conditions de culture analysées
sont découpés, réamplifiés, clonés dans un plasmide PGEM
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easy vector, Promega), séquencés et identifiés par
questionnement de la banque BLAST.
4. Vérification de l'implication des gènes identifiés
dans le mécanisme de l'angiogenèse.
5 Test de fonctionnalité des gènes
Dans une deuxième étape, la fonctionnalité de chaque
séquence identifiée est testée sur le modèle d'angiogenèse
in vitro avec les cellules endothéliales humaines
transfectées avec un vecteur d'expression comprenant un
10 oligonucléotide antisens de ladite séquence.
Pour la construction de ces vecteurs, l'amplification
du fragment cloné dans le plasmide bactérien est effectuée
au moyen d'amorces particulières, choisies parmi les
séquences GS-PGS F, GS-PGM-R ou GS-PGM-F et GS-PGS-R
15 s'hybridant aux régions du plasmide encadrant le gène cloné
et comprenant également dans leurs extrémités les sites de
restriction (sites Sall et MluI), non contenus dans le
fragment cloné, et présents dans la région multisite du
vecteur d'expression.
20 Ces deux sites de restriction pouvant être interchangés
selon que le fragment ait été cloné dans le plasmide
bactérien dans son orientation sens ou antisens.
Ces amorces (voir demande de brevet internationale
publiée sous le n WO 01/218312) sont indiquées sur le
25 Tableau I ci-dessous :
Tableau I
GS-PGS-F CGGGTCGACGGCCGCGGGAATTCGATT
GS-PGM-R CGCACGCGTGCGGCCGCGAATTCACTA
GS-PGM-F CGCACGCGTGGCCGCGGGAATTCGATT
GS-PGS-R CGGGTCGACGCGGCCGCGAATTCACTA
Des contrôles effectués avec ces amorces, que l'on peut
considérer comme des amorces universelles, en absence du
gène cloné, (plasmide vide) ont montré que le fragment
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amplifié du plasmide (40 paires de bases) lorsqu'il est
intégré dans le vecteur d'expression n'altère pas la
formation des néovaisseaux dans le test de fonctionnalité in
vitro. Les résultats obtenus avec ce vecteur ainsi construit
sont identiques à ceux obtenus avec le vecteur vide
(Résultats non montrés) et montrent que ces paires de bases
supplémentaires n'altèrent pas l'effet des fragments
antisens spécifiques de la séquence identifiée.
Ces amorces contiennent à chacune de leurs extrémités,
un site d'une enzyme de restriction différente (SalI
GTCGAC ou MluI : ACGCGT).
Des fragments amplifiés de chaque gène sont obtenus par
PCR à partir des plasmides bactériens contenant le fragment
du gène identifié en utilisant lesdites amorces.
Ces fragments sont purifiés, digérés par les enzymes de
restriction SalI et M1uI et insérés dans un vecteur
d'expression chez les mammifères du type pCi-neo vector,
(Promega), lui-même digéré par ces deux enzymes de
restriction.
Chaque fragment est introduit dans l'orientation
antisens.
D'une façon générale, les vecteurs susceptibles d'être
utilisés pour la mise en évidence de la fonctionnalité des
gènes identifiés dans la présente invention dans le
mécanisme de l'angiogenèse comprennent tout système de
vecteurs d'expression chez les mammifères comprenant un
promoteur qui permet l'expression d'un gène cloné, à titre
d'exemple on peut citer le promoteur fort du
cytomégalovirus humain (CMV).
D'autres vecteurs d'expression constitutifs ou
inductibles susceptibles d'être également utilisés, sont
indiqués dans la liste non-exhaustive ci-après indiquée :
Vecteurs commercialisés par la Société Promega ; des
vecteurs avec un promoteur fort pour un haut niveau
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d'expression constitutif des gènes chez les cellules de
mammifères (pCI Mammalian Expression vector, Expression
Vector System cloning vector pALTER(R)*-MAX), des vecteurs
commercialisés par la société Invitrogen :(pcDNA3.1, -
/hygro, -/Zeo, pcDNA4/HisMAx, -E, paires de basesudCE4,
pRcRSV, pRcCMV2, pSecTag2, - /hygro secretion vectors, les
vecteurs pEBVHis A, B et C), des vecteurs d'expression chez
le mammifère commercialisés par la société Clontech (pIRES,
pIRES-EYFP pIRES2-EGFP, pCMV-Myc et pCMV-HA ), Epitope-
Tagged pTRE, les vecteurs VP16 Minimal Domain (ptTA 2, ptTA
3 et ptTA 4), les vecteurs d'expression Tet bidirectionnels
( paires de basesl, paires de basesl-EGFP, paires de basesl-
G, paires de basesI-L), pRevTRE, pTRE2, pLEGFP-Ni Vecteur
Retroviral pLEGFP-C1, les systèmes d'expression adenoviraux
Adeno-X , pCMS-EGFP, pd1EGFP-N1, pd2ECFP-N1, pd2EYFP-N1,
pEGFP(-C1, -C2, -C3, -N1, -N2, -N3), pEYFP-C1, -N1.
Chaque vecteur comprenant ledit fragment anti-sens est
alors produit chez E.Coli, extrait, purifié et quantifié. Un
pg de chaque vecteur est incubé en présence d'un agent
transfectant (effectene, Qiagen) en suivant le protocole
préconisé par le fabricant avec les cellules endothéliales.
Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules
endothéliales sont trypsinées et étalées sur la matrice
extracellulaire contenant les facteurs angiogéniques en
l'occurrence le matrigel selon le modèle décrit par Grant et
al, (1989,Cell,58(5):933-43). Après 24h d'incubation, la
formation de vaisseaux est observée et comparée aux cellules
témoins transfectées avec le vecteur d'expression de
mammifère vide.
5. Etablissement de la banque de lignées stables
exprimant les vecteurs d'expression contenant les séquences
des gènes ou leurs fragments ou les séquences antisens.
Les systèmes d'expression peuvent comprendre un
marqueur de sélection à un antibiotique (un gène de
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résistance à un antibiotique), pour sélectionner les
cellules transfectées exprimant de façon stable le vecteur
comprenant l'acide nucléique cloné dans ledit vecteur et ce,
soit dans le même vecteur, soit dans un 2"e vecteur co-
transfecté.
Ce vecteur d'expression peut être un système
d'expression constitutif ou inductible.
Dans l'exemple particulier ci-dessous décrit, les
lignées stables pour l'expression de l'oligonucléotide
antisens correspondant à chaque gène identifié ont été
obtenues avec un vecteur d'expression constitutif et après
sélection en présence d'antibiotique.
Pour ce faire, 24h après la transfection effectuée dans
les conditions décrites ci-dessus, les cellules
endothéliales BAEC sont trypsinées et ensemencées à raison
de 80 000 cellules/puits en plaque de six puits en présence
de 700 ug/ml de l'antibiotique G418 (Promega). Un puit
contrôle est ensemencé avec des cellules non transfectées.
Le milieu est changé tous les trois jours avec une recharge
de l'antibiotique. Les cellules contrôles sont éliminées
après 8 à 10 jours, les cellules résistantes à
l'antibiotique sont récoltées à confluence (après 2 à trois
semaines) puis transférées en flacons de culture toujours en
présence de l'antibiotique. Les lignées stables sont ensuite
testées pour leur capacité à former ou non des vaisseaux
dans le test d'angiogenèse in vitro.
6. Résultats
6.1 Identification des gènes.
Les séquences d'acide nucléiques identifiées dans la
liste de séquences fournie en annexe par les n SEQ ID N 1,
2, 4, 5, 9 à 11, 13, 17 à 19, 27 à 29 et 34 et les protéines
identifiées dans la liste de séquences fournie en annexe par
les n SEQ ID N 35, 37, 38, 43, 47 à 49 et 57 n'ont pas été
identifiées auparavant comme ayant un rôle biologique
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quelconque, et encore moins comme ayant un rôle dans le
processus de l'angiogenèse ou la différentiation des
cellules endothéliales en tubes capillaires. Ces protéines
sont décrites ci-dessous.
La méthode d'affichage différentielle ci-dessus décrite
a permis l'identification des ARNm suivants :
- GS-N1 : ARNm de 1041 paires de bases, identifié par
la séquence SEQ ID No : 1 dans la liste de séquences en
annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK
permet de l'identifier sous le numéro d'accession BC002759.
La séquence de cet ARNm présente une séquence codante
du nucléotide 213 au nucléotide 482. Une protéine, GS-
P1,résultant de la traduction de cet ARNm, (SEQ ID No 35
dans la liste de séquences en annexe), a été identifiée.
Cette protéine est composée de 89 acides aminés.
- GS-N2 : ARNm de 4275 paires de bases identifié par la
séquence SEQ ID No : 2 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet
de l'identifier sous le numéro d'accession BC040192.
- GS-N3 : ARNm de 6104 bp identifié par la séquence SEQ
ID No : 3 dans la liste de séquences en annexe. Une
recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de
l'identifier sous le numéro d'accession XM 497078.
La séquence de cet ARNm présente une séquence codante
du nucléotide 438 au nucléotide 5687. Une protéine, GS-P2,
(SEQ ID No 36 dans la liste de séquences en annexe),
résultant de la traduction de cet ARNm, a été identifiée.
Cette protéine est composée de 1749 acides aminés, est
appelée Nucléoporine 188.
La nucléoporine 188kDa fait partie de la famille d'une
trentaine de protêines appelées les nucléoporines qui
constituent sur la double membrane nucléaire des larges
structures protéiques formant des pores nucléaires et
servant de sites de translocation de macromolécules entre le
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noyau et le cytoplasme. Des études ont montré qu'une
nucléoporine a un rôle unique dans la régulation de la
fonction du pore nucléaire et le transport de protéines et
ARNs. Leur rôle a été plus clair avec la mise en évidence de
5 leur association avec des maladies spécifiques (revue:
Cronshaw et Matunis,Trends Endocrinol Metab. 2004 Jan-
Feb;15(1):34-9.). Par exemple, la surexpression de la
nucléoporine NUP88 a été associée à une haute agressivité du
cancer du sein (Agudo et al, Int J Cancer. 2004 May
10 1;109(5):717-20). Des rôles spécifiques ont été aussi
démontrés par d'autres types d'études, ainsi par exemple, un
rôle spécifique a été suggéré pour la nucléoporine 98kDa
(NUP98): la répression de l'expression de cette protéine par
la technique des RNai, a permis à certains auteurs de mettre
15 en évidence une altération spécifique de la structure du
pore nucléaire et de certaines fonctions comme l'entrée du
cDNA du virus HIV dans le noyau suggérant que cette protéine
participerait à l'entrée du cDNA du virus dans le
noyau(Ebina et al, Microbes Infect. 2004 Jul;6(8):715-24).
20 Autre exemple, La nucléoporine P62 a été impliquée dans le
transport de facteurs activateurs de transcription (STAT3)
vers le noyau des neurones lorsque ces cellules sont
stimulées par l'angiotensine II (Lu et al, Neurosci. 1998
Feb 15;18(4):1329-36).
25 Concernant la protéine NUP188, aucun rôle spécifique
n'a été encore démontré, son rôle notamment dans la
régulation de l'angiogenèse n'a pas encore été décrit.
- GS-N4: ARNm de 1768 bp, identifié par la séquence SEQ
ID No : 4 dans la liste de séquences en annexe. Une
30 recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet de
l'identifier sous le numéro d'accession BC002509.
La séquence de cet ARNm (GS-N4) présente une séquence
codante du nucléotide 176 au nucléotide 1387. Une protéine,
GS-P3, (SEQ ID No 37 dans la liste de séquences en annexe)
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résultant de la traduction de cet ARNm a été identifiée.
Cette protéine est composée de 403 acides aminés.
Cette séquence est homologue de la séquence GS-N5.
- GS-N5: ARNm de 1552 paires de bases identifié par la
séquence SEQ ID No : 5 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet
de l'identifier sous le numéro d'accession BC008630.
La séquence de cet ARNm (GS-N5) présente une séquence
codante partielle du nucléotide 1 au nucléotide 949. Une
protéine, GS-P4, (SEQ ID No 38 dans la liste de séquences en
annexe), résultant de la traduction de cet ARNm, homologue à
la protéine GS-P3, composée de 315 acides aminés a été
identifiêe.
Cette nouvelle protéine de 44kDa contient un domaine
PHD Zinc finger, motif principalement trouvé dans les
protéines impliquées dans la régulation de la transcription
chez les eucaryotes (revue : Trends Biochem Sci. 1995
Feb;20(2):56-9).
- GS-N6: ARNm de 3181 paires de bases identifié par la
séquence SEQ ID No : 6 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet
de l'identifier sous le numéro d'accession NM 170707.
La séquence de cet ARNm (GS-N6) présente une séquence
codante du nucléotide 213 au nucléotide 2207. Une protéine,
GS-P5, (SEQ ID No 39 dans la liste de séquences en annexe),
appelée lamine A/C isoforme 1, résultant de la traduction de
cet ARNm, composée de 664, a été identifiée.
Cette séquence est homologue de la séquence GS-N7.
- GS-N7 : ARNm de 2404 paires de bases identifié par la
séquence SEQ ID No : 7 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet
de l'identifier sous le numéro d'accession X03444.
La séquence de cet ARNm (GS-N7), présente une séquence
codante du nucléotide 211 au nucléotide 2319. Une protéine,
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GS-P6, (SEQ ID No 40 dans la liste de séquences en annexe),
résultant de la traduction de cet ARNm, composée de 702
acides aminés, appelée précurseur de la lamine A, a été
identifiée.
Le gène LMNA code pour une protéine appelée lamine A/C
isoforme 1. Les lamines sont les composants principaux de la
lamina nucléaire. Ces protéines sont importantes dans une
variété de fonctions cellulaires telles que l'assemblage
nucléaire, réplication, transcription et intégrité nucléaire
(revue : Curr Opin Cell Biol. 2002 Jun; 14(3):357-64). Des
mutations de la lamine A/C a été liée à plusieurs maladies
telles que des dystrophies musculaires ou maladies
cardiovasculaires (revue : Trends Cardiovasc Med. 2001 Oct;
11(7):280-5) ; la perte d'expression de ce gène a été
rapportée dans une forme de cardiopathie dilatée (Virchows
Arch. 2003 Nov; 443(5): 664-71. Epub 2003 Jul 26). Mais à ce
jour, aucune implication de ce gène n'a été décrit dans la
régulation de l'angiogenèse.
- GS-N8: ARNm de 2570 paires de bases identifié par la
séquence SEQ ID No : 8 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet
de l'identifier sous le numéro d'accession AB005047.
La séquence de cet ARNm (GS-N8) présente une séquence
codante du nucléotide 64 au nucléotide 1341. Une protéine,
GS-P7, (SEQ ID No 41 dans la liste de séquences en annexe),
résultant de la traduction de cet ARNm a été identifiée.
Cette protéine est composée de 425 acides aminés et est
appelée protéine SAB.
La protéine SAB est une protéine liant le domaine SH3,
son rôle dans la voix de signalisation de la tyrosine kinase
de Bruton (Btk) a été suggéré par la mise en évidence de sa
liaison avec le domaine SH3 de cette kinase (Biochem Biophys
Res Commun. 1998 Apr 17;245(2):337-43). Son rôle dans la
voix de signalisation de la protéine c-Jun N-terminal kinase
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a été également suggéré (Biochem J. 2002 Nov 1; 367 (Pt 3)
: 577-85). Par ailleurs, la c-Jun N-terminal kinase a été
montrée impliquée dans l'angiogenèse (Jimenez et al,
Oncogene. 2001 Jun 7;20(26):3443-8) et plus récemment,
l'expression augmentée de la Btk a été observée au cours de
l'angiogenèse in vivo (2004, Zippo et al, Blood).
Cependant, à ce jour aucune implication de la protéine
SAB n'a été démontrée dans l'angiogenèse.
Cette séquence présente une homologie de séquence avec
les séquences GS-N9, GS-N10, GS-N11 inférieure à 90 %.
Toutefois ces 4 séquences présentent une séquence conservée
dont l'antisens, identifié dans la liste de séquence fournie
en annexe sous le numéro SEQ ID N : 67, permet l'inhibition
de l'expression.
- GS-N9 : ARNm de 2190 paires de bases identifié par la
séquence SEQ ID No : 9 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK permet
de l'identifier sous le numéro d'accession AK090524.
- GS-N10 : ARNm de 5593 paires de bases identifié par
la séquence SEQ ID No : 10 dans la liste de séquences en
annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK
permet de l'identifier sous le numéro d'accession AL133111
- GS-N11 : ARNm de 2774 paires de bases identifié par
la séquence SEQ ID No : 11 dans la liste de séquences en
annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK
permet de l'identifier sous le numéro d'accession BX641159.
- GS-N12 : ARNm de 8974 paires de bases identifié par
la séquence SEQ ID No : 12 dans la liste de séquences en
annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK
permet de l'identifier sous le numéro d'accession NM 015382
La séquence de cet ARNm (GS-N12) présente une séquence
codante du nucléotide 324 au nucléotide 8162. Une protéine,
GS-P8, (SEQ ID No 42 dans la liste de séquences en annexe),
résultant de la traduction de cet ARNm a été identifiée.
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Cette protéine est composée de 2612 acides aminés, et est
appelée protéine HECT domain containing 1 (HECTD1).
La protéine HECTD1 est rangée par son domaine conservé
dans la famille de protéines HECT qui fonctionnent comme des
protéines ubiquitine ligases E3, ciblant des protéines
spécifiques pour la protéolyse contrôlée par l'ubiquitine
(Callaghan et al, Oncogene, 1998 Dec 31 ; 17(26):3479-91). A
titre d'exemples, la protéine Smurfl, autre membre de cette
famille joue un rôle spécifique dans la différentiation des
cellules ostéoblastes et la formation de l'os in vivo en
inhibant cette différentiation (Zhao et al, J Biol Chem.
2004 Mar,26;279(13):12854-9). La protéine Nedd4, également
un membre de la famille HECT a été décrite comme régulant la
stabilité et donc l'activité du récepteur du facteur de
croissance IGF-I (insulin-like growth factor I) (Mol Cell
Biol. 2003 May;23(9):3363-72. Le rôle spécifique de HECTDI
n'est pas encore décrit dans la littérature, et en
particulier aucun rôle dans la régulation de l'angiogenèse
n'a été décrit pour cette protéine.
- GS-N13: ARNm de 5346 paires de bases identifié sous
le numéro de séquence SEQ ID No 13 dans la liste de
séquences en annexe. Une recherche BLAST dans la base de
séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro
d'accession XM 291344.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 1
au nucléotide 3522. Une protéine, GS-P9, (SEQ ID No 43 dans
la liste de séquences en annexe), résultant de la traduction
de cet ARNm a donc été identifiée. Cette protéine est
composée de 1173 acides aminés.
Cette protéine encore inconnue est caractérisée par un
domaine catalytique tyrosine kinase.
- GS-N14: ARNm de 3769 paires de bases identifié sous
le numéro de séquence SEQ ID No 14 dans la liste de
séquences en annexe. Une recherche BLAST dans la base de
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séquences GENBANK permet de l'identifier sous le numéro
d'accession NM181847.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide
469 au nucléotide 2037. Une protéine, GS-P10, (SEQ ID No 44
5 dans la liste de séquences en annexe), résultant de la
traduction de cet ARNm a donc été identifiée. Cette protêine
est composée de 522 acides aminés et est appelée AMIGO2.
La protéine Amigo 2 a été découverte récemment et a été
classée dans une nouvelle famille de gènes codant pour des
10 protéines transmembranaires de type I qui contiennent une
séquence signal de sécrétion et un domaine transmembranaire
(Kuja-Panula et al, J Cell Biol. 2003; 160(6):963-73). Ces
auteurs ont suggéré que ce sont de nouvelles molécules
d'adhésion, elles sont exprimées sur les fibres des neurones
15 et participeraient à leur formation.
La protéine Amigo 2 reste encore mal connue, elle n'a
encore jamais été décrite comme impliquée dans
l'angiogenèse.
- GS-N15: ARNm de 7407 paires de bases identifié sous
20 le numéro SEQ ID No 15 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet
de l'identifier sous le numéro d'accession NM 005650:
Cet ARNm présente une région codante du nucléotide 135
au nucléotide 6017. Il a donc été identifié une protéine,
25 GS-P11, (SEQ ID No 45 dans la liste de séquences en annexe),
résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est
composée de 1960 acides aminés, et est appelée facteur de
transcription 20, isoforme 1 (TCF20).
Cette protéine, également appelée SPBP, a été décrite à
30 l'origine comme étant un facteur de transcription qui
contrôle l'expression de la stromolysine, une
metalloproteinases impliquée dans l'invasion de tumeurs et
les métastases (Sanz et Mol. Cell. Biol. 15 (6), 3164-3170
(1995).Plus récemment, il a été rapporté que cette protéine
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nucléaire contient plusieurs domaines fonctionnels et
qu'elle stimule l'activité transcriptionnelle de facteurs de
transcription variés tels que Etsl ou C-Jun, elle est
suggérée être un coactivateur transcriptionnel (Rekdal et
al, J Biol Chem. 2000 Dec 22;275(51):40288-300).
A ce jour, aucune implication dans la régulation de
l'angiogenèse n'a été décrite pour cette protéine.
- GS-N16: ARNm de 2104 paires de bases identifié sous
le numéro SEQ ID No 16 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet
de l'identifier sous le numéro d'accession NM 016408.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide
125 au nucléotide 1888. Il a ainsi été identifié une
protéine GS-P12, (SEQ ID No 46 dans la liste de séquences en
annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette
protéine est composée de 587 acides aminés, et est appelée
protéine 1 associée à la sous unité régulatrice CDK5
(CDK5RAP1).
Cette protéine également appelée C42, ou HSPC167, a été
isolée et montrée s'associer à une sous unité activatrice
(p25nck5a dérivée de p35nck5a) d'une protéine kinase associée
au cycle cellulaire appelée protéine kinase dépendante des
cyclines, la CDK5 (Ching et Wang, Gene. 2000 Jan 25;242(1-
2):285-94). Chez les cellules en division, les cdks,
régulent la prolifération, différentiation, senescence, et
apoptose. La CDK5 neuronale a été impliquée dans la
régulation de la différentiation et la migration neuronale.
L'activité des protéines Cdk est régulée par des mécanismes
complexes incluant la phosphorylation de protéines,
l'association avec des inhibiteurs spécifiques. Pour la
Cdk5, deux activateurs ont été identifiés la p35nk5a, et son
isoforme, la p39nek5ai. La protéine CDK5RAP1 a été montré
inhiber l'activité kinase de la CDK5 neuronale en
s'associant à la p35nck5a (Ching et al, J. Biol. Chem., Vol.
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277, Issue 18, 15237-15240, May 3, 2002). D'autre part,
récemment, l'augmentation d' expression de la CDK5 et son
rôle dans la prolifération et l'apoptose chez les cellules
endothéliales (BAE) en prolifération stimulées par le bFGF
ont été rapportés (Sharma et al, J Cell Biochem. 2004 Feb
1;91(2):398-409).
Par contre, à ce jour, aucune implication de la
CDK5RAP1 n'a été démontrée dans la régulation de
l'angiogenèse
- GS-N17: ARNm de 5859 paires de bases identifié sous
le numéro SEQ ID No 17 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet
de l'identifier sous le numéro d'accession AK074056.
Cet ARNm, (GS-N17), présente une séquence codante
partielle du nucléotide 45 au nucléotide 935.
Il a été ainsi identifié une nouvelle protéine, GS-P13,
(SEQ ID No 47 dans la liste de séquences en annexe),
résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est
composée de 296 acides aminés.
Cette protéine inconnue, de 33kDa, contient des
domaines BTB/POZ et Kelch, le domaine BTB/POZ est un domaine
conservé d'interaction protéine-protéine (Xu et al, Int J
Mol Med. 2004 Jan; 13(1):193-7. décrits impliqués dans les
processus de régulation et transduction du signal (NCBI,
Conserved Domain Search). Cependant, les protéines contenant
ces domaines constituent une large famille dont les
fonctions physiologiques restent encore mal connues (Ohmachi
et al, Genes Cells. 1999 Jun;4(6):325-37. Un membre de cette
famille a déjà été décrit impliqué dans un processus tel que
la migration dirigée des cellules chez la drosophile.
(Development, 2001 Aug;128(15):3001-15).
- GS-N18 : ARNm de 1694 paires de bases identifié sous
le numéro SEQ ID No 33 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST dans la base de séquences GENBANK permet
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de l'identifier sous le numéro d'accession BC001792.
Cet ARNm, (GS-N18), présente une séquence codante du
nucléotide 164 au nucléotide 448. Il a été ainsi identifié
une protéine, GS-P14, (SEQ ID No 48 dans la liste de
séquences en annexe), résultant de la traduction de cet
ARNm. Cette protéine est composée de 94 acides aminés.
Cette protéine de lOkDa n'a aucun domaine particulier
mais contient une séquence signale de sécrétion et une
hélice transmembranaire.
Cette séquence est homologue de la séquence GS-N19.
- GS-N19 : ARNm de 2437 paires de bases identifié par
la séquence SEQ ID No : 19 dans la liste de séquences en
annexe. Une recherche BLAST sur la base de séquences GENBANK
permet de l'identifier sous le numéro d'accession AF370373.
Cet ARNm (GS-N19) présente une séquence codante du
nucléotide 628 au nucléotide 1533. Une protéine, GS-P15,
(SEQ ID No 49 dans la liste de séquences en annexe),
résultant de la traduction de cet ARNm a ainsi été
identifiée. Cette protéine, isoforme de la protéine GS-P14,
est composée de 301 acides aminés.
Cette isoforme est caractérisée par un domaine appelé
ubiquitine, de la famille des ubiquitines, molécules
impliquées dans la protéolyse des protéines qui régule le
turnover des protéines , afin de contrôler la progression
du cycle cellulaire.
Ces 2 isoformes sont également caractérisés par une
séquence signal d'excrétion.
- GS-N20: un ARNm de 1714 paires de bases identifié
sous le numéro SEQ ID No 20 dans la liste de séquences en
annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le
numéro d'accession BC022870 dans la base de séquences
GENBANK.
La séquence de cet ARNm présente une séquence codante
du nucléotide 90 au nucléotide 1424. Il a été ainsi
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identifié une protéine GS-P16 résultant de la traduction de
cet ARNm. Cette protéine est composée de 444acides aminés.
Elle est identifiée sous le numéro SEQ ID No 50 dans la
liste de séquences en annexe, appelée protéine 44 induite
par l'interféron (ZFI44).
Le gène codant pour un nouvel antigène la protéine,
p44 a été isolé à l'origine chez le chimpanzé infecté par un
virus de l'hépatite (Takahashi et al, 1990, J Gen Virol., 71
(Pt 9):2005-11). Par la suite, il a été identifié chez
l'homme comme étant inductible par l'interféron (Kitamura et
al, Eur J Biochem. 1994 Sep 15;224(3):877-83). A ce jour,
cette protéine n'a pas été décrite comme étant impliquée
dans l'angiogenèse.
- GS-N21: ARNm de 1715 paires de bases identifié sous
le numéro SEQ ID No 21 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro
d'accession NM 004905 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm, GS-N21, présente une séquence codante du
nucléotide 52 au nucléotide 726. Il a été ainsi identifié
une protéine, GS-P17, (SEQ ID No 51 dans la liste de
séquences en annexe), résultant de la traduction de cet
ARNm, composée de 224 acides aminés, appelée peroxiredoxine
6 (PRDX6).
La protéine peroxiredoxine 6 (également appelée
antioxidant protein 2; non-selenium glutathione peroxidase;
acidic calcium-independent phosphôlipase A2,1-Cys
peroxiredoxin) appartient à la famille grandissante et
ubiquitaire de peroxiredoxines qui sont des enzymes
multifonctionelles avec une peroxidase in vitro, and in vivo
participent dans beaucoup de processus cellulaires connus
pour être sensible aux oxygène réactifs tels que les
processus physiopathologiques incluant l'adaptation à
l'oxygène, l'athérosclérose, le cancer , la différentiation
cellulaire (WAGNER et al, Biochem. J. (2002) 366):777-785.
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Une récente étude décrit que PRDX6 est un unique antioxidant
non redundant qui fonctionne indépendamment des autres
peroxiredoxines et protéines antioxidantes. Très abondantes
dans les cellules épithéliales, PRDX6 a été trouvée dans le
5 cytosol (Wang et ai, J. Biol. Chem., Vol. 278, Issue 27,
25179-25190, July 4, 2003). Elle a également été trouvée
dans les cellules endothéliales, uniquement dans le cytosol
(Stuhlmeier et al, Eur J Biochem. 2003 Jan;270(2):334-41).
A ce jour cette protéine n'a pas été décrite avoir un
10 rôle dans la régulation de l'angiogenèse.
- GS-N22: ARNm de 5978 paires de bases identifié sous
le numéro SEQ ID No 22 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro
d'accession AF220037 dans la base de séquences GENBANK.
15 Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide
1801 au nucléotide 3933. Il a ainsi été identifié une
protéine, GS-P18, (SEQ ID No 52 dans la liste de séquences
en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm composée
de 710 acides aminés et appelée protéine motif tripartite
20 isoform beta, TRIM9.
La protéine TRIM9 appartient à une famille caractérisée
par un domaine conservé, le motif tripartite (TRIM). Le TRIM
est composé de Trois domaine de liaison du zing, un RING(R),
un B-box type 1( B 1) et un B-box type 2 (B2 ) suivis par une
25 région coiled-coil. Ces protéines partagent une fonction
commune par le fait d'une homo-multimérisation, chacune
d'entre elles est associée à un compartiment spécifique de
la cellule, la protéine TRIM9 a été rapportée cytoplasmique
(EMBO J. 2001 May 1;20(9):2140-51). Le questionnement de la
30 banque de donnée de NCBI sur les domaines conservés montre
que la protéine TRIM9 contient également un domaine
fibronectine Type III , module présent à la fois dans les
protéines extracellulaires et intracellulaires. Les gènes de
la famille des TRIM ont été impliqués dans des processus
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variés, tels que le développement et la croissance
cellulaire et l'oncogénèse et autres pathologies (EMBO J.
2001 May 1;20(9):2140-51 ; Berti et al, Mech Dev. 2002
May;113(2):159-62.). TRIM11, par exemple, jouerait un rôle
dans la régulation du niveau d'expression intracellulaire
d'un peptide neuroprotecteur qui supprime spécifiquement la
neurotoxicité liée à la maladie d'Alzheimer à travers la
voie de dégradation des protéines contrôlée par les
ubiquitines (Niikura et al, Eur J Neurosci. 2003
Mar;17(6):1150-8. TRIM9 est encore mal connu, à l'heure
actuelle, il a été rapporté que TRIM9 est principalement
confiné dans le système nerveux central.
Son rôle n'est pas encore défini et à ce jour aucun
rôle dans la régulation de l'angiogenèse n'a été décrit pour
TRIM9.
- GS-N23: ARNm de 5858 bp identifié sous le numéro SEQ
ID No 23 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche
BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession
AF213987 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 66
au nucléotide 2213. Il a ainsi été identifié une protéine,
GS-P19, (SEQ ID No 53 dans la liste de séquences en annexe),
résultant de la traduction de cet ARNm. Cette protéine est
composée de 715 acides aminés et est appelée protéine MCEF.
La protéine MCEF a été décrite comme un nouveau membre
de la famille des facteurs de transcription AF4 impliqués
dans les leucémies lymphoblastiques Estable et al, J Biomed
Sci. 2002 May-Jun; 9(3):234-45).
La protéine MCEF est encore très peu étudiée et à ce
jour, aucun rôle dans la régulation de l'angiogenèse n'a été
décrit pour cette protéine.
- GS-N24: ARNm de 3907 paires de bases identifié sous
le numéro SEQ ID No 24 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro
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d'accession NM 012318 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide
298 au nucléotide 2517. Une protéine, GS-P20, (SEQ ID No 54
dans la liste de séquences en annexe), de 739 acides aminés,
appelée protéine transmembranaire 1 contenant un domaine
leucine zipper-EF-hand (LETM1) a ainsi été identifiée.
La protéine LETM1 contient deux domaines EF-Hand , un
domaine transmembranaire, un domaine leucine Zipper et
plusieurs domaines coiled-coil. Sur la base de sa possible
propriété de liaison du Calcium et de son implication dans
la voie de signalisation du calcium, cette protéine a été
suggéré être impliqué dans une maladie mentale, le syndrome
de Wolf-Hirschhorn, cette protéine étant délétée chez
beaucoup de patients atteints de ce syndrome (Endele et al,
Genomics. 1999 Sep 1;60(2):218-25. Une récente étude, a
montré une localisation mitochondriale de cette protéine
(Schlickum et al, Genomics. 2004 Feb;83(2):254-61).
A ce jour, aucun rôle dans l'angiogenèse n'est décrit
pour cette protéine.
- GS-N25: un ARNm de 7190 paires de bases identifié
sous le numéro SEQ ID No 41 dans la liste de séquences en
annexe. Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le
numéro d'accession NM020119 dans la base de séquences
GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide
389 au nucléotide 3097. Il a été ainsi identifié une
protéine, GS-P21, (SEQ ID No 55 dans la liste de séquences
en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm. Cette
protéine est composée de 902 acides aminés et est appelée
protéine antivirale zinc finger (ZAP).
La protéine ZAP est une protéine Zinc finger de type
CCCH. Son rôle décrit actuellement concerne la prévention de
l'infection par les rétrovirus. L'expression de cette
protéine ZAP a été montrée qu'elle provoque une profonde et
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spécifique perte d'ARNms viraux dans le cytoplasme de la
cellule sans affecter les ARNms nucléaires suggérant un rôle
dans l'inhibition de la réplication virale de cellules
infectées (Gao et al, Science. 2002 Sep 6;297(5587):1703-6).
Aucun autre rôle n'est connu à l'heure actuelle et
aucun rôle dans la régulation de l'angiogenèse n'a été
décrit, à ce jour, pour cette protéine.
- GS-N26 : ARNm de 2359 paires de bases identifié sous
le numéro SEQ ID No 26 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro
d'accession NM 022777 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm, GS-N26, présente une séquence codante du
nucléotide 41 au nucléotide 598. Il a ainsi été identifié
une protéine, GS-P22, (SEQ ID No 56 dans la liste de
séquences en annexe), résultant de la traduction de cet
ARNm. Cette protéine est composée de 185 acides aminés et
est appelée protéine RABL5.
Le gène codant pour la protéine RABL5 a été récemment
décrit (Ota et al, Nat. Genet. 36 (1), 40-45 (2004) et la
protéine a été classée par ses domaines conservés comme un
membre de la famille des Rab GTPAse appartenant à la
superfamille de protéines de type Ras liant les GTP, qui ont
émergés comme régulateurs au niveau membrane cellulaire, en
particulier la formation, le transport vésiculaire et la
fusion de membrane (revues : Prekeris R, Scientific World
Journal. 2003 Sep 15;3:870-80; Stenmark H et Olkkonen VM.,
Genome Biol. 2001;2(5)). Cette superfamille comprend plus de
80 protéines hautement conservées qui sont impliquées dans
de multiples voix de la signalisation intracellulaire. Elles
fonctionnent comme des switches moléculaires de la
transduction du signal à partir de récepteurs membranaires,
en passant d'un état inactif liant le GDP à un état actif
liant le GTP pouvant ainsi agir sur différentes molécules
effectrices (revue : Coxon FP et Rogers MJ., Calcif Tissue
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Int. 2003 Jan;72(1):80-4.). Les membres de la famille Ras
ont largement été impliqués dans l'oncogenèse soit par
mutation soit par une surexpression de la protéine (revue:
Oxford et Theodorescu, Cancer Lett. 2003 Jan 28;189(2):117-
28.) Une protéine Rab a déjà été décrite dans l'angiogenèse,
appelée VRP (Yonekura et al, Nucleic Acids Res. 1999 Jul
1;27(13):2591-600.
Par contre, la protéine RABL5 reste encore mal connue
et son rôle exacte n'a pas encore été découvert, aucun rôle
dans l'angiogenèse n'a été décrit à ce.jour.
Cette séquence, GS-N26, présente une homologie de
séquence avec les séquences GS-N27 et GS-N28 inférieure à
90%. Toutefois ces 3 séquences présentent une séquence
conservée dont l'antisens, identifié dans la liste de
séquence fournie en annexe sous le numéro SEQ ID N : 81,
permet l'inhibitiôn de l'expression.
- GS-N27 : ARNm de 1782 paires de bases, identifié sous
le numéro SEQ ID No 27 dans la liste de séquences en
annexe.Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le
numéro d'accession BC050531 dans la base de séquences
GENBANK.
- GS-N28: ARNm de 2587 paires de bases, identifié sous
le numéro SEQ ID No 28 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro
d'accession AL157469 dans la base de séquences GENBANK.
- GS-N29: ARNm de 2520 bp identifié sous le numéro SEQ
ID No 29 dans la liste de séquences en annexe. Une recherche
BLAST permet de l'identifier sous le numéro d'accession
XM211534 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm (GS-N29) présente une séquence codante du
nucléotide 484 au nucléotide 792. Il a ainsi été identifié
une protéine, GS-P23, (SEQ ID No 57 dans la liste de
séquences en annexe), résultant de la traduction de cet
ARNm. Cette protéine est composée de 102 acides aminés.
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Cette nouvelle protéine de 11 kDa (102acides aminés) ne
présente aucun domaine particulier, elle est supposée
extracellulaire et possède une séquence signale de
sécrétion.
5 - GS-N30 : ARNm de 7300 paires de bases identifié sous
le numéro SEQ ID No30 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro
d'accession NM 003023 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm (GS-N30), présente une séquence codante du
10 nucléotide 262 au nucléotide 1947. Il a ainsi été identifié
une protéine, GS-P24 (SEQ ID No 58 dans la liste de
séquences en annexe), résultant de la traduction de cet
ARNm. Cette protéine est composée de 561 acides aminés et
est appelée protéine 2 liant le domaine SH3 (SH3BP2).
15 Cette protéine a été identifiée dans le cancer de la
vessie et de par sa structure, elle a été suggérée jouer un
rôle dans la signalisation et pourrait être un régulateur
négatif de l'oncogène abl (Bell et al, Genomics. 1997 Sep
1;44(2):163-70. Récemment, Cette protéine a été décrite
20 comme étant une protéine adaptatrice dans des voies de
signalisation en promouvant l'activité transcriptionnelle de
deux facteurs de transcription NFAT/AP-1 (connus étant
impliqués dans la transcription du gène de l'interleukine 2)
chez les cellules T à travers l'activation des voies
25 dépendantes de Ras et calcineurine (Foucault et al, J Biol
Chem. 2003 Feb 28;278(9):7146-53). Cette protéine a été
également décrite comme régulateur positif de la
phosphorylation de la tyrosine de la PLC-gamma chez les
cellules basophiles conduisant à leur dégranulation (Sada et
30 al, Blood. 2002 Sep 15;100(6):2138-44). Par ailleurs, une
mutation de ce gène a été récemment décrite pouvant avoir un
rôle dans une pathologie cystique multioculaire héréditaire,
le Chérubisme (Ueki et al, Nat Genet. 2001 Jun, 28(2):125-
6 ; Lo et al, Am J Med Genet., 2003 Aug 15; 121A(1) : 37-
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40). A ce jour, aucun rôle dans la régulation de
l'angiogenèse n'a été décrit pour cette protéine.
- GS-N31: ARNm de 1701 paires de bases identifié sous
le numéro SEQ ID No 31 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro
d'accession AF380162 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm (GS-N31), présente une séquence codante du
nucléotide 19 au nucléotide 1542. Il a ainsi été identifié
une protéine, GS-P25, (SEQ ID No 59 dans la liste de
séquences en annexe), résultant de la traduction de cet
ARNm. Cette protéine est composée de 507 acides aminés et
est appelée protéine FAPP2.
Cette séquence d'ARNm (GS-N31) est homologue des
séquences GS-N32 et GS-N33.
- GS-N32 : ARNm de 2836 paires de bases identifié sous
le numéro SEQ ID No 32 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro
d'accession AK023180 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide
323 au nucléotide 1441. Il a ainsi été identifié une
protéine, GS-P26, (SEQ ID No 60 dans la liste de séquences
en annexe), résultant de la traduction de cet ARNm, composée
de 372 acides aminés et appelée Protéine similaire à la
protéine FAPP2.
Le gène codant pour la protéine FAPP2 a été identifié
en 2002 par Strausberg (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99
(26), 16899-16903), elle est hautement similaire, par
ailleurs, à une protéine NY-BR-86 décrite comme étant un
antigène du cancer du sein (Scanlan et al, 2001, Cancer
Immun.1,4) . Cette protéine possède un domaine conservé de
transfert de glycolipide et un domaine d'homologie de la
pleckstrine. Ce domaine est partagé par un groupe de
nouvelles protéines qui possèdent des spécificités de
liaisons avec les dérivés phosphorylés de l'inositol. Ces
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protéines sont décrites comme pouvant être des protéines
adaptatrices car elles ne possèdent pas de domaines
catalytiques. Ces molécules peuvent être des médiateurs clés
de réponses cellulaires qui sont régulées spécifiquement par
le second messager (le dérivé phosphorylé de l'inositol)
(Dowler et al,Biochem. J. (2000) 351, 19-31).
Le rôle exact de FAPP2 n'est pas encore connu, son rôle
dans l'angiogenèse n'a pas encore été décrit à ce jour.
Cette séquence d'ARNm (GS-N32) est homologue des
séquences GS-N31 et GS-N33.
- GS-N33 : ARNm de 2004 paires de bases identifiée sous
le numéro SEQ ID No 33 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro
d'accession BC002838 dans la base de séquences GENBANK.
Cet ARNm présente une séquence codante du nucléotide 92
au nucléotide 1414. Il a ainsi été identifié une protéine,
GS-P27, (SEQ ID No 61 dans la liste de séquences en annexe),
résultant de la traduction de cet ARNm, composée de
440acides aminés est appelée Protéine liée au potentiel de
prolifération.
Cette séquence d'ARNm (GS-N33) est homologue des
séquences GS-N31 et GS-N32.
- GS-N34: ARNm de 1789 paires de bases identifié sous
le numéro SEQ ID No 34 dans la liste de séquences en annexe.
Une recherche BLAST permet de l'identifier sous le numéro
d'accession AK057491 dans la base de séquences GENBANK.
L'expression des ARNms ci-dessus identifiés est
observée dans des cellules endothéliales qui forment des
tubes capillaires. La Demanderesse a mis donc en êvidence
que l'expression différentielle du gène correspondant à
chacun de ces ARNms accompagne la formation de néovaisseaux
par les cellules endothéliales (Tableau II).
Tableau II
SÉQ.ID Inducteurs de Inhibiteurs de
l'expression l'expression
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SEQ ID No 1(GS-N1) TNF-a FGF2
SEQ ID No 2(GS-N2) FGF2 IFN-y
SEQ ID No 3 (GS-N3) TNF-a FGF2
SEQ ID No 4 (GS-N4) TNF-a VEGF
SEQ ID No 5 (GS-N5) TNF-a VEGF
SEQ ID No 6 (GS-N6) IFN-y VEGF
SEQ ID No 7 (GS-N7) IFN-y VEGF
SEQ ID No 8(GS-N8) IFN-y VEGF
SEQ ID No 9 (GS-N9) IFN-y VEGF
SEQ ID No 10 (GS-N10) IFN-y VEGF
SEQ ID No 11 (GS-N11) IFN-y VEGF
SEQ ID No 12 (GS-N12) IFN-y VEGF
SEQ ID No 13 (GS-N13) IFN-y VEGF
SEQ ID No 14 (GS-N14) IFN-y VEGF
SEQ ID No 15 (GS-N15) IFN-y VEGF
SEQ ID No 16 (GS-N16) IFN-y VEGF
SEQ ID No 17 (GS-N17) TNF-a VEGF
SEQ ID No 18 (GS-N18) TNF-a VEGF
SEQ ID No 19 (GS-N19) TNF-a VEGF'
SEQ ID No 20 (GS-N20) IFN-y VEGF
SEQ ID No 21 (GS-N21) IFN-y VEGF
SEQ ID No 22 (GS-N22) FGF2 IFN-y
SEQ ID No 23 (GS-N23) FGF2 IFN-y
SEQ ID No 24 (GS-N24) VEGF IFN-y
SEQ ID No 25 (GS-N25) VEGF IFN-y
SEQ ID No 26 (GS-N26) VEGF Ang-2
SEQ ID No 27 (GS-N27) VEGF Ang-2
SEQ ID No 28 (GS-N28) VEGF Ang-2
SEQ ID No 29 (GS-N29) VEGF IFN-y
SEQ ID No 30 (GS-N30) VEGF IFN-y
SEQ ID No 31 (GS-N31) VEGF IFN-y
SEQ ID No 32 (GS-N32) VEGF IFN-y
SEQ ID No 33 (GS-N33) VEGF IFN-y
SEQ ID No 34 (GS-N34) VEGF IFN-y
Il apparaît ainsi qu'il existe une corrélation directe
entre l'expression de chacun des gènes GS-N1 à GS-N34 et
l'état angiogénique des cellules endothéliales.
6.2 Vérification du rôle des gènes identifiés dans la
régulation de l'angiogenèse.
De plus, il a été également montré le rôle fonctionnel
de ces gènes dans la formation de néovaisseaux par les
cellules endothéliales humaines.
En effet, un oligonucléotide antisens spêcifique de
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chacun des gènes identifiés, choisi parmi les
oligonucléotides identifiés par les séquences SEQ ID No. :
62 à SEQ ID. : 86 dans la liste de séquences en annexe a été
introduit dans le vecteur d'expression pCI-neo Vector dans
l'orientation antisens.
Les vecteurs résultants appelés GS-V1 à GS-V23
identifiés par leurs séquence SEQ ID No : 87 à SEQ ID No :
109 dans la liste de séquences en annexe ont été utilisés
pour réprimer l'expression du gène codant pour cet ARNm chez
les cellules endothéliales humaines suite à la transfection
de ces dernières par ce vecteur.
Les cellules endothéliales humaines ont été stimulées
alors par des facteurs angiogéniques.
Les résultats obtenus, pour chacune des séquences
illustrées ci-dessous, en utilisant les séquences antisens
et les vecteurs correspondants, indiqués dans le tableau
III, montrent que :
- la répression de l'expression des gènes SEQ ID N. 1 à
SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6 à SEQ ID No. 34 inhibe la
formation de néovaisseaux par les cellules endothéliales ;
- la répression des gènes SEQ ID No. 4 et SEQ ID No. 5
stimule la formation la formation de néovaisseaux par les
cellules endothéliales ;
et cela malgré la présence des différents facteurs
angiogéniques.
Ces résultats sont illustrés dans les figures
correspondantes 1 à 5 en annexe.
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CA 02593464 2007-07-09
WO 2006/075084 PCT/FR2006/000048
53
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DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
PLUS D'UN TOME.
CECI EST LE TOME 1 DE 2
CONTENANT LES PAGES 1 A 53
NOTE : Pour les tomes additionels, veuillez contacter le Bureau canadien des
brevets
JUVIBO APPLICATIONS/PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION/PATENT CONTAINS MORE THAN ONE
VOLUME
THIS IS VOLUME 1 OF 2
CONTAINING PAGES 1 TO 53
NOTE: For additional volumes, please contact the Canadian Patent Office
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