Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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Procédé de préparation d'extraits polyphénoliques à partir de feuilles
d'épinards
La présente invention a pour objet un nouveau procédé de préparation
d'extraits polyphénoliques concentrés et purifiés à partir de feuilles
d'épinards.
L'épinard (Spinacia oleracea) est une plante potagère, annuelle ou
bisannuelle, de la famille des Chénopodiacées. Cette plante est couramment
cultivée et consommée dans l'alimentation habituelle.
En usage traditionnel, l'épinard est considéré, entre autres, comme un
fortifiant, revitalisant, tonifiant musculaire, notamment des muscles
cardiaques. Sa richesse en carotènes, vitamines (notamment C, E),
minéraux et oligo-éléments (notamment magnésium, fer, calcium, potassium)
font de lui une excellente indication contre la fatigue générale et les états
dépressifs.
L'épinard est également traditionnellement utilisé pour ses propriétés
antianémiques.
Les feuilles de l'épinard renferment des polyphénols de types flavonols
et flavanols sous forme simple ou polymérisée.
Ces polyphénols sont connus comme étant de bons anti-oxydants et
anti-inflammatoires.
La présente invention a ainsi pour but de fournir un procédé de
préparation d'extraits d'épinards concentrés riches en polyphénols.
La présente invention a également pour but de fournir des extraits
d'épinards présentant une teneur élevée en polyphénols, lesdits extraits
étant donc destinés à des applications pour l'amélioration des performances
des muscles striés, chez l'humain ou l'animal.
La présente invention concerne un procédé de préparation d'un extrait
concentré d'épinard, sous forme liquide ou sèche, avec un titre en
polyphénols supérieur ou égal à 50%, comprenant une étape de purification
d'un extrait brut d'épinard sous forme liquide, par une technique d'extraction
liquide-liquide avec une huile alimentaire.
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Selon un mode de réalisation préféré, l'huile alimentaire est choisie
dans le groupe constitué de l'huile d'olive, de tournesol, de pépins de
raisin,
de poisson, et de leurs mélanges.
Ainsi, le procédé selon la présente invention comprend les étapes
suivantes :
- on ajoute de l'huile alimentaire à l'extrait brut sous forme liquide,
pour obtenir un extrait brut liquide additionné d'huile alimentaire,
- on soumet ledit extrait brut liquide additionné d'huile alimentaire à
une étape de concentration sous vide et sous agitation, pour obtenir une
phase huileuse surnageante comprenant les pigments chlorophylliens et
caroténoïdes et une phase aqueuse comprenant les composés
hydrosolubles (glucides, protides, composés phénoliques simples ou
complexes...), et
- on isole séparément la phase huileuse et la phase aqueuse.
L'étape d'extraction de l'extrait brut liquide de l'invention avec de l'huile
alimentaire permet d'obtenir un extrait raffiné présentant un titre élevé en
principe(s) actif(s). Pour ce faire, on soumet ledit extrait brut à une étape
de
purification. Cette étape de purification est réalisée en combinant deux
étapes. La première étape a pour vocation d'éliminer les composés colorants
de type chlorophylles, tout en obtenant un produit valorisable en tant que
colorant vert alimentaire de haute qualité, les pigments ayant été préservés
des phénomènes de dégradation par oxydation se produisant généralement
en cours de concentration, par ce moyen.
L'extrait brut sous forme liquide est additionné d'une huile alimentaire
ordinaire, de type huile d'olive, de tournesol, de pépins de raisin, de
poisson,
ou toute autre huile alimentaire de caractéristique identique, dans des
proportions allant de 1 /1 à 1/1000 en fonction de la concentration en
chlorophylles désirée. L'extrait brut liquide additionné d'huile est ensuite
notamment concentré sous vide et sous agitation, par un matériel de type
évapo-concentrateur, ou boule à vide. Cette étape permettra en outre la
réduction du volume de produit, ainsi que l'élimination de l'alcool dans le
cas
d'une extraction par mélange hydro-alcoolique. Le produit obtenu se
présente sous forme d'un mélange biphasique, la phase huileuse
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surnageante contenant les pigments chlorophylliens et caroténoïdes
préservés des phénomènes oxydatifs, la phase aqueuse comprenant
l'ensemble des composés hydrosolubles tels que glucides, protides et
composés phénoliques simples ou complexes. La séparation du mélange
peut être améliorée par l'ajout d'une proportion d'eau suffisante.
Dans le cadre du procédé de la présente invention, la phase huileuse
susmentionnée est ensuite récupérée et est de préférence soumise à une ou
plusieurs étapes de lavage avec de l'eau, et le cas échéant, séchée afin
d'obtenir une poudre colorante.
L'étape de lavage susmentionnée de la phase huileuse par de l'eau,
permet d'augmenter la récupération de composés hydrosolubles
éventuellement émulsifiés avec la phase huileuse.
Cette phase huileuse peut directement être valorisée en tant que
colorant vert alimentaire naturel, voire biologique, en partant d'épinard
issus
de l'agriculture biologique. Cette phase huileuse peut également être séchée
par atomisation, en utilisant des supports de séchage adaptés tels que
caséinates, maltodextrines, lécithines, afin d'obtenir une poudre
hydrodispersible colorante.
La phase aqueuse collectée telle que définie ci-dessus, contenant
notamment les polyphénols, peut être séchée directement ou bien subir un
second raffinage.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention,
la phase aqueuse obtenue à l'issue de l'étape d'extraction avec l'huile
alimentaire est récupérée puis séchée afin d'obtenir un extrait concentré
sous forme sèche.
Selon un autre mode de réalisation particulier du procédé de l'invention,
la phase aqueuse obtenue à l'issue de l'étape d'extraction avec l'huile
alimentaire est récupérée puis soumise à une étape de purification pour
obtenir un extrait concentré purifié.
Cette étape complémentaire de purification peut être effectuée par
passage sur résines adsorbantes et avec élution par un solvant de type
alcool, ou par extraction liquide-liquide, en utilisant un solvant non
miscible à
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l'eau tel que l'acétate d'éthyle, le butanol ou tout autre solvant ayant une
affinité avec les composés phénoliques.
Les résines de chromatographie utilisées peuvent être par exemple de
type échangeuse d'ions (anions ou cations), ou de type
adsorption/désorption, par exemple de type copolymère
divinylbenzène/styrène, polystyrénique ou polyméthacrylique, commercialisé
notamment par les marques Rohm & Haas ou Mitsubishi Chemical.
Le procédé de l'invention peut comprendre des étapes supplémentaires
consistant à obtenir des extraits plus concentrés en principes actifs.
Ainsi, l'extrait purifié obtenu à l'issue de la purification par
chromatographie ou par extraction liquide-liquide avec de l'acétate d'éthyle
ou du butanol peut ensuite être concentré soit par évaporation sous vide, soit
par nanofiltration membranaire, afin d'obtenir un concentré contenant entre
et 70% de matières sèches.
15 Enfin, ce concentré purifié peut ensuite être séché en utilisant un
équipement tel que sécheur atomiseur, lyophilisateur ou sécheur sous vide.
La présente invention concerne donc également la préparation d'un
extrait concentré purifié sous forme sèche, ladite forme sèche étant obtenue
par séchage d'un extrait concentré purifié sous forme liquide.
Selon un mode de réalisation préféré, les étapes de séchage effectuées
pour obtenir des formes sèches sont effectuées par atomisation.
La présente invention concerne également un procédé tel que défini ci-
dessus, caractérisé en ce que l'extrait brut d'épinard sous forme liquide est
obtenu par un procédé comprenant une étape d'extraction par mise en
présence d'épinard sous forme fraîche ou congelée avec un solvant choisi
dans le groupe constitué de l'eau, de l'éthanol et de leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation préféré, l'épinard utilisé dans le cadre du
procédé de l'invention provient de la plante entière, sous forme fraîche ou
sèche.
L'extrait brut d'épinard selon l'invention est obtenu en mettant en
présence la plante, sous sa forme fraîche, ou congelée, avec un solvant, tel
que de l'eau, de l'éthanol ou un mélange d'eau et d'éthanol dans des
proportions pouvant aller de 100/0 à 0/100, pour une étape d'extraction, en
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séparant la plante et le solvant afin d'obtenir un extrait brut sous forme
liquide. Afin d'obtenir un extrait brut sous forme sèche, l'extrait brut sous
forme liquide est séché par exemple par élimination de l'eau dans un flux
d'air chaud, par nébulisation, par évaporation, par sublimation, par
5 déshydratation, par adsorption sur support.
La présente invention concerne également un procédé de préparation
d'un produit colorant, comprenant les étapes suivantes :
- on ajoute de l'huile alimentaire à un extrait brut d'épinard tel que
défini ci-dessus sous forme liquide, pour obtenir un extrait brut liquide
additionné d'huile alimentaire,
- on soumet ledit extrait brut liquide additionné d'huile alimentaire à
une étape de concentration sous vide et sous agitation, pour obtenir une
phase huileuse surnageante comprenant les pigments chlorophylliens et
caroténoïdes et une phase aqueuse comprenant les composés
hydrosolubles,
- on récupère la phase huileuse pour la soumettre à une ou plusieurs
étapes de lavage avec de l'eau afin d'obtenir un produit colorant liquide, et,
le
cas échéant, on sèche la phase huileuse lavée afin d'obtenir une poudre
colorante.
Ce procédé permet donc d'obtenir un produit colorant sous forme
liquide ou sous forme sèche.
La présente invention concerne donc également un produit colorant,
sous forme liquide ou sèche, susceptible d'être obtenu selon le procédé tel
que défini ci-dessus.
Ledit produit colorant sous forme liquide peut ainsi être utilisé en tant
que colorant alimentaire vert.
La présente invention concerne également un extrait concentré
d'épinard, susceptible d'être obtenu selon le procédé de préparation tel que
défini ci-dessus.
Les extraits concentrés de l'invention sont caractérisés en ce qu'ils
présentent un titre en polyphénols totaux supérieur ou égal à 50%.
La présente invention concerne également un extrait concentré
d'épinard, sous forme liquide ou sèche, avec un titre en polyphénols totaux
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supérieur ou égal à 50%, de préférence compris de 60% à 100%, et
préférentiellement de 90% à 100%.
Les polyphénols sont dosés par spectrophotométrie et HPLC (par
exemple selon la méthode décrite ci-après).
De préférence, les extraits de l'invention comprennent majoritairement
des composés polyphénoliques, et ce préférentiellement à raison d'au moins
70% en poids (par rapport au poids total de l'extrait).
Parmi ces composés polyphénoliques, on retrouve essentiellement des
composés de la famille des flavonoïdes et en particulier de la classe
chimique des flavonols.
Ainsi, les quatre grands représentants polyphénoliques entrant dans la
composition des extraits d'épinards de l'invention sont les suivants :
patulétine, spinacétine, jacéidine et spinatoside (sous forme simple ou
glucosylée).
Plus exactement, les extraits d'épinards de l'invention comprennent les
composés suivants :
patulétine-3-glucosyl-(1-6)-apiosyl(1-2)-glucoside,
patulétine-3-glucosyl-(1 -6)-glucoside,
spinacétine-3-glucosyl-(1-6)-apiosyl(1-2)-glucoside,
spinacétine-3-glucosyl-(1 -6)-glucoside,
spinacétine-3-féruloylglucosyl-(1-6)-glucoside,
spinatoside,
jacéidine-4'-glucuronide,
5,3',4'-trihydroxy-3-méthoxy-6:7-méthylènedioxyflavone-4'-glucuronide,
5,4'-dihydroxy-3,3'-diméthoxy-6:7-méthylènedioxyflavone-4'-glucuronide.
Des acides phénoliques sont également présents dans les extraits de
l'invention, notamment l'acide o-coumarique, l'acide férulique, l'acide p-
coumarique et l'acide glucuronique.
Les ecdystéroïdes communément appelés phytoecdystéroïdes
(majoritairement 20-hydroxyecdyone) sont également présents dans les
extraits de l'invention.
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La présente invention concerne également une composition
pharmaceutique comprenant un extrait d'épinard tel que défini ci-dessus, en
association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également un complément alimentaire
comprenant un extrait d'épinard tel que défini ci-dessus, en association avec
un véhicule acceptable.
Les extraits d'épinards de l'invention sont destinés à diverses
applications, notamment pour l'amélioration des performances des muscles
striés chez l'humain ou l'animal. Ainsi, la consommation dudit extrait permet
de réduire les composés issus du métabolisme oxydatif musculaire et des
métabolites dérivés altérant la performance musculaire et augmentant le
temps de récupération.
La présente invention concerne également l'utilisation dudit extrait dans
des préparations sous différentes formes galéniques, en vue de
l'administration à l'humain ou l'animal, que ce soit sous forme
médicamenteuse, ou de complémentation alimentaire, ou de produit
diététique.
L'application desdites préparations concerne l'ensemble des
populations humaines ou animales, pour lesquelles la contribution à
l'amélioration des performances musculaires et l'augmentation de la capacité
de récupération présente un intérêt, comme les sportifs expérimentés, les
sportifs occasionnels nécessitant une aide pour la récupération après effort,
les personnes âgées ayant des difficultés pour la récupération après une
activité physique et les animaux de course ou âgés.
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne
les extraits d'épinard tels que définis ci-dessus pour leur utilisation pour
l'amélioration des performances musculaires.
La présente invention concerne également les extraits d'épinard tels
que définis ci-dessus pour leur utilisation pour le traitement et la
prévention
des désordres musculosquelettiques.
La présente invention concerne également les extraits d'épinard tels
que définis ci-dessus pour leur utilisation pour le traitement et la
prévention
des troubles musculaires consécutifs à l'effort.
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LÉGENDE DE LA FIGURE
La Figure 1 représente le chromatogramme UV à 280 nm d'un extrait
d'épinard purifié obtenu selon le procédé de l'invention (extrait purifié n 1
-
cf. exemples).
MÉTHODE DE DOSAGE DES POLYPHÉNOLS
La méthode utilisée pour le dosage des polyphénols totaux est la
suivante.
Le système chromatographique utilisé est de marque Agilent
Technologie 1100 series.
Les différents polyphénols sont séparés à l'aide d'une colonne Kromasil
C18, 250 mm x 4,6 mm - 5 m, munie d'une pré-colonne de même nature.
Réactifs
On utilise comme solvants de l'eau Ultra-Pure Millipore, de l'acétonitrile
(Chimie Plus, réf.: AC03902500), du méthanol (Chimie Plus, réf.:
ME03102500), de l'acide orthophosphorique 85% (Fisher Scientific, réf.:
O/0450/PB15) et de l'acétique acétique glacial (Fisher Scientific, réf.:
A/0400/PB15).
Comme standards analytiques, on utilise de l'acide gallique
(Extrasynthèse, réf.: 4993 S), de la catéchine (Extrasynthèse, réf.: 0976 S),
de l'épicatéchine (Extrasynthèse, réf.: 0977 S), du gallate d'épicatéchine
(Extrasynthèse, réf.: 0978 S), de la procyanidine B1 (Extrasynthèse, réf.:
0983) et de la procyanidine B2 (Extrasynthèse, réf.: 0984).
Mode opératoire
1. Conditions chromatographiques
Les solvants d'élution sont :
- solvant A : eau qualité HPLC acidifiée à pH 2,5 avec de l'acide
orthophosphorique
- solvant B : acétonitrile / acide acétique 90:10
Le débit de la phase mobile est de 1 mUmin.
La température de la colonne est égale à 25 C.
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Le volume d'injection est 20 pL et la détection est effectuée dans l'UV à
280 nm pour une durée d'analyse de 50 minutes.
On applique le gradient suivant :
Temps (min) % de solvant A % de solvant B
0 95 5
30 75 25
35 70 30
45 50 50
50 40 60
2. Solutions à préparer
- solvant de solubilisation
Eau ultrapure / méthanol qualité HPLC / acide acétique glacial
75:20:5 (v/v/v)
- solution de référence
Dans une fiole jaugée de 20 mL, on pèse 5 mg d'acide gallique, 5 mg
de catéchine, 5 mg d'épicatéchine, 5 mg de gallate d'épicatéchine, 2 mg de
procyanidine B1 et 2 mg de procyanidine B2.
On dissout l'ensemble et on complète avec du méthanol.
- solution d'échantillon à analyser
On pèse 100 mg d'extrait à analyser dans une fiole jaugée de 50 mL et
on dissout pendant 10 minutes aux ultrasons avec le solvant de solubilisation
puis on complète au volume.
On filtre les solutions témoin et essai sur membrane (membranes
Sartorius, 0,45 m, réf.: Minisart-RC-15).
Deux prises d'essai sont effectuées par échantillon.
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Calcul de la teneur en polyphénols
La teneur en polyphénols est calculée selon la formule suivante :
AExmTxVE
Tpolyphénol AT XMR XVT XC1X100
5 T : teneur (en %) en polyphénol X de l'extrait
AE : aire du pic du polyphénol X de la solution analysée
AT : aire du pic du polyphénol X de la solution témoin
ME : masse de la prise d'essai de la solution analysée (en mg)
mT : masse de la prise d'essai du polyphénol X témoin correspondant
10 (en mg)
VT : volume dans lequel le polyphénol X a été solubilisé (en mL)
VE : volume dans lequel l'extrait analysé a été solubilisé (en mL)
d : facteur de dilution si nécessaire
EXEMPLES
I - Extraits bruts raffinés :
1.1. Extrait raffiné n 1
On extrait 100 kg de feuilles d'épinard fraîches par macération dans
300 L d'eau à 50 C pendant 2 heures.
L'eau peut être additionnée d'enzymes de type cellulases et
hémicellulases, ou toute autre enzyme de liquéfaction de fruits ou de
légumes.
Le solvant chargé (eau) est séparé de la matière solide en suspension
et filtré.
Le solvant chargé filtré est additionné d'huile d'olive, à raison de 1 kg
d'huile, par kg de matière sèche dans le liquide.
Le mélange solvant chargé et huile est ensuite concentré par
évaporation sous vide, dans un évaporateur flot tombant.
La température de chauffage est maintenue à une température
inférieure à 60 C.
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L'opération de concentration est conduite jusqu'à réduction par 20 du
volume total.
Le mélange concentré huile / phase aqueuse est ensuite lavé par de
l'eau adoucie, à 10 C, à raison de 1 volume d'eau par volume de mélange
initial.
Cette phase d'extraction liquide-liquide à l'aide d'une huile alimentaire,
réalisée au cours d'une opération de concentration, permet d'éliminer de la
phase aqueuse résiduelle l'ensemble des composants lipophiles, notamment
les pigments, tout en préservant l'intégralité des composants
polyphénoliques d'intérêt.
La phase huileuse est séparée et filtrée, et constitue une solution
lipidique de pigments chlorophylliens et caroténoïdes. Celle-ci peut
directement être utilisée dans des préparations colorantes alimentaires.
Le concentré aqueux constitue un extrait raffiné liquide (extrait raffiné
n 1), qui peut être transformé en poudre par élimination du solvant, par
séchage sous vide par exemple.
1.2. Extrait raffiné n 2
On extrait 100 kg de feuilles d'épinard fraîches par macération dans de
l'éthanol 30% vol à 50 C pendant 2 heures.
Le solvant chargé (éthanol) est séparé de la matière solide en
suspension et filtré.
Le solvant filtré est additionné d'huile de pépins de raisin, à raison de
1 L d'huile par kg de matière sèche. Un antioxydant alimentaire de type
vitamine E naturelle peut être ajouté au mélange.
Le mélange est ensuite désalcoolisé par distillation et concentration
sous vide poussé.
Le concentré obtenu est séparé en deux par collecte de la phase
huileuse contenant les pigments chlorophylliens et caroténoïdes. La phase
aqueuse est collectée séparément.
Cette phase d'extraction liquide-liquide à l'aide d'une huile alimentaire,
réalisée au cours d'une opération de concentration, permet d'éliminer de la
phase aqueuse résiduelle l'ensemble des composants lipophiles notamment
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les pigments, tout en préservant l'intégralité des composants
polyphénoliques d'intérêt.
La phase huileuse concentrée en pigments peut directement être
utilisée après filtration comme colorant alimentaire vert. Elle peut également
être séchée sur un support composé de maltodextrines, caséines, et
lécithines de soja, afin d'obtenir une poudre colorante verte et
hydrodispersible.
Le concentré aqueux constitue un extrait raffiné liquide (extrait raffiné
n 2), qui peut être transformé en extrait brut en poudre par élimination du
solvant, par séchage sous vide ou atomisation par exemple.
1.3. Extrait raffiné n 3
On extrait 100 kg de feuilles d'épinard fraîches par macération dans de
l'éthanol 90% vol à 50 C pendant 2 heures. On répète 3 fois l'opération et
toutes les fractions liquides collectées sont réunies.
Le solvant chargé (éthanol) est séparé de la matière solide en
suspension puis filtré.
Le solvant filtré est additionné d'huile de pépins de raisin, à raison de
1 L d'huile par kg de matière sèche. Un antioxydant alimentaire de type
vitamine E naturelle peut être ajouté au mélange.
Le mélange est ensuite désalcoolisé par distillation et concentration
sous vide poussé.
Le concentré obtenu est séparé en deux par collecte de la phase
huileuse contenant les pigments chlorophylliens et caroténoïdes. La phase
aqueuse est collectée séparément.
Cette phase d'extraction liquide-liquide à l'aide d'une huile alimentaire,
réalisée au cours d'une opération de concentration, permet d'éliminer de la
phase aqueuse résiduelle l'ensemble des composants lipophiles notamment
les pigments, tout en préservant l'intégralité des composants
polyphénoliques d'intérêt.
La phase huileuse concentrée en pigments peut directement être
utilisée après filtration comme colorant alimentaire vert. Elle peut également
être séchée sur un support composé de maltodextrines, caséines, et
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lécithines de soja, afin d'obtenir une poudre colorante verte et
hydrodispersible.
Le concentré aqueux constitue un extrait raffiné liquide (extrait raffiné
n 2), qui peut être transformé en extrait brut en poudre par élimination du
solvant, par séchage sous vide ou atomisation par exemple.
Il - Extraits purifiés :
11.1. Extrait purifié n 1
On soumet l'extrait raffiné n 2 à une étape de purification par
chromatographie sur résine de type divinylstyrènebenzène (XAD 16 de
Rohm & Haas), permettant un procédé d'adsorption/désorption adapté aux
polyphénols.
Les composés adsorbés sont désorbés de la résine par un lavage de
celle-ci à l'aide d'une solution hydro-alcoolique à 60% vol, à 35 C.
L'éluat ainsi obtenu constitue alors l'extrait purifié, qui peut également
être conservé sous forme liquide ou sèche.
La composition de cet extrait purifié est indiquée à la Figure 1.
Ainsi, cet extrait comprend les composés suivants :
acide férulique (pic n 1) ; patulétine-3-glucosyl-(1-6)-apiosyl(1-2)-
glucoside (pic n 2) ; patulétine-3-glucosyl-(1-6)-glucoside (pic n 3) ;
spinacétine-3-glucosyl-(1-6)-apiosyl(1-2)-glucoside (pic n 4) ; spinacétine-3-
glucosyl-(1-6)-glucoside (pic n 5) ; spinacétine-3-féruloylglucosyl-(1-6)-
glucoside (pic n 6) ; spinatoside (pic n 8) ; jacéidine-4'-glucuronide (pic
n 9) ;
5,3',4'-tri hydroxy-3-méthoxy-6:7-méthylènedioxyflavone-4'-glucuronide (pic
n 10) et 5,4'-dihydroxy-3,3'-diméthoxy-6:7-méthylènedioxyflavone-4'-
glucuronide (pic n 11).
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11.2. Extrait purifié n 2
On soumet l'extrait raffiné n 3 à une étape de purification par extraction
liquide-liquide à l'aide d'acétate d'éthyle.
L'acétate d'éthyle collecté contient la fraction polyphénolique d'intérêt,
qui constitue alors l'extrait purifié, qui peut également être conservé sous
forme liquide ou sèche.
