Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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Procédé de production de progéniteurs érythroïdes
La présente invention relève du domaine de la médecine. Elle se rapporte plus
particulièrement à de nouveaux procédés de production de progéniteurs
érythroïdes et de
globules rouges.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Le maintien d'un apport constant en dioxygène aux tissus est indispensable à
la
survie de nombreux êtres vivants, et en particulier des humains. Ce sont les
globules
rouges qui transportent le dioxygène au sein de l'organisme via la circulation
sanguine.
Ce transport est assuré par l'hémoglobine, une protéine spécifique des
globules rouges
qui est capable de fixer le dioxygène. Lorsque les globules rouges parviennent
aux tissus,
le dioxygène diffuse à travers les parois des capillaires. Le rôle des
globules rouges est
donc primordial.
La transfusion de globules rouges est nécessaire lors de situations d'urgences
(hémorragie) ou pathologiques (maladies du sang, cancers, etc.). En 2016, plus
de 100
millions de poches de sang ont été collectées dans le monde et ont été
distribuées afin de
répondre aux besoins transfusionnels. 50% de ces produits sont distribués dans
les pays
riches, qui ne représentent que 15% de la population globale. Si, dans les
pays en voie de
développement, les problématiques de transfusion sont liées à
l'approvisionnement et à
la sécurité transfusionnelle, dans les pays riches, ces problématiques sont
mieux
maîtrisées. Toutefois, les complications immunologiques liées à des
transfusions
chroniques (allo-immunisation) peuvent conduire à des impasses
transfusionnelles
mettant en jeu le devenir des patients.
A ce jour, les transfusions sanguines reposent exclusivement sur le sang issu
de
donneurs.
Chez l'adulte, la production de globules rouges ou érythropoïèse se déroule
dans
la moelle osseuse dite moelle hématopoïétique, qui est présente dans les os
plats et aux
extrémités des os longs. Dans la moelle osseuse, des cellules souches
multipotentes,
appelées cellules souches hématopoïétiques se différencient successivement en
différents
types de progéniteurs érythroïdes (BFU-E, CFU-E, proérythroblastes,
érythroblastes
basophiles, érythroblaste polychromatophiles). Quand les érythroblastes
quittent la
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moelle osseuse, ils perdent leur noyau pour devenir des réticulocytes puis des
globules
rouges matures.
Des milieux de différentiation des cellules souches hématopoïétiques
permettant
la production in vitro de globules rouges sont connus. Cependant, les procédés
actuels
présentent des défauts rédhibitoires pour une production à grande échelle tel
qu'une
orientation trop rapide vers une maturation en globules rouges, ce qui limite
considérablement le rendement de production, ou encore une différenciation en
cellules
incapables de réaliser les étapes d'énucléation correctement (Akimov S et al,
2005, Stem
cells, 23(9) : 1423-1433 ; Hirose SI et al, 2013, Stem Cell Reports, 1(6) :
499-508 ; Huang
X, 2013, Mol. Ther., 22(2) : 451-463). Enfin, d'autres procédés recourent à
des co-
cultures avec des cellules nourricières (Kurita R et al, 2013, PloS One, 8(3)
: e59890), ce
qui est à la fois complexe à mettre en place et coûteux.
Il apparaît ainsi que le développement de nouveaux procédés permettant une
production in vitro de globules rouges permettrait de répondre aux besoins
d'approvisionnement, d'éviter des risques infectieux émergents, et d'éviter
des
complications immunologiques.
L'invention décrite ici vise, entre autres, à répondre à ces besoins.
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont démontré que la culture de cellules souches
hématopoïétiques
dans un milieu comprenant de la dexaméthasone, du SMER28 (Small Molecule
Enhancer
of Rapamycin 28), et optionnellement du DMOG (diméthyloxalylglycine), permet
non
seulement de différencier ces cellules souches en progéniteurs érythroïdes,
mais
également d'amplifier considérablement cette population de progéniteurs tout
en
préservant leur capacité de différentiation terminale en globules rouges. Les
progéniteurs
érythroïdes ainsi obtenus peuvent être maintenus en culture et amplifiés
pendant plus de
60 jours sans pour autant perdre leur capacité à se différencier en cellules
matures
énuclées, c'est-à-dire en globules rouges.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé in vitro de
production de progéniteurs érythroïdes comprenant la mise en contact de
cellules souches
hématopoïétiques avec un milieu de culture cellulaire, de préférence adapté
aux exigences
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nutritionnelles des cellules souches hématopoïétiques et en particulier adapté
à la
croissance et/ou différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique, et
comprenant
une hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie.
De préférence, l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe
constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone,
la
méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la
dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci. De
manière plus
particulièrement préférée, l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le
groupe
constitué de la prednisone, la prednisolone et la dexaméthasone. De manière
tout
particulièrement préférée, l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.
De préférence, l'inducteur d' autophagie est sélectionné dans le groupe
constitué
du SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 et SMER-18, et
d'une combinaison de ceux-ci. De manière plus particulièrement préférée,
l'inducteur
d'autophagie est le SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28).
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de culture comprend en
outre
un activateur de la voie HIF (Hypoxya Inductible Factor), de préférence un
inhibiteur de
la prolyl hydroxylase, et de manière encore préférée du DMOG
(diméthyloxalylglycine).
Les cellules souches hématopoïétiques sont de préférence obtenues par
différenciation de cellules souches pluripotentes, en particulier des cellules
souches
embryonnaires (ES) ou des cellules souches pluripotentes induites (iPS), ou
sont isolées
à partir d'un échantillon de sang de patient avec ou sans mobilisation, de
sang de cordon
ombilical ou de placenta, ou encore à partir d'un échantillon ou prélèvement
de moelle
osseuse. De préférence, les cellules souches hématopoïétiques sont des
cellules souches
hématopoïétiques humaines.
Les cellules souches hématopoïétiques peuvent être génétiquement modifiées, en
particulier pour surexprimer un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe
constitué
de HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV
insertion region 1 homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB. De préférence, les cellules
souches hématopoïétiques peuvent être génétiquement modifiées pour surexprimer
le
gène HTERT ou pour surexprimer le gène BMI1. Elles peuvent également être
modifiées
pour surexprimer le gène HTERT et le gène BMIl.
Le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué de HTERT (Human
Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1
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homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB, sont de préférence placés sous le contrôle d'un
ou
plusieurs promoteurs inductibles.
Ces cellules souches hématopoïétiques peuvent en outre être génétiquement
modifiées pour sur-exprimer :
- un ou plusieurs
facteurs de transcription de la voie des CEN (Core
Erythroid Network), de préférence LMO2 (LIM domain only 2) ; et/ou
- un ou
plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de
préférence BCL-XL (B-cell Lymphoma-extra large).
De préférence, les cellules souches hématopoïétiques sont génétiquement
modifiées pour surexprimer le gène BCL-XL ou pour surexprimer le gène LM02.
Le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes de la voie EPO-
R/JAK2/STAT5/BCL-XL sont, de préférence, placés sous le contrôle d'un ou
plusieurs
promoteurs constitutifs.
Le ou les gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes des facteurs
de
transcription de la voie des CEN (Core Erythroid Network) sont, de préférence,
placés
sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs inductibles.
Les cellules souches hématopoïétiques peuvent également être des cellules
immortalisées.
De préférence, les cellules sont cultivées dans le milieu de culture de
l'invention
pendant au moins 20 jours, de manière encore préférée pendant au moins 40
jours, de
manière tout particulièrement préférée pendant au moins 60 jours.
L'invention concerne encore, dans un deuxième aspect, l'utilisation du milieu
de
culture cellulaire selon l'invention pour la production et/ou l'amplification
de
progéniteurs érythroïdes.
Dans un troisième aspect, l'invention concerne des cellules souches
hématopoïétiques génétiquement modifiées telle que décrites précédemment ainsi
que
l'utilisation de ces cellules souches hématopoïétiques pour la production in
vitro de
progéniteurs érythroïdes et/ou d' érythrocytes.
L'invention concerne, dans un quatrième aspect, un procédé in vitro de
production
d'érythrocytes comprenant :
- la production de progéniteurs érythroïdes selon le procédé de l'invention
; et
- l'induction de la maturation des progéniteurs érythroïdes,
- et optionnellement, la récupération des érythrocytes obtenus.
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De préférence, la maturation des progéniteurs érythroïdes est induite par
culture
des progéniteurs érythroïdes dans un milieu de différenciation érythrocytaire.
L'invention concerne encore, dans un autre aspect, un milieu de culture
cellulaire,
de préférence adapté à la croissance et/ou à la différentiation des cellules
de la lignée
5 hématopoïétique, et comprenant une hormone glucocorticoïde, de préférence de
la
dexaméthasone, et un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, et
optionnellement un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG.
De préférence, le milieu comprend une hormone glucocorticoïde à une
concentration comprise entre 0,01 mM et 0,1 mM, et/ou un inducteur
d'autophagie à une
concentration comprise entre 2 M et 30 M, et/ou un activateur de la voie HIF
à une
concentration comprise entre 75 M et 350 M.
L'inducteur d' autophagie est, de préférence, sélectionné dans le groupe
constitué
du SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), SMER-10 et SMER-18, et
d'une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée est
le SMER-
28.
L'hormone glucocorticoïde est de préférence sélectionnée dans le groupe
constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone,
la
méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la
dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci, de
manière plus
particulièrement préférée est sélectionnée dans le groupe constitué de la
prednisone, la
prednisolone et la dexaméthasone, et de manière tout particulièrement préférée
est la
dexaméthasone.
L'activateur de la voie HIF (Hypoxya Inductible Factor) est de préférence un
inhibiteur de la prolyl hydroxylase (PHIS), et de manière encore plus préférée
du DMOG
(diméthyloxalylglycine).
Le milieu de culture peut comprendre en outre (i) de la transferrine, (ii) de
l'insuline, (iii) de l'héparine, et (iv) du sérum, plasma, pool de sérum ou
lysat plaquettaire,
de préférence du lysat plaquettaire, et optionnellement du SCF (Stem Cell
Factor), de
l'EPO et/ou de l'IL-3.
La présente invention concerne également l'utilisation du milieu de culture
cellulaire selon l'invention pour produire et/ou amplifier des progéniteurs
érythroïdes.
L'invention concerne encore, dans un cinquième aspect, une trousse (ou kit)
pour
la production de progéniteurs érythroïdes et/ou d'érythrocytes comprenant :
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- un milieu de culture selon l'invention ; et/ou
- des cellules souches hématopoïétiques génétiquement modifiées selon
l'invention
; et
- optionnellement, un guide contenant des instructions pour l'utilisation
d'une telle
trousse.
Enfin, l'invention concerne, dans un sixième aspect, l'utilisation d'une
trousse (ou
kit) selon l'invention pour produire des progéniteurs érythroïdes et/ou des
érythrocytes.
DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1 : Profil d'expression des marqueurs de surfaces CD117 et CD 235a à
J14, selon
les différents protocoles de cultures. A: protocole 4 ; B : protocole 3 ; C :
protocole 1;
D : protocole 2.
Figure 2 : Profil d'expression des marqueurs de surfaces CD117 et CD 235a à
J24 des
cellules génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT, BMI1 et LM02, selon
les
différents protocoles de cultures. A : protocole 4 ; B : protocole 1 ; C :
protocole 2.
Figure 3: Profil d'expression des marqueurs de surfaces CD117 et CD 235a à J24
des
cellules génétiquement modifiées pour surexprimer HTERT, BMI1 et BCL-XL, selon
les
différents protocoles de cultures. A : protocole 4 ; B : protocole 1 ; C :
protocole 2.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont démontré que la culture de cellules souches
hématopoïétiques
dans un milieu comprenant un inducteur d'autophagie, à savoir du SMER28 (Small
Molecule Enhancer of Rapamycin 28) et une hormone glucocorticoïde, à savoir de
la
dexaméthasone, permet d'augmenter considérablement la production de
progéniteurs
érythroïdes par rapport à un milieu de culture contrôle dans lequel seul de la
dexaméthasone est ajoutée. Les progéniteurs érythroïdes ainsi obtenus peuvent
être
maintenus en culture et amplifiés pendant plus de 60 jours. Les inventeurs ont
également
démontré que ces progéniteurs érythroïdes sont capables de se différencier
efficacement
en globules rouges.
Ce procédé de culture in vitro a non seulement l'avantage d'être simple et
économique, mais ouvre également la voie à une production industrielle à
grande échelle
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de progéniteurs érythroïdes puis de globules rouges. Ceci pourrait permettre
de réduire
les risques de pénurie de sang ou d'impasse transfusionnelle, tout en offrant
une sécurité
optimale aux patients transfusés.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente demande concerne un procédé in
vitro
de production de progéniteurs érythroïdes comprenant la mise en contact de
cellules
souches hématopoïétiques avec un milieu de culture comprenant un inducteur
d'autophagie et une hormone glucocorticoïde. Ce procédé a pour but d'induire
la
différenciation des cellules souches hématopoïétiques en progéniteurs
érythroïdes et de
permettre l'amplification, c'est-à-dire la multiplication, de cette population
de
progéniteurs tout en conservant leur capacité à se différencier ultérieurement
en globules
rouges. Le procédé selon l'invention est donc un procédé de production et
d'amplification
de progéniteurs érythroïdes.
Tel qu'utilisé ici, le terme de progéniteurs érythroïdes se réfère à des
cellules
progénitrices obtenues par différenciation de cellules souches
hématopoïétiques au cours
de l'érythropoïèse. Ces cellules progénitrices sont des cellules nucléées qui
ont la capacité
de se diviser et de se différencier ultérieurement en globules rouges par
énucléation. Les
progéniteurs érythroïdes sont de préférence sélectionnés parmi les BFU-E
(Burst Forming
Unit ¨ E) qui se caractérisent par l'expression des marqueurs CD117, CD34,
CD41,
CD71, et CXCR4, les CFU-E (Colony Forming Unit ¨ E) qui se caractérisent par
l'expression des marqueurs CD117, CD34, CD36, et CD71, les proérythroblastes
qui se
caractérisent par l'expression des marqueurs CD117, CD71, CD36, et CD235a, les
érythroblastes basophiles qui se caractérisent par l'expression des marqueurs
CD117,
CD71, CD36, CD235a et les érythroblastes polychromatophiles qui se
caractérisent par
l'expression des marqueurs CD36, CD71, CD 235a, et les mélanges de ceux-ci.
Tel qu'utilisé ici, le terme de cellule souche hématopoïétique ou CSH
se
réfère à des cellules souches multipotentes capables de se différencier en
cellules
sanguines et cellules immunitaires que sont les globules blancs, les globules
rouges et les
plaquettes. Les cellules souches hématopoïétiques expriment les antigènes
CD45,
CD133, et/ou CD34. De préférence, les cellules souches hématopoïétiques
expriment les
antigènes CD45 et CD34 et, optionnellement l'antigène CD133.
Selon les modes de réalisation préférés, les CSH sont des CSH humaines.
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Ces CSH peuvent être obtenues à partir de différentes sources et selon des
procédés bien connus de l'homme du métier. Elles peuvent notamment être
isolées à partir
de moelles osseuses, de cytaphérèses, de sang total ou encore de sang de
cordon ombilical
(ou de sang placentaire) par exemple à l'aide d'un système immuno-magnétique
ou d'un
système de tri sur la présence de récepteurs membranaires spécifiques (par
exemple
CD133, CD45 et/ou CD34).
Tel qu'utilisé ici, le terme de cytaphérèse se réfère au prélèvement par
aphérèse des CSH dans le sang. L'aphérèse est une technique de prélèvement de
certains
composants sanguins par circulation extra-corporelle du sang. Les composants
que l'on
souhaite prélever sont séparés par centrifugation et extraits, tandis que les
composants
non prélevés sont réinjectés au donneur ou au patient (aphérèse
thérapeutique).
Les CSH peuvent également être obtenues par différenciation de cellules
souches
pluripotentes, en particulier des cellules souches embryonnaires ou des
cellules souches
pluripotentes induites, de préférence des cellules souches pluripotentes
induites. Les
techniques pour différencier des cellules souches pluripotentes en CSH sont
bien connues
de l'homme du métier. Plusieurs protocoles ont été publiés, notamment le
protocole de
Lengerke C et al (2009, Ann N Y Acad Sci, 1176:219-27) consistant en une
différenciation de 17 jours en passant par une étape intermédiaire de corps
embryoïdes et
grâce à la combinaison des cytokines suivantes: SCF, Flt-3 ligand, IL-3, IL-6,
G-CSF et
BMP-4.
Tel qu'utilisé ici, le terme de cellule souche embryonnaire se réfère à des
cellules dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste et qui ont la
capacité de
conduire à la formation de tous les tissus de l'organisme (mésoderme,
endoderme,
ectoderme), y compris aux cellules de la lignée germinale. La pluripotence des
cellules
souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que
les
facteurs de transcription OCT4 et NANOG et des marqueurs de surface comme
SSEA3/4,
Tra-1-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires peuvent être obtenues
sans
destruction de l'embryon dont elles sont issues, par exemple à l'aide de la
technique
décrite par Chung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2): 113-117). Dans un mode
de
réalisation particulier, et pour des raisons légales ou éthiques, les cellules
souches
embryonnaires sont des cellules souches embryonnaires non humaines. Dans un
autre
mode de réalisation particulier, les cellules souches embryonnaires utilisées
dans
l'invention sont des cellules souches embryonnaires humaines, de préférence
obtenues
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sans destruction de l'embryon dont elles sont issues. Les embryons utilisés
sont de
préférence des embryons surnuméraires obtenus dans le cadre d'un projet
parental après
obtention des autorisations réglementaires et éthiques conformes aux lois en
vigueur.
Tel qu'utilisé ici, le terme de cellule souche pluripotente induite (CSPi,
ou
iPS), se réfère à des cellules souches pluripotentes obtenues par
reprogrammation
génétique de cellules somatiques différenciées, et présentant une morphologie
et un
potentiel d' autorenouvellement et de pluripotence en partie similaires à ceux
des cellules
souches embryonnaires. Ces cellules sont notamment positives pour les
marqueurs de
pluripotence, notamment la coloration à la phosphatase alcaline et
l'expression des
protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA3/4. Les procédés permettant l'obtention
des
cellules souches pluripotentes induites sont bien connus de l'homme du métier
et sont
notamment décrits dans les articles de Yu et al (Science, 2007, 318 (5858):
1917-1920),
Takahashi et al (Cell, 2007, 131(5): 861-872) et Nakagawa et al (Nat
Biotechnol, 2008,
26(1): 101-106).
Les CSH utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent également être des
CSH génétiquement modifiées afin d'augmenter leur capacité à s'engager dans
l'érythropoïèse et/ou leur capacité d'amplification. Ainsi, selon certains
modes de
réalisation, le procédé selon l'invention, peut comprendre la modification
génétique des
CSH afin d'augmenter leur capacité à s'engager dans l'érythropoïèse et/ou leur
capacité
d'amplification. Les méthodes pour modifier génétiquement ces cellules sont
bien
connues de l'homme du métier et impliquent, par exemple, l'introduction de
transgènes
dans le génome des cellules via des rétrovirus ou des lentivirus ou toute
autre forme de
transfert de gènes ou de protéines.
Selon un mode de réalisation, la capacité d'amplification de ces CSH est
améliorée en surexprimant un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe
constitué de
HTERT (Human Telomerase Reverse Transcriptase), BMI1 (B lymphoma Mo-MLV
insertion region 1 homolog), c-MYC, 1-MYC et MYB.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées
pour surexprimer HTERT.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement
modifiées pour surexprimer HTERT et un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le
groupe
constitué de BMI1 (B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog), c-MYC, 1-MYC
et MYB.
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Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées
pour
surexprimer HTERT et/ou BMI1, de préférence HTERT et BMIl.
La capacité des CSH à s'engager dans la voie de l'érythropoïèse peut être
améliorée en surexprimant un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie EPO-
5 R/JAK2/STAT5/BCL-XL et/ou dans la voie des CEN (Core Erythroid Network).
Tel qu'utilisé ici, le terme voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL se réfère à une
voie de signalisation cellulaire dont les protéines clefs sont le récepteur à
l'EPO
(érythropoïétine), JAK2 (Janus Kinase 2), STAT5 (Signal transducer and
activator of
transcription 5) et BCL-XL (B-cell Lymphoma-extra large). L'EPO est
indispensable à
10 l'érythropoïèse, elle favorise l'engagement érythoïde et la survie
cellulaire. La liaison de
l'EPO à son récepteur membranaire provoque la dimérisation de l'EPO-R qui,
ainsi
activé, induit à son tour les kinases JAK2. Les kinases JAK2 phosphorylent
alors les
résidus tyrosine de la queue cytoplasmique du récepteur EPO-R. Ces
phosphotyrosines
permettent l'interaction avec les protéines contenant un domaine 5H2 (Src
Homology 2),
ce qui se traduit par l'activation de différentes voies de signalisation dont
la principale est
la voie du facteur de transcription STAT5. STAT5 est tout d'abord dimérisé
puis
phosphorylé, ce qui conduit à sa translocation dans le noyau où il active la
transcription
de différents gènes dont des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire
et la
différenciation érythroïde.
Selon un mode de réalisation, les CSH sont génétiquement modifiées pour
surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5P/BCL-XL, de
préférence un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des
gènes codant
EPO-R, JAK2, STAT5P, BCL-XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées
.. pour surexprimer un gène codant pour BCL-XL.
Tel qu'utilisé ici, le terme voie des CEN se réfère à un groupe de
facteurs de
transcription essentiels à l'établissement ou au maintien de l'identité des
érythrocytes.
Selon un mode de réalisation, les CSH sont génétiquement modifiées pour
surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence un ou
plusieurs
gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant GATA1 (facteur de
transcription appartenant à la famille des protéines à doigt de zinc se fixant
sur la séquence
ADN GATA ), TAL1 (TAL BHLH Transcription Factor 1), KLF1 (Krueppel-like
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factor 1), LDB1 (LIM Domain Binding 1), LMO2 (LIM domain only 2) et SCL (Stem
Cell Leukemia), et une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées
pour surexprimer un gène codant LMO2.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH utilisées dans le procédé
selon
l'invention sont génétiquement modifiées pour surexprimer:
(i) un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes
codant
HTERT, BMI1, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de préférence
HTERT et/ou BMI1, et de manière plus particulièrement préférée HTERT et BMI1 ;
et
(ii) un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence
sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5, BCL-
XL
et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement
préférée
BCL-XL ; et/ou
(iii) un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence sélectionnés
dans le
groupe constitué des gènes codant GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 et SCL, et une
combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée LMO2.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les CSH utilisées dans le
procédé
selon l'invention sont génétiquement modifiées pour surexprimer:
(i) un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes
codant
HTERT, BMI1, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de préférence
HTERT et/ou BMI1, et de manière plus particulièrement préférée HTERT et BMI1 ;
et
(ii) un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence
sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5P,
BCL-
XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus
particulièrement préférée
BCL-XL ; et
(iii) un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence sélectionnés
dans le
groupe constitué des gènes codant GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 et SCL, et une
combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée LMO2.
Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées
pour
surexprimer
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(i) le gène codant HTERT, et optionnellement le gène codant BMI1, et
(ii) le gène codant LMO2 et/ou le gène codant BCL-XL, de préférence le gène
codant BCL-XL.
En particulier, les CSH peuvent être génétiquement modifiées pour surexprimer
le gène codant HTERT et le gène codant BCL-XL, et optionnellement le gène
codant
BMI1.
Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement
modifiées
pour surexprimer
(i) les gènes codant HTERT et BMI1, et
(ii) le gène codant LMO2 et/ou le gène codant BCL-XL.
En particulier, les CSH peuvent être génétiquement modifiées pour surexprimer
(i) les gènes codant HTERT et BMI1 et le gène codant LMO2, ou
(ii) les gènes codant HTERT et BMI1 et le gène codant BCL-XL.
Tel qu'utilisé ici, le terme surexpression , surexprimer ou
surexprimant
se réfère au niveau d'expression d'un gène dans une cellule génétiquement
modifiée qui
est supérieur au niveau d'expression de ce même gène dans la cellule non
génétiquement
modifiée. Lorsque la cellule n'exprime pas le gène en question avant la
modification
génétique mais l'exprime après modification, ce terme peut être remplacé par
expression , exprimer ou exprimant .
La surexpression d'un gène dans une CSH peut être obtenue par toute technique
connue de l'homme du métier, notamment par introduction dans la CSH d'un acide
nucléique comprenant le ou les gènes à surexprimer, ou de plusieurs acides
nucléiques
comprenant chacun un des gènes à surexprimer. Le ou les acides nucléiques
peuvent ainsi
être disposés sur la même construction ou dans des constructions distinctes.
Ils peuvent
être introduits dans la CSH par toute méthode connue par l'homme du métier, en
particulier par transduction virale, microinjection, transfection,
électroporation et
biolistique.
Tel qu'utilisé ici, le terme construction se réfère à une cassette
d'expression
ou à un vecteur d'expression.
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Dans une cassette d'expression, le ou les gènes à surexprimer sont liés de
manière
opérationnelle aux séquences nécessaires à leur expression. Notamment, ils
peuvent être
sous le contrôle d'un promoteur permettant leur expression dans une CSH. De
manière
générale, une cassette d'expression comprend, ou consiste en, un promoteur
permettant
d'initier la transcription, un ou plusieurs gènes, et un terminateur de
transcription.
L'expression "lié de manière opérationnelle" indique que les éléments sont
combinés de
manière à ce que l'expression de la séquence codante soit sous le contrôle
d'un promoteur
transcriptionnel. Typiquement, la séquence du promoteur est placée en amont
(5') du ou
des gènes d'intérêt. Des séquences d'espacement peuvent être présentes, entre
les éléments
régulateurs et le gène, dès lors qu'elles n'empêchent pas l'expression par
traduction de la
protéine codée. La cassette d'expression peut également comprendre au moins
une
séquence activatrice enhancer liée de manière opérationnelle au promoteur.
Un vecteur d'expression comprend un ou plusieurs acides nucléiques ou
cassettes
d'expression tels que décrits. Ce vecteur d'expression peut être utilisé pour
transformer
une cellule hôte et permettre l'expression de l'acide nucléique d'intérêt dans
ladite cellule.
Les vecteurs peuvent être construits par des techniques classiques de biologie
moléculaire, bien connues de l'homme du métier.
Avantageusement, le vecteur d'expression comprend des éléments régulateurs
permettant l'expression de l'acide nucléique d'intérêt. Ces éléments peuvent
comporter
par exemple des promoteurs de transcription, des activateurs de transcription,
des
séquences terminatrices, des codons d'initiation et de terminaison. Les
méthodes pour
sélectionner ces éléments sont bien connues de l'homme du métier.
Le vecteur peut être circulaire ou linéaire, simple- ou double-brin. Il est
avantageusement choisi parmi les plasmides, phages, phagemides, virus,
cosmides et
chromosomes artificiels. De manière préférée, le vecteur est un vecteur viral.
Le ou les gène(s) à surexprimer peuvent être placés sous le contrôle de
promoteurs
constitutifs ou inductibles, identiques ou différents, qu'ils soient ou non
présents sur le
même acide nucléique.
La CSH peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable et
le ou
les acides nucléiques, cassettes ou vecteurs peuvent être contenus dans la
cellule sous
forme d'épisome ou intégrés dans le génome de la CSH. Ils peuvent être insérés
dans le
génome de la cellule eucaryote en des régions identiques ou distinctes.
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Il existe de nombreuses techniques bien connues de l'homme du métier
permettant
l'expression stable ou transitoire de gènes d'intérêt. En particulier, les
gènes d'intérêts
peuvent être intégrés au génome d'une cellule grâce à une technique de knock-
in utilisant
un système d'expression ciblé, en particulier le système CRISPR-Cas9 (voir par
exemple
Platt et al. Cell. 2014 Oct 9; 159(2):440-55 ou encore Lo et al.
Biotechniques. 2017 Apr
1; 62(4):165-174). Cette technique qui permet d'insérer une seule copie d'un
ou de
plusieurs gènes d'intérêt dans le génome de la cellule en un locus
prédéterminé, repose
sur la transfection d'un ou de plusieurs vecteurs permettant l'expression
coordonnée d'un
gène codant la nucléase Cas9 et d'un ARNg (ARN guide ) spécifique du locus
où le
ou les gènes doivent être insérés. Ledit ou lesdits gènes d'intérêt ou une
cassette
comprenant ledit ou lesdits gènes d'intérêt sont insérés à la faveur de la
réparation de la
cassure générée par Cas9.
Tel qu'utilisé dans la présente demande, le terme ARN guide ou ARNg
désigne une molécule d'ARN capable d'interagir avec Cas9 afin de la guider
vers une
région chromosomique cible.
Chaque ARNg peut comprendre deux régions :
- une première région (communément appelée région SDS ), à l'extrémité 5'
de l'ARNg, qui est complémentaire de la région chromosomique cible et qui
imite
l'ARNcr du système CRISPR endogène, et
- une seconde région (communément appelé région handle ), à l'extrémité 3'
de l'ARNg, qui mime les interactions d'appariement de bases entre l'ARNtracr
(trans-
activating crRNA) et l'ARNcr du système CRISPR endogène et présente une
structure
double brin en tige et boucle s'achevant en 3' par une séquence
essentiellement simple
brin. Cette seconde région est essentielle à la fixation de l'ARNg à Cas9.
Le gène d'intérêt ou la cassette comprenant le ou les gènes d'intérêt est
flanqué
de séquences homologues du site de cassure ciblé par l'ARNg, ce qui permet
l'insertion
du gène ou de la cassette à la faveur de la réparation de la cassure par
recombinaison
homologue.
Des exemples de promoteurs permettant une expression constitutive comprennent,
sans y être limités, pEF1 alpha long, pCMV et pCAG.
Un système d'expression inductible pouvant être utilisé dans la présente
invention
est le système Tet-On, basé sur l'utilisation de la protéine transactivatrice
de la
tétracycline (tTA), qui est créée en fusionnant la protéine TetR (répresseur
de la
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tétracycline) présente chez la bactérie Escheri chia cou i avec le domaine
activateur de la
protéine VP16 présente dans le virus de l'herpès. La protéine rtTA n'est
capable de se lier
à l'ADN sur une séquence opératrice Tet0 spécifique que si elle est liée à une
tétracycline.
Plusieurs répétitions des séquences Tet0 sont placées sous le contrôle d'un
promoteur tel
5 que le promoteur EF1 alpha long. Les séquences Tet0 couplées au promoteur
sont
appelées élément de réponse à la tétracycline (TRE) et répondent à la liaison
de la protéine
transactivatrice de la tétracycline (tTA) en causant une augmentation de
l'expression du
gène placé sous le contrôle du promoteur.
Lorsque plusieurs gènes sont surexprimés, ceux-ci peuvent être placés sous le
10 contrôle d'un même promoteur ou de plusieurs promoteurs.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées
pour surexprimer un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué
des gènes
codant HTERT, BMI1, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de
préférence HTERT et/ou BMI1, et de manière plus particulièrement préférée
HTERT et
15 BMI1, et ce ou ces gènes sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs
promoteurs
inductibles.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées
pour surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence
sélectionnés
dans le groupe constitué des gènes codant GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 et
SCL,
et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée
LMO2, et ce
ou ces gènes sont placés sous le contrôle d'un ou plusieurs promoteurs
inductibles.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont génétiquement modifiées
pour surexprimer un ou plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de
préférence sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2,
STAT5P, BCL-XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus
particulièrement préférée BCL-XL, et ce ou ces gènes sont placés sous le
contrôle d'un
ou plusieurs promoteurs constitutifs.
Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées
pour
surexprimer le gène codant HTERT sous le contrôle d'un promoteur inductible et
le gène
codant pour BCL-XL sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement
modifiées
pour surexprimer les gènes codant HTERT, BMI1 et LMO2 sous le contrôle d'un ou
plusieurs promoteurs inductibles.
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Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement
modifiées
pour surexprimer les gènes codant HTERT et BMI1 sous le contrôle d'un ou
plusieurs
promoteurs inductibles et le gène codant pour BCL-XL sous le contrôle d'un
promoteur
constitutif.
De manière alternative, ou en complément des modifications génétiques décrites
ci-dessus, les CSH telles qu'utilisées dans le procédé selon l'invention
peuvent également
être génétiquement modifiées afin de contenir un gène suicide, par exemple le
gène HSV-
TK ou le gène Casp9, sous le contrôle d'un promoteur inductible. Tel
qu'utilisé ici, le
.. terme de gène suicide se réfère à tout gène dont l'expression entraîne
la mort de la
cellule capable de division qui l'exprime, en présence ou en absence d'une
molécule
supplémentaires (médicament ou autres), selon le gène suicide considéré. A
titre
d'exemples, la mort cellulaire d'une cellule exprimant le gène HSV-TK ou le
gène Casp9
est obtenue, respectivement, par ajout de gancyclovir ou d'AP1003.
Selon certains modes de réalisation, les CSH telles qu'utilisées dans le
procédé
selon l'invention sont des CSH immortalisées. Ces cellules immortalisées
peuvent en
outre être génétiquement modifiées tel que décrit ci-dessus.
Les CSH immortalisées peuvent être obtenues à partir d'une lignée cellulaire
immortalisée établie à partir de cellules malignes.
De préférence, les CSH immortalisées sont obtenues à partir d'une lignée
cellulaire immortalisée établie à partir de cellules non malignes, par exemple
à partir
d'iPS (Kurita et al. PLoS ONE, 2013, 8, e59890), de cellules de sang de cordon
(Kurita
et al. supra ; Huang, X. et al. Mol. Ther. 2014, 22, 451-463) de cellules
souches
embryonnaires (Hirose, S. et al. Stem Cell Rep. 2013, 1, 499-508), ou de CSH
isolées à
partir de la moelle osseuse, de cytaphérèses ou de sang périphérique total
(Trakamsanga
et al., 2017, Nature Communications, Vol. 8, 14750).
Les CSH peuvent être immortalisées par toute technique connue de l'homme du
métier, notamment par transduction avec un vecteur lentiviral portant les
oncogènes E6
et E7 du papillomavirus humain de type 16 (HPV16 E6/E7) (Akimov et al. Stem
Cells.
2005 Oct; 23(9): 1423-1433 ; Trakamsanga et al. supra). Optionnellement, les
CSH
peuvent être en outre transduites avec un vecteur lentiviral portant le gène
codant HTERT
(Akimov et al., supra).
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Selon un mode préféré, les CSH immortalisées utilisées dans le procédé selon
l'invention contiennent un gène suicide permettant leur élimination après
induction de la
maturation des progéniteurs érythroïdes en érythrocytes matures énucléés.
Le procédé selon l'invention comprend la mise en contact des CSH telles que
décrites ci-dessus avec une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'
autophagie, et plus
particulièrement avec un milieu de culture adapté à la croissance et/ou
différentiation des
cellules de la lignée hématopoïétique et comprenant une hormone
glucocorticoïde et un
inducteur d' autophagie.
Tel qu'utilisé ici, les termes autophagie , autolyse et autophagocytose
sont équivalents et peuvent s'employer l'un pour l'autre. L'autophagie se
réfère à une
dégradation d'une partie du cytoplasme de la cellule par ses propres
lysosomes.
L'autophagie est un processus physiologique qui contribue à éliminer certaines
protéines (virales, mal conformées...) et les organelles endommagées. Ce
processus peut
également intervenir dans l'élimination de pathogènes intracellulaires.
Plusieurs voies de
signalisation détectent différents types de stress cellulaire, allant de la
privation de
nutriments à l'invasion microbienne, et convergent pour réguler l'autophagie.
Tel
qu'utilisé ici, le terme inducteur d'autophagie se réfère à une molécule
capable
d'induire 1' autophagie dans une cellule.
Les inducteurs d' autophagie peuvent être notamment des inhibiteurs de la voie
mTOR tels que la metformine, la rapamycine, la perifosine, l'éverolimus, le
resvératrol
ou le tamoxifène, des activateurs de la formation d' autophagosomes tels que
le composé
MG-132 (un inhibiteur du protéasome 26S), le composé SAHA (un inhibiteur de la
Pan-
Histone desacétylase), la trichostatine A ou l'acide valproïque, ou encore des
petites
molécules agissant indépendamment de la voie mTOR telles que SMER-28, SMER-10
ou SMER 18.
Selon un mode de réalisation particulier, l'inducteur d' autophagie est un
inducteur
agissant indépendamment de la voie mTOR, de préférence sélectionné dans le
groupe
constitué du SMER-28 (Small Molecule Enhancer of Rapamycin 28), du SMER 10 et
du
SMER 18, et d'une combinaison de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation préféré, l'inducteur d' autophagie est le SMER-
28.
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Tel qu'utilisé ici les termes hormone glucocorticoïde , glucocorticoïde
,
corticostéroïde , ou de corticoïde sont équivalents et peuvent être
employés l'un
pour l'autre. Ces termes se réfèrent à des hormones stéroïdiennes naturelles
ou
synthétiques ayant un noyau prégnane et présentant une action sur le
métabolisme
protidique et glucidique.
Selon un mode de réalisation, l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans
le
groupe constitué de la cortisone, l'hydrocortisone, la prednisone, la
prednisolone, la
méthylprednisolone, la triamcinolone, la paraméthasone, la bétaméthasone, la
dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation particulier, l'hormone glucocorticoïde est une
hormone synthétique, de préférence sélectionnée dans le groupe constitué de la
prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone, la triamcinolone, la
paraméthasone,
la bétaméthasone, la dexaméthasone, le cortivazol, et les dérivés et mélanges
de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation préférée, l'hormone glucocorticoïde est
sélectionnée
dans le groupe constitué de la prednisolone, la méthylprednisolone, la
dexaméthasone, et
les dérivés et mélanges de ceux-ci, de préférence dans le groupe constitué de
la
prednisolone, la méthylprednisolone et la dexaméthasone.
Selon un mode de réalisation tout particulièrement préféré, l'hormone
glucocorticoïde est la dexaméthasone.
Selon un mode de réalisation particulier, l'inducteur d' autophagie est
sélectionné
dans le groupe constitué du SMER-28, du SMER 10 et du SMER 18, de préférence
est le
SMER-28, et l'hormone glucocorticoïde est sélectionnée dans le groupe
constitué de la
prednisolone, la méthylprednisolone et la dexaméthasone, de préférence est la
dexaméthasone.
Selon un mode de réalisation tout particulier, l'inducteur d'autophagie est le
SMER-28 et l'hormone glucocorticoïde est la dexaméthasone.
Optionnellement, les CSH peuvent également être mises en contact avec un
activateur de la voie HIF. Tel qu'utilisé ici, le terme voie HIF se réfère
à la voie de
signalisation initiée par HIF (Hypoxia induced factor) qui stimule la
sécrétion de l'EPO
et active ainsi la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL.
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De préférence, l'activateur de la voie HIF selon l'invention est un inhibiteur
de la
prolyl hydroxylase (PHIS).
Tel qu'utilisé ici, les termes prolyl hydroxylase (PHIS) et procollagène-
proline dioxygénase sont équivalents et peuvent être employés l'un pour
l'autre. La
prolyl hydroxylase est une enzyme d'hydroxylation de HIF sur ses résidus
prolyls.
Lorsqu'il est hydroxylé, HIF est inhibé. Les inhibiteurs spécifiques de la
prolyl
hydroxylase sont donc des molécules capables d'inhiber la prolyl hydroxylase
et ainsi
d'activer la voie HIF qui va à son tour activer la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-
XL.
De préférence, l'inhibiteur de prolyl hydroxylase est sélectionné dans le
groupe
constitué du DMOG (diméthyloxalylglycine), du NOG (N-oxalylglycine), du DFO
(desferrioxamine), du FG-4383, du F-0041, du FG-2216, du FG-4592, du S956711,
de
l'EDHB (ethy1-3,4 dihydroxy-benzoate), du TM6089, du TM655, du TM6008, du 8-
hydroxyquinoline, et des dérivés de ceux-ci.
De manière tout particulièrement préférée, l'activateur de la voie HIF est le
DMOG.
Lors de la mise en uvre du procédé selon l'invention, les CSH sont mises en
culture dans un milieu de culture adapté à la croissance et/ou à la
différentiation des
cellules de la lignée hématopoïétique. De nombreux milieux de culture adaptés
aux
exigences nutritionnelles des CSH sont connus de l'homme du métier et
disponibles dans
le commerce, tels que le milieu SFEM de Stemspan (Stemcell technologies) de
préférence
complémenté avec du SCF (Stem Cell Factor), de l'EPO (erythropoïétine), et des
lipides
ou le milieu StemMACS HSC Expansion Media XF, human (Invitrogen).
De préférence, les CSH sont mises en culture à une concentration comprise
entre
200 et 10000 cellules/ml, de préférence entre 500 et 2000 cellules/ml, et de
manière
encore préférée à environ 1000 cellules/ml.
Le milieu de culture est de préférence changé tous les environ 3 jours de
sorte que
les cellules ne dépassent pas une concentration d'environ 4000000 cellules/ml.
Les CSH peuvent être mises en contact avec l'hormone glucocorticoïde et
l'inducteur d' autophagie dès le premier jour de culture ou après plusieurs
jours de culture,
par exemple après 10 à 15 jours.
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De préférence, les CSH sont mises en contact simultanément avec l'hormone
glucocorticoïde et l'inducteur d'autophagie.
Alternativement, les CSH peuvent être tout d'abord mises en contact avec
l'hormone glucocorticoïde puis avec l'inducteur d'autophagie, ou vice-versa.
L'ajout du
5 second
composé peut avoir lieu, par exemple, quelques heures après la mise en contact
avec le premier composé
De préférence, les CSH sont mises en contact simultanément avec l'hormone
glucocorticoïde et l'inducteur d'autophagie. De manière plus particulièrement
préférée,
les CSH sont mises en contact simultanément avec l'hormone glucocorticoïde et
10 l'inducteur d'autophagie dès le premier jour de culture.
La mise en contact peut se faire par ajout de l'hormone glucocorticoïde et/ou
de
l'inducteur d'autophagie dans le milieu de culture des CSH ou en plaçant les
CSH dans
un milieu de culture comprenant l'hormone glucocorticoïde et/ou l'inducteur
d' autophagie.
Les concentrations de l'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d'autophagie
peuvent être constantes ou varier tout au long de la culture ou de la mise en
contact.
De préférence, lorsque le milieu de culture comprend l'hormone
glucocorticoïde,
celle-ci est présente à une concentration comprise entre 0,001 mM et 10 mM, de
préférence entre 0,01 mM et 1 mM, de manière encore préférée entre 0,01 mM et
0,5 mM,
et de manière tout particulièrement préférée entre 0,02 mM et 0,1 mM.
Selon un mode de réalisation particulier, lorsque le milieu de culture
comprend
l'hormone glucocorticoïde, celle-ci est présente à une concentration d'environ
0,1 mM.
De préférence, lorsque le milieu de culture comprend l'inducteur d'autophagie,
celui-ci est présent dans le milieu de culture à une concentration comprise
entre 0,1 M
et 100 M, de préférence entre 0,5 M et 50 M, de manière encore préférée
entre 1 M
et 30 M, et de manière tout particulièrement préférée entre 2 M et 30 M.
Alternativement, lorsque le milieu de culture comprend l'inducteur
d'autophagie, celui-
ci peut être présent dans le milieu de culture à une concentration comprise
entre 10 M
et 30 M.
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Selon un mode de réalisation particulier, lorsque le milieu de culture
comprend
l'inducteur d' autophagie, celui-ci est présent dans le milieu de culture à
une concentration
d'environ 2 M.
Tel qu'utilisé ici, le terme environ fait référence à une plage de valeurs
de
5% de la valeur spécifiée, de préférence 2% de la valeur spécifiée. Par
exemple,
environ 20 inclut les 5% de 20, ou de 19 à 21.
De la même manière, dans les modes de réalisation où les CSH sont mises en
présence d'un activateur de la voie HIF, la concentration de l'activateur peut
être
constante ou varier tout au long de la culture ou de la mise en contact.
De préférence, lorsque le milieu de culture comprend un activateur de la voie
HIF,
de préférence du DMOG, celui-ci est présent dans le milieu de culture à une
concentration
comprise entre 1 M et 1000 M, de préférence entre 10 M et 500 M, de
manière
encore préférée entre 50 M et 400 M, et de manière tout particulièrement
préférée entre
75 M et 350 M.
Selon un mode de réalisation particulier, les CSH sont mises en présence d'une
hormone glucocorticoïde, de préférence la dexaméthasone, et d'un inducteur
d'autophagie, de préférence le SMER28, après 10 à 15 jours de culture. De
préférence,
selon ce mode de réalisation, la concentration de l'hormone glucocorticoïde
est comprise
entre 0,01 mM et 0,5 mM, et de manière plus particulièrement préférée entre
0,02 mM et
0,1 mM et la concentration de l'inducteur d'autophagie est comprise entre 10
M et 30
M.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les CSH sont mises en présence
d'une hormone glucocorticoïde, de préférence la dexaméthasone, et d'un
inducteur
d'autophagie, de préférence le SMER28, dès le premier jour de culture ou avant
10 jours
de culture. De préférence, selon ce mode de réalisation, la concentration de
l'hormone
glucocorticoïde est comprise entre 0,01 mM et 0,5 mM, de préférence environ
0,1 mM,
et la concentration de l'inducteur d'autophagie est comprise entre 2 M et 30
M, de
préférence environ 2 M.
Les CSH sont de préférence maintenues dans un milieu de culture comprenant une
hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie, et optionnellement un
activateur
de la voie HIF, durant au moins 10 jours. De manière plus particulièrement
préférée, les
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CSH sont maintenues dans un milieu de culture comprenant une hormone
glucocorticoïde
et un inducteur d'autophagie durant au moins 20, 30, 40, 50 ou 60 jours.
Il est entendu que, durant cette étape, la culture cellulaire comprend non
seulement
des CSH mais également des progéniteurs érythroïdes.
Les inventeurs ont démontré que l'utilisation d'un milieu de culture
comprenant
une hormone glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie permettait
d'amplifier
considérablement la production de progéniteurs érythroïdes, qui ne s'engagent
pas dans
la voie de différentiation érythroïde terminale. Ainsi, selon le procédé selon
l'invention,
les CSH peuvent être cultivées dans le milieu de culture comprenant une
hormone
glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie durant au moins 60, 70, 80, 90 ou
100 jours.
De préférence, les CSH sont cultivées dans le milieu de culture comprenant une
hormone
glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie durant au maximum de 70, 80, 90
ou 100
jours.
La durée de culture des CSH et le temps de mise en contact avec une hormone
glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie, et optionnellement un activateur
de la voie
HIF, peuvent être aisément définis par l'homme du métier en évaluant la
proportion de
progéniteurs érythroïdes présents dans la population cellulaire. De
préférence, les CSH
sont mises en contact avec une hormone glucocorticoïde et un inducteur
d'autophagie
jusqu'à obtenir une population comprenant au moins 90 A de progéniteurs
érythroïdes,
de préférence au moins 95% de progéniteurs érythroïdes, de manière encore
préférée au
moins 99% de progéniteurs érythroïdes.
La culture peut être maintenue jusqu'à l'apparition de marqueurs de la
maturation
en érythrocytes matures. De préférence, la culture est stoppée lorsque les
cellules ne
s'amplifient plus et/ou que moins de 10% d'entre elles, de préférence moins de
5%
d'entre-elles expriment le récepteur membranaire CD117. Alternativement, la
culture
peut être stoppée lorsqu'au moins 90 /0, de préférence au moins 95% des
cellules en
culture ont atteint le stade d'érythroblaste polychromatophile ou sont à un
stade de
différenciation plus avancé.
Selon certains modes de réalisation, le procédé peut comprendre l'alternance
de
phases de culture durant lesquelles le milieu de culture comprend une hormone
glucocorticoïde et un inducteur d'autophagie, et optionnellement un activateur
de la voie
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HIF, et de phases de culture durant lesquelles le milieu de culture ne
comprend pas
d'hormone glucocorticoïde, d'inducteur d' autophagie, et/ou d'activateur de la
voie HIF.
L'hormone glucocorticoïde, l'inducteur d' autophagie et l'activateur de la
voie
HIF, peuvent être ajoutés ou retirés du milieu de culture de façon simultanée
ou
séquentielle.
Les techniques pour modifier la composition d'un milieu de culture sont bien
connues de l'homme du métier. En particulier, l'ajout d'une molécule ou
l'augmentation
de sa concentration peut se faire directement dans le milieu de culture
préexistant et le
retrait d'une molécule ou la diminution de sa concentration peut se faire par
centrifugation
des cellules et resuspension dans un nouveau milieu de culture ou par dilution
du milieu
de culture.
Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape de
récupération
des progéniteurs érythroïdes obtenus. Cette étape peut se faire par toute
technique connue
de l'homme du métier, notamment par centrifugation et élimination du milieu de
culture.
Le procédé de l'invention peut également comprendre une étape de tri
cellulaire, en
particulier une étape de sélection des cellules basée sur l'expression du
marqueur CD117.
Les cellules CD117+ peuvent être sélectionnées afin de prolonger
l'amplification des
progéniteurs érythroïdes. A l'inverse, les cellules CD117- peuvent être
sélectionnées pour
produire des globules rouges.
Le procédé selon l'invention peut également comprendre une étape de lavage des
progéniteurs érythroïdes obtenus/récupérés. Cette étape peut se faire par
toute technique
connue de l'homme du métier, notamment par une succession d'étapes de
centrifugation
et resuspension.
Selon un aspect particulier, l'invention concerne également une population de
progéniteurs érythroïdes obtenus par le procédé de l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention concerne également l'utilisation de
progéniteurs
érythroïdes obtenus par le procédé selon l'invention pour la production
d'érythrocytes.
Tel qu'utilisés ici les termes globule rouge , globule rouge mature ,
hématie , érythrocyte et érythrocyte mature sont équivalents et
peuvent être
employés l'un pour l'autre. Le terme de érythrocyte se réfère à une
cellule énucléée
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présentant des marqueurs caractéristiques de la maturation érythrocytaire. Ils
expriment
notamment la glycophorine A (CD235a) mais n'expriment pas le marqueur CD36.
La présente invention concerne ainsi un procédé in vitro de production
d'érythrocytes comprenant :
- la production de progéniteurs érythroïdes selon le procédé de l'invention
décrit
ci-dessus ; et
- l'induction de la maturation des progéniteurs érythroïdes.
Les modes de réalisation décrits ci-dessus pour le procédé de production de
progéniteurs érythroïdes selon l'invention sont également envisagés dans cet
aspect.
La maturation des progéniteurs érythroïdes peut se traduire notamment par
l'expression des marqueurs de maturation érythrocytaire tels que CD235a et par
l'énucléation.
Le procédé de l'invention peut également comprendre une étape de tri
cellulaire,
en particulier une étape de sélection des cellules CD117-.
La maturation des progéniteurs peut être induite par toute méthode connue de
l'homme du métier. La maturation peut notamment être induite par culture des
progéniteurs érythroïdes dans un milieu de différenciation érythrocytaire, par
exemple un
milieu supplémenté en érythropoïétine et optionnellement en SMER28. De
préférence,
la maturation est induite par culture des progéniteurs érythroïdes dans un
milieu ne
comprenant pas de SCF (Stem Cell Factor), ni de dexaméthasone, et supplémenté
en
érythropoïétine (environ 2,5 UI/mL) ainsi qu'optionnellement en SMER28
(environ
2,5 M). Alternativement, la maturation est induite en plaçant les cellules
dans un milieu
de culture sans sérum. De préférence, la maturation des progéniteurs est
induite à
concentration cellulaire élevée, par exemple supérieure à 5 000 000
cellules/mi de culture.
Selon un mode de réalisation, le procédé de production d'érythrocytes selon
l'invention comprend en outre une étape d'élimination des cellules nucléées.
Cette étape
permet d'obtenir une population homogène comprenant uniquement des
érythrocytes
matures.
Selon un mode de réalisation particulier dans lequel les CSH utilisées dans le
procédé de production des progéniteurs érythroïdes selon l'invention
comprennent un
gène suicide inductible, cette étape d'élimination des cellules nucléées peut
être réalisée
par induction de l'expression de ce gène suicide.
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Le procédé de production d' érythrocytes peut en outre comprendre une étape de
récupération des érythrocytes obtenus. Cette étape peut se faire par toute
technique
connue de l'homme du métier, notamment par filtration, centrifugation et
élimination du
milieu de culture.
5 Le procédé
selon l'invention peut également comprendre une étape de lavage des
érythrocytes obtenus/récupérés. Cette étape peut se faire par toute technique
connue de
l'homme du métier, notamment par une succession d'étapes de filtration,
centrifugation
et resuspension.
10 Selon un
autre aspect, la présente invention concerne également une population
d'érythrocytes obtenus par le procédé de l'invention.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une
composition
pharmaceutique comprenant des progéniteurs érythroïdes obtenus selon le
procédé de
15 l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne également des progéniteurs érythroïdes selon l'invention,
ou une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs érythroïdes
selon
l'invention, pour une utilisation en tant que greffon hématopoïétique. Tel
qu'utilisé ici, le
terme greffon hématopoïétique se réfère à un ensemble de cellules destinées
à être
20
administrées au niveau de la moelle osseuse d'un sujet et capables de produire
des
érythrocytes.
L'invention concerne également des progéniteurs érythroïdes selon l'invention,
ou une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs érythroïdes
selon
l'invention, pour une utilisation dans le traitement d'une anémie.
25 Tel
qu'utilisé ici, le terme anémie se réfère à une anomalie de l'hémogramme
caractérisée par un niveau anormalement bas de globules rouges sains et une
diminution
du taux d'hémoglobine circulante en deçà des valeurs normales pour l'âge du
sujet. A titre
indicatif, une anémie est généralement caractérisée par un taux d'hémoglobine
inférieur à
13g/dL pour un homme, inférieur à 12g/dL pour une femme, inférieur à 11 g/dL
pour un
enfant et inférieur à 14 g/dL pour un nouveau-né.
Les anémies peuvent avoir des causes variées et multiples. Des exemples
d'anémies incluent, mais ne sont pas limités à, une anémie liée à une
hémorragie (par
exemple une hémorragie causée par un traumatisme ou une opération
chirurgicale), une
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anémie induite par un traitement médicamenteux (par exemple une
chimiothérapie) ou
une exposition à des toxiques (par exemple des agents lipolytiques, des agents
oxydants,
le plomb, des venins ou poisons), une anémie hémolytique causée par une
anomalie
héréditaire de la membrane érythrocytaire (par exemple une sphérocytose
héréditaire, une
elliptocytose héréditaire ou une pyropoïkilocytose héréditaire), une anémie
hémolytique
causée par une anomalie acquise de la membrane érythrocytaire (par exemple une
hémoglobinurie paroxystique nocturne ou une acanthocytose, une anémie
hémolytique
auto immune (par exemple un accident transfusionnel), une anémie causée par un
agent
infectieux (par exemple le paludisme, une infection par Babesia ou Bartonella,
une
trypanosomiase, une leishmaniose viscérale, une septicémie ou une infection
par le
CMV), une anémie sidéroblastique héréditaire ou acquise, une anémie causée par
une
insuffisance médullaire (par exemple aplasies médullaires, carence en vitamine
B12,
myélodysplasies ou envahissement médullaire par une hémopathie maligne
(leucémie,
lymphome, métastase), ou encore une anémie liée à une drépanocytose ou un
syndrome
thalassémique. De préférence, l'anémie est liée à une drépanocytose ou à un
syndrome
thalassémique.
L'invention concerne encore une méthode de traitement d'un patient souffrant
d'une anémie comprenant l'administration audit patient d'une quantité
thérapeutiquement efficace de progéniteurs érythroïdes obtenus par le procédé
de
l'invention, ou d'une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs
érythroïdes obtenus selon l'invention.
L'invention concerne également l'utilisation de progéniteurs érythroïdes
obtenus
selon l'invention, ou une composition pharmaceutique comprenant lesdits
progéniteurs
pour la préparation d'un médicament, en particulier un médicament biologique,
destiné
au traitement d'une anémie.
Tel qu'utilisé ici, le terme de médicament biologique se réfère à un
médicament dont la substance active est produite à partir dune source
biologique ou en
est extraite.
De préférence, dans cet aspect, les progéniteurs érythroïdes sont obtenus à
partir
de CSH non génétiquement modifiées.
Tel qu'utilisés ici, les termes sujet et patient sont équivalents et
peuvent
indifféremment être employés l'un pour l'autre. Ces termes font de préférence
référence
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à un animal, en particulier un mammifère, de manière tout particulièrement
préférée un
humain, notamment, un foetus, un nouveau-né, un enfant, un adolescent, un
adulte ou une
personne âgée. Tel qu'utilisé ici, le terme foetus se réfère à un stade de
développement
intra-utérin de plus de 8 semaines de grossesse, le terme nouveau-né se
réfère à un
être humain âgé de moins de 12 mois, le terme enfant se réfère à un être
humain âgé
de 1 à 12 ans, le terme adulte se réfère à un être humain âgé de 12 à 60
ans et le terme
personne âgée se réfère à un être humain âgé de 60 ans ou plus.
Le patient est de préférence un patient en échec de transfusion,
polytransfusé, ou
présentant un groupe sanguin rare. Selon un mode préféré, ce patient souffre
d'une
anémie, en particulier une anémie liée à une drépanocytose ou à un syndrome
thalassémique.
Tel qu'utilisé ici, le terme échec de transfusion se réfère à une
transfusion
inefficace et/ou induisant des complications pathologiques chez le patient.
Une transfusion érythrocytaire peut être considérée comme inefficace lorsque,
24
heures après une transfusion de concentrés de globules rouges (CGR), le
rendement
transfusionnel est inférieur à 80%.
Le rendement transfusionnel érythrocytaire (RTE) est calculé par la formule :
(taux .48 apts transfusion) - {taux Hb avant transfusion)
RTE e2 X100
{partite d'HO transfusee I VST du patient
La quantité d'HB transfusée minimale est de 40g, la moyenne constatée est de
50g. VST désigne le volume sanguin total.
Les complications pathologiques associées à un échec transfusionnel peuvent
être
la conséquence d'une transfusion immunisante (allo immunisation
transfusionnelle) qui
peut se révéler des années après et compromettre l'avenir transfusionnel du
patient. En
effet, lors d'une nouvelle transfusion, l'immunisation antérieure peut soit
provoquer un
danger hémolytique direct (si les anticorps sont présents à un titre
suffisant), soit, le plus
souvent, provoquer une hémolyse retardée (si les anticorps sont présents à un
titre faible
ou même non décelable sérologiquement lors de la nouvelle transfusion).
Tel qu'utilisé ici, le terme polytransfusé se réfère à un patient ayant
subi
plusieurs transfusions sanguines et/ou à un patient ayant déjà eu une
transfusion sanguine
et devant en recevoir une autre.
Tel qu'utilisé ici, le terme groupe sanguin rare se réfère à un groupe
sanguin
dont la fréquence dans la population française et/ou européenne et/ou mondiale
est
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inférieure à 1/250 et/ou à un groupe sanguin dont le patient qui le porte ne
peut pas être
transfusé par du sang 0-. Les sangs rares présentent des difficultés
d'approvisionnement.
Dans le domaine des applications vétérinaires, le sujet de l'invention peut
être un
animal non-humain, de préférence un animal de compagnie ou d'élevage, par
exemple
.. sélectionné dans le groupe constitué des chiens, chats, bovins, ovins,
lapins, porcs,
caprins, équidés, rongeurs, primates non-humains et volailles.
Tel qu'utilisé ici, le terme traitement se réfère à tout acte visant une
amélioration ou disparition des symptômes, un ralentissement de la progression
de la
maladie, un arrêt de l'évolution de la maladie ou une disparition de la
maladie. Ce terme
se réfère plus particulièrement à une augmentation du niveau de globules
rouges sains et
du taux d'hémoglobine circulante, de préférence pour atteindre des valeurs
normales pour
l'âge du sujet. Ce terme englobe aussi bien le traitement préventif que
curatif. Le terme
quantité thérapeutiquement efficace tel qu'utilisé ici, se réfère à une
quantité
suffisante pour avoir un effet sur au moins un symptôme de la pathologie, et
plus
particulièrement pour augmenter le niveau de globules rouges sains et du taux
d'hémoglobine circulante chez le sujet traité.
Tel qu'utilisé ici, les termes véhicule pharmaceutiquement acceptable et
support pharmaceutiquement acceptable sont équivalents et se réfèrent à toute
substance autre qu'un principe actif présent dans une composition
pharmaceutique. Son
addition est notamment destinée à faciliter la conservation et
l'administration des cellules,
sans en modifier les propriétés. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable
utilisé pour
la formulation de compositions comprenant des érythrocytes ou des progéniteurs
érythrocytaires selon l'invention peut être, par exemple, sélectionné dans le
groupe
constitué de sérum physiologique, de solution PBS additionné d'albumine
sérique
humaine, et des mélanges de ceux-ci, ou toute autre solution saline ayant une
osmolarité
adaptée à la conservation des érythrocytes et/ou des progéniteurs et, de
préférence,
pouvant être directement administrée au sujet. Pour la formulation de
compositions
comprenant des érythrocytes, un milieu SAGM (Saline Adénine Glucose Mannitol)
peut
également être utilisé comme véhicule pharmaceutiquement acceptable, seul ou
en
combinaison avec les autres véhicules pharmaceutiquement acceptable listés ci-
dessus.
De préférence, l'administration des progéniteurs, ou greffe, est réalisée au
niveau
de la moelle osseuse du patient ou par injection intraveineuse.
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Selon un mode de réalisation préférée, les cellules souches hématopoïétiques
utilisées pour produire les progéniteurs érythroïdes sont issues d'un
prélèvement réalisé
chez un donneur ou dérivent de cellules obtenues chez un donneur et les
progéniteurs
érythroïdes sont destinés à être transplantées chez un patient receveur. Le
donneur et le
receveur peuvent être le même individu (greffe autologue) ou des individus
différents
(greffe allogénique). De préférence, le donneur et le receveur sont le même
individu.
Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique ou
un médicament, en particulier un médicament biologique, comprenant des
érythrocytes
obtenus selon le procédé de l'invention et un véhicule pharmaceutiquement
acceptable.
L'invention concerne également des érythrocytes obtenus par le procédé de
l'invention ou une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes
obtenus
selon l'invention, pour la transfusion de patients souffrant d'anémie, c'est-à-
dire
nécessitant un apport en érythrocytes.
L'invention concerne encore une méthode de traitement d'un patient souffrant
d'anémie, c'est-à-dire nécessitant un apport en érythrocytes, comprenant
l'administration
d'une quantité thérapeutiquement efficaces d' érythrocytes obtenus par le
procédé de
l'invention, ou d'une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes
selon
l'invention.
L'invention concerne également des érythrocytes obtenus par le procédé de
l'invention ou une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes
obtenus
selon l'invention, pour une utilisation dans le traitement d'une anémie.
De préférence l'anémie est une anémie liée à une drépanocytose ou à un
syndrome
thalassémique.
De préférence, les patients sont en échec de transfusion, sont des
polytransfusés
ou présentent un sang rare.
Dans le cadre d'une médecine personnalisée, les érythrocytes à administrer ou
administrés au patient sont obtenus selon un procédé in vitro de production de
globules
rouges comprenant :
- l'obtention de CSH à partir d'un échantillon provenant dudit patient ;
- l'obtention de progéniteurs érythroïdes à partir desdites CSH selon le
procédé de
l'invention; et
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- l'obtention d'érythrocytes à partir desdits progéniteurs érythroïdes selon
le
procédé de l'invention.
Les CSH peuvent être obtenues à partir d'un échantillon de sang ou de moelle
osseuse du patient. Alternativement, les CSH peuvent être obtenues à partir de
CSPi
5 obtenues
par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées obtenues à
partir du patient.
Les CSH peuvent optionnellement être génétiquement modifiées tel que décrit
précédemment.
10 Selon un
autre aspect, la présente invention concerne en outre des CSH
génétiquement modifiées afin de surexprimer:
(i) un ou plusieurs gènes sélectionnés dans le groupe constitué des gènes
codant
HTERT, BMI1, c-MYC, 1-MYC et MYB, et une combinaison de ceux-ci, de préférence
HTERT et/ou BMI1, et de manière plus particulièrement préférée HTERT et BMI1 ;
et
15 (ii) un ou
plusieurs gènes de la voie EPO-R/JAK2/STAT5/BCL-XL, de préférence
sélectionnés dans le groupe constitué des gènes codant EPO-R, JAK2, STAT5P,
BCL-
XL et BCL-2, et une combinaison de ceux-ci, et de manière plus
particulièrement préférée
BCL-XL ; et/ou
(iii) un ou plusieurs gènes de la voie des CEN, de préférence sélectionnés
dans le
20 groupe
constitué des gènes codant GATA1, TAL1, KLF1, LDB1, LMO2 et SCL, et une
combinaison de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée LMO2.
Les modes de réalisation concernant les CSH utilisées dans le procédé de
production de progéniteurs érythroïdes sont également envisagées dans cet
aspect.
Selon un mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées
pour
25 surexprimer
le gène codant HTERT sous le contrôle d'un promoteur inductible et le gène
codant pour BCL-XL sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
Selon un autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement
modifiées
pour surexprimer les gènes codant HTERT, BMI1 et LMO2 sous le contrôle d'un ou
plusieurs promoteurs inductibles.
30 Selon un
autre mode de réalisation préféré, les CSH sont génétiquement modifiées
pour surexprimer les gènes codant HTERT et BMI1 sous le contrôle d'un ou
plusieurs
promoteurs inductibles et le gène codant BCL-XL sous le contrôle d'un
promoteur
constitutif.
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Les CSH génétiquement modifiées peuvent également contenir un gène suicide
tel que décrit précédemment ou être immortalisées.
La présente invention concerne également l'utilisation de CSH génétiquement
modifiées selon l'invention pour la production, de préférence in vitro, de
progéniteurs
érythroïdes et/ou d'érythrocytes, notamment selon les procédés de l'invention
décrits ci-
dessus.
Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne un milieu de
culture
cellulaire adapté aux exigences nutritionnelles des CSH, et en particulier
adapté à la
croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée
hématopoïétique, et
comprenant une hormone glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie, et
optionnellement un activateur de la voie HIF.
Les modes de réalisation concernant le milieu comprenant une hormone
glucocorticoïde et un inducteur d' autophagie, et optionnellement un
activateur de la voie
HIF, utilisé dans le procédé de production de progéniteurs érythroïdes sont
également
envisagées dans cet aspect.
L'hormone glucocorticoïde et l'inducteur d'autophagie sont tels que définis ci-
dessus concernant le procédé selon l'invention. De préférence, l'hormone
glucocorticoïde
est la dexaméthasone et/ou l'inducteur d' autophagie est le SMER28 et/ou
l'activateur de
la voie HIF est le DMOG.
La base du milieu de culture cellulaire adapté à la croissance et/ou à la
différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique peut être toute base
connue par
l'homme du métier pour subvenir aux besoins des CSH et/ou progéniteurs
érythroïdes.
Tel qu'utilisé ici, le terme croissance se réfère à la multiplication des
cellules.
Le terme différentiation se réfère à l'acquisition par les cellules
cultivées de
caractéristiques qui n'étaient pas présentes dans les cellules initialement
utilisées pour
ensemencer le milieu. Dans le cas présent, ce terme se réfère à l'acquisition
de
caractéristiques des progéniteurs érythroïdes. Un milieu adapté à la
croissance et/ou à la
différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique est donc un milieu
permettant la
différentiation des CSH en progéniteurs érythroïdes ainsi que la
multiplication des CSH
et des progéniteurs érythroïdes. Ce terme ne doit pas être confondu avec la
maturation
qui définit ici le processus par lequel les progéniteurs érythroïdes vont
devenir des
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globules rouges et qui implique notamment l'énucléation des cellules. Le
milieu adapté à
la croissance et/ou à la différentiation des cellules de la lignée
hématopoïétique ne
contient donc, de préférence, aucun composé induisant cette maturation.
La base du milieu de culture cellulaire peut notamment être un milieu de
Dulbecco
modifié selon Iscove (milieu IMDM) ou un milieu équivalent adapté aux
exigences
nutritionnelles des CSH (par exemple le milieu SFEM de Stemspan (Stemcell
technologies) ou le milieu StemMACS HSC Expansion Media XF, human,
Invitrogen),
complémenté avec de l'insuline, de la transferrine, du SCF (Stem Cell Factor),
de
l'héparine, de l'IL-3, de l'EPO, des facteurs de croissance, et/ou du sérum,
plasma, lysat
plaquettaire et/ou pool de sérum. Les composés ajoutés au milieu sont de
préférence des
composés humains obtenus par des techniques recombinantes ou de purification.
Les
concentrations de ces différents composés sont aisément déterminées par
l'homme du
métier sur la base des recommandations des fournisseurs ou des connaissances
générales
du domaine.
Tel qu'utilisé ici, le terme de pool de sérum se réfère à un mélange de
plasmas
humains AB (le plus souvent un mélange de plus de 100 plasmas différents) viro-
atténués.
Pour ce faire, des plasmas AB provenant de centres de transfusion sont
mélangés, viro-
atténués et enfin aliquotés. Le pool de sérum peut alors être utilisé frais ou
conservé
congelé.
Tel qu'utilisé ici, le terme de lysat plaquettaire se réfère à un produit
riche en
facteurs de croissance qui est obtenu à la suite de la lyse de concentrés
plaquettaires. Pour
ce faire, des concentrés plaquettaires provenant de centres de transfusion
peuvent être
mélangés avant d'être lysés. Il existe différentes méthodes de lyse bien
connues de
l'homme du métier, en particulier une lyse par ultrasons, par l'utilisation de
solvants et/ou
de détergents, ou encore par cryolyse. De préférence, les concentrés
plaquettaires sont
lysés par cryolyse. La cryolyse consiste en des cycles de
congélation/décongélation, en
général deux cycles, provoquant la rupture des plaquettes et le relargage dans
le plasma
des facteurs de croissance qu'elles contiennent. Optionnellement, la lyse peut
être suivie
d'une centrifugation et/ou d'une filtration. Le lysat plaquettaire peut alors
être utilisé frais
ou conservé congelé.
De préférence, la base du milieu selon l'invention est un milieu IMDM tel que
défini ci-dessus ou un milieu équivalent, supplémenté en:
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- transferrine, de préférence transferrine humain, à une concentration
comprise
entre environ 200 ug/mL et environ 400 ug/mL, de préférence entre environ
300 ug/mL et environ 350 ug/mL, de manière encore préférée à une
concentration d'environ 330 ug/mL ; et/ou
- insuline, de
préférence insuline humain, à une concentration comprise entre
environ 1 ug/mL et environ 50 ug/mL, de préférence entre environ 5 ug/mL
et environ 20 ug/mL, de manière encore préférée à une concentration
d'environ 10 ug/mL ; et/ou
- du sérum, plasma ou pool de sérum, de préférence humains, à une
concentration comprise entre environ 1 A et environ 10 /0, de préférence
entre
environ 3 A et environ 7 /0, de manière encore préféré à une concentration
d'environ 5%, et/ou un lysat plaquettaire, de préférence d'origine humaine, à
une concentration comprise entre environ 0,05% et environ 0,5 /0, de
préférence entre environ 0,1 A et environ 0,5 /0, de manière encore préféré
à
une concentration d'environ 0,3 %; et/ou
- héparine, de préférence héparine humaine, à une concentration comprise
entre
environ 0,5 U/mL et environ 10 U/mL, de préférence entre environ 1 U/mL et
environ 5 U/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 3
U/mL.
Optionnellement, en particulier pour un milieu de culture adapté à la
croissance
et/ou à la différentiation des cellules de la lignée hématopoïétique, le
milieu peut être
également supplémenté en:
- IL-3, de préférence IL-3 humaine, à une concentration comprise entre
environ
1 ng/mL et environ 20 ng/mL, de préférence entre environ 3 ng/mL et environ
7 ng/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 5 ng/mL;
- SCF, de préférence humain, à une concentration comprise entre environ 10
ng/mL et environ 200 ng/mL, de préférence entre environ 50 ng/mL et environ
150 ng/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 100
ng/mL; et/ou
- EPO, de préférence humaine, à une concentration comprise entre environ 0,5
IU/mL et environ 10 IU/mL, de préférence entre environ 1 IU/mL et environ
5 IU/mL, de manière encore préférée à une concentration d'environ 2 IU/mL.
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Dans un mode de réalisation particulier, la base du milieu de culture selon
l'invention est de préférence un milieu IMDM tel que défini ci-dessus ou un
milieu
équivalent, et comprend de la transferrine, de l'insuline, de l'héparine, et
du sérum,
plasma, pool de sérum ou lysat plaquettaire, de préférence la transferrine, de
l'insuline,
de l'héparine et du pool de sérum ou un lysat plaquettaire, de manière plus
particulièrement préférée, de la transferrine, de l'insuline, de l'héparine et
un lysat
plaquettaire. Ces composés sont de préférence utilisés à des concentrations
telles que
décrites ci-dessus.
Dans un mode de réalisation préféré, ce milieu comprend en outre de l'IL-3, du
SCF et de l'EPO, de préférence à des concentrations telles que décrites ci-
dessus.
Alternativement, le milieu peut comprendre du SCF et de l'EPO, de préférence à
des concentrations telles que décrites ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier, la base du milieu selon l'invention
comprend :
- de la transferrine, de préférence de la transferrine humain, à une
concentration
comprise entre 300 ug/mL et 350 ug/mL;
- de l'insuline, de préférence de l'insuline humain, à une concentration
comprise
entre 5 ug/mL et 20 ug/mL ;
- du sérum, plasma ou pool de sérum, de préférence humains, à une
concentration comprise entre 3 A et 7 /0, et/ou un lysat plaquettaire, de
préférence d'origine humaine, à une concentration comprise entre 0,1 A et 0,5
%; et
- de l'héparine, de préférence de l'héparine humaine, à une concentration
comprise entre 1 U/mL et 5 U/mL,
et optionnellement,
- de l'IL-3, de préférence de l'IL-3 humaine, à une concentration comprise
entre
3 ng/mL et 7 ng/mL;
- du SCF, de préférence humain, à une concentration comprise entre 50 ng/mL
et 150 ng/mL ; et/ou
- de l'EPO, de préférence humaine, à une concentration comprise entre 1
IU/mL
et 5 IU/mL.
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Le milieu selon l'invention comprend, ajouté à cette base, (i) un inducteur
d'autophagie, de préférence du SMER-28, (ii) une hormone glucocorticoïde, de
préférence de la dexaméthasone, et optionnellement (iii) un activateur de la
voie HIF, de
5 préférence du DMOG.
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu selon l'invention
comprend,
ajouté à cette base:
- une hormone glucocorticoïde, de préférence de la dexaméthasone, à une
concentration comprise entre 0,001 mM et 10 mM, de préférence entre 0,002
10 mM et 1 mM,
de manière encore préférée entre 0,005 mM et 0,5 mM, et de
manière tout particulièrement préférée entre 0,01 mM et 0,1 mM ; et
- un inducteur d'autophagie, de préférence du SMER-28, à une concentration
comprise entre 0,1 M et 100 M, de préférence entre 0,5 M et 50 M, de
manière encore préférée entre 1 M et 30 M, et de manière tout
15 particulièrement préférée entre 2 M et 30 M ; et
- optionnellement, un activateur de la voie HIF, de préférence du DMOG, à
une
concentration comprise entre 1 M et 1000 M, de préférence entre 10 M et
500 M, de manière encore préférée entre 50 M et 400 M, et de manière
tout particulièrement préférée entre 75 M et 350 M.
20 Dans un
mode de réalisation particulier, le milieu selon l'invention comprend
entre 0,005 mM et 0,5 mM d'une hormone glucocorticoïde, de préférence de la
dexaméthasone, entre 0,5 M et 50 M d'un inducteur d'autophagie, de
préférence du
SMER-28, et optionnellement entre 50 M et 400 M d'un activateur de la voie
HIF, de
préférence du DMOG.
25 Dans un
autre mode de réalisation particulier, le milieu selon l'invention
comprend entre 0,01 mM et 0,1 mM d'une hormone glucocorticoïde, de préférence
de la
dexaméthasone, entre 2 M et 30 M d'un inducteur d'autophagie, de préférence
du
SMER-28, et optionnellement entre 75 M et 350 M d'un activateur de la voie
HIF, de
préférence du DMOG.
De préférence, le milieu selon l'invention ne comprend pas de sérum d'origine
non humaine (par exemple du sérum de veau foetal), de thrombopoïétine, de
facteur de
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croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), d'IL-6, de BMP (protéine
osseuse
morphogénétique), de FLT3-ligand et/ou d'hydrocortisone.
La présente invention concerne également l'utilisation du milieu de culture
cellulaire selon l'invention et tel que décrit ci-dessus pour la production
et/ou
l'amplification de progéniteurs erythroïdes et/ou la production
d'érythrocytes,
notamment selon les procédés de l'invention décrits ci-dessus, et plus
particulièrement
pour stimuler la différentiation des CSH en progéniteurs érythroïdes et/ou
pour amplifier
des progéniteurs érythroïdes.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne encore une trousse
comprenant :
- un milieu de culture cellulaire selon l'invention; et/ou
- des CSH génétiquement modifiées selon l'invention ou des constructions
génétiques permettant d'obtenir les CSH génétiquement modifiées selon
l'invention; et
- optionnellement, un guide contenant des instructions pour l'utilisation
d'une
telle trousse.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une trousse selon
l'invention pour produire des progéniteurs érythroïdes et/ou des érythrocytes,
notamment
selon les procédés de l'invention décrits ci-dessus.
Toutes les références citées dans cette demande, y compris les articles de
journaux
ou les résumés, les demandes de brevets publiées, les brevets délivrés ou tout
autre
référence, sont entièrement incorporées ici par référence, ce qui inclus tous
les résultats,
tables, figures et textes présentés dans ces références.
Bien qu'ayant des sens différents, les termes comprenant , ayant ,
contenant et consistant en peuvent être remplacés l'un par l'autre dans
toute la
description de l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la
lecture
des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.
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EXEMPLES
Exemple 1 : Amplification de progéniteurs érythroïdes à partir de CSH issues
de
sang de cordon et de cytaphérèse
Matériels et méthodes
Milieu utilisé : Milieu IMDM (Biochrom), supplémenté en transferrine (330
ug/mL), insuline (10 ug/mL), pool de sérum AB (EFS) 5% et héparine (3 U/mL).
De JO
à J7, le milieu a été supplémenté en IL-3 (5 ng/mL), SCF (100 ng/mL) et EPO (2
IU/mL).
A partir de J7 et jusqu'à la fin de l'amplification des progéniteurs
érythroblastiques le
milieu a été supplémenté en SCF (100 ng/mL) et EPO (2 IU/mL).
CSH :
Elles sont obtenues après une séparation magnétique grâce à des billes CD34+
selon le
protocole fourni par Milenyi (cf. CD34 MicroBead Kit human de Miltenyi
Biotec).
Entretien des cellules :
A JO les cellules ont été ensemencées à une concentration de 10 000
cellules/ml,
à J4 les cellules ont été diluées au 1/5 dans du milieu neuf, à J7 les
cellules ont été lavées
et mises en culture à 100 000 cellules/mi dans du milieu neuf. A J11 les
cellules ont été
diluées à 100 000 cellules/mi et ensemencées dans un milieu neuf. A J14 les
cellules ont
été réensemencées à 300 000 cellules/mi dans un milieu neuf. A J18 les
cellules ont été
diluées à 0,5 million/ml. A partir de J21 les cellules ont été
systématiquement remises à
1 million/mi à chaque jour d'entretien (i.e. deux fois par semaine).
Protocoles de culture :
Protocole 1: De JO à J11 les cellules sont cultivées dans le milieu de base. A
J11
le milieu utilisé est supplémenté avec 253,9 litM de DMOG. A J14 le milieu
utilisé est
additionné de 333 litM de DMOG, de 0,02 mM de DEX (dexaméthasone) et de 30
litM
de SMER28. Le milieu utilisé à J18 est complété par 0,09 mM de DEX et 20,1
litM de
SMER28. A J21, 0,10 mM de DEX et 24,5 litM de SMER28 ont été ajoutés au milieu
utilisé, celui de J25 a été additionné de 0,10 mM de DEX et de 17,4 litM de
SMER28.
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Enfin, à partir du 28ème jour, le milieu a été systématiquement supplémenté
avec 0,10
mM de DEX et 13,8 ILEM de SMER28.
Protocole 2 : de JO à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0,1
mM de
DEX et 2,27 M de SMER28.
Protocole 3 : de JO à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0,1
mM de
DEX.
Protocole 4 : ce protocole est le protocole contrôle, il a été réalisé avec le
milieu
de base sans addition de facteur.
Cytométrie de flux :
Un échantillon de 100 000 cellules est prélevé et lavé, les cellules sont
alors mises en
présence des anticorps CD235a et CD117, selon les instructions du fournisseur.
Après 30
min à température ambiante et dans le noir, les cellules sont lavées 2 fois
avec du PBS.
Les cellules sont alors prêtes pour être analysées au cytomètre.
L'anticorps CD235a reconnait spécifiquement la glycophorin A qui signe
l'engagement
érythroïde mature ;
L'anticorps CD117 reconnait spécifiquement le récepteur c-kit (ie le récepteur
au Stem
cell factor) qui signe l'immaturité, la souchitude et la capacité d' auto-
renouvèlement des
cellules
Comptage des cellules :
Les cellules sont diluées au dixième dans une solution de bleu trypan, ce qui
permet
d'évaluer la mortalité cellulaire si besoin.
Résultats
Protocole 1 Protocole 2
Protocole 3 Protocole 4
amplification progén iteurs
é ryth roïd es/ 9,00.107 9,19.107 2,47.107
3,47.105
CD34+ de cytaphérèse à J58
amplification progén iteurs
é ryth roïd es/
7,73.1010 3,64.1010 ND 2,94.107
CD34+ de sang de cordon à
J78
Tableau 1 : Comptage des cellules après culture selon différents protocoles
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Les protocoles 1 et 2 permettent une amplification exponentielle des
érythroblastes. L' amplification obtenue avec les protocoles 1 et 2 est
également largement
supérieure à celle obtenue avec de la dexaméthasone seule (cf. tableau 1). Il
est également
intéressant de noter que les protocoles 1 et 2 permettent une amplification de
progéniteurs
érythroïdes à partir de cellules CD34+ issues de cytaphérèse ou de sang de
cordon.
Le marqueur C-KIT perdure dans ces conditions beaucoup plus longtemps que
dans les conditions contrôles (cf. figure 1), ce marqueur membranaire signe la
jeunesse
des cellules ainsi que leur capacité à proliférer.
Ces travaux ont ainsi permis de démontrer que la culture des cellules souches
hématopoïétiques humaines dans un milieu de culture selon l'invention permet
d'obtenir:
- des cellules ayant un engagement érythroïde total ;
- un enrichissement et une amplification exponentielle des progéniteurs
érythroïdes.
En particulier, l'amplification peut durer jusqu'à 78 jours.
Exemple 2 : Amplification de progéniteurs érytrhoïdes à partir de CSH
ingéniérées
issues de cytaphérèse surexprimant de manière inductible HTERT, BMI1 et de
manière constitutive BCL-XL ou surexprimant de manière inductible HTERT,
BMI1 et LMO2
Matériels et méthodes
Milieu utilisé : Milieu IMDM (Biochrom), supplémenté en transferrine (330
ug/mL), insuline (10 ug/mL), pool de sérum AB (EFS) 5% et héparine (3 U/mL).
De JO
à J7, le milieu a été supplémenté en IL-3 (5 ng/mL), SCF (100 ng/mL) et EPO (2
IU/mL).
A partir de J7 et jusqu'à la fin de l'amplification des progéniteurs
érythroblastiques le
milieu a été supplémenté en SCF (100 ng/mL) et EPO (2 IU/mL).
CSH :
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Les CSH sont obtenues à partir de cytaphérèses après une séparation magnétique
grâce à des billes CD34+ Miltenyi.
Entretien des cellules :
5 A JO les
cellules ont été ensemencées à une concentration de 100 000 cellules/ml,
pour deux infections successives avec le surnageant lentiviral HTERT BMI1 et
le
surnageant rétroviral BCL-XL ou le surnageant lentiviral HTERT BMI1 et le
surnageant
lentiviral LM02; à J3 les cellules ont été lavées 3 fois et réensemencées à
une
concentration de 10 000 cellules/ml, à J4 les cellules ont été diluées au 1/5
dans du milieu
10 neuf. A J7
les cellules ont été lavées et mises en culture à 100 000 cellules/mi dans du
milieu neuf. A J11 les cellules ont été diluées à 100 000 cellules/mi et
ensemencées dans
un milieu neuf. A J14 les cellules ont été réensemencées à 300 000 cellules/mi
dans un
milieu neuf. A J18 les cellules ont été diluées à à 0,5 million/ml. A partir
de J21 les
cellules ont été systématiquement remises à 1 million/mi à chaque jour
d'entretien (ie
15 deux fois par semaine).
Protocoles de culture :
Protocole 1: De JO à J11 les cellules sont cultivées dans le milieu de base. A
J11
le milieu utilisé est supplémenté avec 253,9 ILEM de DMOG. A J14 le milieu
utilisé est
20 additionné
de 333 ILEM de DMOG, de 0,02 mM de DEX (dexaméthasone) et de 30 ILEM
de SMER28. Le milieu utilisé à J18 est complété par 0,09 mM de DEX et 20,1
ILEM de
SMER28. A J21, 0,10 mM de DEX et 24,5 ILEM de SMER28 ont été ajoutés au milieu
utilisé, celui de J25 a été additionné de 0,10 mM de DEX et 17,4 ILEM de
SMER28. Enfin,
à partir du 28' jour le milieu a été systématiquement supplémenté avec 0,10 mM
de
25 DEX et 13,8 ILEM de SMER28.
Protocole 2 : de JO à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0,1
mM de
DEX et 2,27 M de SMER28.
Protocole 3 : de JO à la fin de la culture le milieu est complémenté par 0,1
mM de
DEX.
30 Protocole
4: ce protocole est le protocole contrôle, il a été réalisé avec le milieu
de base sans addition de facteur.
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Résultats
amplification progéniteurs érythroïdes/CD34+
Protocole 1 Protocole 2 Protocole 3 Protocole 4
CD34+ HTERT
1,06.108 1,82.108 5,12.106 8,50.105
BMI1 LMO2
CD34+ HTERT
1,59.106 1,06.109 5,76.105 6,92.105
BMI1 BCL-XL
Tableau 2: Comptage de cellules à J65 après culture selon différents
protocoles
Les protocoles 1 et 2 permettent une amplification exponentielle des
érythroblastes avec les deux modèles de CSH ingéniérées (cf. tableau 2). L'
amplification
obtenue avec les protocoles 1 et 2 est également largement supérieure à celle
obtenue
avec de la dexaméthasone seule.
Le marqueur C-KIT perdure dans ces conditions beaucoup plus longtemps que
dans les contrôles, ce marqueur membranaire signe la jeunesse des cellules
ainsi que leur
capacité à proliférer (cf. figures 2 et 3). Le protocole 2 permet une
amplification
supérieure avec les deux types de CSH ingéniéries.
Ces amplifications sont remarquables car les cellules ingéniérées sont des
CD34+ issues
de cytaphérèse qui sont connues pour leur faible taux d'amplification (par
rapport au
CD34+ de sang de cordon).
Avec ces protocoles de cellules ingéniérées, des cellules CD34+ issues de
cytaphérèse
acquièrent des capacités d'amplification supérieures à des cellules CD34+
issues de sang
de cordon.
