Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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Nouvelle souche de Lactobacillus plantarum
La pratique de la germination des céréales et légumineuses et
notamment du riz bien établie en Asie est devenue populaire dans le monde
occidental. Les graines ainsi germées peuvent être utilisées dans de nombreux
plats,
comme les salades, les soupes, les ragoûts, les boissons et les produits de
boulangerie.
Les graines germées sont considérées comme ayant une valeur nutritive
exceptionnelle. Il est également connu que les graines germées comme le riz
brun
germé ou partiellement germé contiennent des teneurs importantes en acide
gamma-
amino butyrique (GABA). Le GABA est un neurotransmetteur des cellules du
cerveau
qui joue un rôle dans la prévention de certaines maladies et la stimulation de
la
production de l'hormone de croissance.
La germination peut se faire sans équipement sophistiqué. Les graines
sont placées dans de l'eau à une température adéquate pendant plusieurs
heures. Les
graines germées peuvent être conservées pendant quelques jours à plus d'une
semaine au réfrigérateur.
La germination débute avec l'imbibition de la graine et cesse dès que la
radicule a percé les téguments de la graine.
Durant la germination, les phases de trempage et/ou de conservation des
graines humides peuvent être favorables au développement de microorganismes
pathogènes ou d'altération. Il est fréquent que des bactéries comme des
coliformes
tels que Escherichia cou i ou Enterococcus spp., Pseudomonas spp., Bacillus
spp.,
Sphingomonas spp., Microbacterium spp. ou des champignons filamenteux
appartenant notamment au genre Aspergillus se développent. L'ingestion de
telles
bactéries peut s'avérer dangereuse pour la santé.
La présente invention a pour objet une nouvelle souche isolée du genre
Lactobacillus charatérisée par sa capacité à se développer dans le milieu de
germination d'une graine, et sa capacité à limiter le développement de
bactéries
comme les Enterobactericaceae et plus particulièrement E. cou i ou comme
Bacillus
spp, en cas de contamination de ladite graine lors de sa germination
comparativement
à une germination sans Lactobacillus.
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Selon un mode particulier, l'invention a pour objet une souche isolée de
du genre Lactobacillus plantarum et plus particulièrement la souche NUT-2
déposée
auprès de la CNCM le 4 septembre 2013 sous le numéro CNCM 1-4799.
Dans une mise en oeuvre particulière de l'invention, la souche de L.
plantarum NUT-2 permet de limiter la croissance d'une souche d' E. cou i
0157:H7.
Dans le cadre de la présente invention, les graines sont choisies
notamment parmi les espèces suivantes : les légumineuses comme les haricots,
les
lentilles, les pois, le soja, les Chénopodiacées comme le quinoa ou les
céréales comme
le blé, l'orge, le maïs ou le riz.
Le développement de la souche selon l'invention se caractérise par une
augmentation du nombre de bactéries au cours du temps. Ce développement ou
croissance bactérienne peut être mesuré de différentes façons bien connues de
l'homme du métier. On peut citer de manière non exhaustive : la mesure de la
biomasse sèche, le dénombrement des cellules par utilisation de la cellule de
Thoma,
par turbidimétrie, par comptage sur milieu solide (ensemensement, incubation
et
dénombrement), ou encore par mesure de l'activité cellulaire (par exemple :
consommation d'un subtrat ou d'un constituant cellulaire).
La limitation du développement ou de la croissance des bactéries et
notamment d'E.coli, d'Enterobactericaceae, et/ou de Bacillus spp est définie
en
comparant le nombre de bactéries présentes dans le milieu à l'issue de la
germination
dans des conditions expérimentales identiques à l'exception de la présence de
la
souche de l'invention, et plus particulièrement de la souche NUT2. La
limitation est ici
définie à l'issue de la germination par une réduction du nombre de bactéries
d'au
moins 0,5 log, de préférence de 1 log en présence de la souche de l'invention,
et plus
particulièrement de la souche NUT2 par rapport au nombre de bactéries mesuré
en
absence de la souche de l'invention et plus particulièrement de la souche
NUT2.
La présente invention a également pour objet une composition
comprenant une souche selon l'invention.
La souche, comme la composition, selon l'invention peuvent être utilisée
dans des procédés de germination. Un tel procédé comprend la mise en présence
de
la souche ou d'une composition selon l'invention, du milieu de germination et
des
graines.
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Le procédé de germination comporte une première étape de trempage
des graines dans un milieu de trempage en présence de la souche selon
l'invention à
une température et pendant une durée adaptées à la la nature de la graine.
Cette
étape peut être effectuée dans l'obscurité.
Dans une mise en oeuvre particulière la première étape de trempage est
faite en présence de la souche NUT-2 déposée auprès de la CNCM le 4 septembre
2013 sous le numéro CNCM 1-4799 - ou d'une composition comprenant ladite
souche.
Celle-ci est présente dans une quantité de bactéries comprenant entre 105 à
109
UFC/g de graine, de préférence 107 UFC/g de graine.
Le milieu de trempage est défini par l'homme du métier en fonction du
type de graine. Il est le plus souvent constitué par de l'eau.
S'agissant du riz brun, la première étape se déroule dans de l'eau à
température ambiante pendant 16 heures.
Dans une mise en oeuvre particulière du procéde de germination l'étape
de trempage comprend une étape d'activation durant laquelle le milieu de
germination comprenant la souche et les graines est placé à une température
comprise entre environ 35 C et envrion 40 C pendant une durée comprise entre
environ deux et environ quatre heures. La température peut varier entre 30 C
et 45 C.
La durée de cette étape d'activation peut être comprise entre 1h30 et 4h30.
Cette augmentation température permet de réduire le temps total de
trempage de 6 heures.
Par exemple l'étape d'activation, du riz brun peut être faite par trempage
des grains de riz dans de l'eau à environ 30 C-40 C, de préférence 32 C,
pendant une
durée comprise entre 2 et 4 heures.
Dans une seconde étape, ou étape de germination (proprement dite), le
milieu de trempage est enlevé et les graines humides sont placées dans un
récipient
lequel est éventuellement placé à l'abri de la lumière. Les graines sont
rincées à l'eau
à plusieurs reprises durant cette seconde étape dont la durée dépend de la
nature des
graines. Elle est généralement comprise entre 4 et 48h (de l'ordre de 4 à 8h
pour le
quinoa, 16h pour le riz ou encore 48h pour le haricot mungo).
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Le nombre de rinçage est adapté en fonction du type de graine, il est
généralement compris entre 1 et 10 rinçages, de préférence de 1 à 5 rinçages.
Le rinçage est habituellement fait avec de l'eau.
L'apparition de la radicule au travers des téguments de la graine indique
la fin du procédé de germination. Celui-ci peut cependant être poursuivi en
fonction
des souhaits de l'utilisateur par exemple jusqu'à l'obtention de jeunes
pousses.
Un tel procédé de germination s'adapte à tous les types de graines et
notamment les graines choisies parmi les espèces suivantes : les légumineuses
comme
les haricots, les lentilles, les pois, le soja, les chénopodiacées comme le
quinoa ou les
céréales comme le blé, l'orge, le maïs ou le riz.
Pour une cuisson ultérieure des graines, le procédé de germination des
graines peut être effectué directement dans un dispositif de cuisson des
graines (ou
cuiseur tel que décrit par exemple dans la demande de brevet W02012/056171).
Ainsi, le cuiseur peut comprendre également un accessoire de germination
comprenant un panier amovible (comme celui décrit dans la demande de brevet
W02012/056171.
Dans cette mise en oeuvre de l'invention, les graines sont placées
directement dans un accessoire du cuiseur et l'accessoire placé dans la cuve
du
cuiseur avec de l'eau et en présence de la souche selon l'invention durant
l'étape de
trempage.
Puis après avoir enlevé l'eau de la cuve, les graines humides sont laissées
ou non dans l'accessoire à l'abri ou non de la lumière pendant une durée
adaptée à la
graine que l'on fait germer, soit de 4 à 48h et plus particulièrement 30
heures, en
particulier 32 heures.
De temps en temps, les graines sont lavées. Lorsque les germes des
graines sont visibles à l'ceil nu, un dernier rinçage des graines est
effectué. Elles sont
ensuite versées dans la cuve du cuiseur. Le niveau d'eau est ajusté et l'étape
de
cuisson des graines germées est lancée. La cuisson est très rapide puisque le
trempage
a déjà fortement ramolli les graines.
Pour le riz germé, la cuisson se fait à une température de l'ordre de 100 C
(comprise entre 90 et 110 C), plus précisément entre 101 C et 108 C. A cette
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température les nutriments qui se sont multipliés pendant la phase de
germination
des grains sont préservés.
Un tel mode de préparation permet l'obtention d'une préparation
contenant beaucoup plus de GABA dans le riz germé ainsi cuit (jusqu'à 10 fois
plus de
5 GABA par rapport à un riz brun normal non germé).
Ainsi, selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de
cuisson de graines comprenant les étapes suivantes :
- une étape de germination des graines tels que décrit ci-dessus et
- une étape de cuisson des graines germées obtenue à l'étape
précédente.
Ainsi, dans une mise en ouvre particulière, le procédé de cuisson
comprend les étapes suivantes :
- l'étape de trempage des graines est réalisée en présence de la souche
ou de la composition selon l'invention dans un milieu de trempage à
une température et pendant une durée adaptée à la nature de la
graine,
- Lors de l'étape de germination, les graines humides sont laissées de
préférence à l'abri de la lumière et sont régulièrement rincées jusqu'à
l'apparition de la radicule au travers des téguments de la graine,
- Les graines germées obtenues à l'étape précédente sont mises à
cuire.
Dans une mise en oeuvre du procédé de cuisson décrit ci-dessus, l'étape
de trempage comprend une étape d'activation telle que décrite plus haut.
Dans une mise en oeuvre particulière, au moins une étape ou l'ensemble
des étapes du procédé de cuisson est effectué dans un dispositif de cuisson.
Un
exemple de dispositif de cuisson est décrite dans la demande de brevet WO
2012/056171.
Ainsi, s'agissant du riz brun, le procédé comprend les étapes suivantes :
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- les grains de riz brun sont placés directement dans un accessoire du
dispositif de cuisson avec de l'eau. La souche isolée du genre
Lactobacillus selon l'invention est ajoutée et mélangée aux grains. L'
accessoire est replacé dans la cuve du dispositif . Cette étape de
trempage est effectuée à température ambiante pendant 16h,
- après avoir enlevé l'eau du récipient, les grains humides peuvent être
laissées dans l'accessoire à l'abri de la lumière ou en dehors du
dispositif de cuisson pour une durée de 24h à 48h en particulier 32h,
- les grains sont lavées à plusieurs reprises avec de l'eau,
- Lorsque les
radicules sont visibles à l'oeil nu, les graine sont lavés une
dernière fois à l'eau et et sont placées dans la cuve du dispositif,
- le niveau d'eau est ajusté et l' étape de cuisson est lancée.
La cuisson est très rapide puisque le trempage a déjà fortement ramolli le
riz. De plus, la cuisson se fait à une température de l'ordre de 100 C
(comprise entre
90 c et 110 C). Dans un mode de réalisation, la tempétature est plus
précisément
entre 101 C et 108 C. A cette température les nutriments qui se sont
multipliés
pendant la phase de germination des grains sont préservés.
La présente invention est illustrée de manière non limitative par les
exemples et les figures suivants.
Figure 1 : Capacité de bio-préservation (Impact de l'inoculation de la souche
de L.
plantarum NUT-2 à des concentrations de 105, 106 ou 107 UFC/g de riz de la
variété
Koshihikari sur la flore totale, les Entérobactéries et les Bacillus sp. après
16 heures de
germination).
Figure 2 : Capacité de bio-préservation (Impact de NUT-2 à des concentrations
de 105,
106 ou 107 UFC/g de riz de la variété Chu Cheong sur
la flore totale, les
Entérobactéries et les Bacillus sp.).
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Figure 3 : Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de
105,
106 ou 107 UFC/g de riz de la variété Koshihikari suite à une contamination
par E. coui
0157H7 (102 UFC/g de riz).
Figure 4: Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de
105,
106 ou 107 UFC/g de riz de la variété Chu Cheong suite à une contamination par
E. coui
0157H7 (102 UFC/g de riz).
Figure 5: Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de
105,
106 ou 107 UFC/g de riz de la variété Koshihikari suite à une contamination
par E. coui
0157H7 (101 UFC/g de riz).
Figure 6: Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de
105,
106 ou 107 UFC/g de riz de la variété Chu Cheong suite à une contamination par
E. coui
0157H7 (101 UFC/g de riz).
Exemple 1 : isolement de la souche NUT-2
La souche de Lactobacillus plantarum NUT-2 a été isolée à partir du
riz japonais NIPPON BARE paddy.
L'isolement de cette souche a été réalisé après enrichissement du riz
dans du bouillon MRS (Man, Rogosa et Sharpe) à 35 C 2 C pendant 24 heures
en aérobiose et isolement sur du milieu LPSM (L. plantarum Selective Medium) à
35 C
2 C pendant 16 à 24 heures en anaérobiose (système AnaeroGen, Oxoid).
Cette souche a ensuite été conservée à - 80 C dans des stocks glycérolés.
Pour les besoin de l'étude cette souche a été isolée sur du milieu
MRS gélose supplémenté en L-cystéine (0,05 % m/v). Les boites de Pétri ont été
incubées à 35 C 2 C pendant 16 à 24 heures en anaérobiose (système
AnaeroGen,
Oxoid).
Exemple 2: caractérisation de la souche NUT-2 (determination de la
Concentration
Minimal Inhibitrice par la méthode de diffusion ETEST (Biomérieux)
La détermination de la plus petite concentration en antibiotique
nécessaire pour inhiber la croissance de la bactérie (Concentration Minimale
Inhibitrice ou CMI) a été réalisée sur milieu gélose à l'aide du système Etest
. Ce
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système repose sur l'utilisation d'une bandelette imprégnée de quantités
croissantes
d'antibiotique. Dix antibiotiques ont été testés avec cette méthode, les
concentrations
minimales et maximales varient selon les antibiotiques (Tableau 1). Ces
antibiotiques
ont été sélectionnés en accord avec les recommandations de l'EFSA ( Update of
the
criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of
human or
veterinary importance - The EFSA Journal (2008) 732, 1-15).
Tableau 1 : Bandelettes Etest (BioMérieux) utilisées pour la détermination
de la CMI.
FAMILLE Antibiotique Gamme
de concentration
(p,g/mL)
Gentamicine (GM) 0,016 à 1,024
Aminosides Kanamycine (KM) 0,016 à 256
(Aminoglycosides)
Streptomycine (SM) 0,016 à 256
Glycopeptides Vancomycine (VA) 0,016 à 256
Macrolides, Clindamycine (CM)
Lincosamides et Erythromycine (EM) 0,016 à 256
sterptogra mines Qinupristine/dalfopristine
(QDA)
Pénicillines Ampicilline (AM) 0,016 à 256
Phénicolés Chloramphénicol (CL) 0,016 à 256
Tétracyclines Tétracycline (TC) 0,016 à 256
A partir de colonies isolées sur milieu MRS gélosé supplémenté en L-
cystéine (0,05 % m/v), un inoculum a été préparé dans de Veau physiologique
(NaCI
0,85 % - lot 130703) à une densité d'environ 0,5 sur l'échelle de MacEarland.
Des
boites de Pétri de 140 mm contenant de la gélose Mueller-Hinton (BioMérieux n
lot
1002307830 Exp 20130724) ont été ensemencées par inondation avec Vinoculum
préparé.
Les bandelettes Etest ont ensuite été appliquées sur la gélose selon les
recommandations du fournisseur (6 bandelettes par boites). Après incubation à
35 C
2 C pendant 24 à 48 heures, des ellipses d'inhibition symétriques ont été
observées.
La CM! a été lue directement à partir de l'échelle de graduation et
exprimée en 1..i.g/mL au point où l'ellipse d'inhibition croise la bandelette.
Dans le cas
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où le point d'intersection de l'ellipse d'inhibition et de la bandelette était
situé entre
deux graduations, la concentration la plus importante a été retenue comme CM1.
Exemple 3 résultats obtenus avec la souche L plantarum NUT-2
Trois essais indépendants ont été réalisés pour la détermination de la
CM1 sur les 10 antibiotiques testés. Les lectures des tests ont donc été
réalisées après
24 heures de croissance.
Les résultats obtenus, avec la souche de Lactobacillus plantarum NUT-2,
pour les antibiotiques testés, sont indiqués dans le Tableau 2.
L'interprétation des
résultats a été réalisée à l'aide des tables fournies avec les bandelettes
Etest (version
16029 B 2011/01) et des valeurs seuils définies par l'EFSA (European Food
Safety
Autority ¨ Technical guidance- Update of the criteria used in the assessment
of
bacterial resistance to antibiotics of human or veterinary importance ¨
Prepare by the
Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed ¨ The EFSA
Journal (2008) 732, 1-15 and the EFSA Journal (2012);10(6):2740).
Tableau 2
Interprétation des résultats obtenus lors de la détermination des
Concentrations Minimales Inhibitrices (CAM) par la méthode Etest& de la souche
de L.
plantarum NUT-2. Les résultats ont été interprétés selon les critères définis
par l'USA
pour L. plantarum
pentosus (The EFSA journal (2008) 732, 1-15 and the EFSA
Journal (2012)0(6):2740)
Antibiotique C11/11 (mg/mL) Interprétation
Ampicilline (AM) 4,0 Résistante
Chloraruphénicol (CL) 12,0 Résistante
Clindamycine (CM) 4,0 Résistante
Erythromycine (EM) 0,38 Sensible
Gentamycine (GM) 16,0 Sensible
Kanamycine (KM) 32,0 Sensible
Qinupristine dalfopristine 1,0 Sensible
(QDA)
Streptomycine (SM) 128,0 Sensible
Tétracycline (TC) 192,0 Résistante
Vancomycine. (VA) >256 Résistante
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La souche de Lactobacillus plantarum NUT-2 est apparue comme étant
sensible à l'érythromycine, à la g,entarnicine, à la kanamycine, à la
qinupristine
dalfopristine et à la streptomycine.
5 La
souche de Lactobacillus plantarum NUT-2 est résistante à l'ampicilline,
le chlorarnphénicol, la clindamycine, la tétracycline et à la vancomycine,
comme les
souches de Lactobacillus.
Exemple 4 caractérisation moléculaire de la souche NUT-2
A partir de colonies isolées, des extractions d'ADN sont réalisées afin de
confirmer l'identification de la souche. Une réaction d'amplification par PCR
avec des
amorces universelles est effectuée sur l'ADN extrait afin d'amplifier la
totalité de
l'ADN 16S. Cette région de l'ADN est très conservée et la séquence permet de
distinguer les différentes espèces bactériennes. Le produit d'amplification
obtenu a
ensuite été séquencé. La comparaison de la séquence obtenue avec les séquences
disponibles dans les banques de données permet d'identifier le genre et
l'espèce
bactérienne.
Les alignements de séquences réalisés dans les bases de données ont
permis de démontrer que la souche NUT-2 présente une homologie de 99 % avec
l'espèce bactérienne Lactobacillus plantarum. Les résultats de ces alignements
de
séquence sont indiqués dans le Tableau 3.
Tableau 3 : Résultats des alignements de séquence réalisés à partir de la
séquence de
la souche de bactérie lactique NUT-2. Les souches dont les séquences
présentaient les
plus fortes homologies avec la séquence de l'échantillon figurent dans le
tableau. Les
10 séquences ayant les plus fortes homologies sur un total de 100 séquences
ont été
retenues. La base de données comportait plus de 1500 séquences d'espèces
différentes.
Rang Espèce Séq. Réf. % identité
bactérienne
1 L. plantarum KF149794.1 99,00
2 L. plantarum KF149725.1 99,00
3 L. plantarum KF149647.1 99,00
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4 L. plantarum KF149066.1 99,00
L. plantarum KF148981.1 99,00
6 L. plantarum KC836733.1 99,00
7 L. plantarum KC836684.1 99,00
8 L. plantarum KC836660.1 99,00
9 L. plantarum KC836659.1 99,00
L. plantarum KC836641.1 99,00
L'analyse de la séquence codant pour la totalité de l'ADN 16S a permis
d'identifier la souche NUT2 au niveau de l'espèce et de confirmer son
appartenance à
5 l'espèce Lactobacillus plantarum.
Exemple 5 : La capacité de biopréservation de NUT-2 (impact sur la flore
totale, les
Entérobactéries et les Bacillus spp.) a été testée à différentes
concentrations sur deux
variétés de riz (Koshihikari et Chu Cheong).
Pour chaque test 10 grammes de riz ont été nettoyés avec de l'eau stérile
(protocole Centre Sensoriel du Goût et de l'Alimentation CSGA). Le riz est
ensuite
placé dans des flacons avec 20 ml d'eau et 105, 106 ou 107 UFC/g de NUT-2 ont
été
ajoutés dans des flacons différents. Le contrôle est constitué de 10 g de riz
dans 20 ml
d'eau. Les flacons sont placés dans l'obscurité à 30 C pendant 16h. NUT-2, les
Entérobactéries et les Bacillus spp et les germes totaux sont dénombrés par
dilution et
étalement à partir de chaque flacon. Les résultats sont présentés dans les
figures 1 et
2.
Les résultats montrent une persistance et même une croissance de L.
plantarum NUT-2 au cours de la germination et la réduction de la population
d'entérobactéries et de Bacillus spp (Tableau 4).
Tableau 4: diminution du développement d'entérobactéries et de Bacillus sp. en
fonction de la quantité de L. plantarum NUT-2
Taux Réduction logarithmique (log riz non inoculé ¨ log riz
inoculé)
inoculation
Koshihikari Chu Cheong
Enterobactéries Bacillus sp. Enterobactéries Bacillus sp.
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10E5 0,8 1,4 2,2 2,4
10E6 3,0 4,3 3,2 > 6,8
10E7 >66 >5,7 >6,8 >6,8
Exemple 6 : impact de la présence de L. plantarum NUT-2 suite à une
contamination
par la souche E. cou i 0157H7 (101 et 102 UFC/g de riz) testée sur deux
variétés de riz
(Koshihikari et Chu Cheong).
Pour chaque test 10 grammes de riz ont été nettoyés avec de l'eau stérile
(protocole CSGA). Le riz est ensuite placé dans des flacons avec 20 ml d'eau
et 105, 106
ou 107 UFC/g de NUT-2 ont été ajoutés dans des flacons différents. Le contrôle
est
constitué de 10 g de riz dans 20 ml d'eau. Les flacons sont placés dans
l'obscurité à
30 C pendant 16h. NUT-2, les bacteries E. cou i 0157H7 sont dénombrées par
dilution
et étalement à partir de chaque flacon. Les résultats sont présentés dans les
figures 3
à 6.
L'inoculation du riz avec Lactobacillus plantarum NUT-2 permet d'inhiber
le développement d'E. cou i 0157 :H7 à partir d'une concentration de 106
UFC/g.
