Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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PROCEDE DE TRAITEMENT D'UNE PLANTE SUPERIEURE EN VUE DE
CONTROLER SA CROISSANCE ET SON ARCHITECTURE
Domaine technique
L'invention concerne un procédé de traitement en vu de contrôler la
croissance et l'architecture des plantes supérieures. Plus précisément,
l'invention concerne l'utilisation de strigolactones pour inhiber
sélectivement
ou globalement la croissance de bourgeons sur une plante d'intérêt, et ainsi
le nombre de ramifications. L'inhibition peut être temporaire de manière à
contrôler la période de développement de ces bourgeons, ou permanente
afin par exemple de favoriser la croissance d'autres ramifications au
détriment de celle(s) inhibée(s). L'invention concerne également l'utilisation
des strigolactones pour l'identification de gènes et/ou molécules intervenant
dans le processus de contrôle de la croissance et de la pousse des
bourgeons et/ou ramifications chez les plantes supérieures.
L'invention trouve des applications dans le domaine agricole, pour la
culture de plantes, telles que des plantes alimentaires, des légumineuses,
des plantes forestières, des plantes ornementales etc., pour lesquelles le
contrôle du nombre de ramifications et/ou de la période de ramification peut
améliorer le rendement et/ou la qualité de la production (taille du fruit,
qualité
du bois tec.). Par plantes supérieures, on entend les végétaux
pluricellulaires, vasculaires, munis de racines et d'une partie aérienne. Par
culture, on entend aussi bien la culture en champ, qu'en plantation pour les
forêts, que la culture in vitro, hors sol ou autre.
Etat de la technique
Les plantes cultivées, que ce soit pour leurs fleurs, leurs fruits, leurs
graines ou pour leurs parties végétatives font l'objet de nombreux contrôles
et traitements, de manière à obtenir le meilleur rendement possible et la
meilleure qualité.
Ainsi par exemple, on essaie de maîtriser les périodes de floraison de
manière à éviter que les bourgeons floraux soient initiés pendant les
périodes de forts risques de gel. De même, lorsqu'on souhaite obtenir des
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fruits de gros calibre, ou plus généralement des plantes plus vigoureuses, on
procède à une taille de la plante de manière à limiter le nombre de
ramifications et ainsi le nombre d'organes puits que sont les fruits en
période de grossissement ou les graines en cours de remplissage.
L'utilisation d'engrais permet également d'optimiser les rendements.
De tels contrôles et traitements nécessitent une connaissance outre
de la plante elle-même, des conditions dans lesquelles elle est cultivée :
nature du sol, climat etc., notamment pour savoir quand et comment tailler
les plantes. Par ailleurs, la taille est un procédé manuel fastidieux, coûteux
nécessitant l'intervention de personnes qualifiées.
Exposé de l'invention
Dans l'invention, on cherche à fournir un nouveau procédé de
traitement des plantes qui permette de contrôler leur croissance, par
inhibition totale ou partielle, définitive ou temporaire de la croissance des
ramifications, de manière notamment à optimiser le rendement de ces
plantes.
Pour cela, dans l'invention, on propose de mettre les plantes à traiter
en contact de strigolactones de manière à inhiber ou limiter la pousse de tout
ou partie des ramifications.
Les strigolactones sont des molécules composées d'une lactone
tricyclique connectée à un cycle butyrolactone par un pont énol éther.
On connaît actuellement de nombreuses strigolactones naturelles et
de synthèses.
Notamment, dans le document FR2865897 plusieurs strigolactones
sont utilisées pour amplifier le développement et/ou la croissance des
champignons mycorhiziens à arbuscules de manière à augmenter
l'interaction symbiotique entre ces micro-organismes et les plantes hôtes.
Les strigolactones sont également connues comme étant des
inducteurs de la germination des graines de plantes parasites telles que les
Orobanches. Afin d'éliminer de telles plantes des sols agricoles, on traite
lesdits sols avec des strigolactones de manière à induire la germination des
plantes parasites en l'absence de plantes hôtes, ce qui entraîne leur mort par
manque de nutrition.
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Comme l'ont découvert de manière surprenante les inventeurs, les
strigolactones interviennent aussi dans la croissance des plantes supérieures
en contrôlant le démarrage des ramifications et correspondraient au signal
SMS (Shoot Multiplication Signal) répresseur de la ramification identifié chez
plusieurs espèces dicotylédones et monocotylédones par la caractérisation
de mutants hyper-ramifiés notamment les mutants rmsl à rms5 de pois
(Beveridge 2006).
L'invention a donc pour objet un procédé de traitement d'une plante
supérieure en vu de contrôler la croissance et l'architecture de la plante,
caractérisé en ce qu'on place au contact de la plante une quantité adaptée
de strigolactones de manière à inhiber la formation d'au moins une
ramification.
Les strigolactones utilisées sont aussi bien des strigolactones
naturelles telles que
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ou que des strigolactones de synthèse, telle que la GR24, ou la
molécule ABC, ne comportant que certains cycles (A, B et C) des
strigolactones
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Par inhiber, on entend réprimer définitivement ou temporairement la
croissance d'un bourgeon. Ainsi, selon l'invention, on peut supprimer une
ramification en inhibant définitivement la croissance du bourgeon
correspondant, ou mettre en dormance ledit bourgeon de manière à retarder
5 dans le temps sa croissance.
Par ramification, on entend l'excroissance issue du bourgeon axillaire
situé à l'aisselle des feuilles, que ce soit une branche, une fleur ou une
inflorescence.
L'inhibition peut être globale, c'est-à-dire toucher tous les bourgeons
axillaires au moment du traitement de la plante, ou ciblée, c'est-à-dire ne
toucher que des bourgeons spécifiquement visés par le traitement.
Les plantes traitées peuvent aussi bien être cultivées en serres, qu'en
champs, in vitro ou même hors sol.
Une quantité adaptée s'entend d'une quantité au moins suffisante
pour agir sur la croissance et l'architecture de la plante à traiter.
Selon le procédé de l'invention, on peut appliquer une solution
comportant des strigolactones sur une portion au moins partielle de la partie
aérienne de la plante. Par exemple, on peut vaporiser ou déposer la
composition sur les bourgeons que l'on souhaite réprimer, ou sur la partie de
la plante dont on souhaite contrôler la croissance. Il est autrement possible
d'injecter la composition au niveau des bourgeons même, ou des tiges
portant les bourgeons à réprimer.
Dans un autre exemple de mise en oeuvre du procédé selon
l'invention, il est possible de prévoir d'enrichir le sol en strigolactones,
de
manière à diminuer de manière non sélective le nombre de tiges ou de
freiner leur croissance. En effet, les inventeurs ont observé que le signal de
répression SMS de la croissance des ramifications migre dans le sens racine
- tige, ce qui laisse penser qu'il est véhiculé par la sève brute du xylème
(Foo et al. 2001 PI Physiol 126 :203-209).
Avantageusement, la concentration en strigolactones dans la
composition est au minimum de 1 nM et variera selon qu'on souhaite inhiber
définitivement ou temporairement la croissance du bourgeon, la
concentration étant en outre fonction de la nature de la plante à traiter.
D'une
manière générale, la concentration en strigolactones à appliquer variera
entre 1 nM et 100 M, et préférentiellement entre 100 nM et 1000 nM.
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De même, le nombre de jours de traitement peut varier en fonction de
la plante, de son âge au moment du traitement, de l'effet définitif ou non
souhaité etc.
L'invention a également pour objet l'utilisation de strigolactones pour
l'identification de gènes et/ou de molécules intervenant dans le contrôle de
la
croissance des bourgeons et/ou ramifications chez les plantes supérieures.
Ainsi, on peut utiliser les strigolactones pour identifier les récepteurs
aux strigolactones chez les plantes. Le gène RMS4, supposé être impliqué
dans la réponse au signal SMS, code une protéine à boîte F. Or, il existe
plusieurs exemples de récepteurs à des hormones végétales qui sont des
protéines à boîte F : le récepteur à l'auxine TIR1 (Dharmasiri et al. 2005
Nature 435:441-445) ; le récepteur à l'acide jasmonique CO11 (Xie et al.
1998 Science 280:1091-1094).
De même, on peut utiliser les strigolactones pour l'identification des
composantes de la voie de signalisation par le criblage de mutants résistants
aux strigolactones. Les strigolactones naturelles ou synthétiques, telles que
GR24, peuvent être utilisées pour cribler des mutants résistants et/ou ne
répondant pas à l'application de strigolactones. Les gènes correspondant
aux mutants sont alors clonés de manière à identifier de nouvelles protéines
de la voie de signalisation (Leyser et al. 1993 Nature., 364:161-164 ;
Guzmàn and Ecker 1990 Plant Cell. 6:513-523)
Il est également possible d'utiliser des strigolactones pour identifier
des composantes de la voie de signalisation par l'identification de gènes dont
l'expression est modifiée, c'est-à-dire réprimée ou induite, par l'application
de
strigolactones (Ulmasov et al. 1997 Science 276:1865-1868 ; Thines et al.
2007 Nature 448:661-665)
De même, on peut envisager d'identifier des analogues chimiques
plus stables ayant la même activité biologique que les molécules naturelles
de strigolactones, ayant par exemple un coût de fabrication moindre. Dans la
mesure où les strigolactones ont une action sur plusieurs processus
(mycorhization, germination de graines parasites, ramification), on peut
identifier et fabriquer des molécules ayant des activités spécifiques aux
différents processus par l'identification des motifs essentiels à chaque
activité biologique, de manière similaire à l'identification des analogues
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synthétiques réalisée pour les principales phytohormones comme le NAA,
IBA ou 2,4-D (auxines synthétiques), kinétine (cytokinine synthetique).
Il est autrement possible d'utiliser les strigolactones pour identifier tout
ou partie de ses agonistes ou antagonistes, c'est- à- dire des molécules
aptes à moduler positivement ou négativement la réponse aux strigolactones
comme cela a été décrit pour l'identification d'agonistes et d'antagonistes de
l'auxine (Hayashi et al. 2008 PNAS 105 :5632-5637).
Brève description des figures
- Les figures 1 A et 1 B montrent les résultats de l'analyse qualitative et
quantitative de la strigolactone majoritaire présente dans les exsudats
racinaires chez le pois sauvage et chez les mutants rmsl et rms4.
- La figure 2 représente un graphique en barres illustrant l'effet de la
strigolactone synthétique GR24 appliquée sur des mutants de pois ;
- La figure 3 représente un graphique en barres illustrant l'effet de
différentes strigolactones, synthétiques et naturelle, sur des mutants de pois
;
- La figure 4 représente un graphique en barres illustrant l'effet de la
strigolactone synthétique GR24 appliquée sur un pois sauvage ;
- Les figures 5A et 5B représentent des graphiques illustrant l'effet de
la strigolactone synthétique GR24 en fonction du stade de développement
(taille) des bourgeons sur lesquels elle est appliquée
- La figure 6 représente un graphique en barres illustrant l'effet de la
strigolactone synthétique GR24 injectée dans des mutants de pois à des
concentrations croissantes sur le démarrage du bourgeon situé à une
certaine distance au-dessus de la zone d'injection;
- Les figures 7A, 7B et 7C représentent des graphiques en barres
illustrant l'effet de la décapitation de la plante sur un bourgeon axillaire
préalablement inhibé par de la strigolactone (figures 7A et 7B) et de la
strigolactone sur des bourgeons axillaires d'une plante décapitée (figure
7C) ;
- La figure 8 représente un graphique en barres montrant l'absence
d'effet de la strigolactone sur le bourgeon apical chez le pois sauvage ;
- La figure 9 représente un graphique en barres illustrant l'effet de la
strigolactone synthétique GR24 sur des plantes sauvages et mutantes
d'Arabidopsis thaliana ;
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- La figure 10 représente un graphique en barres illustrant l'effet des
strigolactones appliqués par les racines au niveau de la longueur des entre-
noeuds chez le pois sauvage (lignée WT Térèse) et chez les mutants (lignée
M3T-988 ccd8/rmsl issue du WT Térèse);
- La figure 11 représente un graphique en barres illustrant l'effet des
strigolactones appliqués par les racines sur la longueur des ramifications
chez le pois sauvage (lignée WT Térèse) et chez le mutant (lignée M3T-988
ccd8/rmsl issue du WT Térèse).
Description détaillée de l'invention
On a voulu tester l'effet des strigolactones de synthèse GR24 et des
strigolactones naturelles sur les mutants ramosus (rms) hyper-ramifiés du
pois (Beveridge 2000 Plant Growth Regulation 32 :193-203). Les mutants
rms sont connus comme présentant un nombre de ramifications très
supérieur au nombre de ramifications chez le pois sauvage et notamment à
tous les noeuds de la plante.
Ces mutants rms ont été obtenus dans différents fonds génétiques
sauvages (WT) qui présentent des bourgeons axillaires en général dormants.
Ces pois WT peuvent cependant ramifier aux deux premiers noeuds de la
plante suivant les conditions environnementales et différentes expériences
sont également conduites sur les pois sauvages (WT Térèse - Fig 4).
D'une manière générale, chez le pois, les deux premières écailles sont
considérées comme les deux premiers noeuds, le noeud cotylédonaire étant
le noeud 0.
La caractérisation détaillée des mutants de pois hyper-ramifiés rms a
permis de mettre en évidence l'existence d'un nouveau signal appelé SMS
(Beveridge 2006) réprimant la ramification de la plante :
- les mutants rmsl et rms5 sont des mutants de biosynthèse du signal
SMS. La ramification de ces mutants est réprimée lorsque la tige mutante est
greffée sur un porte-greffe sauvage (Morris et al. PI Physiol 126 :1205-1213).
Les gènes RMS1 et RMS5 codent tous les deux pour des Carotenoid
Cleavage Dioxygenase (Sorefan et al. 2003 Genes Dev 17 :1469-1474 ;
Johnson et al. 2006 Plant Physiol 142 :1014-1026) ce qui suggère que le
signal SMS est un dérivé de caroténoïdes comme les strigolactones
(Matusova et al. 2005 Plant Physiol 139 :920-934). Ces gènes sont
conservés chez les plantes et des homologues sont identifiés chez le riz, le
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pétunia ou le peuplier. Ainsi le gène RMS5 du pois correspond au gène
MAX3 d'Arabidopsis et au gène HTD1 du riz (Johnson et al. 2006 Plant
Physiol 142 :1014-1026). On peut donc supposer que le signal SMS est
conservé chez les plantes.
- le mutant rms4 est affecté dans la réception ou dans la voie de
signalisation du signal réprimant la ramification : la ramification de ce
mutant
n'est pas réprimée lorsque la tige mutante est greffée sur un porte-greffe
sauvage (Beveridge et al. 1996 Plant Physiol 110 :859-865).
Chez la plante Arabidopsis thaliana, un autre gène de la voie de
biosynthèse du signal SMS a été identifié, à savoir le gène MAXI. L'enzyme
MAXI correspondante (un cytochrome P450) semble intervenir en aval des
deux dioxygénases de clivage des caroténoïdes ( Carotenoid Cleavage
Dioxygenases ) RMS1/CCD8 et RMS5/CCD7.
Les inventeurs ont montré qu'une famille de molécules déjà connue, la
famille des strigolactones, pouvait être utilisée pour réprimer la croissance
des bourgeons axillaires d'une plante. Ces résultats suggèrent que le signal
SMS identifié à l'aide des mutants hyper-ramifiés rms de pois appartiendrait
à la famille des strigolactones.
Afin de vérifier cette hypothèse, les inventeurs ont recherché et
quantifié les strigolactones produites par le pois sauvage ou les mutants.
Dans un premier temps, les auteurs ont recherché les strigolactones
présentes dans les exsudats racinaires du pois sauvage WT Térèse.
Pour cela, ils ont analysé l'extrait acétate d'éthyle des exsudats par
spectrométrie de masse haute résolution, sur UPLC/QTOFMS (Ultra-
Performance Liquid Chromatography couplé à un Quadrupole Time-Of-
Flight). En recherchant les ions parents pouvant générer un ion fils à m/z :
97.0285, correspondant au cycle D, commun à toutes les strigolactones
caractérisées, ils ont observé un pic majoritaire sur le chromatogramme. Le
spectre obtenu pour ce composé présente les ions m/z 405.1555 et m/z
427.1377 (Figure 1A), correspondant respectivement à la masse théorique
d'une molécule de formule brute C21 H2508 [M + H]+ et C21 H2408Na [M + Na]+.
La formule brute C21 H2408 pourrait correspondre soit à un strigyl acetate
soit
à un orobanchyl acetate portant un groupement supplémentaire hydroxyl ou
epoxy. Cette identité est confirmée par l'ensemble des ions fils observés par
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MS/MS : les ions m/z 345.1351 [M+ H - CH3000H]+, 248.1058 [M + H -
cycle D - CH3000H]+ et 97.0285 [cycle D]+ (Fig. 1 A);
Cette analyse permet de confirmer la présence d'une nouvelle
strigolactone dans les exsudats de pois (Térèse), dont la structure exacte
5 n'est pas encore déterminée.
Dans un deuxième temps, les inventeurs ont quantifié l'abondance de
cette strigolactone dans les exsudats de pois sauvage issue de Térèse, des
mutants rmsl lignée M3T-884 issue de Térèse et rms4 lignée M3T-946 issue
de Térèse.
10 Les spectres présentés sur la figure 1 B correspondent aux
fragmentations de la strigolactone majoritaire avec perte du cycle D +
acétate (spectre 404.8 > 247.8) et avec perte des cycles ABC (spectre 404.8
> 96.9). On observe que cette strigolactone, présente dans les exsudats
racinaires du sauvage (Térèse), est présente chez le mutant rms4 (lignée
M3T-946), mais n'est pas détectable chez le mutant rmsl (lignée M3T-884).
Exemple 1 : Test chez des mutants d'hyper ramification de pois
et chez des pois sauvages avec application locale de strigolactones
pour démontrer l'effet par application directe des strigolactones
A] Expérience N 1
Une première expérience est conduite parallèlement sur les mutants
rmsl (lignée M3T-884 issue du sauvage WT Térèse) et rms4 (lignée M3T-
946 issue du sauvage Térèse).
On utilise 9 graines par traitement, qui sont semées en pots (3 plantes
par pot) dans un terreau mélangé à des billes d'argile. Le semis est réalisé
en serre sous une photopériode de 16h lumière/8h nuit.
Le traitement est réalisé 10 jours après le semis (stade 4 feuilles).
Une solution contenant la strigolactone synthétique GR24 dissoute
dans l'acétone à 0 nM et 100 nM (4% PEG 1450, 25% éthanol, 5 pour 1000
acétone) est appliquée à l'aide d'une micro-pipette sur les bourgeons au
noeud 4 (N4), à raison de 10 pl par bourgeon.
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Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds Ni et N2
des plantes sont coupés pour favoriser le démarrage des bourgeons aux
noeuds supérieurs.
Le graphe de la figure 2 montre les résultats de la croissance du
bourgeon au N4 (taille du bourgeon le jour du traitement - taille du bourgeon
à 8 jours) obtenus 8 jours après le traitement.
Les plantes non-traitées correspondent aux plantes dont les
bourgeons et/ou ramifications aux noeuds 1 et 2 ont été coupés mais qui
n'ont reçu aucun traitement. Le contrôle 0 nM correspond aux plantes
traitées avec la même solution que pour le traitement 500 nM mais sans
strigolactones.
On constate que la croissance des bourgeons au N4 du mutant rmsl
est fortement réprimée avec le traitement à 100 nM, alors que les bourgeons
du mutant rms4 ne sont pas réprimés de manière significative, ce qui est en
accord avec les résultats attendus avec le signal SMS. L'hormone végétale
réprimant la ramification chez les plantes supérieures est vraisemblablement
une molécule de la famille des strigolactones.
L'application de strigolactone synthétique GR24 directement sur les
bourgeons axillaires permet d'inhiber la croissance desdits bourgeons traités
chez le mutant rmsl.
B] Expérience NO2'
Une seconde expérience est conduite sur des mutants rmsl (lignée
M3T-884 issue du sauvage WT Térèse) afin de comparer sur ces mutants
l'effet de la strigolactone synthétique GR24, d'une molécule synthétique ABC
issue de GR24, ne présentant pas le quatrième cycle D caractéristique de la
strigolactone, et une strigolactone naturelle, la Sorgolactone.
Les plantes utilisées sont obtenues de manière identique aux plantes
utilisées pour la première expérience.
Une solution contenant la strigolactone synthétique GR24 à 0 nM, 100
nM, et 500 nM (4% PEG 1450, 10% éthanol) est appliquée à l'aide d'une
micro-pipette sur les bourgeons au noeud 4 (N4), à raison de 10 pl par
bourgeon.
Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds Ni et N2
des plantes sont coupés au moment du traitement.
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On mesure la taille des bourgeons des noeuds supérieurs (noeud N4)
9 jours après le traitement. Les résultats de la croissance du bourgeon sont
illustrés par le graphe de la figure 3.
On constate que la GR24 et la sorgolactone ont des effets
comparables, la différence observée sur le graphe à 500 nM étant due à un
effet statistique du fait du faible nombre de plantes testées (8 ou 9
plantes).
Toutes les strigolactones permettent d'inhiber de manière significative la
croissance des bourgeons traités dès 100 nM. La molécule ABC parait être
beaucoup moins efficace que la GR24 et la sorgolactone.
C] Expérience N 3
On a cherché à démontrer l'effet des strigolactones sur les plantes de
pois sauvages.
Pour cela, une troisième expérience est conduite sur des plantes du
sauvage WT Térèse. Les plantes utilisées sont obtenues de manière
identique aux plantes utilisées pour la première expérience.
Le traitement est réalisé 10 jours après le semis (stade 4 à 5 feuilles).
Une solution contenant la strigolactone synthétique GR24 à 0 nM et
500 nM (4% PEG, 10% éthanol) est appliquée à l'aide d'une micro-pipette
sur les bourgeons au noeud 2 (N2), à raison de 10 pl par bourgeon.
Les bourgeons et/ou ramifications au premier noeud Ni des plantes
sont coupés au moment du traitement.
On mesure la taille des bourgeons au noeud N2, 8 jours après le
traitement, les résultats étant repris dans le graphe de la figure 4.
On constate que la strigolactone synthétique GR24 agit également sur
la croissance des bourgeons traités par application locale chez le pois
sauvage.
Exemple 2 : Test chez des mutants d'hyper ramification de pois
avec application locale de strigolactones à différents stades de
développement des bourgeons
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On a voulu étudier l'effet des strigolactones sur le démarrage des
bourgeons axillaires en fonction de la taille et/ou du stade de développement
du bourgeon au moment du traitement.
A] Expérience N 1
Une première expérience est conduite sur des mutants rmsl (lignée
WL5237 issue du sauvage WT Parvus) afin de comparer l'effet des
strigolactones synthétiques GR24 en fonction de la taille des bourgeons
traitées au moment du traitement.
Dans cette expérience, on utilise 20 graines par traitement, qui sont
semées en pots (2 plantes par pot de 15 cm de diamètre) dans un terreau
mélangé à du sable. Le semis est réalisé en serre en lumière naturelle avec
extension de la photopériode de 18h lumière/6h nuit avec des ampoules à
incandescence (60W).
Le premier jour de traitement, une solution contenant la strigolactone
synthétique GR24 à 0 nM et 1000 nM (4% PEG 1450, 10% éthanol) est
appliquée à l'aide d'une micro-pipette sur les bourgeons au noeud 3 (N3), à
raison de 10 pl par bourgeon.
Le deuxième jour du traitement, une solution contenant la
strigolactone synthétique GR24 à 0 nM et 1000 nM (4% PEG 1450, 50%
éthanol) est appliquée à l'aide d'une micro-pipette sur les mêmes bourgeons,
à raison de 10 pl par bourgeon.
Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds Ni et N2
des plantes sont coupés au moment du traitement.
Le premier traitement est réalisé sur des plantes ayant respectivement
9, 10, 11, 12 et 13 jours (les semis ont été échelonnés sur 5 jours).
On mesure la taille des bourgeons au noeud N3 le jour du premier
traitement (JO) et 3 et 7 jours après. Les résultats obtenus sont illustrés
par
les graphes de la figure 5A.
On constate que tous les bourgeons, qui sont pourtant d'âges
différents et ont une taille comprise entre 0.2 et 1 mm le premier jour du
traitement, sont tous sensibles au traitement par application directe de GR24.
B] Expérience NO2'
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Une seconde expérience est réalisée sur des mutants rmsl (lignée
M3T-884 issue du WT Térèse) afin de comparer l'effet des strigolactones
synthétiques GR24 en fonction de la taille des bourgeons au moment du
traitement.
Les plantes utilisées sont obtenues de manière identique aux plantes
utilisées pour les expériences précédentes.
Les plantes sont traitées par application d'une solution (4% PEG
1450, 10% éthanol) contenant de la sorgolactone ou de la strigolactone
synthétique GR24 à 0 nM et 500 nM. La solution est appliquée à l'aide d'une
micro-pipette sur les bourgeons au noeud 3 (N3), à raison de 10 Pl par
bourgeon.
Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds Ni et N2
des plantes sont coupés au moment du traitement.
La taille des bourgeons traités est mesurée 9 jours après le traitement.
Le graphe de la figure 5B montre l'influence de la taille du bourgeon au
moment du traitement (JO) sur l'effet qu'a finalement la strigolactone sur le
bourgeon traité.
On constate qu'il existe un seuil dans la taille des bourgeons au-delà
duquel ils ne sont plus sensibles au traitement par application de
strigolactones. Ainsi, dans l'expérience conduite ici sur le pois et sur ce
génotype, l'effet des strigolactones est quasiment nul sur des bourgeons
traités faisant plus de 4 à 5 mm au moment du traitement.
Exemple 3 : Test chez des mutants d'hyper ramification de pois
avec injection de strigolactones dans la tige pour démontrer l'action à
longue distance et l'effet dose-réponse des strigolactones
On a voulu ici montré l'effet de l'injection de strigolactones à
différentes concentrations dans les tiges des plantes, au niveau des noeuds
situés au-dessus de la zone de piquage.
Pour cela, une expérience est conduite sur des mutants rmsl (lignée
M3T-988 issue du WT Térèse) obtenus de manière identique aux mutants
utilisés dans les expériences précédentes.
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Les plantes sont traitées par injection de la solution dans la tige au-
dessus du noeud N3. Plus précisément, un fil de coton est piqué dans la tige
des pantes à l'aide d'une aiguille et trempe dans la solution à tester. Les
solutions de GR24 utilisées (à 0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM et 500 nM) ont été
5 préparées en diluant dans l'eau les solutions de GR24 conservées dans
l'acétone à différentes concentrations de manière à avoir le même volume
d'acétone (10 pL d'acétone dans 20 mL d'eau).
Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds Ni et N2
des plantes sont coupés au moment du traitement.
10 Les plantes non-traitées correspondent aux plantes contrôles, dont
les ramifications Ni et N2 ont été coupées, mais qui ne sont pas piquées.
On mesure la taille des bourgeons au noeud situé à une certaine
distance au-dessus de la zone d'injection (N5) 8 jours après le traitement.
Le graphe de la figure 6 montre la taille du bourgeon au noeud N5, 8
15 jours après traitement, en fonction du traitement.
On constate que l'injection de GR24 au-dessus du N3 permet de
réprimer la croissance du bourgeon situé à une certaine distance de la zone
d'injection (N5) dès 10 nM.
La strigolactone peut donc agir à distance sur la croissance des
bourgeons axillaires, en étant vraisemblablement transportée dans la sève
du xylème.
Exemple 4 : Test chez des mutants d'hyper ramification de pois
traités avant ou après décapitation
A] Expérience 1 : Décapitation après traitement
Une première expérience est réalisée parallèlement sur des pois
sauvages (lignée WT Parvus) et mutants rmsl (lignée WL5237 issue de WT
Parvus). Dans cette expérience, on utilise 18 graines par traitement, qui sont
semées en pots (2 plantes par pot de 15 cm de diamètre) dans un terreau
mélangé à du sable. Le semis est réalisé en serre en lumière naturelle avec
extension de la photopériode de 18h lumière/6h nuit avec des ampoules à
incandescence (60W).
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Lors d'une première étape, les plantes sont traitées par deux
applications successives à 24 heurs d'intervalle d'une solution (2% PEG
3550, 50% éthanol) contenant de la strigolactone synthétique GR24 à 0 nM
ou 1000 nM. La solution est appliquée à l'aide d'une micro-pipette sur les
bourgeons au noeud 3 (N3), à raison de 10 pl par bourgeon.
Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds Ni et N2
des plantes sont coupés au moment du traitement.
La taille des bourgeons traités est mesurée 7 jours après le traitement.
Le graphe de la figure 7A reprend les résultats obtenus sur les bourgeons au
N3.
Lors d'une seconde étape, la moitié des plantes mutantes rmsl
traitées sont décapitées au dessus du noeud 3, 9 jours après le traitement,
l'autre moitié étant laissée intacte. Les bourgeons et/ou ramifications au
noeud 3 des plantes traitées à 0 nM (qui n'ont donc pas été réprimés) sont
coupés.
La taille des bourgeons est mesurée 7 jours après la décapitation. Le
graphe de la figure 7B reprend les résultats obtenus sur les bourgeons au
N3.
On constate que les bourgeons inhibés par la GR24 chez le mutant
rmsl sont capables de repartir lorsqu'on décapite la plante, contrairement
aux bourgeons traités des plantes non décapitées.
B] Expérience 2 : Traitement avec décapitation
Une seconde expérience est conduite sur des plantes de pois
sauvages WT Torsdag obtenus de façon identique à l'expérience précédente
(les plantes sont au stade 6 noeuds).
Les bourgeons au noeud N6 des plantes sont traités par quatre
applications successives à 24 heures d'intervalle d'une solution (2% PEG
3550, 50% éthanol) contenant de la strigolactone GR24 à 0 nM, 1000 nM ou
10000 nM.
Les bourgeons et/ou ramifications sont coupés aux noeuds Ni à N5
au moment du traitement, tandis que chaque plante est décapitée au-dessus
du noeud 6 juste avant la première application de la solution GR24.
Les bourgeons N6 sont mesurés 7 jours après la première application,
les résultats étant montrés à la figure 7C.
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On constate que la strigolactone, au moins à de fortes concentrations,
permet de réprimer le démarrage des bourgeons axillaires qui avait pourtant
été induit et favorisé par une décapitation.
Exemple 5 : Test chez des mutants d'hyper ramification de pois
avec application locale de strigolactones sur le bourgeon apical
Une expérience a été menée sur des plantes de pois sauvages WT
Parvus, afin d'observer l'effet de la strigolactone sur la tige principale.
Les plantes testées ont été obtenues de manière identique aux
plantes des 2 expériences précédentes.
Le traitement est réalisé 25 jours après le semis (environ 7 noeuds
sont développés).
On applique sur le bourgeon apical de chaque plante 2 pl d'une
solution 0,1% silwet à une concentration en GR24 de 0 nM ou 10000 nM. En
guise de contrôle, on traite en parallèle des plantes par application sur le
bourgeon apical de 1 pg de GA3 (1,44 mM) dans 0,1% silwet pour vérifier
que ce traitement utilisant le silwet permet la pénétration des hormones dans
les tissus de la plante.
On mesure la taille de la tige principale 14 jours après le traitement,
les résultats étant repris à la figure 8.
On ne constate aucun effet des strigolactones sur la croissance de la
tige principale, et ce même à forte concentration. Ces résultats rejoignent
les
résultats de l'expérience réalisée sur des bourgeons d'âges différents, dans
laquelle lorsque le traitement est réalisé sur des bourgeons ayant déjà
démarrés, le traitement est inefficace.
Ainsi, la strigolactone ne réprime pas la croissance du bourgeon apical
et de la tige principale, ni des ramifications ayant déjà démarrées et qui se
comportent alors comme une tige à proprement parler.
Cette constatation permet d'envisager l'utilisation des strigolactones
pour contrôler la croissance d'arbres, tels que le chêne, le bouleau, le hêtre
etc., qui sont cultivés pour leur bois, afin de limiter le nombre de
ramifications
et d'obtenir des troncs ayant une longueur de tronc pratiquement sans noeud
importante.
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Exemple 6: Test chez des mutants d'hyper ramification
d'Arabidopsis thaliana et chez des plantes sauvages avec application
locale de strigolactones
Une expérience similaire à celle pratiquée sur le pois sauvage et
mutant dans l'exemple 1 a été réalisée sur Arabidopsis thaliana, afin de
démontrer que les strigolactones sont aptes à agir sur différentes espèces de
plantes.
Les plantes utilisées ici sont issues de lignées WT Columbia,
sauvages, mutants maxi (mutant affecté dans une étape de la voie de
biosynthèse du signal SMS en aval des deux Carotenoid Cleavage
Dioxygenase et max2 (correspondant au mutant de réponse du pois rms4).
Les plantes ont été semées en barquettes et entreposés à 4 C
pendant deux jours avant le transfert à 22 C en chambre climatisée. Les
plantes ont été arrosées (sub-irrigation) avec de l'eau tous les 2 jours avec
un apport en éléments nutritifs tous les 10 jours. La longueur du jour est de
18 heures. A 23 jours, juste avant la floraison, un premier traitement GR24 a
été réalisé. Le nombre de plantes traitées varie entre 25 et 41.
Au total, les bourgeons des plantes ont été traités par 7 applications
tous les 3 jours réparties sur une période de 20 jours : chaque traitement
réalisé à l'aide d'une micropipette consiste en l'application de 50 l d'une
solution de GR24 à 0 nM ou 5000 nM dans du Tween20 à 0,1%.
L'application se fait sur les bourgeons à l'aisselle des feuilles de la
rosette ou
à l'aisselle de bourgeons déjà démarrés.
On compte le nombre de hampes florales sur les plantes lorsqu'elles
ont 48 jours, juste avant la sénescence. Les résultats sont repris à la figure
9.
Comme pour le pois, on constate que la strigolactone permet de
réprimer les ramifications chez le sauvage d'Arabidopsis ainsi que chez le
mutant maxi, mais pas chez le mutant max2.
L'effet de la strigolactone sur les ramifications est donc conservé entre
les différentes espèces.
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Exemple 7 : Test chez des mutants d'hyper ramification de pois
et chez des pois sauvages avec application de strigolactones par les
racines pour démontrer l'effet positif sur la hauteur de la plante
(longueur des entre-noeuds ; figure 10) et l'effet inhibiteur sur le
démarrage des bourgeons (figure 11).
On a voulu ici montrer l'effet de l'application par les racines de
strigolactones au niveau des bourgeons et au niveau de la hauteur de la
plante.
Pour cela, une expérience a été menée en solution hydroponique de
façon à amener le GR24 par les racines dans la solution hydroponique.
Dans cette expérience, des graines de pois sauvage (lignée WT
Térèse) et des graines de pois mutants (lignée M3T-988 ccd8/rmsl issue du
WT Térèse) sont d'abord semées dans du sable. Au bout de 8 jours, les
plantes qui en résultent sont mises dans le système hydroponique dans
lequel les racines baignent dans la solution nutritive. 4 jours plus tard, on
ajoute une solution de GR24 (diastéréo isomère n 1) à 1 pM dans les 47
litres de solution nutritive (4,7m1 GR24 à lOmM). Dans cette expérience, les
plantes étaient arrivées au stade 3-4 noeuds.
Puis les ramifications cotydélonaires sont retirées. Les ramifications
aux noeuds Ni et N2 sont maintenues.
L'observation s'est déroulée 7 jours plus tard après l'ajout de GR24
dans la solution.
La figure 10 représente la longueur des entre-noeuds mesurée au bout
des 19 jours après germination sur des plantes sauvages traitées et non
traitées d'une part, et sur des plantes mutantes non traitées et traitées
d'autre part.
On constate que l'apport de GR24 dans la solution hydroponique n'a
d'effet qu'à partir de l'entre-noeud N4-N5. En dessous des entre noeuds N1-
N2, N2-N3 et N3-N4, le GR24 n'a pas agit car ces entre noeuds étaient déjà
bien développés avant l'apport en GR24.
La figure 11 représente la longueur des ramifications (ramifications 3
et au noeud N4) mesurée au bout des 19 jours sur les plantes sauvages
traitées et non traitées d'une part, et sur les plantes mutantes non traitées
et
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traitées d'autre part. Les ramifications aux noeuds Ni et N2 avaient déjà bien
démarrées au moment de l'apport de GR24.
On constate que l'apport de GR24 dans la solution hydroponique
induit une diminution de la longueur des ramifications.
5 On constate donc que l'apport de strigolactones par les racines (en
solution hydroponique) permet d'allonger la taille des entre-noeuds. De plus,
on constate que ce même apport de strigolactones par les racines permet
d'inhiber le démarrage des bourgeons.
L'application de strigolactones par les racines permettrait donc
10 également de jouer un rôle sur la hauteur de la plante.
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