Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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NOUVEAU PROCEDE DE CULTURE D'ALGUES ROUGES UNICELLULAIRES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine de la culture des algues rouges
unicellulaires (ARUs).
L'invention s'adresse particulièrement à un procédé de culture d'ARUs,
caractérisé
en ce que les conditions particulières de la culture en termes d'éclairage et
d'apports de
nutriments peuvent permettre d'obtenir une biomasse constituée d'ARUs en
quantité
supérieure par rapport aux quantités pouvant être obtenues dans des conditions
de
culture classiques, ladite biomasse pouvant présenter au moins une quantité en
phycobiliprotéines, particulièrement en phycocyanine élevée et en outre une
quantité en
agents antioxydants élevée.
L'invention s'adresse également à la biomasse susceptible d'être obtenue par
le
procédé selon l'invention, aux utilisations de ladite biomasse et aux produits
pouvant
comprendre de ladite biomasse.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Certaines algues rouges unicellulaires (ARUs) peuvent être intéressantes comme
source additionnelle de nourriture, car elles peuvent être source de
protéines,
particulièrement des phycobiliprotéines, de fibres, de lipides, ou encore
d'agents
antioxydants particulièrement des caroténoïdes. Elles peuvent être utilisées
natives,
avantageusement séchées, mais aussi transformées, par exemple réduites sous
forme de
farines.
Elles peuvent être utilisées dans l'alimentation humaine ou animale, comme
supplément nutritionnel ou incorporées en petite quantité dans des aliments.
Les algues rouges, ou Rhodophytes (division des Rhodophyta), sont un grand
taxon
d'algues pour la plupart marines et pour la plupart multicellulaires. Elles
sont caractérisées
par une composition pigmentaire avec un seul type de chlorophylle, la
chlorophylle "a",
des caroténoïdes et des pigments caractéristiques, les phycobiliprotéines.
Parmi les Rhodophytes il existe une sous-division, les Cyanidiophytina, qui
sont des
ARUs qui vivent dans des sources chaudes acides.
La sous-division des Cyanidiophytina renferme la classe des Cyanidiophyceae,
qui
elle-même renferme l'ordre des Cyanidiales, lui-même englobant les familles
des
Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, elles-mêmes subdivisées en les genres
Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, auxquelles appartiennent les espèces
Cyanidioschyzon merolae 1 OD, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium
caldarium,
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Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens,
Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria
sulphuraria.
Les phycobiliprotéines sont des pigments hydrosolubles que l'on retrouve dans
le
phycobilisome, complexe photosynthétique présent notamment chez les
cyanobactéries
et certaines microalgues. Il existe quatre types de phycobiliprotéines: la
phycocyanine, la
phycoérythrine, l'allophycocyanine. La phycocyanine présente un pic
d'absorption situé
entre 610 nm et 655 nm, la phycoérythrine présente un pic d'absorption situé
entre 400
nm et 600 nm, la phycoérythrocyanine présentant des pics d'absorption à
environ 450,
525 et 570 nm et l'allophycocyanine un pic d'absorption essentiellement centré
à 650nm.
La production de phycobiliprotéines mondiale est essentiellement obtenue par
culture de spiruline en bassin ouvert (raceway) et représente à peu près 15
000 tonnes
par an.
La phycocyanine extraite de spiruline est également vendue comme complément
alimentaire sous forme liquide, ou sous forme de poudre pour être utilisée
comme
pigment bleu dans l'alimentaire. La phycocyanine est le seul pigment bleu
naturel
approuvé par l'US-FDA (FR Doc No: 2013-19550).
Les cultures de spiruline se font majoritairement à ciel ouvert dans des zones
géographiques chaudes, la température optimale de culture étant de 37 C. Ces
cultures
sont donc dépendantes des fluctuations saisonnières (température, lumière). La
spiruline
présente l'inconvénient d'une faible productivité en biomasse (g biomasse
sèche/L/h)
et/ou phycocyanine (g phycocyanine/L/h) qui ne permet pas le passage à une
culture en
fermenteur nécessaire à une industrialisation de la production de
phycocyanine.
De plus ces cultures sont également sensibles à des contaminations par des
formes
de cyanobactéries, proches de la spiruline, connues pour produire des toxines
telles que
les microcystines [Rellan, S, et coll. ; Food and Chemical Toxicology 47
(2009) 2189-
2195]. Les microcystines peuvent provoquer des troubles intestinaux, et une
exposition à
long terme à ces toxines peut provoquer des cancers du foie. En outre,
certaines souches
de spiruline, comme par exemple Arthrospira platensis, sont elles-mêmes
productrices de
toxines [Rellan, S, et coll., opus cit.].
Des essais de cultures axéniques de spiruline en bioréacteurs fermés ont été
rapportés dans la littérature en utilisant une souche d'Arthrospira platensis
[Chen, Feng,
and Yiming Zhang ; Enzyme and Microbial Technology 20, no. 3 (February 15,
1997):
221-24]. Toutefois, à la connaissance de la Demanderesse aucune production de
spiruline en bioréacteurs à échelle industrielle n'a été rapportée.
On comprend donc qu'outre une faible productivité en biomasse et/ou
phycocyanine, la garantie de la sécurité sanitaire des productions destinées à
l'utilisation
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directe de biomasses de spiruline en alimentation humaine ou animale n'est pas
évidente
et nécessite un contrôle qualité extrêmement précis.
Les ARUs sont connues pour produire des phycocyanines, et l'effet de la
lumière
sur la culture des ARUs et leurs compositions en pigments a fait l'objet de
nombreuses
études de laboratoire [Sloth JK & al., Enzyme and Microbial Technology,
Vol.28, n 1-2,
Janvier 2006, 168-175; Graverholt OS & al., Applied Microbiology and
Biotechnology,
Vol. 77, n 1, 5 septembre 2007, 69-75]. Nichols K & al. [Botanical Gazette,
Vol. 124, n 2,
1er décembre 1962, 85-93] ont étudié les photorécepteurs cellulaires
susceptibles d'être
associés à la synthèse des phycocyanines dans des ARUs mutants, en faisant
varier les
longueurs d'ondes employées pour éclairer les cultures. Steinmuler K & al.
[Plant
Physiology, Vol. 76, n 4, 1er décembre 1984, 935-939] ont étudié la culture
des ARUs
dans des conditions de mixotrophie et constaté que l'ajout de glucose pouvait
inhiber la
synthèse des phycobilliprotéines.
Il existe donc un besoin en une nouvelle source de phycobiliprotéines,
particulièrement de phycocyanine, dont les méthodes de culture pourraient
permettre de
contourner les inconvénients connus des cultures de spiruline.
Il serait intéressant de disposer d'un procédé de culture d'ARUs qui
permettrait
d'obtenir une biomasse desdites algues présentant une quantité d'algues
augmentée par
rapport aux quantités généralement obtenues par les procédés de culture
desdites algues
connus dans l'art antérieur, qui plus est avantageusement riche en métabolites
d'intérêt
particulièrement en phycobiliprotéines, particulièrement en phycocyanine,
et/ou en agent
antioxydants comme par exemple les caroténoïdes.
La présente invention vise à fournir un tel procédé de culture d'algues rouges
unicellulaires (ARUs) enrichies en phycobiliprotéines et caroténoïdes.
EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de culture d'algues rouges
unicellulaires
(ARUs) de la classe des Cyanidiophyceae, dans un milieu comprenant au moins
une
source de carbone, ledit procédé comprenant au moins une étape d'éclairage
sous la
forme d'un rayonnement présentant un spectre étroit de longueur d'onde
comprise entre
400 et 550 nm.
L'invention concerne aussi une biomasse susceptible d'être obtenue par le
procédé
selon l'invention qui présente une teneur en phycobiliprotéines (phycocyanine
et
allophycocyanine) comprise entre 29 et 250 mg/g de matière sèche et
avantageusement
une densité en ARUs comprise entre 20 et 200 g/L de matière sèche,
préférentiellement
entre 90 et 150 g/L de matière sèche.
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L'invention concerne également l'utilisation de la biomasse selon l'invention
pour la
préparation de phycocyanine et/ou de caroténoïdes.
L'invention concerne également une phycocyanine susceptible d'être obtenue à
partir de la biomasse selon l'invention.
L'invention concerne aussi l'utilisation de la biomasse selon l'invention ou
la
phycocyanine selon l'invention pour l'alimentation humaine ou animale, la
cosmétique
et/ou comme colorant.
L'invention concerne également un produit comprenant au moins de la biomasse
ou
une phycocyanine selon l'invention.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Par la suite dans le présent texte, par commodité et sous réserve de
précision,
l'emploi de "ARU" doit s'entendre comme signifiant "Rhodophytes, de la sous-
division des
Cyanidiophytina, de la classe des Cyanidiophyceae de l'ordre des Cyanidiales
des
familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, des genres Cyanidioschyzon,
Cyanidium ou Galdieria, des espèces Cyanidioschyzon merolae 10D,
Cyanidioschyzon
merolae D BV20 1, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum,
Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima,
Galdieria
partita ou encore Galdieria sulphuraria".
De même l'emploi du terme "Cyanidiophyceae" doit être compris, sous réserve de
précision, comme signifiant "Cyanidiophyceae, de l'ordre des Cyanidiales, des
familles
des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium
ou
Galdieria, des espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae
D BV20 1, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum,
Cyanidium
partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria
partita ou
encore Galdieria sulphuraria" ; l'emploi du terme "Cyanidiales" doit être
compris, sous
réserve de précision, comme signifiant "Cyanidiales, des familles des
Cyanidiaceae ou
des Galdieriaceae, des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, des
espèces
Cyanidioschyzon merolae 1 OD, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium
caldarium,
Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens,
Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria
sulphuraria" ;
l'emploi de l'expression "Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae" doit être
compris, sous
réserve de précision, comme signifiant "Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, des
genres
Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, des espèces Cyanidioschyzon merolae
10D,
Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum,
Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala,
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Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria" ;
l'emploi de
l'expression " Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria ", doit être compris,
sous réserve
de précision, comme signifiant " Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, des
espèces
Cyanidioschyzon merolae 1 OD, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium
caldarium,
5 Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium
rumpens,
Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria
sulphuraria".
Il faut aussi noter que, telles qu'elles peuvent être utilisées dans la
description et les
revendications, les formes singulières "un", "une", "le" et "la" englobent les
références à
leurs pluriels, sauf si le contexte en convient clairement autrement.
Certaines ARUs sont des êtres mixotrophes, capable à la fois d'hétérotrophie
(consommation de substrat organique carboné apporté par le milieu de culture)
et
d'autotrophie (utilisation de la lumière pour capter le CO2 via la
photosynthèse). La
mixotrophie est également appelée photo-hétérotrophie. La notion de
mixotrophie est
étendue à l'utilisation de la lumière non seulement pour la photosynthèse mais
également
comme signal lumineux pouvant induire une réponse du métabolisme : par exemple
la
synthèse de pigments.
La mixotrophie à dominante hétérotrophe permet de produire des molécules
d'origine algale en couplant à la fois les avantages de l'autotrophie et de
l'hétérotrophie.
Elle consiste à introduire une composante lumineuse pouvant être de faible
intensité et/ou
de courte durée, avec un milieu de culture pouvant contenir une ou plusieurs
sources
organiques de carbone. Comme en hétérotrophie, les ARUs consomment un substrat
organique, ce qui permet d'atteindre une productivité (exprimée en gramme de
biomasse
sèche/L/h) et/ou une concentration en biomasse (exprimée en gramme de biomasse
sèche/L) importante, le chloroplaste et les autres structures sensibles à la
lumière de la
cellule étant alors activés.
Ces capteurs d'énergie lumineuse peuvent être des organites ou structures
spécifiques au sein de la cellule tels que le chloroplaste, le stigma, le
chronoplaste, le
chromoplaste ou le phycobilisome, ou peuvent être des molécules individuelles
capables
de répondre à la lumière et d'entraîner une réponse cellulaire comme les
rhodopsines, les
phytochromes, les cryptochromes ou les auréochromes.
Ces photorécepteurs permettent d'augmenter la productivité de la cellule ainsi
que
de permettre la synthèse de toutes les molécules pouvant être métabolisées par
une
ARU. Les molécules d'intérêt, produites par lesdites ARUs, peuvent présenter
un intérêt
industriel majeur particulièrement dans les domaines de la nutrition, de la
cosmétique, de
la chimie verte et de l'énergie.
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Ces molécules d'intérêt sont variées telles que par exemple des carbohydrates,
des
protéines, des acides aminés, avantageusement des acides aminés essentiels et
des
pigments, particulièrement des pigments photosynthétiques, dont les principaux
sont les
chlorophylles, les caroténoïdes et les phycobiliprotéines.
Le terme de caroténoïde regroupe les carotènes (a, 13, E, y, O ou -carotène,
lycopène et phytoène) et les xanthophylles (astaxanthine, anthéraxanthine,
citranaxanthine, cryptoxanthine, canthaxanthine, diadinoxanthine,
diatoxanthine,
flavoxanthine, fucoxanthine, lutéine, néoxanthine, rhodoxanthine,
rubixanthine,
siphonaxanthine, violaxanthine, zéaxanthine). Les caroténoïdes sont des
pigments plutôt
orange et jaune, liposolubles. Ils sont synthétisés par toutes les algues,
toutes les plantes
vertes et par de nombreux champignons et bactéries (dont les cyanobactéries).
Ils sont
absorbés par les animaux et les êtres humains dans leur nourriture. Les
caroténoïdes ont
deux principaux pics d'absorption situés autour de 440 et 475 nm.
Les caroténoïdes jouent un rôle important dans la nutrition et la santé, car
plusieurs
sont des provitamines A, et certains présentent aussi des activités anti-
cancer et
antioxydantes. Ils stimulent en outre la synthèse d'anticorps. Certains
d'entre eux sont
largement utilisés dans l'industrie agro-alimentaire pour leurs propriétés
colorantes, et
également dans les industries cosmétiques et pharmaceutiques pour leurs
propriétés
antioxydantes et leur capacité de photoprotection.
Certains caroténoïdes présentent un grand intérêt, comme la lutéine, la
zéaxanthine, et l'astaxanthine, cette dernière particulièrement pour son
important pouvoir
antioxydant.
La Demanderesse a montré, de manière surprenante et après de longues
recherches, qu'une culture d'ARUs dans un milieu pouvant comprendre au moins
une
source de carbone et une source de phosphore et pouvant comprendre en outre au
moins
une étape d'éclairage, avantageusement un éclairage par une lumière présentant
un
spectre étroit centré sur une longueur d'onde donnée, particulièrement un
spectre centré
à 455 nm, peut permettre d'obtenir une biomasse dont la quantité en ARUs peut
être
nettement améliorée par rapport aux cultures habituellement réalisées et qui
plus est
pouvant contenir une quantité de molécules d'intérêt, particulièrement de la
phycocyanine,
de l'allophycocyanine, de la zéaxanthine et des fl-carotènes, éventuellement
supérieure à
celle pouvant être obtenue dans les cultures décrites dans l'art antérieur.
Les ARUs au sens de l'invention, sont des organismes extrémophiles capables de
supporter des pH très acides (0,05-5), ainsi que des températures très élevées
(25-
56 C). On trouve ces organismes souvent près des volcans ou des sources d'eaux
chaudes. Généralement ces organismes mixotrophiques sont capables d'utiliser
un
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nombre important de métabolites carbonés (glucose, glycérol, pentose...)
[Wolfgang
Gross and Claus Schnarrenberger. "Heterotrophic Growth of Two Strains of the
Acido-
Thermophilic Red Alga Galdieria Sulphuraria." Plant and Oeil Physiology 36,
no. 4 (June
1,1995): 633-38].
Un autre avantage du procédé mis au point par la Demanderesse est qu'il peut
être
conduit en bioréacteur, qui plus est avantageusement à l'échelle industrielle.
A la connaissance de la demanderesse aucune production industrielle (en
bioréacteur) d'ARUs en autotrophie, mixotrophie ou hétérotrophie n'est connue.
La Demanderesse a particulièrement montré qu'une culture d'ARUs, au sens de
l'invention, utilisant un milieu de culture comprenant au moins une source de
carbone et
au moins une source assimilable de phosphore, ledit procédé comprenant au
moins une
étape d'éclairage, peut permettre d'obtenir une productivité et/ou une
concentration en
biomasse nettement améliorée par rapport aux cultures habituellement
réalisées,
biomasse qui en outre peut être riche en phycocyanine et/ou en caroténoïdes.
Par "riche en phycocyanine et/ou en caroténoïdes" on entend dans le présent
texte
que la concentration en phycobiliprotéines et/ou de caroténoïdes dans la
biomasse
pouvant être produite après culture dans les conditions selon l'invention est
plus
importante que la concentration de phycobiliprotéines et/ou de caroténoïdes
pouvant être
produite par une biomasse des mêmes algues obtenue après culture dans les
conditions
décrites dans l'art antérieur.
Un avantage non négligeable de la culture de Cyanidiophyceae en fermenteur en
conditions de mixotrophie est qu'elle permet de réaliser des cultures de
souche pure (ou
axénique) ne contenant qu'un seul type cellulaire inoculé dans un milieu de
culture stérile,
évitant ainsi les problèmes de contamination par des souches toxiques comme
cela peut-
être observé pour des cultures de Spiruline platensis en raceway ou open
ponds. Hormis
une productivité et/ou une concentration en biomasse plus élevée, le mode de
culture en
fermenteur offre également plus de garanties d'un point de vue sanitaire.
Ainsi l'invention a pour objet premier un procédé de culture d'algues rouges
unicellulaires (ARUs) de la classe des Cyanidiophyceae, avantageusement de
l'ordre des
Cyanidiales, très avantageusement des familles des Cyanidiaceae ou des
Galdieriaceae,
particulièrement des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, très
particulièrement des espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon
merolae
DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium
partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria deedele, Galdieria maxima, Galdieria
partita ou
encore Galdieria sulphuraria, préférentiellement de l'espèce Galdieria
sulphuraria, utilisant
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un milieu comprenant au moins une source de carbone, et au moins une source de
phosphore, ledit procédé comprenant au moins une étape d'éclairage.
De telles conditions de culture peuvent permettre d'atteindre une productivité
en
biomasse et/ou une concentration en biomasse plus importante des ARUs que la
productivité en biomasse et/ou la concentration obtenue(s) dans les cultures
décrites
dans l'art antérieur, peuvent permettre d'obtenir une quantité de ladite
biomasse plus
grandes qu'une quantité de biomasse obtenue dans les cultures décrites dans
l'art
antérieur et peuvent favoriser une production de protéines par ladite biomasse
pouvant
atteindre jusqu'à 51% de la matière sèche voire plus.
Selon l'invention, l'étape d'éclairage du procédé peut être réalisée à l'aide
d'une
lumière blanche ou, avantageusement, d'une lumière bleue. En effet, la
Demanderesse a
mis en évidence le fait que la culture des ARUs, au sens de l'invention, en
lumière bleue
favorise la production de phycocyanine par rapport à la même culture mais en
lumière
blanche. Ainsi selon une variante de l'invention l'étape d'éclairage du
procédé peut être
réalisée à l'aide d'une lumière bleue.
Selon l'invention, par lumière bleue on entend un rayonnement présentant un
spectre étroit de longueur d'onde comprise entre 400 et 550 nm,
préférentiellement entre
420 nm et 500 nm. Un tel rayonnement peut permettre d'obtenir une biomasse
riche en
phycocyanine et en agents antioxydants, particulièrement en caroténoïdes.
Selon une
variante de l'invention ledit spectre peut être centré à 455 nm et ne pas
s'étendre au-delà
de 25 nm de chaque côté. De préférence selon l'invention, la longueur d'onde
choisie sera
comprise entre 430 et 480 nm, très préférentiellement la longueur d'onde
choisie sera de
455 nm.
Selon l'invention, l'éclairage peut être produit par tout moyen connu de
l'homme du
métier, notamment une ou plusieurs lampes, un ou plusieurs tubes, une ou
plusieurs
diodes électroluminescentes (DELs).
La Demanderesse a démontré que le procédé est encore plus efficace lorsque
l'éclairage est réalisé par une ou plusieurs diode(s) électroluminescente(s)
(DEL).
Ainsi, selon une variante de l'invention, l'éclairage peut être réalisé par
une ou
plusieurs DELs. Les DELs sont de préférence des DELs du commerce.
A titre d'exemple on citera les DEL provenant de chez Seoul Optodevice Co.,
LTD
(Corée du Sud), de chez Nichia Corporation (Japon), ou encore de chez SunLED
Corporation (Etats-Unis).
Selon le procédé de l'invention la culture peut être soumise au rayonnement
lumineux pendant un temps suffisant correspondant au moins au temps nécessaire
pour
que les critères de taux de croissance, de phycocyanine et/ou de caroténoïdes
désirés
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soient remplis. L'homme du métier saura sans expérimentation excessive juger
de ce
temps nécessaire. Il saura adapter ce temps grâce à ses connaissances du
domaine.
Plus particulièrement, les conditions de mixotrophie peuvent être obtenues
dans des
conditions d'éclairage discontinu et/ou variable au cours du temps.
Par éclairage discontinu, il faut entendre un éclairage ponctué par des
périodes
d'obscurité. L'éclairage peut être notamment sous forme de flashs. Un flash,
au sens de
l'invention, est un éclairage lumineux de durée donnée.
Selon l'invention, 3 notions sont à considérer à propos de l'éclairage: la
fréquence
ou le nombre de flashs par unité de temps, la durée du flash et l'intensité de
la lumière
émise.
En termes de fréquence selon l'invention, on définit, selon le nombre de
flashs par
unité de temps utilisé dans le procédé selon l'invention deux types
d'éclairage :
- un éclairage à basse fréquence dont le nombre de flashs peut être compris
entre
environ 2 et 3,6 104 par heure (5,4.10-4 Hz à 10 Hz), préférentiellement entre
3 et 3,6 103
par heure (8,3.10-4 Hz à 1 Hz). On entend bien ici que le nombre de flashs par
heure peut
prendre toutes les valeurs comprises entre 2 et 36000 sans qu'il soit
nécessaire de toutes
les citer (2, 3, 4,..., 35598, 35599, 36000) ;
- un éclairage à haute fréquence dont le nombre de flashs peut être compris
entre
environ 3,6 x104 et 5,4 x 109 (10 Hz à 1,5.10' Hz) par heure,
préférentiellement entre
3,6x105 et 5,4x109 (100 Hz à 1,5.10' Hz). On entend bien ici que le nombre de
flashs par
heure peut prendre toutes les valeurs comprises entre 3,6 x105 et 5,4 x 109
sans qu'il soit
nécessaire de toutes les citer (36000, 36001, 36002,..., 5399999998,
5399999999,
5400000000).
En termes de durée selon l'invention, quelle que soit la fréquence d'éclairage
choisie, la durée du flash peut être comprise entre 1/150000 de seconde et
1799
secondes (29 minutes et 59 secondes).
Bien évidement lorsque l'on utilise un éclairage à haute fréquence la durée du
flash
pourra être préférentiellement comprise entre 1/150000 de seconde et 1/10 de
seconde.
Et lorsque l'on utilise un éclairage à basse fréquence la durée du flash
pourra être
préférentiellement comprise entre 1/10 de seconde et 1799 secondes (29 minutes
et 59
sec).
En termes d'intensité lumineuse selon l'invention, l'intensité de la lumière
apportée
sous forme de flashs peut être comprise entre 5 et 5000 mol. m-* s-1, de
préférence
entre 5 et 500 mol. m-* s-1, ou 50 et 400 mol. m-* s-1, et plus
préférentiellement entre
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150 et 300 mol. m-2. s-1 (1 mol. m-2. s-1 correspond à 1 pLE m-2. s-1
(Einstein), unité
souvent utilisée dans la littérature).
Selon l'invention le nombre de flashs par heure peut être choisi en fonction
de
l'intensité et de la durée des flashs (voir ci-dessus).
5 Selon l'invention les notions de fréquence, de durée et d'intensité
lumineuse
s'appliquent à l'éclairage tel que le prévoit l'invention, c'est-à-dire à
l'éclairage produit par
la source lumineuse choisie, avantageusement par une DEL, émettant un
rayonnement
lumineux de spectre étroit compris entre 400 et 550 nm de préférence 420 et
500 nm,
encore plus préférentiellement comprise entre 430 et 480 nm, très
préférentiellement
10 centré à 455 nm et pendant les temps considérés selon l'invention.
Une forme préférée de l'invention pourra être un procédé selon l'invention
dans
lequel l'apport d'éclairage peut être réalisé sous la forme d'une lumière
discontinue sous
forme de flashs, obtenue avec des DELs émettant un rayonnement présentant un
spectre
étroit de longueur d'onde comprise entre 400 nm et 550 nm, préférentiellement
entre 420
nm et 500 nm, encore plus préférentiellement comprise entre 430 et 480 nm,
très
préférentiellement de longueur d'onde de 455nm.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'éclairage peut être
variable, ce
qui signifie que l'éclairage n'est pas interrompu par des phases d'obscurité,
mais que
l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité
de lumière
peut être régulière ou non, et peut être périodique ou cyclique. Selon
l'invention, on peut
aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairage continues
et des
phases d'éclairage discontinues.
Par éclairage variable, on entend que l'intensité de la lumière varie de
manière
régulière au moins deux fois par heure. Un exemple des conditions d'éclairage
adaptées
à la méthode de l'invention est décrit dans la demande WO 2012/035262.
L'éclairage peut présenter, de préférence, des variations d'intensité dont
l'amplitude
peut être généralement comprise entre 5 pmol. m-* s-1 et 2000 pmol. m-* s-1,
de
préférence entre 50 et 1500 pmol. m-* s-1, plus préférentiellement entre 50 et
200
pmol. m-2. s-i.
Selon un mode de réalisation préféré, l'éclairage peut présenter des
variations
d'intensité dont l'amplitude peut être comprise entre 5 et 1000 pmol. m-2. s-
1, de
préférence entre 5 et 400 pmol. m-* s-1, ces variations pouvant avoir lieu
entre 2 et 3600
fois par heure, de préférence entre 2 et 200 fois par heure.
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Ces conditions de culture permettent d'apporter une quantité définie de
lumière. Cet
apport lumineux peut comporter des phases d'éclairage discontinu et/ou
variable, avec
des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou
différentes.
Selon l'invention, les conditions de culture des souches d'ARUs pourront être
les
conditions connues et utilisées dans l'art antérieur pour cultiver les souches
retenues,
conditions auxquelles une étape d'éclairage aura été ajoutée. Avantageusement,
on
utilisera les conditions qui permettront d'obtenir la meilleure productivité
en biomasse
/et/ou la meilleure concentration en biomasse.
L'homme du métier saura intégrer l'étape d'éclairage selon l'invention dans un
procédé connu, afin une biomasse qui réponde aux critères selon l'invention en
taux de
croissance et en taux de métabolites d'intérêt, particulièrement en taux de
caroténoïdes
et/ou de phycobiliprotéines, recherchés. A cet égard, on pourra citer les
procédés décrits
par Wolfgang Gross and Claus Schnarren berger (opus cit.).
Les procédés permettant d'obtenir une productivité en biomasse ou une
concentration en biomasse important pourront être privilégiés. Comme exemple
de
procédé on pourra citer celui décrit par exemple par Graverholt et coll.,
[Appl. Microbiol.
Biotechnol. (2007) 77:69-75].
Plus particulièrement cette étape pourra être intégrée dans les procédés
décrits par
la demanderesse dans la demande W02012/035262.
Selon l'invention, la culture peut être réalisée par toute technique de
culture connue,
par exemple en fioles ou en réacteur, mais aussi en fermenteurs ou encore dans
tout
contenant apte à la croissance de ARUs comme par exemple des bassins de type
"raceway/openpond", à condition que ladite technique permette de mettre en
contact les
ARUs avec au moins la source carbonée, et en outre soit équipée d'au moins une
source
de lumière émettant dans les longueurs d'onde présentant un spectre étroit
comprise
entre 400 nm et 550 nm, de préférence comprise entre 430 et 480 nm, très
préférentiellement centrée à 455 nm, dont l'action sur la culture pourra
conduire à la
composition macroscopique de biomasse désirée c'est-à-dire une biomasse riche
en
phycobiliprotéines (phycocyanine et allophycocyanine) avec des teneurs
intracellulaires
comprises entre 29 et 250 mg/g de matière sèche, préférentiellement entre 35
et 150
mg/g de matière sèche et éventuellement riche en agents antioxydants en
particulier en
caroténoïdes, avantageusement de la zéaxanthine et du p-carotène, en teneurs
comprises entre 0,1 et 10 mg/g, avantageusement entre 0,250 et 1 mg/g. Ces
performances de productivité en biomasse sèche/ou en concentration en biomasse
sèche
et de teneur intracellulaire en phycobiliprotéines et en caroténoïdes peuvent
être
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également atteintes en bioréacteurs de 1 rn3, 4 rn3, 10 rn3 et 200 rn3, qui
sont des volumes
couramment utilisés en production industrielle.
La Demanderesse a en outre pu montrer que dans le cas d'une culture
discontinue
lorsque les concentrations du carbone (C) et du phosphore (P) dans le milieu
de culture
initial sont telles que le rapport PIC de ces concentrations (exprimé en mole
de
phosphore/mole de carbone) est inférieur à 0.01898, avantageusement inférieur
à
0,01503, plus avantageusement inférieur à 0,01054, encore plus avantageusement
inférieur à 0,00527, préférentiellement inférieur à 0,00263, très
préférentiellement inférieur
à 0,00131, alors la teneur intracellulaire en phycocyanine de la biomasse est
augmentée
par rapport à la teneur intracellulaire en phycocyanine d'une biomasse obtenue
dans les
conditions standard de l'art antérieur.
De même en culture alimentée de type discontinue ou continue, la Demanderesse
a
pu montrer que lorsque les quantités consommées de phosphore et de carbone
sont
telles que le rapport PIC de ces quantités consommées (exprimé en mole de
phosphore/mole de carbone) de ces quantités consommées est inférieur à
0,01898,
avantageusement inférieur à 0,01503, plus avantageusement inférieur à 0,01054,
encore
plus avantageusement inférieur à 0,00527, préférentiellement inférieur à
0,002637, très
préférentiellement inférieur à 0,00131, alors la teneur de phycocyanine de la
biomasse est
augmentée.
Selon l'invention, les sources de phosphore peuvent être choisies parmi les
espèces
suivantes : l'acide phosphorique, les sels de phosphore, avantageusement de
l'hydrogénophosphore de sodium (Na2HPO4), ou du dihydrogénophosphore de sodium
(NaH2PO4), ou du dihydrogénophosphore de potassium (KH2PO4), ou de
l'hydrogénophosphore de potassium (K2HPO4), ou tout mélange, en toute
proportion d'au
moins deux de ces sources.
Selon l'invention, les sources de carbone peuvent être choisies parmi les
espèces
suivantes : glucose, glycérol, acétate, saccharose ou tout mélange en toute
proportion
d'au moins deux de ces sources.
Ainsi l'invention a aussi pour objet un procédé de culture d'ARUs de la classe
des
Cyanidiophyceae, avantageusement de l'ordre des Cyanidiales, très
avantageusement
des familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, particulièrement des
genres
Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, très particulièrement des espèces
Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium
caldarium,
Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens,
Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria
sulphuraria,
préférentiellement de l'espèce Galdieria sulphuraria, dans un milieu
comprenant au moins
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une source de carbone, et au moins une source de phosphore, ledit procédé
comprenant
au moins une étape d'éclairage.
Selon une première variante du procédé selon l'invention, dans le cas d'une
culture
discontinue, les concentrations en carbone et en phosphore dans le milieu de
culture
initial peuvent être telles que le rapport PIC de ces concentrations (exprimé
en mole de
phosphore/mole de carbone) peut être inférieur à 0,01898, avantageusement
inférieur à
0,01503, plus avantageusement inférieur à 0,01054, encore plus avantageusement
inférieur à 0,00527, préférentiellement inférieur à 0,00263, très
préférentiellement inférieur
à 0,00131.
Selon une deuxième variante du procédé selon l'invention, dans le cas d'une
culture
alimentée de type discontinue ou continue, les quantités consommées en carbone
et
phosphore au cours de la culture peuvent être telles que le rapport PIC de ces
quantités
consommées (exprimé en mole de phosphore/mole de carbone) peut être inférieur
à
0,01898, avantageusement inférieur à 0,01503, plus avantageusement inférieur à
0,01054, encore plus avantageusement inférieur à 0,00527, préférentiellement
inférieur à
0,00263, très préférentiellement inférieur à 0,00131.
Selon des variantes préférées du procédé selon l'invention, celui-ci peut être
réalisé
selon les variantes décrites ci-dessus mais comprenant en outre au moins une
étape
d'éclairage réalisée à l'aide d'une lumière bleue.
Ainsi selon encore une autre variante préférée du procédé selon l'invention,
dans le
cas d'une culture discontinue, ledit procédé comprenant au moins une étape
d'éclairage
réalisée à l'aide d'une lumière bleue, les concentrations en carbone et en
phosphore dans
le milieu de culture initial peuvent être telles que le rapport PIC de ces
concentrations
(exprimé en mole de phosphore/mole de carbone) peut être inférieur à 0,01898,
avantageusement inférieur à 0,01503, plus avantageusement inférieur à 0,01054,
encore
plus avantageusement inférieur à 0,00527, préférentiellement inférieur à
0,00263, très
préférentiellement inférieur à 0,00131.
Et selon encore une autre variante préférée du procédé selon l'invention, dans
le
cas d'une culture alimentée de type discontinue ou continue, ledit procédé
comprenant au
moins une étape d'éclairage réalisée à l'aide d'une lumière bleue, les
quantités
consommées en carbone et phosphore au cours de la culture peuvent être telles
que le
rapport PIC de ces quantités consommées (exprimé en mole de phosphore/mole de
carbone) peut être inférieur à 0,01898, avantageusement inférieur à 0,01503,
plus
avantageusement inférieur à 0,01054, encore plus avantageusement inférieur à
0,00527,
préférentiellement inférieur à 0,00263, très préférentiellement inférieur à
0,00131.
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Selon ces variantes les conditions d'éclairage par la lumière bleue peuvent
être
celles décrites précédemment.
Avantageusement selon l'invention le procédé peut comprendre, simultanément ou
indépendamment, toute autre étape nécessaire à la croissance de la biomasse ou
à la
production des molécules d'intérêt (phycocyanine et caroténoïdes) comme par
exemple
sans être limitatif une ou plusieurs étape(s) de culture sans lumière ou
encore une ou
plusieurs étape(s) de récupération de la biomasse.
D'une manière générale selon l'invention, la culture selon le procédé pourra
s'effectuer à une température comprise entre 15 C et 47 C, avantageusement
entre 22 C
et 42 C.
Selon l'invention le procédé de culture peut être utilisé pour cultiver une
seule
souche d'ARUs d'un genre donné, plusieurs souches d'un seul genre donné, ou
plusieurs
souches de genres différents donnés (au moins 2 espèces de 2 genres
différents).
Selon l'invention la source carbonée peut être choisie parmi toute source
carbonée
connue et utilisable selon la souche choisie. L'homme du métier saura sans
difficulté
choisir la source carbonée la mieux adaptée à la souche à cultiver. A titre
d'exemple on
peut citer entre autre comme source carbonée utilisable le glucose, le
saccharose,
l'acétate ou encore le glycérol [Wolfgang Gross and Claus Schnarrenberger,
opus cit.].
Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister
en
des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de
la
biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de
pomme de
terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules
de petite
taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés organiques adaptés à
la culture
en mixotrophie des cellules selon l'invention.
Les quantités de sources carbonées utilisées selon le procédé dépendront bien
évidement de la souche choisie. L'homme du métier saura là encore sans
difficulté
adapter les quantités de source carbonée à la souche à cultiver sous forme
pure ou en
mélange.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le substrat carboné organique
pourra
avoir une concentration comprise entre 5 mM et 1,5 M, de préférence 50 mM et
800 mM.
Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre une étape de
récupération
des ARUs. Ladite récupération des ARUs peut être réalisée par toute technique
permettant la récupération de la biomasse, notamment les méthodes de
filtration,
gravimétrique ou sous pression réduite, de décantation, ou bien encore des
méthodes de
précipitation suivie d'une filtration gravimétrique.
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L'invention concerne également la biomasse susceptible d'être obtenue par
l'une
quelconque des variantes du procédé selon l'invention.
Selon l'invention ladite biomasse peut présenter une densité en ARUs d'au
moins
g/L et jusqu'à environ 200 g/L de matière sèche, préférentiellement d'au moins
50 g/L
5 de matière sèche, plus préférentiellement d'au moins 90 g/L de matière
sèche et jusqu'à
environ 150 g/L de matière sèche.
Selon l'invention ladite biomasse peut présenter une teneur intracellulaire en
phycobiliprotéines (phycocyanine et allophycocyanine) avec des teneurs
intracellulaires
comprises entre 29 et 250 mg/g de matière sèche, préférentiellement entre 35
et 150
10 mg/g de matière sèche.
Selon l'invention encore ladite biomasse peut présenter une teneur
intracellulaire en
phycocyanine comprise entre 29 et 200 mg/g de matière sèche,
préférentiellement entre
40 et 100 mg/g de matière sèche.
Selon l'invention les phycobiliprotéines, et particulièrement la phycocyanine,
15 produites par ladite biomasse peuvent être extraites pour être utilisées
par exemple dans
l'alimentation ou encore comme colorant. L'extraction des phycobiliprotéines,
et
particulièrement de la phycocyanine, à partir de ladite biomasse peut se faire
selon toute
technique d'extraction connue de l'homme du métier comme par exemple celle
décrite par
Moon et coll., 2014 (Myounghoon, Sanjiv K Mishra, Chul Woong Kim, William I
Suh, Min S
20 Park, and Ji-Won Yang. "Isolation and Characterization of Thermostable
Phycocyanin
from Galdieria Sulphuraria" 31 (2014): 1-6) ou par Jouen et coll., 1999
(Jaouen, P., B.
Lepine, N. Rossignol, R. Royer, and F. Quemeneur. "Clarification and
Concentration with
Membrane Technology of a Phycocyanin Solution Extracted from Spirulina
Platensis."
Biotechnology Techniques 13, no. 12 (December 1999): 877-81.
doi:10.1023/A:1008980424219.) ou dans le brevet FR2789399A1.
L'invention concerne donc aussi un procédé de préparation de phycocyanines qui
comprend les étapes suivantes :
a) cultiver des ARUS de la classe des Cyanidiophyceae, dans un milieu de
culture
comprenant au moins une source de carbone avec au moins une étape d'éclairage
sous
la forme d'un rayonnement présentant un spectre étroit de longueur d'onde
comprise
entre 400 et 550 nm, pour obtenir un mout de fermentation comprenant lesdites
ARUs
dans le milieux de culture, à une densité cellulaire d'au moins 20 g/L de
matière sèche, tel
que défini précédemment et ci-après,
b) récupérer la biomasse obtenue à partir du mout de fermentation,
c) récupérer les phycocyanines à partir de la biomasse.
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La phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de ladite biomasse
présente
des propriétés différentes notables par rapport à la phycocyanine susceptible
d'être
obtenue par culture d'autre organisme, particulièrement par exemple par
rapport à la
phycocyanine susceptible d'être obtenue par culture de spiruline.
Ladite phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de la biomasse obtenue
selon l'invention, particulièrement à partir d'une biomasse de Galdieria
sulphuraria, peut
présenter une coloration bleue, pas ou peu altérée dans une solution dont le
pH est
compris entre 2 et 8, préférentiellement entre 3 et 7, très préférentiellement
entre 4 et 5.
De plus, la phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de la biomasse
obtenue
selon l'invention, particulièrement à partir d'une biomasse de Galdieria
sulphuraria, peut
présenter l'avantage de peu ou pas précipiter à pH acide, particulièrement à
un pH
compris entre 2 et 4, contrairement à la phycocyanine susceptible d'être
obtenue à partir
d'une biomasse de spiruline. Cette propriété fait de la phycocyanine
susceptible d'être
obtenue à partir de la biomasse obtenue selon l'invention, particulièrement à
partir d'une
biomasse de Galdieria sulphuraria, un excellent candidat pour une utilisation
dans des
boissons acides, gazeuses ou non gazeuses.
De plus, la phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de la biomasse
obtenue
selon l'invention, particulièrement à partir d'une biomasse de Galdieria
sulphuraria, peut
présenter une thermostabilité améliorée par rapport à celle à la phycocyanine
extraite de
spiruline pour des températures supérieures à 50 C (Moon et al., 2014).
Enfin, la phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de la biomasse
obtenue
selon l'invention, particulièrement à partir d'une biomasse de Galdieria
sulphuraria, peut
présenter une résistance à l'éthanol améliorée par rapport à la phycocyanine
de spiruline.
Selon l'invention on entend par "résistance de la phycocyanine", (au pH acide,
à la
température et/ou à l'éthanol) une absence de perte de coloration ou une perte
de
coloration inferieure à ce qui est décrit pour la phycocyanine extraite de
Spirulina
platensis. La quantification de l'altération de la couleur peut se mesurer au
spectrophotomètre en comparant l'absorbance d'une solution aqueuse dans des
conditions standard de température et de pH, comme décrit par Moon (2014),
puis de
comparé ces résultats à ceux obtenues des conditions de température élevée, pH
acide
ou alcalin, et/ou en cas d'ajout d'éthanol dans la solution par exemple.
Ainsi l'invention concerne également de la phycocyanine susceptible d'être
obtenue
selon le procédé de l'invention, ladite phycocyanine pouvant être résistante à
une
température comprise entre 70 C et 0 C, préférentiellement entre 65 C et 25 C,
très
préférentiellement entre 60 C et 50 C, et/ou résistante à un pH compris entre
8 et 2,
préférentiellement compris entre 3 et 7, très préférentiellement compris entre
4 et 5, et/ou
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résistante à une concentration en éthanol comprise entre 50% et 1%,
préférentiellement
de comprise entre 40% et 10%, très préférentiellement comprise entre 20 et 30%
L'invention concerne également l'utilisation de la phycocyanine susceptible
d'être
obtenue selon le procédé de l'invention, dans l'alimentation, animale ou
humaine, comme
complément alimentaire, ou encore comme colorant, particulièrement comme
colorant
alimentaire.
Le tourteau susceptible d'être obtenu après extraction de la phycocyanine à
partir
de la biomasse d'ARUs susceptible d'être obtenue par le procédé selon
l'invention peut
être utilisé comme complément alimentaire riche en protéines et caroténoïdes,
dans
l'alimentation humaine ou animale.
Selon l'invention ladite biomasse peut présenter une teneur intracellulaire en
caroténoïdes comprise entre 0,1 et 10 mg/g de matière sèche, avantageusement
entre
0,250 et 1 mg/g de matière sèche.
Les ARUs présentent un potentiel d'utilisation important dans beaucoup de
domaines dont on citera par exemple, l'alimentation humaine ou animale, la
cosmétique,
la médecine.
Selon l'invention, ladite biomasse d'ARUs susceptible d'être obtenue selon
l'invention peut être utilisée après récolte soit directement, éventuellement
séchée, soit
après transformation. En particulier ladite biomasse peut être utilisée sous
la forme de
farines entrant dans des compositions alimentaires ou sous forme de
compléments
alimentaires.
La biomasse d'ARUs susceptible d'être obtenue selon l'invention peut être
transformée en farine selon tout procédé connu de l'homme du métier. On peut
ainsi
envisager par exemple que les ARUs puissent être séparées du milieu de
culture, lysées
et réduites en particules fines (diamètre moyen de 10 microns), puis séchées.
L'invention concerne également toute utilisation de la biomasse d'ARUs
susceptible
d'être obtenue selon l'invention dans tout domaine connu d'utilisation des
ARUs,
particulièrement, l'alimentation humaine ou animale, la cosmétique, la
médecine.
La biomasse obtenue après culture de ARUs selon le procédé de l'invention peut
permettre d'obtenir en particulier une farine riche en agents antioxydants, en
particulier en
caroténoïdes (particulièrement zéaxanthine et fl-carotènes) en teneurs
comprises entre
0,1 et 10 mg/g de matière sèche, avantageusement entre 0,25 et 1 mg/g de
matière
sèche dont en particulier de la zéaxanthine en une teneur comprise entre 0,05
et 5 mg/g
de matière sèche, avantageusement entre 0,1 et 1 mg/g de matière sèche, et/ou
du R-
carotène en une teneur 0,05 et 5 mg/g de matière sèche, avantageusement entre
0,1 et 1
mg/g de matière sèche, répondant à un besoin en particulièrement dans
l'industrie
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alimentaire, parce que plus appétentes, ayant meilleur goût, apportant des
antioxydants
en quantité importante et pouvant être utilisable dans l'alimentation animale
ou humaine.
L'invention concerne donc une farine susceptible d'être obtenue après
transformation de la biomasse en ARUs susceptible d'être obtenue par le
procédé selon
l'invention.
Quelle que soit la forme d'utilisation du produit susceptible d'être obtenu
par le
procédé selon l'invention (biomasse native ou transformée), ledit produit peut
être utilisé
pur ou mélangé à d'autres ingrédients classiquement utilisés, particulièrement
en
alimentation ou en cosmétique.
L'invention concerne également tout produit pouvant comprendre au moins de la
biomasse d'algues susceptible d'être obtenue selon l'invention. L'invention
concerne aussi
tout produit pouvant comprendre au moins de la farine issue de la
transformation de la
biomasse d'algues susceptible d'être obtenue selon l'invention.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 décrit l'optimisation de la croissance de Galdieria sulphuraria en
Bioréacteur.
Elle montre l'évolution de la concentration en biomasse en fonction du temps
d'une
souche de Galdieria sulphuraria selon le mode trophique de culture utilisé.
Les résultats
montrent que les conditions de mixotrophie (-0-) permettent d'obtenir une
croissance de
la souche plus rapide et nettement améliorée par rapport à des conditions
d'hétérotrophie
(-=-). Cette courbe montre également que la concentration en biomasse sèche
est
nettement supérieure en fin de culture avec des conditions de mixotrophie
qu'avec les
conditions d'hétérotrophie.
La Figure 2 montre l'effet de la lumière bleue sur la croissance et la
production de
pigments.
o La figure 2A montre la teneur intracellulaire en phycocyanine exprimée en
mg/g de
matière sèche (DW) (E) et la concentration cellulaire de la biomasse estimée
par
mesure de la densité optique à 800nm (_). L'essai a été réalisé en lumière
blanche
et en lumière bleue. Les mesures ont été faites à 180h et 250h.
o La figure 2B montre la quantité de chlorophylle 1), de 13-carotène (¨) et de
zéaxanthine 0 dans les mêmes cultures, en lumière blanche et en lumière bleue,
à
180h et 250h.
La Figure 3 montre l'effet de l'azote et du phosphore sur la croissance et la
production de phycocyanine. Elle montre les résultats obtenus lors de l'essai
visant à
tester l'influence de la concentration en azote (Figure 3A et 3B), la
concentration en
phosphore (Figure 3C et 3D) sur les cultures de Galdieria sulphuraria.
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Les figures 3A et 3C sont la représentation de la croissance de la souche en
fonction du
temps en présence de 1 (-A-), 2 (-o-), 4 (-0-) et 8 (-*-) g/L de sulfate
d'ammonium (Figure 3A) ou
de 250 (-A-), 500 (-o-), 1000 (-0-) et 2000 (-*-) mg de KH2PO4 (Figure 3C).
Les Figures 38 et 3D représentent la teneur intracellulaire en phycocyanine
exprimée en
mg/g de matière sèche dans les souches des cultures en présence de 1 (1), 2 (-
), 4 (_) et 8 (_) g/L
(NH4)2504, à 250 h (Figure 313) ou de 250 ( ), 500 (-), 1000 (_) et 2000 (_)
mg de Phosphore de
KH2PO4 (Figure 3D).
La Figure 4 montre les effets combinés de la lumière bleue et de la limitation
en
phosphore sur la production de pigments sur des cultures de Galdieria
sulphuraria. Elle
montre en A la teneur intracellulaire en phycocyanine exprimée en mg/g de
matière sèche
obtenue dans les différentes conditions testées. La figure 4B montre les
teneurs
intracellulaires en chlorophylle 0, en 13-carotène (-) et en zéaxanthine 0
dans les mêmes
cultures.
La Figure 5 montre le suivi de culture en Fermenteur en mode continu avec
contre-
pales lumineuses bleues (455 nm)
o En A le suivi de croissance de la souche de Galdieria sulphuraria en
fermenteur
par mesure d'absorbance à 800 nm, et par mesure de masse sèche par litre de
moût.
o En B montre la teneur intracellulaire en phycocyanine exprimée en mg/g de
matière sèche (MS)
La Figure 6 montre les caractéristiques physicochimiques de la phycocyanine
extraite de Galdieria sulphuraria comparée à la phycocyanine extraite de
Spirulina
platensis. (A) Test de résistance au pH, (B) Résistance à la température. (C)
Résistance à
l'éthanol:
o En A que la phycocyanine extraite de Galdieria sulphuraria présente une
bonne
résistance au pH : moins de 20 % de perte de pigmentation jusqu'à pH 2.75, la
perte devenant plus importante jusqu'à pH 2.
o En B que la phycocyanine extraite de Galdieria sulphuraria présente une
bonne
résistance à la température : plus de 40% de pigmentation restante après 30
minutes à 70 C.
o En C que la phycocyanine extraite de Galdieria sulphuraria présente une
bonne
résistance à l'éthanol : 40 % de perte de pigmentation à 30 % d'éthanol,
environ
70% à 50% d'éthanol.
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EXEMPLES
Exemple 1 : Optimisation de la croissance en Fermenteur.
Matériel et méthodes
Souche : Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium) UTEX#2919
5 Milieu de culture
Hétérotrophie et Mixotrophie : 30 g/L glycérol, 8 g/L (NH4)2SO4, 1g/L KH2PO4,
716mg/L MgSO4, 44mg/L CaCl2, 3 mL/L de solution stock Fe-EDTA (FeSO4 à 6,9g/L
et
d'EDTA-Na2 à 9,3g/L ) et 4 ml/L de solution de trace métal (3,09g/L EDTA-Na2 ;
0,080g/L CuSO4,5H20 ; 2,860g/L H3B03 ; 0,040g/L NaV03, 4H20; 1,820g/L MnCl2 ;
10 0,040g/L CoC12,6H20 ; 0,220g/L ZnSO4,7H20 ;
0,017g/L Na2Se03 ; 0,030g/L
(NH4)6Mo7024, 4H20).
Conditions de culture :
Les cultures sont réalisées dans des réacteurs de 1 à 2 L de volume utile avec
automates dédiés et supervision par station informatique. Le pH de la culture
est régulé
15 via l'ajout de base (solution d'ammoniaque 14% (w NH3/w) et/ou d'acide
(solution d'acide
sulfurique 4N). La température de culture est fixée à 42 C. L'agitation est
réalisée grâce
à 3 mobiles d'agitation : 1 turbine Rushton à 6 pâles droites positionnée à
l'extrémité
inférieure de l'arbre d'agitation au-dessus du "sparger" et 2 hélices tripâles
HTPG2 placés
sur l'arbre d'agitation. La pression en oxygène dissous dans la phase liquide
est régulée
20 dans le milieu tout au long de la culture, par la vitesse de rotation de
l'arbre d'agitation
(250-1800 t/min), le débit de ventilation par l'air et/ou d'oxygène. Les
paramètres de
régulation, intégrés dans l'automate de supervision, permettent de maintenir
une pression
partielle en oxygène dissous dans la phase liquide comprise entre 5 et 30 % de
la valeur
de saturation par l'air dans des conditions identiques de température, de
pression et de
composition du milieu. Le temps de culture a été compris entre 50 et 300
heures.
Afin de d'optimiser la croissance des souches d'ARUs différents modes
trophiques
ont été testés :
- l'hétérotrophie (-*-) Le substrat glycérol est apporté par une conduite
de type
discontinue alimentée. Aucun apport de lumière n'est réalisé.
- la mixotrophie (-O-): Le substrat glycérol est apporté par une conduite de
type
discontinue alimentée et un apport de lumière est réalisé.
- Résultats
Les performances en fin de croissance des différentes conditions sont résumées
dans le tableau 1 suivant
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Mixotrophie Hétérotrophie
Temps (h) 100 350
Concentration cellulaire (g biomasse sèche/L) 98 68
Rendement (g/ g de substrat carboné) 0,5 0,5
Productivité (g biomasse sèche/L/h) 0,98 0,19
Tableau 1
La culture en Mixotrophie permet d'obtenir plus rapidement une concentration
en
biomasse supérieure à celles obtenues avec des cultures en mode hétérotrophe
ou
autotrophe.
La productivité de biomasse en mixotrophie est de 0,98 g biomasse/L/h, contre
0,19
g biomasse/L/h en hétérotrophie. On note que dans l'art antérieur Graverholt
et
collaborateurs. ont obtenu une productivité de 0,286 g/L/h en hétérotrophie
[Graverholt et
col., opus cit.].
Les résultats sont présentés à la figure 1.
En plus d'une croissance plus rapide, la présence de lumière permet de
favoriser la
production de protéines dans les cellules, celle-ci pouvant atteindre 51,56 %
de la matière
sèche en mixotrophie contre 29,57 % en hétérotrophie (Tableau 2 : Analyses du
contenu
en acide aminé de biomasse de G. sulphuraria ou de S. platensis).
A Acides Aminés
Galdieria
sulphuraria ASP GLU ALA ARG CYS GLY HIS ILE LEU
% 4,92 8,78 2,96
3,01 0,76 2,46 1,13 2,76 3,86
LYS MET PHE PRO SER THR TYR VAL TOTAL
% 3,81 1,20 2,25
2,96 3,60 3,44 0,00 3,66 51,56
B Acides Aminés
Galdieria
sulphuraria ASP GLU ALA ARG CYS GLY HIS ILE LEU
% 2,99 5,34 1,62
1,57 0,46 1,33 0,62 1,41 2,07
LYS MET PHE PRO SER THR TYR VAL TOTAL
% 2,14 0,62 1,26
1,77 2,24 2,03 0,00 2,10 29,57
C Acides Aminés
Spiruline
ASP GLU ALA ARG CYS GLY HIS ILE LEU
platensis
% 6,11 8,77 4,85
4,14 0,62 3,20 1,05 3,53 5,42
LYS MET PHE PRO SER THR TYR VAL TOTAL
% 2,86 1,35 2,82
2,20 2,58 3,23 0,00 3,98 56,71
Tableau 2 : A) et B) : Contenu en acides aminés de Galdieria sulphuraria
cultivée en
conditions de mixotrophie (A) et d'hétérotrophie (B). Le contenu protéique
estimé par la
méthode de Kjeldahl a été estimé à 51.5% et 37% respectivement avec un facteur
N-
6.25x. C) : Contenu en acides aminés d'un échantillon de Spiruline platensis
commerciale. Le contenu protéique estimé par la méthode de Kjeldahl a été
estimé à 65%
avec un facteur N-6.25x.
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Le contenu élevé en protéines de Galdieria sulphuraria en fait un bon candidat
pour
entrer dans la préparation de compléments alimentaires et ainsi concurrencer
la spiruline
sur ce marché car son aminoscore est supérieur à celui recommandé par la FAO
et ses
scores sont supérieurs à ceux de la spiruline pour 4 des 7 acides aminés
essentiels pour
la nutrition humaine (Tableau. 3) :
His lie Leu Lys Th r Val SSA
Recommandations FAO 16 30 61 48 25 40 23
Galdieria sulphuraria 21,94
53,59 74,95 73,98 66,80 71,07 38,06
Spirulina platensis 16,15
54,31 83,38 44,00 49,69 61,23 30,31
Tableau. 3 : Aminoscores comparant l'apport journalier recommandé par la FAO
et les
quantités apportés par les souches de cette étude (mg/g de protéines) (adapté
de la
recommandation 92 nourriture et nutrition de la FAO.
Exemple 2 : Effet de la lumière bleue sur la production de phvcocvanine en
fioles
d'Erlenmever sur la souche Galdieria sulphuraria.
Matériel et méthodes
Souche : Galdieria sulphuraria (ou Cyanidium caldarium) UTEX#2919
Milieu de culture :
30 g/L glycérol, 8 g/L (NH4)2SO4, 1 g/L KH2PO4, 716mg/L MgSO4, 44mg/L CaCl2, 3
mL/L de solution stock Fe-EDTA (FeSO4 à 6,9g/L et d'EDTA-Na2 à 9,3g/L ) et 4
ml/L de
solution de trace métal ( 3,09g/L EDTA-Na2 ; 0,080g/L CuSO4,5H20 ; 2,860g/L
H3B03 ;
0,040g/L NaV03, 4H20; 1,820g/L MnCl2 ; 0,040g/L CoC12,6H20 ; 0,220g/L
ZnSO4,7H20 ;
0,017g/L Na2Se03 ; 0,030g/L (NH4)6Mo7024, 4H20).
Conditions de culture ;
Dans chaque fiole d'Erlenmeyer 100 mL de milieu sont inoculés à 0,1% (v/v)
avec
une pré-culture âgée de 240h. Pour tester l'effet de la lumière combinée à la
concentration en phosphore, on illumine de façon indépendante les fioles
d'Erlenmeyer
avec un système de LED blanche ou de LED bleue (455 nm). L'intensité lumineuse
pour
chacune des conditions est de 100 pmol m-2 s-i. Les cellules sont cultivées à
une
température de 42 C sous agitation modérée (200 tours/minute). Le suivi de la
croissance
des cellules est effectué toutes les 24h par mesure d'absorbance à 800 nm.
Lorsque la
phase de stationnaire est atteinte (environ 190h) 50 mL de suspension
cellulaire sont
prélevés afin d'effectuer une mesure de masse sèche par filtration, des
mesures de
concentration en phosphore dans le milieu grâce à une mesure par Reflectoquant
(méthodes connue de l'homme du métier).
L'estimation de la teneur intracellulaire en phycocyanine par gramme de
matière
sèche a été réalisée à différents temps de culture grâce à la méthode décrite
par Moon et
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collaborateur [Moon et al., Korean J. Chem. Eng., 2014, 1-6] (A). Les autres
pigments
comme la chlorophylle et les caroténoïdes ont été estimés par une méthode de
dosage
par HPLC connue de l'homme du métier (B).
Résultats
Cet essai montre que déjà à 180h la concentration en phycocyanine est 300%
plus
élevée en lumière bleue qu'en lumière blanche (Fig. 2A). A 250h cette
différence bien que
significative n'est plus que de 25%.
En analysant le contenu en phosphore du milieu à 250h, on constate qu'il en
reste
environ 100 mg/L pour les Erlenmeyers en lumière bleue alors qu'en lumière
blanche il
reste 5 mg/L et que nous sommes en dessous des valeurs en phosphore du milieu
induisant la production phycocyanine comme nous le verrons plus tard dans le
point 3. A
180h les souches ne contiennent pas de chlorophylle mais déjà du 13-carotène
et de la
zéaxanthine (Fig. 2B).
Des essais avec des longueurs de lumière bleue de 475 nm montrent un effet
similaire à celle de 455 nm ; il est donc envisageable d'utiliser toute la
plage de longueur
d'onde de lumière bleue pour favoriser la production de phycocyanine.
A part la lumière blanche seul la lumière bleue a permis d'obtenir une
croissance de
la souche avec production de phycocyanine.
L'exposition à la lumière bleue permet une croissance plus ou moins
équivalente à
celle observée en lumière blanche, avec une augmentation importante de la
teneur
intracellulaire de PC par gramme de masse sèche (Figure 2).
Exemple 3 : Effet de la composition du milieu de culture sur la production de
phycocvanine.
Matériel et méthodes
Souche : Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium) UTEX#2919
Milieu de culture :
Pour tester l'effet de la concentration en phosphore on effectue un suivi des
cultures
sur 4 milieux différents. Ces milieux sont composés d'une même base :
g/L glycérol, 8 g/L (NH4)2SO4, 716mg/L MgSO4, 44mg/L CaCl2, 3 mL/L de
30 solution stock Fe-EDTA (FeSO4 à 6,9g/L et d'EDTA-Na2 à 9,3g/L ) et 4
ml/L de solution de
trace métal ( 3,09g/L EDTA-Na2 ; 0,080g/L CuSO4,5H20 ; 2,860g/L H3B03 ;
0,040g/L
NaV03, 4H20; 1,820g/L MnCl2 ; 0,040g/L CoC12,6H20 ; 0,220g/L ZnSO4,7H20 ;
0,017g/L
Na2Se03 ; 0,030g/L (NH4)6Mo7024, 4H20).
Pour la limitation en phosphore on impose des concentrations en KH2PO4 de
250mg/L, 500mg/L, 1g/L, et 2g/L. Une fois les milieux assemblés, on ajuste le
pH à 3
avec du H2SO4 36N puis on les stérilise. Le même protocole est appliqué pour
les milieux
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ou la concentration en azote varie, cette fois ci en gardant la concentration
en KH2PO4 à
une valeur initiale de 1 g/I.
Conditions de culture ;
Dans chaque fiole d'Erlenmeyer 100 ml de milieu sont inoculés à 0,1% avec une
préculture âgée de 240h. Les cellules sont cultivées à une température de 42 C
sous
agitation modérée (140 tours/minute) avec un éclairage constant par tube
fluorescent
(Osram 865 Cool Day light) à 100 pmol m-2 s-1. Le suivi de la croissance des
cellules est
effectué toutes les 24h par mesure d'absorbance à 800 nm.
L'estimation de la teneur en phycocyanine par gramme de matière sèche a été
réalisée à différents temps de culture grâce à la méthode décrite par Moon et
collaborateur [Moon et al., Korean J. Chem. Eng., 2014, 1-6] (A). Les autres
pigments
comme la chlorophylle et les caroténoïdes ont été estimés par une méthode de
dosage
par HPLC connue de l'homme du métier (B).
Résultats :
La figure 3 présente les résultats de ces essais
(A) Croissance de la souche en présence de différentes concentration en
(NH4)2SO4 dans le milieu initial.
(B) Estimation de la teneur intracellulaire en phycocyanine dans la biomasse
en fin
de culture ;
(C) Croissance de la souche en présence de différentes concentrations en
KH2PO4
dans le milieu initial ;
(D) Estimation de la quantité de PC dans la biomasse à 180h et 250h:
Pour ces expériences les cellules sont éclairées par de la lumière blanche
(100
E m-2. s-1).
Hormis, l'ajout de quantités importantes d'azotes dans le milieu culture
visant à
favoriser la production de phycocyanine, la Demanderesse a pu mettre en
évidence que
la quantité de phosphore dans le milieu est prépondérante pour la production
de
phycobiliprotéines et de caroténoïdes (Figure 3).
La Demanderesse a pu déterminer que pour des croissances équivalente (Figure
3C), c'est à dire que pour des concentrations en phosphore non restrictives,
la production
de phycocyanine était supérieure dans un milieu contenant 250 mg/I de KH2PO4
(soit
0.0025 mole de phosphore/L) à celle obtenue dans un milieu contenant 2 g/I de
KH2PO4
(soit mole de phosphore/L) (Figure 3B).
De façon linéaire plus la concentration en phosphore dans le milieu initial
est
importante pour une concentration dans le milieu initial en source de carbone
fixe, plus la
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teneur intracellulaire en phycocyanine diminue, et inversement. Autrement dit,
plus le
rapport PIC des concentrations initiales dans le milieu (exprimé en mole de
phosphore/mole de carbone) est important, plus la teneur intracellulaire en
phycocyanine
et en caroténoïdes dans la biomasse augmente.
5 De ce fait, le procédé de culture discontinue vise à maintenir un niveau
de
phosphore dans le milieu permettant de combiner croissance et production de
phycobiliprotéines et de caroténoïdes, en déterminant une gamme de
concentration en
phosphore- idéale. Contrairement à ce qui a été décrit dans la demande
internationale
W02015107312 pour les chlorelles, la carence en phosphore n'induit pas une
10 augmentation de la teneur en protéines de façon globale chez Galdieria
sulphuraria.
Selon nos résultats la concentration en phycobiliprotéines augmente alors que
la teneur
en protéines de la biomasse (AA%) reste stable.
Exemple 4 : Effets combinés de la lumière bleue et de la concentration en
phosphore sur la production de phycocvanines et de caroténoïdes.
15 Matériel et méthodes
Souche : Galdieria sulphuraria (ou Cyanidium caldarium) UTEX#2919
Milieu de culture :
g/L glycérol, 8 g/L (NI-14)2504, 716mg/L Mg504, 44mg/L CaCl2, 3 mL/L de
solution stock Fe-EDTA (Fe504 à 6,9g/L et d'EDTA-Na2à 9,3g/L ) et 4 ml/L de
solution de
20 trace métal ( 3,09g/L EDTA-Na2 ; 0,080g/L Cu504,5H20 ; 2,860g/L H3B03 ;
0,040g/L
NaV03, 4H20; 1,820g/L MnCl2 ; 0,040g/L CoC12,6H20 ; 0,220g/L Zn504,7H20 ;
0,017g/L
Na25e03 ; 0,030g/L (NH4)6Mo7024, 4H20).
Conditions de culture :
Une gamme de concentration en phosphore, sous forme de KH2PO4, en présence
25 de lumière bleue ou de lumière blanche a été utilisée pour faire croitre
des souches de
Galdieria sulphuraria en Erlenmeyer pendant 250h.
250 500 1000 1000 2000 2000
KH2PO4 250 mg 500 mg
mg mg mg mg mg mg
Lumière Blanche Bleue Blanche Bleue Blanche Bleue Blanche Bleue
Condition 1 2 3 4 5 6 7 8
Dans chaque fiole d'Erlenemeyer 100 mL de milieu sont inoculés à 0,1% (v/v)
avec
une pré-culture âgée de 240h. Pour tester l'effet de la lumière combinée à la
concentration en phosphore, on illumine de façon indépendante les fioles
d'Erlenmeyer
30 avec un système de LED blanche ou de LED bleue (455 nm). L'intensité
lumineuse pour
chacune des conditions est de 100 pmol m-2 s-1. Les cellules sont cultivées à
une
température de 42 C sous agitation modérée (200 rpm). Le suivi de la
croissance des
cellules est effectué toutes les 24h par mesure d'absorbance à 800 nm.
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Résultats :
La figure 4 présente les résultats de ces essais
Visuellement les souches présentent une différence de coloration allant du
vert bleu
au jaune pâle en passant par le vert.
De façon similaire à ce qui a été décrit dans les expériences précédentes on
retrouve l'effet positif de la lumière bleue et de la carence en phosphore.
Si l'on compare de façon croisée les données il apparaît clairement que la
condition
la plus favorable pour la production de pigments que ce soit de la
phycocyanine, des
caroténoïdes ou de la chlorophylle, est une culture en lumière bleue en
présence de faible
concentration de phosphore.
Le tableau 4 ci-dessous montre les concentrations des différents pigments dans
la
biomasse après 250 h de croissance.
Conditions Phycocyanine* Chlorophylle A* &carotène* Zéaxanthine*
1 30 0,989 0,214 0,115
2 60 2,154 0,543 0,441
3 25 0,993 0,239 0,131
4 53 1,687 0,393 0,307
5 24 1,073 0,252 0,182
6 40 0,738 0,162 0,089
7 20 0,408 0,114 0,081
8 39 0,622 0,120 0,063
*: (mg/g de matière sèche)
Tableau 4. Concentration des différents pigments dans la biomasse après 250 h
de
croissance.
Bien que significatif dans les deux cas, l'effet de la concentration en
phosphore est
beaucoup plus marqué en présence de lumière bleue que de lumière blanche, les
concentrations pouvant être multipliées par deux pour la phycocyanine (Figure
4A et
Tableau 4), par 4,5 pour les fl-carotènes, et par 7 pour la zéaxanthine
(Figure 4B et
Tableau 4).
Exemple 5 : Effets combinés de la lumière bleue et de la concentration en
phosphore sur la production de phycocvanines et de caroténoïdes en culture
continue
Conditions de culture :
La souche Gladieria UTEX 2919 a été cultivée dans les conditions de l'exemple
1,
avec 500 mg de KH2PO4 et une contre-pale bleue délivrant jusqu'a 3 Watts de
puissance
lumineuse à une longueur d'onde de 455 nm. Le milieu d'alimentation est
dimensionné
pour obtenir entre 60 et 65 g de matière sèche par litre de moût. La
concentration de
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chaque élément du milieu est ajustée afin de respecter les ratios du milieu
utilisé pour le
pied de cuve décrit dans l'exemple 1.
Pour la première phase de culture correspondant a la culture en batch, fed
batch et
puis à la stabilisation au alentour de 60 g de MS/L, la lumière est maintenu à
50% de la
puissance maximale. A partir de 600 heures de culture, considéré comme la
phase de
production, la puissance lumineuse est passé a 100% soit 3 Watts.
Figure 5 A: (-0-) suivi de croissance par matière sèche ; (-E-) suivi de
croissance
par mesure d'absorbance à 800 nm.
Figure 5 B: Mesure de l'évolution du contenu intracellulaire en phycocyanine
au
cours de la culture.
Résultats :
Après 3 semaines le régime de permanant de culture a été établi entre 60 et 65
g de
MS par litre de moût (Figure 5A). Lorsque la puissance de lumière est
augmenter à 600h
s'en suit une augmentation progressive de la teneur en PC dans la biomasse
jusqu'à
atteindre 40 mg/g de MS. En moyenne la teneur en PC mesurée sur les 200
dernières
heures culture reste proche de cette valeur.
Exemple 6: Caractérisation physicochimique de la phycocyanine extraite de
la souche Gladieria UTEX 2919 cultivée selon l'invention.
Protocoles des tests
La souche Gladieria UTEX 2919 a été cultivée dans les conditions de l'exemple
2.
Pour ces essais la phycocyanines a été extraite selon le protocole décrit par
Moon
et al., 2014 (op.citus). La phycocyanine mesure de couleur bleue se fait par
mesure
d'absorbance à 618 nm grâce à un spectrophotomètre (Annershann Biosciences
Ultra Spec
2100 Pro). La perte de couleur exprimée en pourcentage se calcule de façon
relative à la
mesure de l'absorbance de l'échantillon dans les conditions de référence, pH 6
pour le
test pH, 25 C pour le test de température, 0 % d'éthanol pour la résistance à
l'alcool.
Pour le test de résistance en condition acide le pH est descendu de façon
graduelle
par ajout d'une solution d'acide citrique à la préparation de phycocyanine.
Pour chaque
valeur de pH un échantillon de la solution de phycocyanine est prélevé et son
absorbance
à 618 nm mesuré.
Pour les essais de résistance à la température la solution de phycocyanine est
placée pendant 30 minutes dans un bain-marie préalablement chauffé à 70 C,
après
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refroidissement à température ambiante l'absorbance de l'échantillon à 618 nm
est
mesurée.
Pour les essais de résistance à l'alcool, 1 volume de solution de phycocyanine
est
mélangé à 1 volume équivalent d'une solution d'éthanol à 0%, 40 %, 60% , 80%,
et 100%
pour obtenir au final une solution de phycocyanine contenant 0%, 20%, 30%,
40%, et
50% respectivement. Après 1 heure d'incubation une mesure d'absorbance à 618
nm est
effectuée pour chaque mélange.
Résultats :
Les résultats de ces essais sont présentés à la figure 6
La figure 6A montre que la phycocyanine extraite de la souche Galdieria
sulphuraria
(UTEX 2919) présente encore plus de 80% de sa coloration à pH 2.75.
La figure 6B montre que la phycocyanine extraite de la souche Galdieria
sulphuraria
(UTEX 2919) présente encore plus de 40% de sa coloration après 30 minutes
d'incubation à 70 C.
La figure 60 montre que la phycocyanine extraite de la souche Galdieria
sulphuraria
(UTEX 2919) présente encore plus de 30% de sa coloration après 1 heure
d'incubation
dans 40% d'éthanol.
Ces résultats peuvent être comparés à ceux décrits dans l'art antérieur pour
la
phycocyanine de spiruline (http://www.dlt-
spl.co.jp/business/en/spirulina/linablue.htm.
REFERENCES
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(February
15, 1997): 221-24
Sloth JK & al., ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, Vol.28, n 1-2, Janvier 2006,
168-175
Graverholt OS & al., APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Vol. 77, n 1,
5 septembre 2007, 69-75
Gross W and Schnarrenberger C, "Heterotrophic Growth of Two Strains of the
Acido-
Thermophilic Red Alga Galdieria Sulphuraria." Plant and Oeil Physiology 36,
no. 4 (June
1, 1995): 633-38
Jouen & al., 1999, "Clarification and Concentration with Membrane Technology
of a
Phycocyanin Solution Extracted from Spirulina Platensis." Biotechnology
Techniques 13,
no. 12 (December 1999): 877-81
Moon & al., 2014, "Isolation and Characterization of Thermostable Phycocyanin
from
Galdieria Sulphuraria" 31(2014): 1-6)
Nichols K & al., BOTANICAL GAZETTE, Vol. 124, n 2, 1er décembre 1962, 85-93
CA 02998973 2018-03-16
WO 2017/050917
PCT/EP2016/072582
29
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