PROCESS FOR EXTRACTING LIPIDS FROM MARINE SOURCES PRODUCING AN EXTRACT RICH IN OMEGA-3 PHOSPHOLIPIDS

UN PROCEDE D'EXTRACTION DES LIPIDES DE SOURCE MARINE PRODUISANT UN EXTRAIT RICHE EN PHOSPHOLIPIDES OMEGA-3

Abrégé français

Nous avons développé un système d'extraction des lipides à partir des oeufs de
hareng. Il s'agit d'un procédé en une seule étape qui génère deux phases : une
phase supérieure
enrichie en solvants , appelée phase supérieure et une phase aqueuse pauvre en
matières
liposolubles. La phase supérieure est constituée d'un système ternaire qui
extrait à la fois les
lipides neutres et les lipides polaires. Ce système ternaire est généré par la
combinaison d'un
solvant apolaire et un solvant polaire dans des proportions qui ont été
préalablement testées et
optimisées. Il s'agit d'un mélange à volume égal d'acétate d'éthyle et
d'acétone que l'on sature
avec une solution d'acide citrique à 5 % dont le pH a été ajusté à 4,5 avec de
l'hydroxide de
sodium. Nous ajoutons au solvant de l'orizanol à 0,1%. Le solvant apolaire de
la phase
supérieure étant peu miscible avec l'eau fait en sorte que cette phase
contient très peu d'eau. Nos
expériences ont montré que la phase supérieure se distille relativement bien
sous vide partiel. Ce
qui permet d'obtenir un extrait semi-visqueux . Le rendement que nous avons
obtenu est
légèrement inférieur à celui obtenu avec la méthode classique de Bligh et Dyer
avec le
chloroforme: méthanol.
Nous avons noté que le matériel choisi garde une certaine consistance lorsque
nous travaillons à
pH acide (5 et moins) ce qui facilite la filtration. Nous avons aussi qu'un pH
acide du mélange
ternaire cause un noircissement de l'huile (oxydation). A partir de pH 4,5 et
à pH plus élevé ce
phénomène est beaucoup moins prononcé. Nous avons aussi introduit un agent
chélateur dans la
phase aqueuse, ce qui devrait réduire la présence des métaux lourds dans les
lipides de l'extrait.
Comme antioxydant nous ajoutons un extrait d'huile de riz. On pourrait
utiliser d'autres
antioxydants tels que des caroténoides (astaxanthine, leucopène , vitamine E
et autres
antioxydants)
Comme agent chélateur on pourrait faire appel à une résine échangeuse de
cations ou encore à
des extraits de protéines de petit lait.
Une personne familière avec l'art pourrait appliquer cette méthode à toute
biomasse terrestre ou
marine.

Revendications

REVENDICATIONS
1.-Un procédé d'extraction des lipides d'animaux marins faisant appel à une
combinaison d'un
solvant organique polaire et d'un solvant organique non polaire et permettant
d'obtenir les
diverses classes de phospholipides.
2.-Le procédé de la revendication 1 où les lipides sont extraits de poissons
3.-Le procédé de la revendication 1 où le solvant non polaire utilisé est un
acide organique acylé
4.-Le procédé de la revendication 3 où le solvant acylé est l'acétate d'éthyle
5.- Le procédé de la revendication 1 où le solvant polaire est une cétone
6.- Le procédé de la revendication 5 où le solvant polaire est l'acétone
7.- Le procédé de la revendication 1 où une combinaison du solvant polaire et
du solvant non
polaire se retrouve en proportions variant de 10 à 90% du volume total
8.- Le procédé de la revendication 7 où l'acétone et l'éthyl acetate se
retrouvent dans des
proportions variables , idéalement dans un rapport volume ;volume de 1 pour 1
9.- Le procédé de la revendication 1 où le tissu choisi est broyé finement au
hache-viande à
préférablement à basse température
10.- Le procédé de la revendication 1 où la matière broyée est extraite par la
combinaison de
solvants durant une période suffisante pour extraire les lipides de 5 minutes
et plus
préférablement 30 minutes et plus .
11.- Le procédé de la revendication 1 où l'extrait est séparé de la matière
solide par
sédimentation, centrifugation, filtration
12.- Le procédé de la revendication 1 où les solvants de l'extrait sont
séparés par évaporation,
distillation ou par filtration sur membrane.
13.- Le procédé de la revendication 1 où on obtient une composition de lipides
de poisson

14.- Le procédé de la revendication 13 où la composition est obtenue de
poissons riches en
lipides tels que saumon hareng, maquereau flétan, anchois, morue, thon
15.- Le procédé de la revendication 13 où les pesticides et le cholestérol
sont éliminés par short-
path distillation à haute température
16.- Le procédé de la revendication 1 où les métaux lourds sont chélatés par
addition d'un agent
chélateur tel que l'acide citrique ou 1'EDTA (éthylenediamine tétraacétate )
17.- Le procédé de la revendication 1 ou l'agent chélateur acide citrique est
ajouté à une
concentration de finale de 2,0 % basée sur la teneur en eau de la matière
extraite.
18.- Le procédé de la revendication 1 où un agent antioxydant est ajouté à une
concentration
suffisante pour réduire l'oxydation des lipides .
19 .- Le procédé de la revendication 1 où l'agent antioxydant est de
l'orizanol
20.- Le procédé de la revendication 19 où l'orizanol est ajouté à une
concentration 0,05% et plus
du poids/ volume des solvants utilisés pour l'extraction.
21.- Le procédé de la revendication 1 où le ratio volume de solvants par
rapport au poids frais est
de 1 pour 1 et plus idéalement 3 pour 1
22. Une composition obtenue selon le procédé décrit à la revendication
comprenant des
phospholipides et des lipides neutres d'origine marine .
23. L'utilisation de ce procédé pour l'extraction de lipides de sources
marines autres que le
poisson (algues , microalgues, calmars et pieuvres crustacées, mammifères
marins.

Description

CA 02656545 2009-02-26
MÉTHODES EXPÉRIMENTALES
Sauf indication contraire le matériel provenant du poisson est congelé Le
matériel est broyé au
hache-viande avec ouvertures de 1/8 pouce. Le matériel haché est pesé et
plongé dans les
solvants à température de la pièce. Après une période minimale de trente
minutes d'agitation
lorsque l'échantillon peut sédimenter, on le laisse sédimenter durant une
quinzaine de minutes .
Le solvant est décanté et la suspension est soit filtrée ou centrifugée durant
3 min à 1000g . Le
volume d'extrait est mesuré. Pour déterminer la teneur en lipides 3
échantillons de 10ml sont
prélevés et évaporés au four à 90 *C . Nous faisons la moyenne.
Pour la séparation des diverses classes de lipides polaires. Des échantillons
sont déposés sur des
plaques de silica gel G et séchés. La migration des lipides est réalisée dans
une chambre à
chromatographie par un mélange de solvants
Chlor : Methanol : eau :Acide acétique dans un rapport de 65 :25 : 3 : 4
Lorsque la migration est complétée les spots de lipides sont révélés à l'iode
après avoir séché la
plaque au préalable
RÉSULTATS
20 nov 2008 Test de partition de lipides dans un système ternaire.
-l1er essai
Pour extraire les lipides nous avons opté pour un système ternaire ethyl
acetate : acetone
saline 8 :2 :1
De l'huile végétale est ajoutée 0,2 ml
Après saturation on voit que toute la coloration des lipides se trouve dans la
phase supérieure.
10,1 ml et la phase aqueuse 0,9 ml
2ième essai
Pour un mélange 7ml acetate éthyle ; 3 ml acétone avec 2 ml de saline + 0,2 ml
d'huile végétale
2,2 ml phase aqueuse
9,8 ml de phase supérieure
Tous les lipides vont dans la phase supérieure.
3`ème essai
Pour un mélange 6 acetate éthyle ; 4 ml acétone avec 2 ml de saline + 0,2 ml
d'huile végétale
2,4 phase aqueuse
9,6 ml phase supérieure
une phase intermédiaire apparaît (solubilité des lipides neutres réduite)

CA 02656545 2009-02-26
Extraction de lipides de poissons avec la combinaison de solvants
Date espèces ethyl acetate:acétone recu ération Chlor meth Matière
28-nov Maquereau 100 et O 17.5 18,2
80 et 20 19
70 et 30 19,4
03-déc flétan tête 64 et 36 16% 14 3 pour 1
04-déc oeufs hareng 78 et 22 0,4 2,3 2 pour 1
O et 100 1,44
8 dec flétan 18,1
dec oeufs de hareng 50 et 50 4 2 pour 1
O et 100 2,8 2 pour 1
12 dec maquereau filets 50 et 50 16,75 16,1 2 pour 1
14 dec maquereau 50 et 50 froid 16,9 12,5? 2 pour 1
50 et 50 chaud 18,9 2 pour 1
16 dec maquereau 50 et 50 + citrate 12,9 13,2 2 pour 1
50 et 50 pH 0,8 12,8 2 pour 1
21 janv oeufs de hareng 50 et 50 +HCI 3,9 3,4 3 pour l
50 et 50 -HCI 3,2
10 fev oeufs de hareng 50 et 50 + HCI -0 3,3 -16% 3,6 3 pour 1
50 et 50 + HCI+O 3,8'-16%
11 fev oeufs de hareng 50 et 50 pH 2 5,2 3 pour 1
50 et 50 pH 3 5,1 3 pour 1
50 et 50 pH 4 3,9 3 pour 1
50 et 50 pH 5 3,8 3 pour l
50 et 50 pH 6 4,2 3 pour 1
50 et 50 pH 7 4 3 pour 1
50 et 50 pH 10 4,7 3 pour 1
50 et 50 eau 5,1 3 pour 1
19 fev oeufs de hareng 50 et 50 pH 4,5+0 3,57 3,8 3 pour 1
fev oeufs de hareng 50 et 50 citr pH4,5 3,27 3 pour 1
21 fev oeufs de hareng Extrait du 20 fev 6,5 3 r I

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Description des conditions expérimentales et commentaires
28 nov. Comme le maquereau contient surtout des lipides neutres l'acétate
d'éthyle seule est très
efficace. L'augmentation avec acetone est attribuable à la présence de
phospholipides non
extraits par acétate d'éthyle
4 dec L'extraction des oeufs de hareng est très faible parce que l'acétate
d'éthyle ne solubilise
pas bien les lipides polaires
dec Le rendement de 4 % est très satisfaisant, par contre l'acétone seule
semble moins
efficace 2,8%
14 dec L'extraction des lipides de poisson peut se faire à chaud ou a froid.
Les valeurs sont
supérieures à chaud i.e. température de la pièce
21 janv. Influence du pH de la solution aqueuse sur le rendement. A pH acide
on a des valeurs
plus élevées 3,9 vs 3,2%. A pH neutre les oeufs prennent un aspect laiteux. de
plus on note une
coloration brune ambrée qui s'accentuem lorsque les échantillons sont séchés
10 fev . Si l'on met dans le mileieu d'extraction de l'orizanol (O) un
antioxydant la coloration
diminue légèrement,. Le rendement apparemment plus élevé doit être corrigé
pour tenir compte
du lipide ajouté. Malgré cela il reste plus élevé.De plus comme l'indique le
chiffre 16% nous
avons ré-extrait les lipides obtenus par notre procédé et nous selon la
méthode de Bligh et Dyer
les résultats obtenus sont 16% plus bas ce qui indique que notre méthode
extrait des ingrédient s
qui ne seraient pas lipidiques. Il faut donc réduire le rendement de 16%.
11 fev L'influence du pH de la solution aqueuse sur le rendement et la couleur
a été mesuré.
Le rendement semble plus élevé à pH acide et dans l'eau
A pH supérieur à 6 le matériel devient laiteux alors qu'a pH acide les
matériel est floconneux
et se sépare bien de la solution. Encore une fois la coloration apparaît à pH
3,0 ou moins
19 fev Ici on a changé le ratio solvant matière première 2 :1 pour 3 :1 .
L'extraction fonctionne
aussi bien.
fev Cette expérience consistait à vérifier si l'on pouvait charger davantage
le solvant. On
prenait un extrait pour ré-extraire de la nouvelle matière première. On peut
voir que le deuxième
extrait donne une valeur double du premier extrait .

CA 02656545 2009-02-26
AUTRES RÉSULTATS
Viscosité Nous avons noté qu'après évaporation des solvants l'extrait prenait
un aspect semi-
visqueux. Pour corriger cet aspect nous avons ajouté à la préparation des
esters éthylés
concentrés en DHA et EPA fournis par Ocean Nutrition, Halifax Canada. Le
mélange est
devenu fluide à Température de la pièce .La quantité ajoutée était de 10% du
poids
Adsorption de l'extrait de lipides de hareng sur support solide.
L'extrait lipidique a été suspendu dans l'éthanol et de la poudre de cellulose
microcristalline
Avicel -100 a été mélangé dans un ratio de 2 :1 poids poudre : poids lipides.
L'éthanol a été
évaporé à 55 *C Le mélange résultant est homogène et de coloration jaune pâle
sans odeur de
rancissement après 10 jours. On pourrait ajouter plus de cellulose et au
besoin un antioxydant.
Figure 1 Influence de l'acidité de la phase aqueuse sur la coloration de
l'extrait.
Ce procédé d'extraction peut s'appliquer à tous les animaux marins et les
micro-algues .