Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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POLYMERES A EMPREINTE MOLÉCULAIRE, LEUR PROCÉDÉ DE
PRÉPARATION ET LEUR UTILISATION POUR DÉTECTER DES
MOLÉCULES EN MILIEU BIOLOGIQUE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne de nouveaux polymères à empreinte
moléculaire capable de détecter des molécules cibles dans les milieux
biologiques. L'invention concerne également le procédé de préparation de ces
polymères à empreinte moléculaire et l'utilisation de ceux-ci pour détecter
des
molécules en milieu biiologique.
DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR
Polymères à empreinte moléculaire
Les développements dans le domaine des polymères à empreinte moléculaire,
ou "polymères imprimés" ("Molecular Imprinted Polymers" (MIP) en anglais)
sont relativement récents. En 1993, la technologie a fait un bond en avant
lorsque le groupe de Mosbach a montré que les polymères imprimés pouvaient
être substitués aux anticorps dans des tests immunologiques (Vlatakis et al.
1993, Nature, 361, 645 - 647).
L'impression moléculaire consiste à créer des images complémentaires, les
"empreintes moléculaires", d'une molécule dans un polymère synthétique. La
molécule pour laquelle une empreinte doit être générée est mise en contact
avec un mélange de monomères portant des groupements fonctionnels
capables de la complexer, par exemple par des liaisons hydrogène, liaisons
ioniques ou interactions hydrophobes. La polymérisation, conduite en présence
d'un monomère réticulant, permet d'obtenir un réseau polymère rigide qui,
après élimination de la molécule cible, porte des sites complémentaires de
cette
dernière, capables de la reconnaître de manière spécifique.
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Comme indiqué ci-dessus, les procédés connus de préparation de polymères à
empreinte moléculaire impliquent une étape de polymérisation de monomères
fonctionnalisés en présence d'une molécule cible pour laquelle on veui:
obtenir
une empreinte. L'étape suivante est de retirer la molécule cible du polymère
obtenu en y laissant son empreinte. Cette étape est critique puisqu'il faut
pouvoir garder intacts les sites de reconnaissance de la molécule au sein du
polymère imprimé.
Les polymères à empreinte moléculaire connus sont en majorité à base de
polyacrylate ou polyméthacrylate. Ils peuvent être obtenus par exernple en
faisant réagir des monomères "acide acrylique" ou "acide méthacrylique" en
présence de la molécule cible. Dans ce cas, la réaction produit des hydrogels
qu'il faut ensuite sécher pour obtenir le polymère imprimé. Toutefois,
l'empreinte tend à se dénaturer lors du séchage, ce qui va se traduire par une
spécificité du polymère imprimé qui est diminuée.
La demande de brevet des États-unis publiée le 6 décembre 2007 sous le No.
US 2007/0281366 Al décrit un procédé de préparation de polymères à
empreinte moléculaire comprenant plusieurs étapes. Dans la première étape
une molécule cible (i.e. glucose oxydase) est mise en contact avec des
monomères comportant des groupements fonctionnels (i.e. acide acrylique ou
méthacrylique) capables d'interagir avec des groupements fonctionnels
complémentaires de la molécule cible pour ainsi former un complexe dans
lequel la molécule cible est liée aux monomères. La deuxième étape consiste
en une polymérisation en présence de monomères supplémentaires (i.e.
acrylamide) et d'un agent de réticulation (i.e. N, N'-
méthylènebisacrylarnide). A
l'issue de cette deuxième étape, on obtient un complexe polymérique irnprimé.
La troisième étape est la désactivation des groupements fonctionnels auxquels
la molécule cible n'est pas attachée. Enfin, dans une quatrième étape la
molécule cible est retirée du complexe polymérique et on obtient le polymère
imprimé. Ce type de procédé est long à mettre en oeuvre et à optimiser.
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Il y a donc un besoin pour des polymères à empreinte moléculaire spécifiques,
faciles à synthétiser et à moindre coût.
Détection de molécules en milieux biologiques
Une des méthodes les plus connues de dépistage de molécules en milieux
biologiques sont les tests ELISA. Les tests ELISA sont utilisés dans des
domaines variés comme par exemple pour détecter des virus, des bactéries,
des protéines, etc... L'application la plus connue du test ELISA est le
déâpistage
du VIH. Toutefois, ce type de test a également trouvé des applications dans
l'industrie de l'alimentation, afin de détecter des allergènes dans des
produits
alimentaires, comme le lait, les cacahuètes, les noix et les oeufs. Une autre
application connue de ce type de test est la détection quantitative
d'antibiotiques comme par exemple dans les eaux usées, le lait, la viande, le
sang, etc...
Un exemple d'utilisation du test ELISA est la détection d'antibiotiques
présents
dans le lait de vache. En effet, l'utilisation d'antibiotiques est répandue
pour
traiter des vaches (ou d'autres animaux d'élevage) pour des nialadies
infectieuses ou pour faciliter la croissance.
Chaque année des quantités inestimables de lait impropre à la consornmation
sont perdues à cause de la présence d'un taux trop élevé d'antibiotiques dans
le lait. Cela représente des pertes économiques considérables. Ces pertes sont
importantes car la détection se fait en général à l'usine de traitement du
lait sur
de très grands volumes.
De plus, lorsque des contrôles individuels des vaches sont effectués
directement à la ferme, les épreuves de dépistage actuelles (test ELISA par
exemple) signalent souvent à tort la présence de résidus (faux positifs) mais
aussi leur absence (faux négatifs). Ces problèmes sont associés à des
substances inhibitrices présentes dans le lait, à sa teneur en gras et en
protéines, à des caractéristiques physiologiques des vaches ainsi qu'à des
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indicateurs de leurs processus pathologiques. Le manque de fiabilité des
épreuves de dépistage proviendrait de leur tendance à cibler les groupements
fonctionnels des antibiotiques, qui diffèrent à l'intérieur d'une même classe
de
produits mais qui peuvent être présentes aussi sur des molécules non
apparentées. Ceci expliquerait les problèmes de spécificité excessive pour
certaines épreuves de dépistage et de spécificité insuffisante pour d'autres.
Les tests ELISA actuellement utilisés nécessitent aussi un personnel
spécialisé.
Ils sont chers et donc peu fiables surtout lors de l'utilisation individuelle
(chaque
vache).
Un autre moyen de détection s'effectue en laboratoire par chromatographie en
phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS). Mais, encore une
fois cette méthode est onéreuse et non-ambulatoire.
Il y a donc une nécessité de concevoir un moyen de détection fiable utilisable
directement à la ferme au pis de la vache à moindre coût.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention a pour objet de surmonter les problèmes de l'art
antérieur
décrits ci-dessus. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet
de
nouveaux polymères à empreinte moléculaire préparés par un procédé simple,
permettant de détecter de manière fiable et spécifique des molécules cibles en
milieux biologiques. D'autres applications sont prévues comme la
chromatographie spécifique, ou l'utilisation comme biosenseurs.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de
préparation d'un polymère à empreinte moléculaire destiné à détecter une
molécule cible dans un milieu biologique. Le procédé comprend une première
étape de préparation d'un mélange d'au moins un polymère greffé par des
groupements fonctionnels et d'une molécule cible, les groupements
fonctionnels du polymère formant des interactions avec des groupements
spécifiques de la molécule cible. La deuxième étape implique l'obtention de
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particules solides ou d'un film comprenant la molécule cible complexée au
polymère greffé à partir du mélange obtenu à la première étape. Enfin, la
troisième étape consiste en l'élimination de la molécule cible qui était
complexée au polymère greffé pour former le polymère à enipreinte
5 moléculaire.
Selon un second aspect, la présente invention concerne un polymère à
empreinte moléculaire obtenu par le procédé selon l'invention décrit ci-
dessus.
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un
polymère à empreinte moléculaire selon l'invention pour la détection de
molécules dans un milieu biologique.
Selon un quatrième aspect, la prësente invention concerne un kit de dépistage
de molécules dans un milieu biologique comprenant un polymère à ernpreinte
moléculaire selon l'invention et un moyen de détection de la molécule.
L'invention et ses avantages ressortiront mieux de la description détaillée et
des
exemples qui suivent illustrant des modes de réalisations préférés de
l'invention.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La Fig. 1 représente schématiquement les différentes étapes du procédé de
préparation d'un polymère à empreinte moléculaire selon un mode de
réalisation préféré de l'invention.
La Fig. 2 représente schématiquement des exemples d'interactions possibles
entre le PLA greffé avec des groupements fonctionnels et la tétracycline.
La Fig. 3 illustre le taux de recouvrement dans le lait de polymères à
erripreinte
moléculaire spécifiques à la tètracycline selon l'invention, en comparaison à
des
polymères non imprimés (B polyrnère greffé avec COOH, OH et Benzyle dans
une proportion de 1/1/1, A polymère greffé avec OH et COOH 1/1).
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La Fig. 4 illustre le taux de recouvrement dans le lait de polymères à en-
ipreinte
moléculaire spécifiques à la tétracycline selon l'invention, en fonction du
mélange de polymères greffés utilisé pour la préparation du polymère iimprimé
(B polymère greffé avec COOH, OH et Benzyle dans une proportion de 1/1/1, A
polymère greffé avec OH et COOH 1/1).
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
Définitions
Les expressions "polymère à empreinte moléculaire" et " polymère in-iprimé"
sont utilisées indépendamment pour définir le polymère à erripreinte
moléculaire selon l'invention.
Le terme "interaction" est utilisée pour indiquer toute interaction, non
covalente
et non ionique, entre les groupements fonctionnels du polymère greffé et des
groupements spécifiques de la molécule cible. Ces interactions incluent les
interactions électrostatiques, les interactions de Van der Waals, les liaisons
hydrogène, les interactions hydrophobes, et les interactions aromatiques
(interactions Tr- n entre cycles aromatiques).
L'expression "molécule cible" est utilisée pour représenter toute molécule que
l'on souhaite détecter dans un milieu biologique. Ces molécules cibles selon
l'invention sont de préférence des antibiotiques ou des hormones corriportant
une combinaison de groupements fonctionnels tels que aromatiques, de
groupements hydroxyles carboxyliques, carbonyles ou amino dans leur
structure. Les antibiotiques sont par exemple des antibiotiques de la classe
des
tétracyclines, des sulfamides ou des quinolones. Les hormones sont de
préférence des hormones stéroïdiennes, comme par exemple les oestrogènes
(oestradiol, estriol ou estrone).
Le "polymère greffé" selon l'invention est un polymère tel que par exemple un
polyester, un polyhydroxyacide, un acide polylactique, un acide
polyglycolique,
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un polylactame, ou leurs copolymères sur lequel est greffé au moins un
groupement fonctionnel capable de former des interactions avec des
groupements spécifiques de la molécule cible. Le polymère greffé selon
l'invention peut par exemple être obtenu à partir du polymère décrit dans la
demande de brevet No. US 2005/0203270 Al sur lequel des groupements
fonctionnels sont greffés. De manière avantageuse, le polymère greffé est un
acide polylactique (PLA) greffé.
Comme indiqué ci-dessus, les "groupements fonctionnels" greffés sur le
polymère sont des groupements capables de former des interactions avec des
groupements spécifiques de la molécule cible. Les molécules cibles selon
l'invention étant préférentiellement des molécules comportant au moins un
groupement aromatique et au moins un groupement hydroxyle et/ou amino
dans leur structure, les groupements fonctionnels du polymère greffé seront de
préférence des groupements se terminant par des fonctions hydroxyle, amino,
aromatique ou acide carboxylique.
Description de modes de réalisations préférés de l'invention
Les inventeurs de la présente invention ont mis au point une méthode tout à
fait
originale pour obtenir des polymères à empreinte moléculaire destinés à
détecter une molécule cible dans un milieu biologique, à partir de polymères
déjà construits. La polymérisation est faite au préalable et l'empreinte est
produite par la suite au moyen d'un mécanisme strictement physique.
La Figure 1 représente les différentes étapes d'un mode de réalisation
particulier du procédé selon l'invention. Plus particulièrement, le procédé de
préparation des polymères à empreinte moléculaire selon l'invention comprend
une première étape de préparation d'un mélange comportant au moins un
polymère greffé par des groupements fonctionnels et la molécule cible. Le
mélange est préparé en présence d'un solvant ou un mélange de solvants
capable dans lequel le ou les polymères greffés et la molécule cible sont tous
les deux solubles. Lorsque le polymère greffé et la molécule cible sont en
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contact, des interactions physiques se produisent entre les groupements
fonctionnels du polymère et des groupements spécifiques de la molécule cible.
Il se forme ainsi un "complexe polymère(s)-molécule cible" qui va déterrniner
la
structure finale du polymère imprimé obtenu à la fin du procédé.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le polymère greffé est un
polymère tel que le polymère décrit dans la demande de brevet No.
2005/0203270 Al sur lequel des groupements fonctionnels sont éventuellement
greffés.
Ainsi, le polymère greffé peut être un polymère de formule (I) suivante:
0
Z H
HO R 0
Rz m (I)
~-~ y,-~ x
A B
dans laquelle:
Z est -O- ou -NH-;
R, représente une chaîne d'un hydroxyacide ou d'un aminoacide dérivant
d'un monomère (A) étant un ester ou diester cyclique ou un amide ou ciiamide
cyclique;
R2 représente un groupement-CH2-O-CH2-CH-R3 avec R3 = OH, NH2,
COOH ou COOBn (Bn is benzyl) dérivant d'un époxyde (B);
n est le nombre d'unité dérivant du monomère (A);
m est le nombre d'unités dérivant de l'époxyde (B);
x est égal à n+m;
et le rapport m/x est compris entre 0.005 et 0.30.
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De préférence, le polymère est obtenu à partir du dilactide (3,6-diméthyl-1,4-
dioxane-2,5-dione) comme monomère (A). Ainsi, le polymère obtenu est un
acide polylactique fonctionnalisé de formule I dans laquelle Z = O et R, = -
CH2-
CH3.
Les molécules cibles qui sont avantageusement utilisées dans le procédé selon
l'invention, sont des antibiotiques ou des hormones comportant une
combinaison de groupements fonctionnels tels que aromatiques, groupements
hydroxyles, caroboxyliques, carbonyles ou amino dans leur structure. Les
antibiotiques sont par exemple des antibiotiques de la classe des
tétracyclines,
des sulfamides ou des quinolones. Les hormones sont de préférerice des
hormones stéroïdiennes, comme par exemple les oestrogènes. De préférence,
les antibiotiques utilisés en tant que molécules cibles selon l'invention sont
de la
classe des tétracyclines et des sulfamides.
Le choix des polymères greffés et plus particulièrement de leurs groupements
fonctionnels et des molécules cibles tels que définis ci-dessus est dicté par
la
possibilité de former des interactions entre les groupements fonctionnels du
polymère et des groupements spécifiques de la molécule cible. En effet, la
structure finale du polymère imprimé et sa spécificité vis-à-vis de la
miolécule
cible à détecter par la suite est déterminée par ses interactions. Ainsi, plus
le
nombre d'interactions possible sera élevé, plus le polymère à erripreinte
moléculaire sera spécifique à la molécule cible. Par exemple, si la rriolécule
cible selon l'invention comprend au moins un groupement aromatique, le choix
d'un polymère greffé par un groupement fonctionnel comportant égalernent un
groupement aromatique s'avérera intéressant sachant que des interactions de
type 1r-rr entre les deux groupements aromatiques pourront se faire. De plus,
si
la molécule cible comporte au moins une fonction amino ou hydroxyle, le
polymère greffé pourra avantageusement comporter lui aussi des fonctions
amino ou hydroxyle, ou bien acide carboxylique pour former avec les
groupements amino ou hydroxyle de la molécule cible des interactions de type
liaison hydrogène et interactions électrostatiques.
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On comprendra que dans le mélange préparé à la première étape du procédé, il
est également possible de mettre la molécule cible en contact avec plus d'un
polymère greffé. Avantageusement, on peut mettre la molécule cible en contact
avec plusieurs polymères greffés, chacun possédant un type de groupement
5 fonctionnel. Par exemple dans le cas du PLA greffé, il est possible de
miettre en
contact la molécule cible avec à la fois un PLA greffé possédant un
grou,pement
fonctionnel R2 se terminant par un COOH, et un PLA greffé possédant un
groupement fonctionnel R2 se terminant par un COOBn.
Le mélange du ou des polymères greffés avec la molécule cible se fait
10 avantageusement en présence d'un solvant ou d'un mélange de solvants.
Ainsi,
on peut par exemple utiliser un solvant unique dans lequel les pollymères
greffés et la molécule cible sont tous les deux solubles, ou bien on peut
utiliser
un mélange de solvants comprenant un solvant dans lequel les pollymères
greffés sont solubles et un solvant dans lequel la molécule cible est soluble.
Le
choix des solvants est évident à une personne dans le domaine selon la nature
du polymère et celle de la molécule cible. En se référant à la littératuire il
est
possible de connaître quels solvants solubilisent le polymère et la rriolécule
cible visés.
Dans le cas du PLA, un solvant de dissolution approprié est par exemple
l'acétone ou encore le dichorométhane. Les tétracyclines sont par exemple
solubles dans le méthanol. Le sulfaméthoxazole, de la famille des sulfamides,
est avantageusement dissout dans l'éthanol. En général, la dissolution se fait
à
température ambiante.
La deuxième étape du procédé selon l'invention implique l'obtention de
particules solides ou d'un film comprenant le "complexe polymère-n-iolécule
cible". Le film peut être obtenu à partir du mélange complexe polymère-
molécule cible-solvant(s) qui est par exemple étalé en couche et le ou les
solvants sont évaporés. Les particules sont avantageusement obtenues par
précipitation, soit par évaporation sous vide, soit par nébulisation. La
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nébulisation peut se faire par exemple en utilisant un séchoir de Büchi B-
290TM
La taille des particules peut varier de quelques centaines de nanomètres à
quelques centaines de microns selon le type de polymère greffé et de molécule
cible. La taille des particules est également un paramètre que l'horrime du
métier est en mesure d'optimiser selon la sensibilité souhaité. De la même
manière, une personne dans le domaine est en mesure d'optimiser la surface
spécifique des particules et/ou le ratio polymères/molécule cible.
Dans le cas d'un complexe PLA-tétracylcine, les particules obtenues dans ce
cas ont une taille qui est de l'ordre de 4 à 6 pm.
La troisième étape du procédé selon l'invention consiste en l'élimination de
la
molécule cible qui était liée au polymère greffé pour former le polymère à
empreinte moléculaire. L'élimination de la molécule cible peut se faire par
exemple par lavage avec un solvant qui ne dissout pas le polymère.
L'acétonitrile est avantageusement utilisé dans le cas des tétracyclines et
l'eau
convient comme solvant de lavage dans le cas des sulfamides.
A l'issu de cette troisième étape du procédé, on obtient un polyimère à
empreinte moléculaire spécifique à la molécule cible qui a été utilisée dans
le
procédé. Le polymère obtenu peut être présenté sous la forme de poudre, de
bandelette, de film, de colonne etc.
Le polymère à empreinte moléculaire ainsi obtenu peut donc être utilisé pour
la
détection de la molécule cible dans un milieu biologique. Par exemple, le
polymère à empreinte moléculaire peut être utilisé pour détecter la molécule
cible dans le lait, l'urine, le sang, la viande, les eaux consommables ou
usées,
etc.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le polymère à erripreinte
moléculaire est un polymère à base de PLA tel que décrit ci-dessus, qui est
spécifique à un antibiotique de la famille des tétracyclines ou des
sulfamides.
Ainsi, ce polymère à empreinte moléculaire est utilisé pour détecter ce type
d'antibiotique dans un milieu biologique tel le lait ou l'urine. De
préférence, le
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polymère à empreinte moléculaire selon l'invention permet de détecter une
tétracycline ou un sulfamide présent dans le lait.
La présente invention fournit également un kit de dépistage de molécules dans
un milieu biologique. Le kit comprend un polymère à empreinte moléculaire
obtenu selon le procédé décrit ci-dessus et un moyen de détectiori de la
molécule. L'utilisation d'un tel kit est simple. Elle implique une première
étape
de mise en contact du milieu biologique qui est sensé contenir la molécule
cible
avec le polymère à empreinte moléculaire. Si la molécule cible est en effet
présente dans le milieu biologique, elle est "reconnue" par le polymère à
empreinte moléculaire et est retenue au sein du polymère. La deuxièmE: étape
lors de l'utilisation du kit est de détecter la molécule cible ainsi retenue
par un
moyen de détection, de préférence visuel.
Étant donné que la molécule cible selon l'invention comporte avantageusement
un cycle aromatique, une détection visuelle grâce à une lampe UV est de choix.
L'utilisation d'une lampe UV ne requiert pas de formation technique ou la
présence d'un technicien pour voir une fluorescence, d'où l'avantage de ce
type
de détection qui offre un résultat fiable.
D'autres moyens de détection sont envisageable et vont dépendre de la nature
de la molécule cible. Par exemple, si la molécule cible est la tétracycline,
la
détection peut également se faire par colorimétrie. En effet, on sait d'après
la
pharmacopée que la tétracycline réagit avec le chlorure de fer, la solution
passant d'une couleur jaune à brune. Toute méthode colorimétrique basée sur
la réactivité spécifique des groupements fonctionnels de la molécule cible
peut
être utilisée. Des méthodes par interaction de fluorescence d'un groupement
(anthracène) porté par le polymère peuvent également être utilisées.
Un tel kit est particulièrement intéressant par exemple pour détecter un
antibiotique, tel que par exemple une tétracycline, présent dans le lait
directement au pis de la vache. Le kit peut se trouver sous la forme d'une
trousse de dépistage utilisable directement par l'éleveur. Par exemple, cette
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trousse comprend le polymère à empreinte moléculaire présent sur une lamelle
sous une forme stable. L'éleveur prélève un échantillon de lait d'une vache
qui
a été traitée par la tétracycline et le dépose sur la lamelle pour qu'il soit
en
contact avec le polymère à empreinte moléculaire. De préférence, l'échantillon
reste en contact avec le polymère imprimé pour un temps déterminé pour
chaque molécule cible (12h pour les tétracyclines dans le test préalable).
Après
ce temps, l'éleveur observe la lamelle sous une lampe UV. Dans le cas où
l'éleveur observe une fluorescence, il doit s'interdire la traite de la vactie
car la
tétracycline n'est pas totalement éliminée de son organisme. Au cas d'une
absence de fluorescence, le taux de tétracycline dans le lait est inférieur au
seuil de détection du polymère imprimé, qui correspond au taux maximal de
tétracycline accepté dans le lait. L'éleveur peut donc continuer à traire la
vache.
Cela présente une approche tout à fait simple, rapide, spécifique, écoriomique
et applicable au pied de la vache par des personnes n'ayant pas
nécessairement besoin d'une formation spécifique.
Exemples
Dans les exemples qui suivent, le polymère à empreinte moléculaire testé est à
base d'acide polylactique (PLA). La molécule cible est de la famille des
tétracyclines. Plus précisément, des tests ont été effectués avec la
tétracycline
(TC) et l'oxytétracycline (oxy-TC) dont les structures sont représentées ci-
dessous.
OH 0 OH O 0
OH
I I I
\`,.= H OH
HCH
s N
H3C~ CH3 Tétracycline (TC)
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OH O OH O O
OH
N
1 I i
\ \\\`,.= H OH
HO CH H i ""-C
3 OH /N~
H3C cH, Oxytétracycline (Oxy-TC)
Le PLA comporte de longues chaînes filiformes qui sont construites par la
réaction du groupement acide d'une molécule d'acide lactique sur le
groupement hydroxyle d'une autre pour donner une jonction ester selon la
réaction suivante:
0
HP ~ Catalys t+ CH3 0 CH3 0
p Heat
O-CH-CI O-CH-CI-
CH3 n
0
Lactide Polylactide
La Figure 1 illustre des exemples d'interactions possibles entre le PLA une
fois
greffé, avec les groupements fonctionnels et la tétracycline. Ces interactions
comprennent par exemple des liaisons hydrogène entre les fonctions acide
carboxylique des groupements fonctionnels greffés sur le PLA et les
groupements hydroxyles de la tétracycline. La Figure 1 montre aussi la
possibilité d'interactions entre le cycle aromatique de la tétracycline et le
phényle d'un groupement fonctionnel greffé sur le PLA.
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1- Synthèse des polymères PLA greffés
1.1- Synthèse du PLA-allyle
o
o aH3
SnPh4 (1:10 000) 0
180C ( 6 heures)
F-~c 0 0
PLA Å
3,6-Diméthyl-1,4-dioxane Glycidyl éther P(,A-allyr 0
-2,5-dione ( dilactide>) d'allyle
1) Mettre le SnPh4 (tétraphényle étain) dans un creuset avec un ratio (1 10
5 000) par rapport au 3,6-diméthyl-1,4-dioxane-2,5-dione et mélanger;
2) Mettre le mélange préparé à l'étape 1 dans un ballon à fond rond de 250
mI;
3) Ajouter du toluène (juste assez pour que le produit soit totalement
submergé);
10 4) Évaporer le toluène à l'aide d'un évaporateur rotatif (140 rpm, 45 C);
5) Mettre le ballon à fond rond de 250 ml dans un dessiccateur contenant du
P205 (pentoxyde de phosphore) pour la nuit;
6) Prendre le ballon à fond rond de 250 ml contenant le 3,6-diméthyl-1,4-
dioxane-2,5-dione + SnPh4;
15 7) Ajouter le volume calculé de glycidyl éther d'allyle dans le ballon;
8) Purger le ballon de 250 mL avec de l'argon (répéter cette étape 3 fois);
9) Préchauffer le bain de paraffine et le régler à 180 C ;
10) Laisser réagir pendant environ 6 heures ;
11) Une fois refroidi, mettre le ballon à fond rond dans un dessiccateur
contenant du P205 (pentoxyde de phosphore), faire le vide et le laisser pour
la
nuit;
12) Dissoudre le produit dans environ 100-125 ml d'acétone;
13) Récupérer le PLA-allyl dans un grand volume d'eau;
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14) Mettre le produit obtenu dans un dessiccateur contenant c-u P205
(pentoxyde de phosphore) et faire le vide.
1.2- Synthèse du PLA-OH par hydroboration du PLA-allyle
Hbon
O 1=~- TI-F
1}-F, (TC O
2 N~-I (3-`~, ~-~O
~ c~ ~ ~ PLA~,~ Å
PL,4allSl C PLArqi O
1) Dissoudre la quantité voulue de PLA-allyle dans 300 ml de THF dans un
ballon à fond rond de 2 I;
2) Ajouter au ballon à fond rond de 21 le volume calculé de BH3=THF 1 M,
goutte à goutte; (1 équivalent de BH3-THF 1 M pour 1% de groupement
allyle);
3) Laisser réagir pendant environ 2 heures;
4) Une fois les 2 heures écoulées, ajouter respectivement les volumes
calculés de H20, de la solution de NaOH 3N (hydroxyde de so(lium) et
de H202 30% (peroxyde d'hydrogène);
5) Après 1 heure, ajouter 300 ml de H20 au produit obtenu à l'étape 4, puis
évaporer le mélange réactionnel à l'aide d'un évaporateur rotatif (160
rpm et T = 45 C);
6) Dissoudre le produit obtenu dans 50 ml d'acétone;
7) Ajouter 100 ml de H20 au liquide obtenu à l'étape 6, et évaporer
l'acétone à l'aide de l'évaporateur rotatif (160 rpm et T = 45 C);
8) Mettre le produit obtenu dans un dessiccateur contenant clu P205
(pentoxyde de phosphore), faire le vide et laisser pendant la nuit.
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1.3- Synthèse du PLA-COOH : Oxydation de Jones
HO 0
Oxydation de Jones
o :::
a~ PLA PLA y"' 01
irpL""
PLq- O PLA-COOH O
1) Dissoudre la quantité voulue de PLA-OH dans 500 ml d'acétone dans un
ballon à fond rond de 2 I;
2) Ajouter goutte à goutte, le réactif de Jones (2 équivalents d'o)(yde de
chrome VI (Cr03) pour du PLA-OH 1 !o,);
3) Laisser réagir pendant environ 3 heures;
4) Après les 3 heures, ajouter environ 30 ml d'isopropanoi (i-PrOH) afin
d'arrêter la réaction (l'isopropanol va détruire le réactif de Jones);
5) Ajouter 500 ml de la solution de HCI 1 N et évaporer le niélange
réactionnel à l'aide de l'évaporateur rotatif (190-200 rpm et T = 45 C);
6) Après environ 3 heures, vider le liquide restant dans le ballon dans le bac
de récupération des acides;
7) Dissoudre le gel jaunâtre dans 50 ml d'acétone;
8) Ajouter 125 ml d'eau distillée;
9) Évaporer l'acétone à l'aide de l'évaporateur rotatif (160 rpm et T = 45 C);
10) Mettre le produit obtenu dans un dessiccateur contenant du P205
(pentoxyde de phosphore), faire le vide et laisser pendant la nuit.
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1.4- Synthèse du PLA-COCI
Ho 0 a o
Qilorure de thionyle
O ~Z 0
T arribiante
PLA \ C 0 PLA PLA Cr, n n
PLA-COOH p PLA-COCI 0
1) Dissoudre 500 mg de PLA-COOH dans 5 ml de chloroforme (CHC13);
2) Mettre 5 ml de chlorure de thionyle (SOCI2) dans un ballon à fond rond
de 100 ml;
3) Ajouter goutte-à-goutte la solution obtenue à l'étape 1 dans le ballon;
4) Laisser réagir pendant environ 2 heures;
5) Évaporer le solvant à l'aide de I' évaporateur rotatif (145 rpm et T
40 C);
6) Mettre le produit obtenu dans un dessiccateur contenant du P205
(pentoxyde de phosphore), faire le vide et laisser pendant la nuit.
1.5- Synthèse du PLA-OBn
CI 0 Bn0 O
BnOH + 0 ---~ 0
PLA 0D0PLA PLA OD"OPLA
0 5% 0 5 i
A une solution de 110 mg de polymère PLA-COCI dans du chloroforrrie sont
ajoutés 100 ml d'alcool benzylique, 100 ml de pyridine et 10 mg de DMAP. Le
mélange réactionnel est agité durant 3 h, puis neutralisé avec du HCI 1 N. Le
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produit est récupéré par élimination par évaporation du chloroforme en
présence d'eau. Ce polymère a été caractérisé par résonance magnétique
nucléaire'H pour détecter les différents groupements existants ainsi que de
s'assurer de la présence du groupement benzyle. Sa masse moléculalire a été
calculée à l'aide d'une chromatographie par perméation de gel.
2- Préparation des Polymères à empreinte moléculaire à base de PLA
2.1- Polymère à empreinte moléculaire A
On prépare dans un bécher un mélange de 250 mg de PLA 5% + 200 mg de
PLA-OH + 200mg de PLA-COOH +200 mg de TC dans 100 ml d'acétone
(milieu de dissolution du PLA)+ 100 ml de méthanol (milieu de dissolution de
la
TC hydrochloride). Le mélange est placé sous agitation magnétique jusqu'à
dissolution complète, à température de la pièce. Le mélange est traité à
travers
un séchoir par nébulisation du type Büchi B-290TM dans les conditions
suivantes: température d'entrée de 50 C, aspiration à 90% et pompe à 30%.
Des particules comprenant le "complexe PLA-greffé-TC" de taille nioyenne
d'environ 4 à 5 pm sont obtenues.
Ensuite les particules sont lavées avec un mélange acétonitrile/eau/acide
acétique (92.5/2.5/5) v/v/v afin d'éliminer la TC. II y a deux méthodes de
lavage
possible. La première consiste à prendre des tubes de 15 ml dans lesquels on
met 50 mg des particules avec 13 ml de la solution de lavage puis on agite
sous
vortex pendant 10 min. L'étape suivante consiste à mettre les tubes dans une
centrifugeuse à 3000 G, à une température stable de 20 C pendant 15 min. On
récupère le surnageant, on prend un échantillon qu'on fait passer dans un
appareil HPLC pour une détection de la tétracycline. L'opération doit être
répétée 6 fois jusqu'à la disparition du pic détectable.
L'autre méthode de lavage consiste à remplir une colonne de garde de 5 cm
(SuperlcoTM, Bellafonte, USA) avec les particules de PLA-greffé-TC puis de
faire passer la solution de lavage dans le système à un débit de 1 mI/min.
Cette
méthode est simple car on peut observer la variation du taux de la TC
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directement sur l'écran du système. L'opération dure à peu près 3 heures
jusqu'à ce que la courbe soit linéaire et proche de zéro.
2.2- Polymère à empreinte moléculaire B
On prépare un mélange 1/3 de PLA-OH, 1/3 de PLA-COOH et 1/3 de PLA-OBn
5 avec 200 mg de TC dans 100 mi d'acétone et 100 ml de méthanol comme
solvants. Le mélange est placé sous agitation magnétique jusqu'à dissolution
complète, à température de la pièce. Les solvants sont ensuite éliminés par
évaporation sous vide. On obtient une poudre blanche poreuse avec des tailles
moyennes de particules aux alentours de 5 à 6 m, visibles au microscope
10 optique.
Le lavage des particules pour éliminer la TC se fait comme indiqué ci-dessus
pour le polymère à empreinte moléculaire A.
2.3- Polymère à empreinte moléculaire C
Le polymère C est préparé de la même manière que décrit ci-dessus pour le
15 polymère B si ce n'est que l'oxytétracycline est utilisée à la place de la
tétracycline.
3- Caractérisation des Polymères à empreinte moléculaire de PL.A
Les polymères à empreinte moléculaire A et B ont été testés sur du lait qui
contient la molécule cible. Du lait sans ajout de l'antibiotique et des NIP
20 (polymères non imprimés) servent de témoins.
On procède comme suit : 5 ml de lait sont mélangés avec 5ml d'acétoriitrile en
présence de 1 mg de TC. Après agitation, on laisse reposer pendant 10 minutes
à température ambiante. Ensuite, on centrifuge la solution pendant 20 rninutes
à une vitesse de 5000 g. Le surnageant est par la suite transféré dans des
flacons. L'opération est répétée plusieurs fois afin d'avoir assez de cette
solution. 110 mg de A ou B lavés préalablement avec la solution de lavage sont
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incubés dans 20 ml de lait pendant 24 h. Les NIP sont soumis aux mêmes
conditions.
Pour fin de validation un dosage HPLC a été réalisé pour déterminer le taux de
recouvrement de ces polymères A et B. Les résultats sont représentés sur les
Figures 3 et 4.
Le graphique de la Figure 3 démontre que la tétracycline a été détectée dans
le
lait sur les polymères à empreinte moléculaire A et B.
Le graphique de la Figure 4 compare le taux de recouvrement de A et E3, c'est-
à-dire le taux de recouvrement en fonction du mélange de polymères greffés
utilisé pour la préparation du polymère imprimé (B polymère greffé avec COOH,
OH et Benzyle dans une proportion de 1/1/1, A polymère greffé avec OH et
COOH 1/1). L'introduction du groupement benzyle dans B a augmenté
significativement le taux de détection par rapport à A.
4- Kit de détection
Un intérêt de l'invention est de produire une méthode de détectioin de la
présence des résidus d'antibiotiques dans le lait assez simple et au pied de
la
vache. Concernant la détection visuelle des résidus, deux approches ont été
retenues. A cause de la présence du cycle aromatique dans le pharmacophore
de la tétracycline, une détection visuelle grâce à une lampe UV est un bon
choix. L'utilisation d'une lampe UV ne requiert pas de formation technique ou
la
présence d'un technicien pour voir une fluorescence, d'où l'avantage de cette
nouvelle approche qui offre un résultat fiable et sur place. D'après la
pharmacopée, la tétracycline réagit aussi avec le chlorure de fer ce qui
offrirait
une détection colorimétrique. La solution passant d'une couleur jaune à brune.
Les tests ont été effectués sur des échantillons de tétracycline ayant des
concentrations allant de 0 à 200 g/I.
La solution avec le chlorure de fer a été préparée en 3 concentrations
différentes 1 M, 2M et 3M. Après plusieurs essais, la détection
colorimétrique,
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qui se manifeste comme une coloration grise de la solution, s'est avéré très
efficace à partir d'une concentration de 150 g/I.
Avec la lampe UV, la détection (fluorescence) peut se faire pour une
concentration de 50 g/I. La lampe UV s'avère comme un outil de détection
fiable et économique à la fois. Dans le cas d'une fluorescence, l'éleveur doit
arrêter de traire la vache car la tétracycline n'est pas totalement éliminée
de son
organisme. En absence de fluorescence, le taux de tétracycline dans ce lait
est
inférieur à 50 g/I, donc le fermier peut continue à traire la vache.
Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en
détail ci-haut et illustrés dans les exemples, l'invention n'est pas limitée à
ces
seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications peuvent
y être effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ni de
l'esprit
de l'invention.
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