Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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COMPOSITION COSMETIQUE A BASE D'ESTER D'OPC DE PIN
L'invention concerne une composition cosmétique pour réparer et
éventuellement prévenir les effets du vieillissement de la peau à base d'un
extrait
d'écorce de pin maritime dont les oligomères procyanidoliques (OPC) sont
estérifiés
avec un acide gras. Ces compositions sont utiles notamment pour augmenter la
synthèse de collagène, pour apaiser la peau, ou encore protéger la peau des
radicaux libres.
Les Oligomères ProCyanidoliques (OPC), également appelés proantho-
cyanidines ou oligomères proanthocyanidiques, sont des molécules naturelles
très
répandues dans la nature. En effet, on les trouve dans les légumes, les
fruits, les
céréales mais également dans les pépins de raisin et l'écorce de pin.
L'intérêt
nutritionnel et physiologique de ces molécules est lié à leurs propriétés
antioxydantes et à leur bénéfice sur le système cardiovasculaire.
Les OPC appartiennent à la famille chimique des polyphénols et plus
particulièrement à la classe des flavonoïdes, composés reconnus pour leurs
propriétés antioxydantes. Les OPC sont constitués par une ou plusieurs unités
monomères répétées de flavan-3-ol, ces unités étant indépendamment choisies
parmi la catéchine, ou l'épicatéchine ou épicatéchine gallate. Ces unités sont
généralement répétées de 2 à 4 fois, les OPC les plus courants étant
généralement
sous forme dimère.
} I l y
Structure biochimique d'un OPC
(trimère de catéchine)
Toutefois, les fonctions phénoliques des OPC rendent ces composés
particulièrement sensibles aux différents facteurs de dégradation tels que la
lumière,
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l'air et les pH acide ou basique. Cette instabilité constitue, dans la
majorité des cas,
un frein à l'exploitation de leurs effets bénéfiques. Pour stabiliser ces
composés, il a
notamment été proposé d'estérifier les extraits oligomères polyphénoliques par
des
dérivés d'acides gras à longues chaînes hydrocarbonées (FR 2 723 943).
Les inventeurs ont maintenant mis en évidence qu'un extrait d'écorce de pin
dont les oligomères procyanidoliques (OPC) sont estérifiés avec un acide gras,
présentait des propriétés cosmétiques particulièrement intéressantes. Il a
ainsi été
mis en évidence que les esters d'OPC extraits d'écorce de pin permettaient
d'augmenter la synthèse de collagène par les fibroblastes de derme humain, et
donc de réparer les effets du vieillissement cutané. Il a également été mis en
évidence que ces esters d'OPC présentaient en outre des propriétés anti-
inflammatoires et anti-radicalaires, les rendant ainsi particulièrement utiles
pour
apaiser la peau et prévenir les effets du vieillissement cutané.
La présente invention a ainsi pour objet une composition cosmétique pour
réparer les effets du vieillissement cutané comprenant :
a) les oligomères procyanidoliques (OPC) extraits d'écorces de pin, lesdits
oligomères étant estérifiés avec au moins un acide gras ; et
b) un véhicule cosmétiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation préféré, les compositions cosmétiques selon
l'invention comprennent :
a) un extrait d'écorce de pin dont les oligomères procyanidoliques (OPC) sont
estérifiés avec au moins un acide gras, et
b) un véhicule cosmétiquement acceptable.
Par véhicule cosmétiquement acceptable , on entend un véhicule adapté
pour une utilisation en contact avec des cellules humaines et animales, en
particulier les cellules de l'épiderme, sans toxicité, irritation, réponse
allergique
indue et similaire, et proportionnée à un rapport avantage/risque raisonnable.
Les extraits d'écorce de pin, notamment maritime, contiennent une grande
variété d'oligomères procyanidoliques, dont notamment des monomères de
catéchine, et de taxifoliol ainsi que des oligomères procyanidoliques de 2 à 5
unités
flavan-3-ol, les monomères et les dimères étant présents de façon majoritaire.
La composition des extraits d'écorce de pin se différencie de façon
qualitative
et/ou quantitative de celle des autres extraits d'origine végétale, en
particulier des
extraits de pépin de raisin, que l'on trouve notamment dans le commerce sous
la
dénomination VITAFLAVAN . Plus précisément, les oligomères procyanolidiques
extraits d'écorce de pin comprennent notamment du taxifoliol, du taxifoliol
glucoside,
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du férulate glucoside et différents acides phénoliques, qui ne sont pas
présents
dans les extraits de pépin de raisin. A la différence de ceux-ci, ils ne
comprennent
pas en revanche, d'épicatéchine ou d'épicatéchine gallate. Les OPC
représentent
généralement environ 70% en poids du poids total de l'extrait d'écorce de pin.
Les extraits d'écorce de pin maritime sont disponibles commercialement
(OLIGOPIN , DRT). Ils peuvent être également obtenus par un procédé
d'extraction classique tel que celui décrit dans le brevet FR 998 508.
L'extrait d'écorce de pin peut être notamment un extrait de pin maritime
français (Pinus pinaster), tel que le pin des Landes.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les oligomères
procyanidoliques (OPC) contenus dans les extraits d'écorce de pin maritime
sont
estérifiés avec un acide gras selon le procédé décrit dans la demande de
brevet
FR 2 723 943. Plus particulièrement, les OPC sont estérifiés selon le procédé
comprenant les étapes de :
a) mise en contact de l'extrait d'écorce de pin maritime dans un milieu
liquide non
solvant pour ledit extrait mais solvant pour les esters à obtenir, de façon à
obtenir
une suspension ;
b) ajout à ladite suspension d'au moins une amine tertiaire aliphatique à bas
poids
d'ébullition, en présence d'une quantité catalytique d'au moins une base
organique
autre que la pyridine, et
c) introduction dans ce mélange d'au moins un chlorure d'acide gras, le
mélange
réactionnel étant agité à une température inférieure à 40 C puis concentré par
évaporation pour obtenir un extrait dont les OPC sont estérifiés.
De préférence, les OPC sont estérifiés par des acides gras saturés,
notamment l'acide palmitique et l'acide stéarique, plus préférentiellement
l'acide
palmitique.
L'application d'une composition cosmétique selon l'invention est effectuée par
voie topique.
La composition est destinée plus particulièrement au traitement de la peau et
peut se présenter sous forme d'onguent, de crème, d'huile, de lait, de
pommade, de
poudre, de tampon imbibé, de solution, de gel, de spray, de lotion, de
suspension,
de savon.
Les compositions selon l'invention peuvent être des compositions
cosmétiques sous la forme d'émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile, ou
d'émulsions multiples, de micro-émulsion, de gel hydroalcoolique, de crème,
d'huile,
de lotion hydroalcoolique.
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De manière préférentielle, les compositions cosmétiques selon l'invention
peuvent comprendre de 0,1 à 2,5% dudit extrait estérifié exprimé en poids par
rapport au poids total de la composition, de préférence de 0,2 à 1,0%.
Les compositions cosmétiques selon l'invention sont particulièrement utiles
pour augmenter la synthèse de collagène, notamment par les fibroblastes de
derme
humain. Elles sont en outre avantageusement utiles pour apaiser la peau, et/ou
pour protéger la peau des radicaux libres. Ils sont ainsi particulièrement
utiles pour
prévenir les effets du vieillissement cutané, notamment le
photovieillissement.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une composition cosmétique
comprenant :
a) les oligomères procyanidoliques (OPC) extraits d'écorce de pin, lesdits
oligomères étant estérifiés avec au moins un acide gras ; et
b) un véhicule cosmétiquement acceptable,
pour réparer les effets du vieillissement cutané.
La présente invention concerne également une méthode de traitement
cosmétique, comprenant l'application, notamment topique, d'une composition
cosmétique telle que définie ci-dessus.
Ainsi, la présente invention concerne une méthode de traitement cosmétique,
pour réparer les effets du vieillissement cutané, comprenant l'application
d'une
composition cosmétique comprenant les oligomères procyanidoliques (OPC)
extraits d'écorces de pin, lesdits oligomères étant estérifiés avec au moins
un acide
gras ; et un véhicule cosmétiquement acceptable.
La présente invention concerne également une méthode de traitement
cosmétique, pour réparer les effets du vieillissement cutané, comprenant
l'application d'une composition cosmétique comprenant un extrait d'écorce de
pin
dont les oligomères procyanidoliques (OPC) sont estérifiés avec au moins un
acide
gras, et un véhicule cosmétiquement acceptable.
Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
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EXEMPLES
Exemple 1
5 Préparation d'un extrait d'écorce de pin maritime contenant des OPC
estérifiés
L'extrait d'écorce de pin (Oligopin ) est estérifié avec l'acide palmitique
selon
le procédé décrit dans la demande de brevet FR 2 723 943.
Dans les exemples qui suivent, les termes esters d'OPC de pin se réfèrent
à l'extrait d'écorce de pin estérifié selon le présent exemple 1.
Exemple 2
Etude de l'activité cytotoxique des esters d'OPC de pin sur une
monocouche de cellule en culture
1. Objectif de l'étude
Le but de cette étude est d'évaluer, par un test in vitro, la capacité des
esters
d'OPC de pin préparés selon l'exemple 1 à induire des effets cytotoxiques sur
monocouche de fibroblastes humains.
2. Principe de l'étude
L'objectif de l'étude est d'évaluer la capacité des esters d'OPC de pin à
induire des effets cytotoxiques sur une culture primaire de fibroblastes
humains
normaux.
Après application du produit sur les cellules pendant 24 heures, la viabilité
cellulaire est évaluée par la mesure de l'activité de la succinate
déshydrogénase
mitochondriale des cellules vivantes. Cette enzyme transforme le MTT (bromure
de
3(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) en cristaux de formazan
bleu.
Après dissolution de ces cristaux, on réalise une lecture spectro-
photométrique. Les
absorbances mesurées sont proportionnelles au nombre de cellules vivantes.
3. Système d'essai
Les cellules utilisées sont des fibroblastes de tissu de peau humaine (prépuce
enfant caucasien), au passage 1.
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4. Déroulement de l'étude
Eléments de référence :
Les contrôles suivants sont inclus à chaque analyse
- Témoin négatif : milieu de culture complet
- Témoin positif : SDS
Définition des séries :
Six dilutions de chaque échantillon, préparées dans du milieu de culture à
0,005 % de tween 60 et 0,05 % d'huile de coton, sont testées à raison de 5
puits de
tests par concentration. Les éléments de référence sont testés sur 5 puits.
5. Expression et interprétation des résultats
L'absorbance est mesurée à 540 nm. Les résultats sont exprimés sous forme
de pourcentage de mortalité comparé au contrôle négatif :
mortalité = Abs contrôle négatif - Abs échantillon x100
Abs contrôle négatif
6. Résultats
UA MTT (N=8)
Ecart type Mortalité en %
Témoin négatif (solvant) 0,245 0%
0,016
Témoin positif 0,065 73%
0,011
1000 pg/rn I 0,262 0%
0,009
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
500 g/rnl 0,237 4%
0,034
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
100 g/ml 0,224 9%
Esters dOPC 0,023
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
de pin 0,227
50~tg/ml 8%
0,019
0,272
10 g/rn 1 0%
0, 026
0,221
1 g/rn1 0,027 10%
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Le contrôle positif présente une mortalité supérieure à 30%, ceci valide le
test.
7. Conclusion
Dans les conditions expérimentales retenues, les esters d'OPC de pin selon
l'exemple 1 ne présentent pas d'effet cytotoxique significatif. Pour toutes
études
d'efficacité, la concentration maximale utilisée devra être 1000 pg/ml.
Exemple 3
Etude de screening du potentiel anti-inflammatoire et anti-radicalaire
1. Principe de l'étude
On reconstruit in vitro un épiderme humain dans des inserts de culture.
On dépose sur le stratum corneum un disque de papier filtre sur lequel a
été déposée la substance à l'essai (traitement préventif). 24 heures après, on
irradie
par les UVB puis on applique de nouveau la substance à l'essai (traitement
curatif).
24 heures après, on réalise :
- une étude de la cytotoxicité (MTT),
- un dosage de l'IL-1 a, médiateur pro-inflammatoire dans le milieu de
culture,
- un dosage de MDA (malonaldéhyde) (produit terminal formé lors du
processus de peroxydation lipidique induit par la formation d'espèces
radicalaires,
ou d'espèces activées par l'oxygène).
2. Identification de la substance à l'essai
OPC estérifié selon l'exemple 1 en solution à 1 % (p/p) dans le solvant E (50
% isopropanol - 50 % isopropyl myristate en p/p)
3. Protocole
3.1. Préparation du système réactif : feuillets épidermiques humains
reconstruits :
- Culture de kératinocytes humains au 3e passage exempts de mycoplasmes
- Les kératinocytes sont ensemencés à la densité de 100 x 103 cellules/cm2
dans des inserts dont le fond est constitué d'une membrane en polycarbonate
(porosité 0,4 m - 1 cm2).
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- Les cellules sont incubées à 37 C en atmosphère humide contenant 5 %
(v/v) de C02 pendant 24 heures, en "situation immergée" dans le milieu de
culture :
MCDB/153 supplémenté par l'EGF (5 ng/mL), l'insuline (5 g/mL),
l'hydrocortisone
(0,5 g/mL), le BPE (70 g/mL).
- Le milieu de culture est remplacé par le même milieu de culture supplémenté
par 1 mM de Ca" afin d'induire la stratification de la monocouche en
"situation
immergée" pendant 6 jours. Le milieu de culture est changé tous les trois
jours.
- Le feuillet épidermique est mis en "situation émergée" au 6e jour, c'est-à-
dire
qu'il n'est plus nourri que par l'intermédiaire des cellules basales, le
stratum
corneum étant exposé à l'air. Le milieu de culture est changé tous les trois
jours.
3.2. Préparation de la substance à l'essai :
Au 14' jour d'incubation, le milieu de culture est changé et remplacé par le
même milieu de culture supplémenté par des antibiotiques à 1% (10 000 U
Penicillin
- 10 000 g/mL Streptomycin - 25 g/mL Amphotericin) 20 L de la substance à
l'essai (3 concentrations non-cytotoxiques), ou 20 L des témoins négatifs
(milieu
de culture) ou des témoins solvants sont appliqués, en conditions stériles,
sur un
disque de papier filtre (Whatman n 3MMChr) couvrant la surface de l'épiderme
reconstruit, le côté sur lequel ont été déposés la substance à l'essai, et les
témoins,
au contact du stratum corneum .
3.3. Définition des séries :
Les séries suivantes sont mises en oeuvre en triplicate
- 3 séries substance à l'essai (5, 50 et 500 g/mL) constituées de 3 épidermes
chacune (à irradier),
-1 série témoin négatif absolu (non irradiée),
- 1 série témoin négatif absolu (à irradier),
- 1 série témoin solvant (non irradiée),
- 1 série témoin solvant (à irradier),
- 1 série témoin positif 1 (Vit E : 200 g/mL) (à irradier),
- 1 série témoin positif 2 (Indométhacine : 10 g/mL) (à irradier),
Les huit premières séries sont mises à incuber pendant 24 heures à 37 C en
atmosphère humide contenant 5% (v/v) de C02 (traitement préventif pour les
séries
traitées).
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La neuvième série, correspondant au témoin positif 2 (Indométhacine), est
constituée en déposant 20 L d'une solution d'indométhacine à 10 g/mL sur un
disque de papier filtre (Whatmann n 3 MMChr) déposé au contact de l'épiderme
reconstruit et incubé pendant 3 heures à 37 C, 21 h après la mise en oeuvre
des
séries précédentes.
Ensuite, les disques de papier filtre sont soigneusement retirés et toutes les
séries sont irradiées par les UVB (0,6 J/cm2) (Spectroline modèle X-15N/F, a,
= 312
nm) exceptée la série correspondant au témoin négatif absolu et au témoin
solvant.
Le traitement curatif est ensuite mis en oeuvre comme décrit plus haut pour le
traitement préventif sur une période de 24 heures, sauf pour la série témoin
positif 2
(Indométhacine).
3.4. Estimation de la population cellulaire (Test au MTT*)
Le test au MTT est réalisé selon les conditions décrites dans les publications
Hausen M.B, Nielsen S.E. et Berg K. Re-examination and further development of
a
precise and rapid dyemethod for measuring cell growth/cell kilt. J. Immunol.
Methods. 1989, 119, 203 ; et Mosmann T., Rapid colorimetric assay for cellular
growth and survival : Application to prolifération and cytotoxic assays, J.
Immunol.
Methods. 1983, 65, 55-63.
A la fin du temps d'incubation choisi, le disque de papier Whatman est
soigneusement prélevé, le stratum corneum rincé, et la membrane poreuse
portant le feuillet épidermique est détachée de l'insert à l'aide d'un
bistouri. Les
milieux de culture sont utilisés pour le dosage de FIL-1 a et du MDA.
Le feuillet épidermique est :
- rincé avec du PBS (2 fois),
- incubé pendant 3 heures, à 37 C, à l'obscurité, en présence de 2 mL de MTT
(bromure de 3-{4,5-dimethylthiazol-2-yl}- 2,5 - diphenyl tetrazolium) à 0,5
mg/mL de
milieu de culture,
- rincé avec du PBS (2 fois).
Les cristaux violets de formozan produits par le clivage du MTT par les
enzymes mitochondriaux sont dissous dans 2 mL de DMSO sous agitation douce
pendant une heure à température ambiante.
Pour chaque feuillet, on pipette 200 L de la solution obtenue dans une
plaque de 96 puits pour réaliser la spectrométrie avec un lecteur de plaques
(FL600
- BIO-TEK) à A = 540 nm.
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3.5. Dosage de l'IL-1 a :
Le dosage de I'IL-1 a est réalisé dans les milieux de culture prélevés (n = 3)
dilués au 1/10e et au 1/20ème conformément au protocole décrit dans le kit de
dosage.
5
3.6. Dosage du MDA:
Préparation de la gamme étalon de MDA :
- solution mère à 10 M de malonaldéhyde bi[diméthylacetal] dans l'acide
10 sulfurique à 1 % (v/v) (2 heures à température ambiante),
- des dilutions sont réalisées entre 0,1 et 10 M (0,1 - 1 - 2,5 - 5 et 10
M).
500 L de milieu de culture (ou 500 L de gamme étalon) sont mélangés
énergiquement au Vortex à 1 mL d'une solution TCA, TBA, HCI (TCA (acide
trichloroacétique) à 0,15 % (p/v), de TBA (acide 2-thiobarbiturique) à 0,375 %
(p/v),
d'HCI 0,25 M (chauffée 15 minutes à 100 C pour dissoudre le TBA, puis laissée
refroidir).
Le mélange est mis à incuber 15 minutes à 100 C et la DO mesurée à A _
535 nm contre un blanc constitué de la solution TCA, TBA, HCI .
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4. Résultats
~~n~t~t:aat~an
6ifbrtance: 1'e=sa E.t;gtsaL) [`A= t31HT) I1_.Ia ~pZ-'mL IL1 :;L:_1~ 1TT1
OPC estérifié en solution à
1 % (p/p) dans le solvant E f3,292 D,051 5: KI It}I' 39R
3:. 1
(50 % isopropanol - 50 % 1'' 2
isopropyl myristate en p/p) 17'
.D 247 i _;
+ UVB
O'295 _ D,071 252 Dib 9411 43R
.3'ti 4 t 'OZ5 .1i 314 783 - s1
414 1<+cs ;
Téfan nt `.1-=t 1 +A 11)3
17 13 ti
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43,245 t O39 191 9 8fl 420
Tlmoira Solvant r, _î il, 4Ç 12
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47 -
Tg~aan negatf absout .,
0,374 0OSis 61 f 1';i 1.65 35
Tableau 1
*UA : unités arbitraires
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12
L .73i f ~.IS iT'::iÉFï?19:
*.:tq:~cp3.t' ~;ù 1.4 :TTT ÃI: tai5:f-~ 1D: çt .I:T'A`LIT:
OPC estérifié en solution à1 %
0.5 33 ].
(p/p) dans le
L~ ? :; 3,f='41 _ } 3,tlti 1::?: s ~i ,.mec,.
solvant E (50 % isopropanol - .. õ _
50 % isopropyl myristate
en p/p) + UVB r
G; ;9f } >), 71 RF.: t. e.(f x 1.1 Lis t t
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_fi O.^ ,.,
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L). 3
Tableau 2
UA : unités arbitraires
5 4.1. Cytotoxicité
= Le témoin négatif absolu irradié : on observe une diminution de 37 % (P <
0,05) de la DO (UA MTT) par rapport au témoin négatif absolu, ce qui
correspond à
l'effet cytotoxique généralement obtenu pour la dose d'irradiation utilisée
(0,6 J/cm2)
et valide l'irradiation.
10 = Le témoin négatif absolu irradié, traité par l'indométhacine 3 heures
avant
l'irradiation : il n'y a pas d'effet protecteur de l'indométhacine en ce qui
concerne la
cytotoxicité.
= Le témoin négatif irradié, traité par la Vitamine E 24 heures avant
l'irradiation
on observe un effet protecteur de la Vitamine E puisque l'effet cytotoxique
n'est
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plus que de 13% (NS), soit environ le tiers de celui observé en l'absence de
Vitamine E.
= Le témoin solvant : il n'a pas modifié significativement la prolifération
cellulaire.
= Le témoin solvant irradié : il n'est pas significativement différent du
témoin
négatif absolu irradié.
= La substance à l'essai : on observe un effet protecteur. Pour 500 g/mL,
l'effet cytotoxique est de 17 % (NS).
4.2. Etude du dosage de l'IL- la (Tableau 1) :
= Témoin négatif absolu irradié : Le taux d'IL-1 a dans le milieu de culture
est
très important : + 290 % (P < 0,02) par rapport au témoin négatif absolu. Ce
résultat
valide le système réactif qui apparaît particulièrement réactif.
= Témoin négatif absolu irradié traité par l'indométhacine 3 heures avant
l'irradiation : l'indométhacine utilisée en préventif inhibe partiellement (-
20 %) la
synthèse et la sécrétion d'IL-la dans le milieu de culture. Bien que n'étant
pas
statistiquement significatif cet effet correspond aux valeurs habituellement
obtenues.
= Témoin solvant : il n'est pas significativement différent du témoin négatif
absolu.
= Témoin solvant irradié : comme pour le témoin négatif absolu irradié le taux
d'IL-la est fortement augmenté. Cette augmentation n'est pas significativement
différente de celle observée pour le témoin négatif absolu irradié.
= La substance à l'essai (esters d'OPC de pin) : on observe une diminution du
taux d'IL-la dans le milieu de culture ; cet effet est particulièrement net
pour la
concentration la plus forte (500 g/mL) : - 41 % (P < 0,02) par rapport au
solvant
irradié, ce qui représente le double de l'inhibition induite par
l'indométhacine.
4.3. Etude du MDA (Tableau 2) :
= Le témoin négatif absolu irradié : le taux de MDA est augmenté de 175 %
(P<0,02) par rapport au témoin négatif absolu non-irradié, ce qui valide le
système
réactif.
= Le témoin négatif absolu irradié, traité par la Vitamine E avant et après
irradiation : l'augmentation du taux de MDA n'est plus que de 58% (P<0,05), ce
qui
représente le tiers du taux observé pour le témoin négatif absolu irradié non
traité.
= Le témoin solvant non-irradié : il n'a pas d'effet significatif sur le taux
de
MDA, par rapport au témoin négatif absolu.
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= Le témoin solvant irradié : il n'a pas d'effet significatif sur le taux de
MDA, par
rapport au témoin négatif absolu irradié.
= La substance à l'essai (esters d'OPC de pin) : on observe une diminution du
taux de MDA dans le milieu de culture pour toutes les concentrations étudiées.
Pour
50 g/mL, on observe une inhibition de 43 % par rapport au témoin solvant
irradié
par les UVB.
5. Conclusion
Pour les concentrations non-cytotoxiques étudiées, 5, 50 et 500 .ig/mL, la
substance à l'essai, OPC estérifié selon l'exemple 1, en solution à 1 % (p/p)
dans le
solvant E (50 % isopropanol - 50 % isopropyl myristate en p/p) :
- protège l'épiderme irradié de la cytotoxicité induite par les UVB ;
- diminue le taux d'IL-1 a sécrété dans le milieu de culture après irradiation
par
les UVB :- 42 % par rapport au témoin solvant irradié pour 500 g/mL ;
- diminue le taux de MDA sécrété dans le milieu de culture : 35 % à 45 %.
Ces résultats de screening montrent une activité anti-inflammatoire et
même antiradicalaire.
Les témoins positifs et négatifs ont validé l'expérimentation.
Exemple 4
Etude de l'effet d'un élément d'essai (esters d'OPC de pin de l'exemple
1) sur la synthèse du collagène par des fibroblastes humains
1. Objectif de l'étude
Le but de cette étude est d'évaluer, par un test in vitro, l'effet des esters
d'OPC de pin selon l'exemple 1 sur la synthèse du collagène par une culture de
fibroblastes primaires humains.
2. Principe de l'étude
Les fibroblastes sont les principales cellules du derme. Ils sont spécialisés
dans la synthèse de deux types de fibres protéiques : les fibres de collagène
et les
fibres d'élastine constituants de la matrice extra-cellulaire. Le collagène
constitue 70
% des protéines du derme et lui confère sa résistance aux tensions et aux
tractions.
L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet de l'élément d'essai sur la
synthèse de collagène après un contact de 24 heures avec une mono-couche de
fibroblastes humain normal.
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3. Système d'essai
Cellules utilisées :
Les cellules utilisées sont des fibroblastes de tissu de peau humaine enfant
(garçon, Caucasien), au passage 2.
5 Les fibroblastes sont préparés et mis à jour selon le mode opératoire en
vigueur.
Eléments de référence :
Les contrôles suivants sont inclus à chaque analyse
- Control négatif : milieu complet
10 - Control positif : TGF3 1Ong/m1
Définition des séries :
Trois dilutions non cytotoxiques de chaque échantillon, préparées dans du
milieu de culture à 0,005 % de tween 60 et 0,05 % d'huile de coton, sont
testées à
15 raison de 3 puits par concentration.
Les éléments de référence sont également testés en trois exemplaires.
4. Déroulement de l'étude
Mise en contact des cellules avec le produit à l'étude
Les cellules sont ensemencées à raison de 50 000 cellules /cm2. Après 24
heures de culture (37 C, 5% C02), elles sont incubées avec le produit à
l'étude et
l'élément de référence pendant 24 heures dans un milieu de 1% de SVF.
Dosage du collagène :
Le collagène est dosé dans la matrice extra-cellulaire et dans le milieu de
culture à l'aide du coffret de dosage Sircol, Biocolor Ltd, Irlande, selon le
protocole
décrit dans le coffret.
Le dosage est réalisé à l'aide du colorant rouge Sirius (Direct Red 80) qui
présente une affinité spécifique pour la structure en triple hélice (Gly-X-Y),
du
collagène natif.
L'absorbance du complexe colorant-collagène est lue au spectrophotomètre à
540 nm.
Une courbe standard est réalisée entre 0 et 50 g/ml de collagène de type I.
Mesure de la densité cellulaire :
La densité cellulaire est évaluée dans les mêmes conditions que
précédemment, par la mesure de l'activité de la succinate déshydrogénase
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mitochondriale des cellules vivantes. Cette enzyme transforme le MTT (bromure
de
3(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) en cristaux de formazan
bleu.
Après dissolution de ces cristaux, on réalise une lecture spectro-
photométrique. Les
absorbances mesurées sont proportionnelles au nombre de cellules vivantes.
5. Expression et interprétation des résultats
Pour l'évaluation de la densité cellulaire, l'absorbance mesurée est exprimée
en unité de MTT (U MTT). Elle est proportionnelle à la quantité de cellules
présentes dans chaque puits.
La concentration en collagène est exprimée en g de collagène/ml/U MTT
dans la matrice extra-cellulaire et dans le milieu de culture.
Résultats
Densité Dosage du collagène
Ratio collagène
cellulaire pg / puits
( g/puits/U MTT
(N=3)
Control N=3 Milieu de Matrice Milieu Matrice
Test item N=3 Ecart type culture cellulaire TOTAL de cellulaire TOTAL
culture
Contrôle 0747 8.08 4.14
12.22 10.81 5.54 16.35
négatif 0.030 2.83 3.89
Contrôle 0.934 11.36 9.74
positif
21.09 12.15 10.42 22.57
TGF X31 0.037 2.03 7.42
(100ng/ml)
* Contrôle 0.834 9.58 3.13
12.70 11.48 3.75 15.23
véhicule 0.014 1.41 6.10
Esters d'OPC 0.795 16.84 3.42
de pin 20.26 21.18 4.3 25.48
0.053 3.92 3.61
500 pg/m l
------------------- ---------------------------------------------------- -- ..
.... .....
0.719 26.85 2.04
200 pg/ml 28.89 37.36 2.84 40.20
0.062 9.00 7.68
------------- ------------- ------------------------
50 pg/ml 0.677 28.07 0.27
28.34 41.45 0.40 41.85
0.032 5.55 1.92
---------- - ------------ ------------------------
0.720 2.45 2.57
5 pg/ml 5.02 3.40 3.57 6.97
0.044 1.70 2.74
*véhicule : milieu de culture à 0,005 % de tween 60 et 0,05 % d'huile de coton
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Stimulation du Stimulation du Stimulation de la
collagène excrété collagène produit dans synthèse du
dans le milieu de la matrice cellulaire collagène total
culture
Contrôle
positif 12% 88% 38%
TGF (31
(100n /ml)
Esters d'OPC
de pin 84% 15% 67%
500 pg/m I
- ---- ------------------------------------------------------------- ----------
-----------------
200 pg/ml 225% 0% 164%
-------------------- ----------------------------------------------------------
--- ---------------------------
50 pg/m l 261% 0% o 175%
175/0
-------------------- ----------------------------------------------------------
--- ---------------------------
pg/ml 0% 0% 0%
Le TGF X31 à 10 g/ml stimule de façon significative (38 %) la synthèse totale
de collagène. Ce résultat valide le modèle utilisé. La stimulation est
particulièrement
efficace au niveau de la matrice cellulaire (88 %).
5
En ce qui concerne l'effet du produit à l'essai, on peut noter une stimulation
de
la synthèse du collagène total très significative avec un maximum de plus de
175 %
pour une concentration de 50 g/ml du produit.
On peut constater également que le produit présente un effet essentiellement
sur la sécrétion du collagène à l'inverse de ce que l'on peut observer pour le
contrôle positif (TGF X31).
L'effet est maximum pour les concentrations 200 et 50 g/ml.
A 500 g/ml, l'effet reste très marqué mais il est moins important. A 5 g/ml,
le
produit n'a plus d'effet. Ce type de réponse, en cloche , est très souvent
observé
dans ce type d'étude.
6. Conclusion
Dans les conditions expérimentales retenues, les esters d'OPC de pin selon
l'exemple 1 présentent un effet important sur la synthèse du collagène.
