Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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Procédé de dépôt de nanoobjets à la surface d'un gel polymérique
de rigidité uniforme
La présente invention concerne un procédé de dépôt de nanoobjets à la surface
d'un gel polymérique de rigidité uniforme, le gel susceptible d'être obtenu et
ses
applications.
Dans de nombreux domaines, en particulier en biologie, en pharmaceutique, ou
en
diagnostic, des dispositifs comprenant un substrat dont la surface comprend
des
nanoobjets (protéines, nanoparticules...) sont recherchés.
Il est relativement aisé de déposer des nanoobjets à la surface d'un substrat
"dur"
comme le verre ou le silicium. Toutefois, afin de renforcer les forces de
liaison entre la
surface et les nanoobjets et ainsi de prolonger la durée de vie du dispositif,
on cherche à
remplacer le verre ou le silicium par des substrats plus mous, comme des gels
à base de
matrice polymériques, tels que les hydrogels.
La densité d'un gel à base d'une matrice polymérique est directement liée à sa
porosité. Plus un gel est poreux, moins il est rigide, et réciproquement.
Contrôler la densité surfacique de nanoobjets déposés à la surface de gels est
un
enjeu dans le domaine de la culture cellulaire, où l'on souhaite cultiver les
cellules à la
surface de substrats de rigidité physiologique (de l'ordre du kPa) tout en
conservant le
contrôle quantitatif de la chimie de surface. Ce besoin est particulièrement
prégnant pour
l'ingénierie des cellules souches et émerge dans le domaine du criblage
pharmacologique.
Les cellules adaptent leurs réponses biochimiques à la rigidité de leur
environnement en
sus de l'adapter à leur environnement chimique, il existe donc un besoin de
contrôler de
façon indépendante les propriétés de rigidité et chimiques des supports de
culture
cellulaire in vitro et des supports implantables.
Les procédés de dépôts de nanoobjets à la surface des gels existants dépendent
de la structure chimique du gel. Plus précisément, trois techniques sont
utilisées.
Selon une première technique, les monomères utilisés pour préparer le polymère
de la matrice polymérique sont modifiés pour inclure le nanoobjet. Dans ce
cas, un
contrôle de la densité surfacique du polymère obtenu est possible, mais la
densité
surfacique de nanoobjets sur le gel obtenu est directement liée à la
rigidité/à la porosité
du gel.
Les deux autres techniques sont basées sur un dépôt puis greffage des
nanoobjets à la surface du gel totalement ou partiellement solvate:
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- une solution de nanoobjets est mise en présence du gel dont la surface a
éventuellement été préalablement activée (par greffage d'un intermédiaire
réactionnel
et/ou par rayonnement) ; ou
- les nanoobjets sont modifiés pour les rendre réactifs avec la surface du gel
puis
ajoutés sous forme de solution à la surface du gel.
Dans ces deux cas, la densité surfacique de nanoobjets greffés est dépendante
de
la porosité/de la rigidité du gel dès que le procédé inclut une étape de
séchage partiel, ce
qui est généralement inévitable, par exemple lorsqu'on retire la solution de
nanoobjets
pour réaliser la réaction de greffage des nanoobjets. En effet, les gels sont
des matériaux
poreux, et de ce fait très sensibles à la déshydratation : les temps
caractéristique de
séchage sont généralement de l'ordre de quelques secondes (typiquement pour un
gel de
rigidité de l'ordre de 0,1kPa) à quelques minutes (typiquement pour un gel de
rigidité de
l'ordre de 25 kPa) suivant la porosité/la rigidité du gel. En revanche, si le
gel est maintenu
totalement solvate au cours du procédé, la densité surfacique de nanoobjets
déposés est
indépendante de la rigidité/porosité du gel. Toutefois, le rendement de dépôt
des
nanoobjets est très faible étant donné la faible probabilité que les
nanoobjets
s'approchent de la surface du gel et interagissent avec celle-ci, car ces deux
techniques
sont limitées par la diffusion des nanoobjets vers la surface. Ainsi, ces deux
techniques
ne permettent pas de contrôler facilement la densité surfacique en nanoobjets
déposés.
Il existe donc un besoin de développer un procédé de dépôt de nanoobjets à la
surface d'un gel qui permettent de contrôler la densité surfacique en
nanoobjets déposés,
sans qu'elle ne dépende de la rigidité du gel.
A cet effet, selon un premier objet, l'invention concerne un procédé de dépôt
de
nanoobjets sur la surface d'un gel comprenant les étapes de:
a) fournir un gel comprenant une matrice polymérique et un solvant au sein
de la
matrice polymérique, la matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel
susceptible de gonfler en présence dudit solvant, où la solubilité de la
matrice
polymérique à 1 bar et 25 C dans le solvant est inférieure à 1 g/L,
où le gel présente une variabilité de la rigidité à l'échelle du micromètre
inférieure à
10%, puis
b) déposer des nanoobjets à la surface du gel, lesdits nanoobjets ayant un
diamètre
moyen supérieur ou égal au diamètre moyen des pores du gel, puis
c) évaporer le solvant du gel au moins jusqu'à ce que la teneur en solvant
ne varie
plus avec le temps, sous réserve qu'au début de l'évaporation, la teneur en
sels
minéraux dans le solvant soit inférieure à 6 g/L.
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Le procédé comprend une étape a) de fourniture d'un gel comprenant une matrice
polymérique et un solvant au sein de la matrice polymérique, la matrice
polymérique
formant un réseau tridimensionnel susceptible de gonfler en présence dudit
solvant, où la
solubilité de la matrice polymérique à 1 bar et 25 C dans le solvant est
inférieure à 1 g/L.
Le gel comprend une matrice polymérique et un solvant au sein de la matrice
polymérique, la matrice polymérique formant un réseau tridimensionnel
susceptible de
gonfler en présence dudit solvant. La matrice polymérique est donc capable de
retenir
une proportion de solvant au sein de sa structure. Généralement, la teneur
maximale en
solvant au sein de la matrice polymérique du gel à 25 C (calculée comme le
ratio entre le
poids de solvant maximal par rapport à la somme du poids de solvant maximal et
du poids
de la matrice polymérique sèche) varie de 20 à 100%, de préférence de 38 à
100%.
Quand on continue à ajouter du solvant au-delà de la teneur maximale, le
solvant ajouté
n'est plus incorporé au sein de la matrice polymérique.
Le polymère de la matrice polymérique du gel peut être homopolymérique (réseau
tridimensionnel formé à partir d'un homopolymère), copolymérique (réseau
tridimensionnel formé à partir d'un copolymère) ou multipolymérique (réseau
tridimensionnel de polymères interpénétrant ( interpenetrating polymeric gel
(IPN) en
anglais).
Généralement, la matrice polymérique comprend (voire est constituée de) un
polymère choisi parmi :
- les polyacrylamides ;
- les polyéthylènes glycols, polypropylènes glycols et copolymères d'éthylène
glycol ou
de propylène glycol, ceux-ci comprenant éventuellement des motifs issus de la
polymérisation de composés (meth)acrylates;
- les polysaccharides, comprenant éventuellement des motifs répétitifs issus
de la
polymérisation de composés (meth)acrylates) ;
- les (co)polymères issus de la polymérisation de composés diacrylates et/ou
(méth)acrylates ;
- les alcools polyvinyliques comprenant des motifs répétitifs issus de la
polymérisation
de composés (meth)acrylates;
- les dextranes comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de
composés (méth)acrylates ;
- les polyfumarates de propylène et les poly (fumarate de propylène-co-
éthylène glycol);
- les polysiloxanes, comme le poly(dimethylsiloxane) (PDMS) ; et
- les combinaisons de ceux-ci.
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Les matrices polymériques à base de polyacrylamides, et en particulier issus
de la
polymérisation de l'acrylamide et du N,N'-méthylènebisacrylamide, sont
particulièrement
préférées.
Par composés (meth)acrylates , on entend des composés dérivés d'acrylate
ou
de méthacrylate, par exemple choisis parmi l'acide acrylique (AA), l'acide
méthacrylique
(MA), le diméthacrylate d'éthylène glycol (EGDMA), le méthacrylate de 2-
hydroxyéthyle
(HEMA), l'acrylate de sulfopropyle, où les acides peuvent être sous forme de
sel,
notamment de sodium ou de potassium.
Le solvant peut être tout solvant dans lequel la solubilité de la matrice
polymérique
à 1 bar et 25 C est inférieure à 1 g/L et dans lequel elle est susceptible de
gonfler.
Par exemple, le solvant peut être une solution aqueuse ou un solvant organique
choisi parmi les alcools, les alcanes (pentane, hexane par exemple), les
amines
(triéthylamine, diisopropylamine par exemple), les cétones (l'acétone par
exemple) et les
solvants aromatiques (toluène, xylène par exemple).
Dans un mode de réalisation, la matrice polymérique comprend (voire est
constituée de) polysiloxanes, comme le poly(dimethylsiloxane) (PDMS), et le
solvant est
choisi parmi le pentane, la triéthylamine, la diisopropylamine ou le xylène.
Le solvant le plus usuel est une solution aqueuse, et est de préférence de
l'eau,
éventuellement déionisée. Le gel est alors un hydrogel. Des exemples
d'hydrogel sont
fourmis dans la revue de Enas M. Ahmed (Joumal of Advanced Research, 2015, 6,
105-
121). La matrice polymérique comprend alors généralement (voire est constituée
de) un
polymère choisi parmi :
- les polyacrylamides, par exemple issues de la polymérisation de l'acrylamide
et du
N,N'-méthylènebisacrylamide ;
- les polyéthylène glycols, polypropylène glycols et copolymères d'éthylène
glycol ou
de propylène glycol, ceux-ci comprenant éventuellement des motifs issus de la
polymérisation de composés (meth)acrylates;
- les polysaccharides, comprenant éventuellement des motifs répétitifs issus
de la
polymérisation de composés (meth)acrylates) ;
- les (co)polymères issus de la polymérisation de composés diacrylates et/ou
(méth)acrylates ;
- les alcools polyvinyliques comprenant des motifs répétitifs issus de la
polymérisation
de composés (meth)acrylates;
- les dextranes comprenant des motifs répétitifs issus de la polymérisation de
composés (méth)acrylates ;
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- les polyfumarates de propylène et les poly (fumarate de propylène-co-
éthylène
glycol) ; et
- les combinaisons de ceux-ci.
La rigidité du gel fourni à l'étape a) est uniforme. Dans le gel fourni à
l'étape a),
5 l'écart type (3 des valeurs de rigidité Ri (où i varie de 1 à n) est de
préférence inférieure à
20%, typiquement inférieure à 15%, en particulier inférieure à 10%, notamment
inférieur à
5%, de préférence inférieur à 1%, les valeurs de rigidité Ri étant mesurées
par
microscopie à force atomique sur n points répartis sur toute la surface du gel
fourni à
l'étape a), n étant supérieur à 50, typiquement supérieur à 100, notamment
supérieur à
1 000, de préférence supérieur à 10 000,
l'écart type 6 étant tel que défini à la formule (I) :
G= ¨ me an) 2 (I)
où mean est la moyenne arithmétique des valeurs de rigidité Ri et est
telle que définie
à la formule (II) :
me an = ri2-1 Ri (Il).
De préférence, lesdites valeurs de rigidité Ri suivent à 10%, notamment à
5%,
de préférence à 1%, une distribution symétrique, sous réserve que la moyenne
mean
et la médiane median de ladite distribution sont telles que l'écart e
défini à la formule
(III) :
e = 2 mean-median
(III)
mean+median
est inférieur à 10%, notamment inférieur à 5%, de préférence inférieur à 1%.
L'écart type
6 des valeurs de rigidité est alors telle que définie ci-dessus, ou non.
La médiane est la valeur de rigidité median qui permet de partager la
série de
n valeurs de rigidité Ri ordonnée en deux parties de même nombre d'éléments.
L'ensemble des valeurs de rigidité Ri est alors coupé en deux parties ayant le
même
nombre d'éléments : avec d'un côté une moitié des valeurs de rigidité Ri, qui
sont toutes
inférieures ou égales à median et de l'autre côté l'autre moitié des
valeurs de rigidité
Ri, qui sont toutes supérieures ou égales à median .
Plus la valeur e est faible, plus les valeurs de rigidité Ri suivent une
distribution
symétrique. Une distribution de rigidités parfaitement symétrique a un écart e
de 0.
De préférence, lesdites valeurs de rigidité Ri suivent à 10%, notamment à
5%,
de préférence à 1%, une distribution normale, sous réserve que la moyenne
mean et
la médiane median de ladite distribution sont telles que l'écart e est
inférieur à 10%,
notamment inférieur à 5%, de préférence inférieur à 1%.
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De préférence, les n points sont répartis aléatoirement sur toute la surface
du gel.
De préférence, la variabilité de sa rigidité à l'échelle du micromètre est
inférieure à
10%, de préférence inférieure à 5%. La rigidité est mesurée à la surface du
gel sur
laquelle seront déposés les nanoobjets lors de l'étape b). Autrement dit, la
différence de
rigidité de deux points du gel distants de 1 jirn n'excède de préférence pas
10%.
De préférence, la variabilité de la rigidité du gel à l'échelle du centimètre
est
inférieure à 20%, notamment inférieure à 15% de préférence inférieure à 10%.
De manière particulièrement préférée, la variabilité de la rigidité du gel est
inférieure à 20%, notamment inférieure à 15% de préférence inférieure à 10%.
Autrement
dit, la différence de rigidité de deux points (où qu'ils soient à la surface
du gel sur laquelle
seront déposés les nanoobjets lors de l'étape b)) n'excède pas 20%, notamment
15%, de
préférence 10%.
Le gel a typiquement une surface supérieure ou égale à 1 11m2, de préférence
supérieure ou égale à 10 11m2. Des surfaces inférieures à 1 11m2 permettent
plus
difficilement de mesurer une variabilité de la rigidité. Des surfaces
inférieures à 10 11m2
permettent plus difficilement de mesurer une variabilité de la densité
surfacique en
nanoobjets lorsque la taille de ceux-ci est de 500 nm à 1000 nm. De plus, la
surface du
gel est généralement inférieure ou égale à 1000 mm2. Pour que la distribution
surfacique
des nanoobjets soit uniforme, il est en effet préférable de limiter l'impact
des forces
capillaires à l'interface entre le gel, la goutte de solvant entrain de
s'évaporer et le gaz
utilisé pour évaporer. Ces forces capillaires tendent en effet à tirer les
nanoobjets vers le
centre de la goutte et induisent un gradient de concentration des bords vers
le centre. Cet
effet peut être observé lorsque la surface du gel excède 1000 mm2.
Plus la surface du gel est importante, plus il est facile de mesurer la
rigidité sur un
nombre de points important. Généralement, plus la surface du gel est faible,
plus l'écart e
est faible.
Lorsque la surface du gel est inférieure à 80 mm2 (si la surface est
circulaire, son
diamètre est alors inférieur à 10 mm), la distribution est mesurée sur au
moins 50 points,
de préférence sur au moins 500 points et l'écart e est de préférence inférieur
à 5%, voire
même inférieure à 1%.
Lorsque la surface du gel est comprise de 80 mm2 à 1000 mm2 (si la surface est
circulaire, son diamètre est alors compris de 10 mm à 35 mm), la distribution
est de
préférence mesurée sur au moins 100 points, notamment au moins 1000 points,
idéalement au moins 10 000 points, et l'écart e est de préférence inférieur à
10%, voire
même inférieure à 5%.
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La rigidité du gel est généralement de 0,01 kPa à 500 kPa, notamment de 0,05
kPa à 100 kPa, de préférence de 0,1 kPa à 50 kPa.
La rigidité locale et donc la variabilité de rigidité peuvent être déterminées
par
microscopie à force atomique (AFM), par exemple en suivant le protocole décrit
pages 29
et 30 de la demande WO 2013/079231.
Le procédé comprend une étape b) de dépôt de nanoobjets à la surface du gel.
Les nanoobjets sont de préférence choisis parmi :
- les protéines, les peptides et leurs mélanges,
- les polysaccharides, et
- les
nanoparticules, notamment les nanoparticules de métal, de semi-conducteur ou
de polymère.
Les nanoobjets peuvent être des bactéries.
Les nanoobjets ne sont généralement pas des cellules. Dans un mode de
réalisation, les
nanoobjets ne sont pas des organismes vivants.
Le métal est notamment choisi parmi les métaux alcalins, les métaux alcalino-
terreux, les lanthanides, les actinides, les métaux de transition et les
métaux dits
pauvres , et est de préférence choisi parmi l'or, l'argent et l'indium.
Le semi-conducteur est par exemple de tellurure de cadmium (CdTe).
Les nanoparticules de polymère peuvent par exemple être en polystyrène ou en
latex.
Les protéines, peptides, polysaccharides et mélanges de ceux-ci sont les
nanoobjets préférés, notamment des protéines et/ou peptides induisant une
adhésion
cellulaire via les intégrines, une telle protéine pouvant être de la
fibronectine, du
fibrinogène, du collagène, de la laminine, de la vitronectine ou des peptides
du type RGD.
Les protéines et/ou les peptides et/ou les polysaccharides peuvent avoir été
modifiés pour
qu'ils soient porteurs d'une fonction susceptible de réagir avec la matrice
polymérique du
gel.
Le préfixe nano signifie que le diamètre moyen du nanoobjet est compris de
1
à 1000 nm, notamment de 2 à 500 nm, par exemple de 2 à 250 nm. Les
nanoparticules
d'or ont typiquement des diamètres moyens de 5 à 400 nm. Les nanoparticules
d'argent
ou d'indium ont typiquement des diamètres moyens de 2 à 10 nm.
Les nanoobjets déposés à l'étape b) ont un diamètre moyen supérieur ou égal au
diamètre moyen des pores du gel (diamètre moyen des pores lorsque les
nanoobjets sont
déposés, c'est-à-dire dans les conditions de l'étape b)). Ceci permet que les
nanoobjets
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restent à la surface du gel et ne s'enfoncent pas ou peu dans la matrice
polymérique. En
effet, si les nanoobjets peuvent pénétrer au sein du gel en proportion
significative, alors la
densité surfacique des nanoobjets déposés à la surface du gel désolvaté est
d'autant plus
importante que les pores sont petits. Dans ce cas, la densité surfacique des
nanoobjets
n'est pas indépendante de la rigidité/porosité du gel.
De préférence, les nanoobjets déposés à l'étape b) ont un diamètre moyen au
moins deux fois supérieur, notamment au moins trois fois supérieur, en
particulier au
moins quatre fois supérieur, de préférence au moins cinq fois supérieur, par
exemple au
moins dix fois supérieur au diamètre moyen des pores du gel.
Le diamètre moyen des pores du gel peut être mesuré par diffusion de neutrons
ou de rayons X aux petits angles. Il est typiquement de l'ordre de 2 à 4
angstrôms.
Le diamètre moyen des protéines ou peptides est typiquement mesuré par
électrophorèse par gel. Le diamètre moyen des polysaccharides est généralement
mesuré par chromatographie liquide sous haute pression (HPLC), couplée à la
diffusion
de lumière (ce qui permet de déterminer le rayon hydrodynamique). Le diamètre
moyen
des nanoparticules est typiquement mesuré par microscopie électronique à
transmission
ou à balayage ( transmission electron microscope (TEM) et scanning
electron
microscope (SEM) en anglais).
Généralement, lors de l'étape b), les nanoobjets sont déposés sous forme d'un
mélange comprenant les nanoobjets et un solvant. Le solvant de ce mélange peut
être
identique ou différent du solvant du gel. De préférence, le solvant du mélange
est soluble
dans le solvant du gel (soluble dans les conditions de l'étape b)). De manière
préférée, le
solvant du mélange est identique au solvant du gel.
Le mélange peut être colloïdal (les nanoobjets étant en suspension).
Le procédé peut comprendre, entre les étapes b) et c), une étape b1)
consistant à
laisser en contact les nanoobjets à la surface du gel, généralement pendant
une durée de
1 min à 24 heures, notamment 1 min à 12 heures, par exemple 5 min à 1 heure.
Lorsque
les nanoobjets sont des protéines, cette étape correspond à une incubation.
Le procédé est de préférence exempt, entre les étapes b) et c) :
- d'étape consistant à éliminer une partie des nanoobjets de la surface du
gel, par
exemple réalisée en aspirant la solution surnageante au-dessus de la surface
du gel,
et/ou
- d'étape de rinçage.
En effet, il est plus difficile de contrôler la quantité de nanoobjets
restants, et donc la
densité surfacique en nanoobjets du gel obtenu, lorsque de telles étapes sont
effectuées.
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Le procédé comprend une étape c) d'évaporation du solvant du gel au moins
jusqu'à ce que la teneur en solvant ne varie plus avec le temps.
L'évaporation du solvant d'un gel de densité uniforme comprend deux régimes
qui
sont illustrés sur les figures 1 et 2.
Pendant la première période d'évaporation ( A sur les figures 1 et 2), du
solvant
est éliminé en continu de la surface du gel par des forces capillaires et la
teneur en
solvant diminue à taux constant, ce qui s'explique par le fait que la surface
du gel est
suffisamment mouillée par le solvant et se comporte comme la surface d'un
liquide. Son
taux d'évaporation est égal à celui d'une surface liquide, qui dépend
uniquement du gaz
utilisé pour le séchage et du coefficient de transfert de la couche limite de
la surface du
gel.
Lorsque l'évaporation est poursuivie, le taux d'évaporation atteint un taux
d'évaporation critique à un temps critique d'évaporation Tc qui marque la
transition entre
les première et deuxième périodes d'évaporation.
Pendant la deuxième période d'évaporation ( B sur les figure 1 et 2), les
forces
de diffusion deviennent prédominantes par rapport aux forces de capillarité et
l'élimination
du solvant hors du gel est principalement contrôlée par la diffusion du
solvant dans les
pores du gel vers sa surface. Le taux d'évaporation du solvant n'est pas
constant dans le
temps. Il diminue jusqu'à atteindre un taux d'évaporation d'équilibre à un
temps d'équilibre
Teq au-delà duquel le gel ne peut plus être séché, c'est-à-dire que la teneur
en solvant ne
varie plus avec le temps.
Dans l'étape c) du procédé selon l'invention, l'évaporation du solvant est
effectuée
au moins jusqu'à ce temps d'équilibre Teq, qui est le temps minimal à partir
duquel la
teneur en solvant ne varie plus avec le temps.
La teneur en solvant au-delà du temps d'équilibre Teq peut être non nulle
(figure 1)
ou nulle (figure 2), et ce en fonction du gel et du solvant utilisé. Par
exemple, pour un
hydrogel (pour lequel le solvant est une solution aqueuse), la teneur en
solvant au-delà du
temps d'équilibre Teq d'une matrice polymérique hygroscopique sera non nulle,
alors que
la teneur en solvant au-delà du temps d'équilibre Teq d'une matrice
polymérique non
hygroscopique sera nulle.
Le temps d'équilibre Teq est une caractéristique de chaque gel. Il dépend de
la
nature du solvant et de la nature de la matrice polymérique (à savoir de la
nature du
polymère, mais aussi de sa porosité et donc de sa rigidité) et des conditions
de l'étape c).
Lorsque le solvant est une solution aqueuse (le gel étant alors un hydrogel),
l'évaporation du solvant est une déshydratation.
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Généralement, lors de l'étape c) :
- l'évaporation est réalisée par mise en contact du gel avec un gaz
qui est de l'air ou un
gaz inerte (tel que l'azote ou l'argon), de préférence de l'air, et/ou
- la pression est de 0,1 à 1 bar, de préférence à 1 bar, et/ou
5 - la température du gaz mis en contact avec le gel est de 4 à 90 C,
notamment de 10 à
70 C, de préférence de 15 à 40 C, en particulier à température ambiante (20 C)
ou à
37 C, et/ou
- la vitesse du gaz mis en contact est compris de 0 à 4 m/s, notamment de 0 à
1 m/s,
de préférence de l'ordre de 0,45m/s à 0,50m/s (par exemple lorsque le gel est
placé
10 sous une hotte à flux laminaire),
ces conditions étant indépendamment constantes dans le temps ou variables dans
le
temps au cours de l'étape c).
Bien sûr, plus la température est élevée et/ou plus la vitesse du gaz mis en
contact
est élevée, et plus l'évaporation du solvant, et donc l'étape c), est rapide.
Lorsque les
nanoobjets ont un diamètre moyen au moins dix fois supérieur à celui du
diamètre moyen
des pores du gel, l'accélération de l'évaporation n'impacte pas la
distribution des
nanoobjets à la surface du gel, car ceux-ci ne pénètrent pas au sein du gel.
Toutefois,
lorsque les nanoobjets ont un diamètre moyen du même ordre de grandeur que
celui du
diamètre moyen des pores du gel, l'accélération de l'évaporation permet de
limiter la
pénétration des nanoobjets au sein du gel. Des températures plus élevées et/ou
une
vitesse du gaz mis en contact plus élevée(s) sont alors à privilégier. Les
températures et
vitesse du gaz ne doivent toutefois pas être trop élevées afin de ne pas
dégrader le gel
et/ou les nanoobjets (par exemple, certaines protéines se dégradent au-delà de
certaines
températures, ou un gaz projeté à trop grande vitesse peut endommager la
surface du gel
et/ou conduire à sa fracturation/fissuration).
De préférence, au moins jusqu'au temps d'équilibre Teq, voire même pendant la
durée de l'étape c), les conditions d'évaporation sont constantes dans le
temps, c'est-à-
dire que:
- lorsque l'évaporation est réalisée par mise en contact du gel avec
un gaz:
- la nature du gaz reste identique dans le temps,
- le débit de gaz est constant à 10%, et
- la température du gaz est constante à 2 C, et
- la (dé)pression est constante à 10 /0 dans le temps (où (dé)pression
signifie
pression (P 1 bar)) ou dépression (P < 1 bar), pour une évaporation sous vide
par
exemple).
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Généralement, afin de permettre une évaporation du solvant lors de l'étape c),
au
début de l'étape c) (lorsque l'évaporation est débutée), le gel a une teneur
en solvant Ta
supérieure à la teneur en solvant Teg du gel au temps d'équilibre Teq. En
pratique, cette
condition est presque toujours vérifiée lorsque les nanoobjets sont déposés
sous forme
d'un mélange comprenant les nanoobjets et un solvant.
Lors de l'étape c), au début de l'évaporation, la teneur en sels minéraux dans
le
solvant est inférieure à 6 g/L, notamment inférieure à 5 g/L, typiquement
inférieure à 4 g/L,
par exemple inférieure à 3 g/L, de préférence inférieure à 2 g/L, une teneur
inférieure à
1,5 g/L, voire inférieure à 1,0 g/L, voire même inférieure à 0,5 g/L, étant
particulièrement
préférée. De préférence, lors de l'étape c), le solvant est exempt de sels
minéraux.
Des sels de chlorure (NaCI, KCI, CaCl2 et/ou MgCl2), des sels de phosphate
(Na2HPO4 et/ou K2HPO4), des sels de carbonate (NaHCO3) sont des exemples de
sels
minéraux. Ceux-ci sont utilisés de façon usuelle dans des solutions aqueuses
physiologiques et/ou tampon utilisées à titre de solvant dans des hydrogels et
pour les
protéines.
Généralement, l'utilisateur connait la teneur en sels minéraux au début de
l'évaporation, car il connait la teneur en sels minéraux dans le gel fourni à
l'étape a) et la
teneur en sels minéraux éventuellement ajoutés lors de l'étape b) (ces sels
minéraux
pouvant notamment provenir du solvant du mélange comprenant les nanoobjets et
un
solvant déposé lors de l'étape b)). Si la teneur en sels minéraux est
inconnue, elle peut
être déterminée par chromatographie ionique.
L'invention repose sur la découverte que l'évaporation totale du solvant du
gel
(c'est-à-dire au moins jusqu'à ce que la teneur en solvant ne varie plus avec
le temps)
permet de contrôler facilement la distribution surfacique des nanoobjets et
donc leur
densité surfacique, et ce sans dégrader ni le gel, ni les nanoobjets. Comme le
solvant est
évaporé, il est facile de connaître la quantité de nanoobjets déposés à la
surface du gel,
puisque cette quantité correspond à la quantité de nanoobjets déposés lors de
l'étape b)
(sous réserve qu'un partie des nanoobjets n'ait pas été éliminée entre les
étapes b) et c)
(par aspiration de la solution ou par rinçage)). La densité surfacique en
nanoobjets
déposés est donc connue avec une grande précision. Lors de l'étape c), les
nanoobjets
sont déposés sans limite due à la diffusion des nanoobjets vers la surface du
gel.
Il y avait un préjugé technique à surmonter pour parvenir au procédé selon
l'invention. En effet, l'homme du métier évite d'évaporer totalement le
solvant du gel, car il
s'attend à le dégrader, notamment par fissuration/fracturation et dépôt de
cristaux. Or, ces
dégradations ne sont observées que lorsque la teneur en sels minéraux excède
celle
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mentionnée ci-dessus. Sans vouloir être liés à une théorie particulière, les
inventeurs
observent que les sels minéraux, présents à des teneurs supérieures
cristallisent lors de
l'évaporation du solvant, ce qui conduit à la fissuration du gel, notamment
lors de son
regonflement en vue de son utilisation sous forme solvatée, et de manière
générale,
conduit à la présence de nombreux dépôts et cristaux inamovibles sur la
surface. De
préférence, lors de l'étape c), le solvant est exempt de composé susceptible
de cristalliser
dans les conditions de l'étape c).
Des préjugés techniques supplémentaires existaient lorsque les nanoobjets sont
des protéines. En effet, l'homme du métier évite généralement d'évaporer
totalement le
solvant du gel, car il s'attend à dégrader les protéines si elles se
retrouvent à sec. En effet,
la plupart des fournisseurs de protéines recommandent d'éviter de sécher une
protéine
qui a été mise en solution afin d'éviter de la dénaturer. Or, de manière
surprenante, une
telle dénaturation n'est généralement pas observée dans le procédé selon
l'invention. De
plus, l'homme du métier est habitué à utiliser des protéines dans des milieux
physiologiques, qui sont des solutions aqueuses, généralement tamponnées, et
dont la
teneur en sels minéraux excède celle mentionnée ci-dessus. Utiliser un solvant
donc le
teneur en sel est telle que définie à l'étape c) est très inhabituel pour
l'homme du métier.
Avantageusement, la densité surfacique en nanoobjets sur le gel obtenu à la
fin de
l'étape c) est indépendante de la rigidité du gel utilisé. La rigidité du gel
intervient
uniquement sur la cinétique de l'évaporation (sur la durée pour atteindre le
temps
d'équilibre Teq).
Avantageusement, la densité surfacique en nanoobjets du gel obtenu à l'étape
c)
est uniforme.
La méthode pour mesurer la densité surfacique en nanoobjets est variable selon
la
nature des nanoobjets. Par exemple, lorsque les nanoobjets sont des protéines,
on peut
utiliser un anticorps primaire susceptible de reconnaitre ladite protéine,
puis un anticorps
secondaire susceptible de reconnaitre ledit anticorps primaire, cet anticorps
secondaire
étant lié à un fluorophore, puis analyser la densité surfacique par
microscopie confocale
de fluorescence. Lorsque les nanoobjets sont des nanoparticules, la densité
surfacique
peut être analysée par microscopie électronique à balayage.
Le procédé peut comprendre, avant l'étape a), les étapes consistant à:
a0) fournir un gel ayant une teneur en solvant initiale Ti supérieure à la
teneur en solvant
Ta, puis
a0') évaporer le solvant du gel jusqu'à la teneur en solvant initiale Ta, ce
par quoi un gel tel
que défini à l'étape a) est obtenu.
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L'évaporation de l'étape a0') est donc réalisée avant le dépôt des nanoobjets.
Cette
évaporation préalable permet de diminuer l'épaisseur de la couche de solvant à
la surface
du gel et ainsi de favoriser la migration par convection des nanoobjets vers
la surface du
gel lors de l'étape b) qui suit.
Le procédé peut comprendre, avant l'étape b), une étape b0) consistant à
greffer à
la surface du gel des groupes fonctionnels susceptibles de réagir avec les
nanoobjets qui
seront déposés à l'étape b).
Les nanoobjets déposés lors de l'étape b) peuvent avoir été modifiés avant
l'étape
b) pour qu'ils soient porteurs d'une fonction susceptible de réagir avec la
matrice
polymérique du gel. Le procédé peut comprendre, avant l'étape b), une étape
b0')
consistant à greffer sur les nanoobjets (en particulier les protéines et/ou
les peptides et/ou
les polysaccharides) au moins un groupe fonctionnel susceptibles de réagir
avec le gel.
Dans les étapes b0) et b0'), les groupes fonctionnels sont de préférence
susceptibles de réagir pour former une liaison covalente.
Lorsque les nanoobjets sont des protéines et/ou des peptides et/ou des
polysaccharides, le procédé peut comprendre, une étape d) de greffage covalent
des
protéines et/ou peptides et/ou polysaccharides sur le gel, ce qui permet de
les immobiliser
définitivement et d'éviter que les peptides et/ou protéines et/ou
polysaccharides ne se
déplacent à nouveau à la surface du gel, lors d'un rinçage du gel après
l'étape c) par
exemple. Cette étape d) peut être simultanée à l'étape c) (pendant
l'évaporation), ou être
réalisée après l'étape c) (sur le gel désolvaté). De préférence, lorsque
l'étape d) est mise
en oeuvre, le procédé ne comprend pas d'étape de rinçage entre les étapes a)
et d).
Le procédé peut comprendre, après l'étape c), une étape e) de rinçage avec un
solvant. Ce solvant peut être identique ou différent du solvant du gel.
L'étape de rinçage
peut être répétée.
Le procédé peut comprendre, après l'étape c), ou, si elle est présente, après
l'étape e), une étape f) de récupération du gel. Le gel est sous forme
désolvaté (teneur en
solvant au-delà du temps d'équilibre du gel) s'il est récupéré à la fin de
l'étape c). Si une
étape e) de rinçage a été effectuée après l'étape c) et avant l'étape f), le
gel peut être
sous forme solvatée (le solvant étant le solvant de la solution de rinçage).
Le gel sous
forme solvatée ou désolvatée peut avantageusement être conservé plusieurs
mois,
généralement au moins un mois, notamment au moins trois mois, voire au moins
neuf
mois à température ambiante (20 C), généralement sans qu'aucune dégradation ni
du gel
ni des nanoobjets (y compris aucune dénaturation des protéines) ne soit
observée.
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Le procédé selon l'invention est facile à mettre en oeuvre. Il ne nécessite
pas
d'équipement complexe. Il est peu coûteux.
Selon un deuxième objet, l'invention concerne le gel susceptible d'être obtenu
par
le procédé défini ci-dessus, la surface du gel étant au moins partiellement
revêtue de
nanoobjets, où l'écart type G' des quantités Qj (j variant de 1 à p) de
nanoobjets par 1m2
de surface est inférieure à 40%, typiquement inférieure à 30%, notamment
inférieure à
20%, de préférence inférieure à 10%, les quantités Qj de nanoobjets étant
mesurées par
microscopie sur p 1m2 de surface répartis sur toute la surface du gel, p étant
supérieur à
10, notamment supérieur à 100, typiquement supérieur à 10000 (100 x 100), de
préférence supérieur à 1 000 000 (1000 x 1000),
l'écart type G' étant tel que défini à la formule (IV) :
G' = j ¨ mean')2 (IV)
où mean' est la moyenne arithmétique des quantités Qj de nanoobjets par
1m2 de
surface et est telle que définie à la formule (V) :
mean' = j (V).
De préférence, lesdites quantités Qj de nanoobjets par 1m2 de surface suivent
à
10%, notamment à 5%, de préférence à 1%, une distribution symétrique, sous
réserve que la moyenne arithmétique mean et la médiane median de
ladite
distribution sont telles que l'écart e' tel que défini à la formule (VI) :
e = 2 meanr-medianf
(VI)
meanr+medianf
est inférieur à 25%, notamment inférieure à 20%, typiquement inférieure à 10%,
de
préférence inférieure à 5%. L'écart type G' des quantités Qj (j variant de 1 à
p) de
nanoobjets par 1m2 de surface est alors tel que défini ci-dessus, ou non.
La médiane est la quantité median' de nanoobjets par 1m2 de surface qui
permet de partager la série de p quantités de nanoobjets par 1m2 de surface
ordonnée en
deux parties de même nombre d'éléments. L'ensemble des quantités Qj de
nanoobjets
par ptrn2 de surface est alors coupé en deux parties ayant le même nombre
d'éléments :
avec d'un côté une moitié des quantités Qj de nanoobjets par ptrn2 de surface,
qui sont
toutes inférieures ou égales à median' et de l'autre côté l'autre moitié
des valeurs de
quantités Qj de nanoobjets par ptrn2 de surface, qui sont toutes supérieures
ou égales à
median' .
Plus la valeur e' est faible, plus les quantités Qj de nanoobjets par ptrn2 de
surface
suivent une distribution symétrique. Une distribution surfacique en nanoobjets
parfaitement symétrique a un écart e' de 0.
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De préférence, lesdites quantités Qj de nanoobjets par lie de surface suivent
à
10%, notamment à 5%, de préférence à 1%, une distribution normale, sous
réserve
que la moyenne mean' et la médiane median' de ladite distribution sont
telles
que l'écart e' est inférieur à 25%, notamment inférieure à 20%, typiquement
inférieure à
5 10%, de préférence inférieure à 5%.
De préférence, les p lie de surface sont répartis aléatoirement sur toute la
surface du gel.
De préférence, la variabilité de la densité surfacique en nanoobjets à la
surface du
gel est inférieure à 60%, notamment inférieure à 50%, typiquement inférieure à
40%, de
10 préférence inférieure à 30%.
Généralement, le gel, solvate ou non solvate, n'est pas fissuré, ce qui peut
être
caractérisé :
- optiquement, en microscopie à contraste de phase,
- par une mesure de la rigidité : en scannant une surface, on observe des
courbes
15 force/indentation qui ne sont pas élastiques au niveau des fractures
(présence de
cassures dans la courbe pour des indentations de faibles amplitudes).
- ou en microscopie électronique, si l'échantillon n'est pas
transparent.
Ce gel a des applications très variables selon la nature des nanoobjets
déposés
en surface. Selon un troisième objet, l'invention concerne l'utilisation de ce
gel pour la
culture cellulaire, pour le criblage de principes actifs pharmaceutiques,
comme capteur
photonique (typiquement lorsque les nanoobjets sont des semiconducteurs) ou
physico-
chimique, par exemple comme capteur de pH (typiquement lorsque les nanoobjets
sont
des particules d'or) ou de température (typiquement lorsque les nanoobjets
sont des
particules de CdTe), comme capteur pour la détection d'analyte, comme puce à
protéines
ou à peptides (typiquement lorsque les nanoobjets sont des protéines et/ou des
peptides),
comme puces à cellules ou comme puce de capture à biomolécules.
L'invention concerne également :
- une méthode de positionnement de cellules pour le criblage de principes
actifs
pharmaceutiques comprenant la mise en contact de principes actifs
pharmaceutiques
avec le gel selon l'invention dans lequel les nanoobjets sont des peptides,
des
protéines et/ou des polysaccharides,
- une méthode de capture de biomolécules comprenant la mise en contact d'un
milieu
comprenant des biomolécules à capturer avec le gel selon l'invention dans
lequel les
nanoobjets sont des peptides, des protéines et/ou des polysaccharides,
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- une méthode d'analyse comprenant la mise en contact d'un milieu comprenant
un
analyte à détecter avec le gel selon l'invention.
Les figures et exemples ci-dessous illustrent l'invention.
Les exemples ont été réalisés avec des hydrogels de polyacrylamide et des
protéines (fibronectine ou fibrinogène) comme nanoobjets.
Les hydrogels de polyacrylamide utilisés avaient une variabilité de rigidité
de 10 %
à l'échelle centimétrique et de 5 % à l'échelle de 100 um (une mesure de
rigidité ayant été
faite tous les 10um).
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Exemple 1 : Greffage de protéines (fibronectine) préalablement activées à la
surface
d'hydrogels de polyacrylamide.
A cet exemple, un réticulant photosensible a été greffé à la fibronectine
utilisée
comme protéine, pour la rendre réactive avec la surface de l'hydrogel sous
exposition aux
UV A. Le greffage de la fibronectine préalablement activée à la surface du gel
est une
réaction photoactivée.
a) Silanisation des lamelles de verre basales
La lamelle basale sert d'ancrage basal à l'hydrogel.
La lamelle de verre basale, de diamètre 30 mm, a été nettoyée dans une
solution
de 0,1 mol/L de soude pendant 10 min. Elle a ensuite été rincée intensivement
à l'eau,
puis à l'éthanol, et séchée à l'air.
5001.11_ d'une solution de silane comprenant 561.11_ de Bind-Silane (GE
Healthcare),
484 1.11_ d'acide acétique à 10%, et 14,46 mL d'éthanol ultra pur ont été
déposés sur la
lamelle et frottés avec un chiffon tricoté de polyester jusqu'à disparition
des traces de
solution. On a ainsi obtenu une lamelle de verre présentant des fonctions
aldéhyde à sa
surface, qui permettent le greffage covalent du gel de polyacrylamide.
b) Silanisation du masque transparent
L'hydrogel a été réticulé par UV, le masque transparent permettant de rendre
plane la surface de l'hydrogel. Le masque consistait en une lame de microscope
traitée
par un silane fluoré pour limiter son accroche à l'hydrogel.
Une lame de microscopie optique (26 mm x 76 mm) a été lavée dans une solution
d'eau oxygénée/acide sulfurique concentré en proportions 1:2 pendant 10
minutes. Elle a
ensuite été rendue hydrophobe par un traitement Optool (Daikin DSX) :
immersion
pendant 1 minute dans l'Optool dilué à 1/1000 dans du perfluorohexane. Puis la
lame a
été laissée 1 heure dans de la vapeur d'eau à 80 C. Enfin, elle a été immergée
sous
agitation lente pendant 10 minutes dans du perfluorohexane.
c) Préparation de trois hydrogels de polyacrylamide
L'hydrogel a été préparé selon le procédé décrit dans la demande WO
2013/079231 à partir d'une composition constituée de:
- 10% d'acrylamide (2501.11_ de solution initialement à 40%)
- 0,5% de N,N'¨méthylènebisacrylamide (Bis) (2501.11_ de solution initialement
à 2%)
- 0,2% de lrgacure 819 w/v (Ciba, photoinitiateur)
- 1% de propylamine (amorceur)
- eau déionisée (490 lit)
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L'Irgacure 819 a été pesé dans un flacon opaque aux UV. On y a ajouté la
propylamine. L'ensemble a été chauffé à 50 C pendant 2 minutes. Apres
chauffage, on a
obtenu une solution homogène et transparente. L'eau, l'acrylamide, et le bis
acrylamide
ont été ajoutés rapidement. L'ensemble a été homogénéisé doucement à la
pipette, pour
limiter l'incorporation d'oxygène. 30 1.11_ ont été déposés sur la lamelle de
verre de 30 mm
prétraitée selon le protocole ci-dessus. La lamelle a été placée sur un porte-
échantillon
possédant des cales d'épaisseur qui maintiennent un espacement de 40 jim entre
la
lamelle et le masque transparent, déposé sur les cales d'épaisseur. L'ensemble
(masque,
solution, lamelle) a été illuminé à l'aide d'une lampe fibrée Eleco UVP281
(2W/cm2)
pendant 7,8 s, 15 s ou 20 s, afin d'obtenir trois hydrogels. Chaque ensemble a
ensuite été
plongé dans l'eau pour détacher le masque de l'hydrogel à l'aide d'une pince.
Chaque
hydrogel a été rincé 3 fois avec de l'eau déionisée et conservé dans l'eau
déionisée.
d) Caractérisation de la rigidité des hydrogels
La variabilité de porosité de chaque hydrogel a été estimée par le biais de la
mesure de la rigidité locale de l'hydrogel. La rigidité locale a été mesurée
par un AFM en
milieu aqueux (marque JPK). La résistance du gel à l'enfoncement de la pointe
a été
enregistrée. Quatre régions de 100 jim x 100 jim espacées de plusieurs
millimètres ont
été scannées. Les scans ont été réalisés avec un pas de 10 jim afin d'obtenir
une série
de courbes d'indentation. Chaque courbe a été traitée selon le protocole du
fabricant avec
un modèle d'indentation élastique.
Les rigidités obtenues sont dépendantes du temps d'illumination pour préparer
le
gel. Elles sont de l'ordre :
-
de 0,6 kPa avec un écart type G des valeurs de rigidité Ri de 11,7% pour un
hydrogel
préparé avec une durée d'illumination de 7,8 s,
- de 11,8 kPa avec un écart type G des valeurs de rigidité Ri de 11,8% pour un
hydrogel préparé avec une durée d'illumination de 15 s et
- de 24.7 kPa avec un écart type G des valeurs de rigidité Ri de 9,2% pour un
hydrogel
préparé avec une durée d'illumination de 20 s.
e) Dépôt de fibronectine activée sur l'hydrogel puis greffage covalent
La fibronectine a préalablement été couplée au réticulant hétéro-bifonctionnel
sulfo-NHS-LC-Diazirine
(Su If osuccin imidy1-6-(4,4'-azipentanam ido)hexanoate,
ThermoScientific Pierce; nom commercial: sulfo-LC-SDA), avec un ratio molaire
de 1/480.
5 mg de fibronectine (Roche) ont été dissous dans 2 mL d'eau déionisée
ultrapure, à
37 C pendant 30 min. 1,2 mg de sulfo-LC-SDA ont été pesés à l'abri de la
lumière et
dissous dans la solution de fibronectine pendant 30 min à température
ambiante. Cette
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opération a été répétée une seconde fois, conduisant au rapport molaire de
1/480. Ce
protocole a permis de faire réagir la fonction sulfo-NHS du sulfo-LC-SDA avec
les
groupements amine de la fibronectine en limitant l'hydrolyse du sulfo-LC-SDA.
Le
composé formé est une molécule de fibronectine couplée à une fonction
photosensible
diazirine. Le compose formé a été dialysé à travers une membrane 6-8000 en
chambre
noire et à 4 C contre 2L de PBS+/+ lx pendant 48h avec un changement du PBS au
bout de 24h. Il a ensuite été aliquote en petits volumes (25 et 50 lit) et
conservé congelé
à -20 C.
L'hydrogel préparé selon le protocole ci-dessus a été déshydraté sous une
hotte à
flux laminaire vertical (Aura) à 26 C pendant une heure (étape a0')).
Dans une pièce à éclairage sans UV, 8001.11_ de solution de fibronectine
conjuguée
selon le protocole ci-dessus a été préparée à une concentration de 3,5 pg/mL
dans de
l'eau stérile déionisée, et a été déposée à l'aide d'une pipette sur le gel
(étape b)).
L'ensemble hydrogel + solution de fibronectine a été déposé sur une plaque
chauffante à 37 C sous une hotte à flux laminaire (flux convectif de 0,5 m/s)
jusqu'à
évaporation complète de la solution à la surface de l'hydrogel (étape c)).
Le gel a immédiatement été illuminé par la lampe UV ElecoUVP281 pendant 5 min
(étape d)). Il a ensuite été rincé délicatement 3 fois avec une solution de
PBS+/+ (étapes
e)). Le gel fonctionnalisé a été conservé hydraté dans une solution de PBS+/+,
à 4 C.
f) Caractérisation de la distribution des protéines greffées
La solution de PBS+/+ a été aspirée du gel, et remplacée par une solution de
saturation consistant en une solution de PBS+/+ lx ¨ Tween20 0,1% - BSA 2%,
pendant
min sous agitation lente à température ambiante.
La solution de saturation a été aspirée à l'aide d'une pipette et remplacée
par une
25 solution de 3 1.11_ d'anticorps polyclonal primaire anti fibronectine
produit chez le lapin
(Sigma-Aldrich, F3648) dilué dans 1,2 mL de PBS+/+ lx ¨ Tween20 0,1% - BSA 2%.
L'anticorps a été incubé pendant 1h sous agitation lente à température
ambiante. Il a
ensuite été révélé avec 1, 2 mL d'une solution contenant 0,6 1.11_ d'un
anticorps
secondaire couplé à l'Alexa 488 produit chez l'âne et dirigé contre le lapin
(Molecular
30 Probes, A21206), complété par une solution de PBS+/+ lx - Tween20 0,1% -
BSA 2%
pendant 1h sous agitation lente à température ambiante et à l'abri de la
lumière. La
solution a ensuite retirée par aspiration et le gel a été rincé 3 fois par
1,2mL de PBS+/+
lx - Tween20 0,1% - BSA 2%. Le gel a ensuite été conservé dans une solution de
PBS+/+ lx à 4 C et à l'abri de la lumière.
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La caractérisation de la distribution des protéines greffées a été effectuée
par
microscopie confocale de fluorescence (microscope Leica SP). Une pile d'images
a été
acquise pour chaque hydrogel à la longueur d'onde 488 nm avec un espacement
entre
les images de 0,28 jim. Les différentes acquisitions ont été faites à gain
constant et à
5 niveau de l'intensité laser constante. Chaque pile d'images a ensuite été
assemblée avec
le logiciel ImageJ et des coupes ont été extraites. L'image d'intensité
maximale a été
calculée à partir de la pile d'image, permettant d'obtenir une projection
bidimensionnelle
de la surface fluorescente pour des fenêtres de 375 x 375 jim. Les marquages
anticorps
conduisent à l'obtention d'images pixellisées. Pour y remédier, la
pixellisation a été
10 limitée par un filtre gaussien de rayon 10 pixels. Puis la valeur
moyenne de l'intensité a
été calculée sur cette projection (Tableau 1).
Gel de rigidité de Gel de rigidité de Gel de rigidité de
0,6 kPa 11,8 kPa 24,7 kPa
Intensité de 85,1 13,5 81,1 10,5 80,7 19,8
fluorescence
moyenne
écart type G' des 16% 13% 25%
quantités Qj de
protéines par lie
de surface
Tableau 1 : Intensité de fluorescence moyenne sur une surface de 375x375 lie
et
variabilité de la densité surfacique en protéines pour chaque hydrogel.
15 L'absence de variation significative d'intensité entre chacun des
trois hydrogels
démontre que la quantité de protéines greffées est indépendante de la
rigidité/porosité de
l'hydrogel.
Exemple 2 : Greffage de protéines (fibrinogène) sur la surface préalablement
20 activée d'un hydrogel de polyacrylamide.
Dans cet exemple, le même réticulant que celui de l'exemple 1 a été fixé en
excès
à la surface de l'hydrogel par réaction photochimique pour obtenir une surface
activée, et
les protéines (fibrinogène) ont réagi avec la surface activée de l'hydrogel
par une réaction
de couplage avec les fonctions amine primaire des protéines.
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a) Silanisation des lamelles de verre basales
Idem que Exemple la.
b) Silanisation du masque transparent
Idem que Exemple lb.
c) Préparation de trois hydrogels
Idem que Exemple 1c. Les temps d'illumination étaient de 7,5, 9 et 10 s.
d) Caractérisation de la rigidité de chaque hydrogel
Idem que Exemple 1d. Les rigidités obtenues étaient respectivement de:
- 2,9 kPa avec un écart type G des valeurs de rigidité Ri de 10,3%,
-4,6 kPa avec un écart type G des valeurs de rigidité Ri de 4,3% et
- 9,5 kPa avec un écart type G des valeurs de rigidité Ri de 9,5%.
e) Activation de la surface des hydrogels (étape b0))
Dans une pièce à éclairage sans UV, chaque hydrogel préparé selon le protocole
ci-dessus a été déshydraté sous une hotte à flux laminaire vertical (Aura) à
26 C pendant
une heure. Une solution du réticulant hétéro-bifonctionnel sulfo-NHSLC-
Diazirine
(Sulfosuccinimidyl 6-(4,4`-azipentanamido)hexanoate, ThermoScientific Pierce;
nom
commercial: sulfo-LC-SDA) a été préparée dans de l'eau stérile déionisée à une
concentration de 0,44 mg/ml. 800 I de cette solution ont été déposés sur le
gel à l'aide
d'une pipette. Cette solution a été laissée incuber pendant 60 min à 26 C sous
la hotte à
flux laminaire. La solution résiduelle a ensuite été aspirée délicatement à
l'aide d'une
pipette, et le gel a été à nouveau laissé sécher pendant 40 min, toujours sous
la hotte a
flux laminaire.
Le gel a alors été illuminé par la lampe UV ElecoUVP281 pendant 5 min.
f) Greffage covalent du fibrinogène
Une solution de fibrinogène couplé à une sonde fluorescente Alexa Fluor 488
(F13191, Invitrogen) a été préparée à la concentration de 8,75 g/ml. 800
1.11_ de cette
solution ont été déposés sur la surface activée du gel à l'aide d'une pipette
(étape b)).
L'ensemble hydrogel + solution de fibrinogène a été déposé sur une plaque
chauffante à 37 C sous une hotte à flux laminaire (flux convectif de 0,5 m/s)
jusqu'à
évaporation complète de la solution à la surface de l'hydrogel (étapes c) et
d)).
Le gel a ensuite été rincé délicatement 3 fois avec une solution de PBS+/+
(étapes
e)).
Le gel fonctionnalisé a été conservé hydraté dans une solution de PBS+/+, à 4
C
et à l'abri de la lumière.
g) Caractérisation de la distribution des protéines greffées
CA 03098405 2020-09-09
WO 2019/175177
PCT/EP2019/056168
22
Les protéines greffées ont été couplées à un fluorophore. La caractérisation
de la
distribution des protéines greffées a été effectuée par microscopie confocale
de
fluorescence (microscope Leica SP). Une pile d'images a été acquise pour
chaque
marche de rigidité à la longueur d'onde 488 nm avec un espacement entre les
images de
0,28 jim. Les différentes acquisitions ont été faites à gain constant et à
niveau de
l'intensité laser constante. Chaque pile d'images a ensuite été assemblée avec
le logiciel
ImageJ. L'image d'intensité maximale a été calculée à partir de la pile
d'image, permettant
d'obtenir une projection bidimensionnelle de la surface fluorescente. Les
marquages
anticorps conduisent à l'obtention d'images pixellisées. Pour y remédier, la
pixellisation a
été limitée par un filtre gaussien de rayon 10 pixels. Puis la valeur moyenne
de l'intensité
a été calculée sur cette projection (Tableau 2).
Gel de rigidité de Gel de rigidité de Gel de rigidité de 9,5
2,9 kPa 4,6 kPa kPa
Intensité de 178,4 49,5 167,5 48,7 144,9 40,6
fluorescence
moyenne
écart type G' des 28% 29% 28%
quantités Qj de
protéines par lie
de surface
Tableau 2 : Intensité de fluorescence moyenne sur une surface de 375x375
j..tm2 et
variabilité de la densité surfacique en protéines pour chaque hydrogel.
L'absence de variation significative d'intensité entre chacun des trois
hydrogels
démontre que la quantité de protéines greffées est indépendante de la
rigidité/porosité de
l'hydrogel.
