Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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Description
Titre : Procédé de traitement de tumeurs par captation du
cuivre et/ou du fer
Domaine technique
[0001] La présente divulgation porte sur des nanoparticules et leurs
utilisations
dans le domaine de la médecine, en particulier pour le traitement de tumeurs
par
captation du cuivre et/ou du fer.
Technique antérieure
[0002] La diminution du taux de cuivre et/ou du fer dans les organismes est
une
stratégie intéressante dans le traitement de cancers métastatiques. Si cette
diminution peut être proposée par de simples régimes [Counter CM, Brady DC,
Turski ML, & Thiele DJ (2015) Methods of treating and preventing cancer by
disrupting the binding of copper in the map-kinase pathway 1(19) 0-4], l'idée
est
surtout d'administrer des médicaments capables de complexer le cuivre.
Plusieurs
agents chélatants du cuivre ont été testés à ce jour : pénicillamine,
trientine,
disulfiram, clioquinol et tétramolybdate ainsi que des agents chélatants du
fer qui
comme pour le cuivre étaient utilisés pour traiter les surcharges métalliques
:
deferoxamine (DFO), deferiprone (DFP) deferasirox (Gaur et al, lnorganics,
2018,
6, 126). Des résultats intéressants précliniques et cliniques ont été obtenus,
mais
souvent limités ou associés à des effets secondaires qui pourraient empêcher
leur
utilisation.
[0003] Le cuivre et/ou le fer sont des cations métalliques essentiels à la
vie,
cependant, de nombreux autres cations métalliques le sont également. Ainsi,
l'utilisation de chélateurs trop puissants risque d'affaiblir le patient dans
d'autres
parties de l'organisme : il s'agit là d'une problématique courante dans
l'utilisation
de médicaments utilisés en chimiothérapie.
[0004] A l'inverse, l'utilisation d'un chélatant peu spécifique, qui possède
alors une
affinité plus forte pour d'autres métaux bio-essentiels comme le zinc, ou même
le
manganèse, peut également conduire à des effets secondaires gênants.
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[0005] Dans les stratégies de traitements par déplétion du cuivre ou du fer,
un
objectif est donc d'augmenter de plus en plus la constante de chélation et la
spécificité au cuivre et/ou au fer, pour limiter les effets secondaires tout
en
assurant une bonne efficacité. Un autre objectif est de cibler la localisation
de
cette extraction et capter bien précisément le cuivre et/ou le fer dans la
zone
tumorale.
[0006] Le tétrathiomolybdate, un chélateur du cuivre très efficace in vitro, a
montré
un effet en particulier sur la suppression de l'angiogenèse et de la
croissance
tumorale, en induisant une diminution du cuivre accessible [Alvarez HM, Xue Y,
Robinson CD, Canalizo-Hernandez MA, Marvin RG, Kelly RA, Mondragein A,
Penner-Hahn JE, & O'Halloran T V. (2010) Tetrathiomolybdate inhibits copper
trafficking proteins through metal cluster formation Science (80- ) 327(5963)
331-
334, https://doi.org/10.1126/science.1179907].
[0007] Cependant cette utilisation est encore limitée et des effets
secondaires
indésirables comme des érythèmes, névrites optiques, vomissements et
leucopénies, sont observés pendant les traitements, probablement reliés à une
extraction non sélective du cuivre dans tout le corps.
[0008] Zhou et al ont proposé une association d'un chélateur au sein de
polymères qui s'assemblent pour former une capsule permettant d'associer un
autre médicament (le resiquimod ¨ R848). Le chélateur utilisé est le TETA. Les
particules formées sont de taille importante (plus de 400 kDa de poids
moléculaire
du RPTDH) et possèdent une capacité d'extraction assez limitée, le complexant
étant assez spécifique du cuivre mais de faible stabilité. Ainsi, il a été
montré une
capacité d'extraction du cuivre pour des teneurs en ions cuivre supérieur à 50
pg/ml, soit 50 ppm (plus d'un ordre de grandeur de la concentration naturelle
au
sein de nos organismes). [Zhou P, Qin J, Zhou C, Wan G, Liu Y, Zhang M, Yang
X,
Zhang N, & Wang Y (2019) Multifunctional nanoparticles based on a polymeric
copper chelator for combination treatment of metastatic breast cancer
Biomaterials
195 86-99, httpslidoi.org/10.1016/Lbiomaterials.2019.01.007]. En outre, dans
des
expériences précliniques, on a observé qu'après injection, malgré un bon
ciblage
de la tumeur par les particules, une part importante des nanoparticules s'est
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retrouvée à 6h dans le foie, la rate, les reins et les poumons et encore dans
les
poumons à 24h.
[0009] Récemment, Wu et al ont proposé l'utilisation de nanoparticules
chargées
en cuivre pour profiter des possibilités de relargage puis de captation du
cuivre
pour initier un effet antitumoral [Wu W, Yu L, Jiang Q, Huo M, Lin H, Wang L,
Chen Y, & Shi J (2019) Enhanced Tumor-Specific Disulfiram Chemotherapy by in
Situ Cu2+ Chelation-Initiated Nontoxicity-to-Toxicity Transition J Am Chem Soc
141(29) 11531-11539, hitpslidoi.omil 0.1 0211iacs.9b035031. La taille de ces
particules à base de silice mésoporeuse pégylé en surface est de l'ordre de
165
nm. Les études de biodistribution pour ces grosses particules ont cependant
montré une très forte captation dans les poumons, rate, foie et coeur. Outre
l'aspect original réversible de la captation du cuivre, les particules
présentent une
faible capacité de chélation des cations cuivre endogènes.
[0010] Feng et al ont proposé l'utilisation de particules mésoporeuses de
sulfure
de cuivre chargées avec un médicament connu pour sa capacité de complexation
du cuivre (la bléomycine). Si cette approche est intéressante du fait des
propriétés
optiques du sulfure de cuivre pour initier une absorption dans le proche infra-
rouge,
il faut bien considérer que l'utilisation du sulfure de cuivre, même chargé
par un
complexant, risque d'entrainer un apport de cuivre excessif dans certaines
zones.
Pour cette utilisation également, les particules sont de taille importante
(119,8 nm
en moyenne), afin de pouvoir encapsuler suffisamment de molécules. Feng Q,
Zhang W, Li Y, Yang X, Hao Y, Zhang H, Li W, Hou L, & Zhang Z (2017) An
intelligent NIR-responsive chelate copper-based anticancer nanoplatform for
synergistic tumor targeted chemo-phototherapy Nanoscale 9(40) 15685-15695,
https://doi.org/10.1039/c7nr05003h.
[0011] Le déferoxamine (DFO) qui est également utilisé pour le traitement des
surcharges métalliques en fer a été le premier chélatant à être utilisé en
cancérologie pour un traitement par séquestration du fer. Le DFO a ainsi donné
des résultats encourageants pour le traitement de la leucémie et du
neuroblastome dans des essais cliniques préliminaires (Wang et al.. Iron and
Leukemia, 2019, 38, 406).
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[0012] Cependant l'utilisation de ces chélates moléculaires est limitée par
leur
élimination rapide, leur absence de ciblage de la tumeur, leur toxicité à
haute dose
et les effets secondaires qu'ils entrainent.
[0013] Pour pallier ces différents problèmes, plusieurs équipes ont proposés
d'associer des chélateurs du fer à des nanoparticules ou d'user des
nanoparticules intrinsèquement chélatantes pour le fer. Ainsi J. Perring et al
(Journal of Materials Science : Materials in medicine 2018, 29, 181) ont
proposé
de former des nanoparticules de mélanine qui présente naturellement une
chélation pour le fer. Ces particules présentent une taille proche de 220 nm
et ont
montré leur capacité à capter le fer et à entrainer la mort cellulaire de
cellules
cancéreuses (rhabdomyosarcome et glioblastome). La taille importante des
nanoparticules risque néanmoins d'induire une biodistribution peu adaptée à
une
utilisation clinique.
[0014] Des dispositifs de drug delivery classique à base de liposomes ont
également été proposés afin d'améliorer la biodistribution du DFO. C'est ce
qu'ont
proposé Lang et al (ACS Nano, 2019, 13, 2176-2189). Ils ont également associé
le DFO au sein de ce liposome à un inhibiteur HIFI a (hypoxia-inducible factor
la)
afin de limiter la surexpression d'HIF1a qui est habituellement observée avec
le
DFO. L'encapsulation au sein des liposomes a permis d'obtenir des
nanoparticules d'une centaine de nanomètres environ. Les essais précliniques
in
vitro et in vivo sur des modèles rongeurs ont permis de montrer une action
antitumorale. Néanmoins en raison de la taille des nanoparticules, une forte
accumulation dans le foie et la rate est observée.
[0015] Suivant la même logique, M. Theerasilp et al. (RSC Advances, 2017, 7,
11158) ont proposé l'encapsulation d'un autre chélateur du fer à l'intérieur
de
micelles polymériques. Ces micelles sont formées à partir de polymères
présentant une partie hydrophobe pour constituer le coeur de la micelle et une
partie hydrophile pour assurer la stabilité colloïdale. Ces micelles ont
montré une
activité anticancéreuse sur différentes lignées cellulaires et présentent des
tailles
autour de 25 nm ainsi qu'un relargage en fonction du chélateur en fonction du
pH.
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[0016] De toutes ces études, force est de constater qu'il n'existe pas à
l'heure
actuelle de solutions permettant à la fois un ciblage efficace et spécifique
des
tumeurs et une chélation locale du cuivre et/ou du fer endogène suffisante
pour
une utilisation dans le traitement de tumeurs, notamment par l'administration
de
5 nanoparticules dans des concentrations efficaces de l'ordre du mg/I.
[0017] Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé
permettant la captation du cuivre et/ou du fer non seulement lors de sa
circulation
sanguine générale, mais également plus spécifiquement au sein de zones
tumorales. En particulier, un objectif de la présente divulgation est de
fournir un
composé permettant de capter dans la zone tumorale plus de 10 pmole de cuivre
et/ou de fer par litre voire plus de 100 pmole de cuivre et/ou de fer par
litre, c'est-
à-dire capter localement de 100 à 10 000 ppb de cuivre ou de fer.
[0018] Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé
permettant une chélation avec une grande spécificité vis-à-vis du cuivre et/ou
du
fer et un temps de résidence dans les zones tumorales suffisamment élevé,
notamment de plusieurs jours, voire plusieurs semaines.
[0019] Un autre objectif de la présente divulgation est de pouvoir libérer
localement des ions qui viendraient se substituer au cuivre et/ou au fer dans
l'organisme en neutralisant ainsi son effet.
[0020] Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé
dont
la taille est suffisamment faible et permettant un ciblage de nombreuses
tumeurs
solides, y compris les métastases, et en particulier les métastases osseuses.
[0021] Un autre objectif de la présente divulgation est de fournir un composé
permettant à la fois la captation du cuivre et/ou du fer dans les tumeurs et
de
fournir un effet radiosensibilisant pour un traitement par radiothérapie.
Ainsi,
pendant l'irradiation, la captation localisée des biométaux devrait perturber
les
mécanismes de réparation cellulaire et amplifier les effets de la
radiothérapie.
[0022] La présente divulgation vient améliorer la situation vis-à-vis d'un ou
plusieurs de ces objectifs énoncés ci-dessus.
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[0023] 1 1 est en effet proposé d'utiliser des nanoparticules chélatantes
présentant
une biodistribution adaptée et des caractéristiques thermodynamiques et
cinétiques appropriée à un traitement de tumeurs, notamment de tumeurs
primaires et/ou métastatiques.
[0024] Selon un premier aspect, il est proposé une nanoparticule de formule
suivante :
[Ch1]n-PS-[Ch2], dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Chi est un groupement chélatant non complexé ou complexé avec un cation
métallique Ml,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante
de
complexation avec Chi est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en
particulier
au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les
alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2 est un groupement chélatant, identique ou différent du groupement
chélatant Chi, et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé
supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Chi et Ch2 sont greffés sur la matrice de
polymères PS,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40%
et
60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1
et
50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8
nm.
[0025] Selon un autre aspect, il est proposé une solution colloïdale de
nanoparticules comme définies ci-dessus.
[0026] Selon un autre aspect, il est proposé une composition pharmaceutique
comprenant ladite solution colloïdale de nanoparticules et un ou plusieurs
excipients pharmaceutiquement acceptables.
[0027] Les caractéristiques exposées dans les paragraphes suivants peuvent,
optionnellement, être mises en oeuvre. Elles peuvent être mises en oeuvre
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indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les
autres :
[0028] Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Chi est choisi
parmi
ceux ayant une constante de complexation par rapport au cuivre (II) supérieure
à
1015.
[0029] Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Chi est choisi
parmi
ceux ayant une constante de complexation avec le cuivre (II) au moins 10 fois
supérieure à leur constante de complexation avec le zinc et au moins 106 fois
supérieure à leurs constantes de complexation avec le magnésium et le calcium.
[0030] Dans un autre mode de réalisation, le groupement chélatant Chi est
choisi
parmi ceux ayant une constante de complexation avec le fer (II) au moins 10
fois
supérieure à leur constante de complexation avec le zinc et au moins 106 fois
supérieure à leurs constantes de complexation avec le magnésium et le calcium.
[0031] Dans un mode de réalisation, au moins 50% des Chi est complexé avec
un cation métallique choisi parmi les alcalino-terreux.
[0032] Dans un mode de réalisation, au moins 50% des Chi est complexé avec le
zinc, le calcium ou le magnésium.
[0033] Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Chi, et le cas
échéant Ch2, est choisi parmi les agents macrocycliques, de préférence parmi
l'acide 1,4,7-triazacyclononanetriacétique (NOTA),
1,4,7,10-
tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacétique (DOTA), l'acide
1,4,7-
triazacyclononane-l-glutarique-4,7-acide diacetique (NODAGA), et l'acide
1,4,7,10-tetraazacyclododececane,1-(glutaric acid)-4,7,10-triacetique
(DOTAGA),
2,2',2",2"-(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetraacetam ide
(DOTAM), et 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (Cyclam), et 1,4,7,10-
tetraazacyclododecane (Cyclen) et le déferoxamine (DFO) ou autre agent
chélatant du fer.
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[0034] Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Chi est le DOTAGA
de formule (I) suivante [Chem. 1]
HO
o
" \ /.--CO OH
0 N1\1\
S N
H 0 0 C / \,C0 OH
(I)
[0035] Dans un mode de réalisation, PS est une matrice de polysiloxane.
[0036] Dans un mode de réalisation, la nanoparticule est caractérisée en ce
que
- le ratio poids en silicium sur le poids total de la nanoparticule est
compris entre
5% et 25%,
- le nombre total n-Fm de groupements chélatants greffés sur le polymère
est
compris entre 5 et 50 par nanoparticule, de préférence entre 10 et 30, et,
- la nanoparticule a un diamètre moyen compris entre 2 et 8 nm.
[0037] Dans un mode de réalisation, la nanoparticule est fonctionnalisée avec
un
agent de ciblage, en particulier un peptide, une immunoglobuline, un nanobody,
un anticorps, un aptamère ou une protéine ciblante.
[0038] Dans un mode de réalisation, le cation métallique M2 est choisi parmi
des
agents radiosensibilisants et/ou des agents de contraste pour l'imagerie par
résonance magnétique, en particulier le gadolinium ou le bismuth.
[0039] Dans un mode de réalisation, la nanoparticule est caractérisée en ce
que
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Chi et Ch2 comprennent des groupements chélatants DOTAGA de formule (I)
suivante [Chem. 1]
Lz n
, õ
0
\es.
'"C001-1
v N "
N
HOOC,../11,\_,/
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(I)
greffés à la matrice de polysiloxane par liaison covalente,
(iii) M1 est absent et M2 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n-Fm est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(y) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
[0040] Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est
caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition injectable pour une
administration
intraveineuse, intratumorale ou intrapulmonaire chez un sujet, en particulier
comprenant une quantité efficace de groupement chélatant Chi pour la captation
in vivo du cuivre et/ou du fer dans une tumeur, le chélatant libre étant par
exemple
à une concentration d'au moins 10 mM dans la composition.
[0041] Dans un mode de réalisation, la présente divulgation fournit une
composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement du cancer
chez un sujet, en particulier pour la captation in vivo du cuivre et/ou du fer
dans
une tumeur. En particulier, dans ce mode de réalisation, ladite composition
pharmaceutique peut comprendre une quantité efficace de cation métallique M2,
de préférence du gadolinium, pour une utilisation en tant qu'agent
radiosensibilisant et le sujet est traité par radiothérapie après
administration de
ladite composition.
Brève description des dessins
[0042] D'autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la
lecture de
la description détaillée ci-après, et à l'analyse des dessins annexés, sur
lesquels :
Fig. 1
[0043] [Fig. 1] La figure 1 montre un chromatogramme HPLC-ICP/MS du
Gadolinium libre dans le milieu réactionnel en fonction du temps de rétention
Tr en
minute.
Fig. 2
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[0044] [Fig. 2] La figure 2 montre les résultats de la titration des DOTA
libres de
CuPRiX20 par mesure de l'intensité de luminescence à 590 nm en fonction de la
quantité d'europium ajoutée par mg de CuPRiX20 (excitation à 395 nm).
Fig. 3
5 [0045] [Fig. 3] La figure 3 est un chromatogramme de AGuIXO et de CuPRiX20
avant et après complexation de cuivre.
Fig. 4
[0046] [Fig. 4] La figure 4 montre l'effet de concentrations croissantes de
CuPRiX20 (0, 50, 100, 500, 1000 pM de chélate libre équivalent à environ 0,
150,
10 300, 600, 900, 1200, 1500 et 3000 pM de gadolinium) sur la motilité
cellulaire de
cellules A549. (A) Analyse quantitative de la fermeture de la blessure en
fonction
du temps. La densité relative de la blessure est une mesure de la densité de
la
région de la blessure par rapport à la densité de la région.
Fig. 5
[0047] [Fig. 5] La figure 5 montre l'effet de concentrations croissantes de
CuPRiX20 (0, 100, 200, 300, 400 et 500 pM de chélate libre équivalent à
environ 0,
300, 600, 900, 1200 et 1500 pM de gadolinium) sur la motilité cellulaire de
cellules
A549. (A) Analyse quantitative de la fermeture de la blessure en fonction du
temps.
La densité relative de la blessure est une mesure de la densité de la région
de la
blessure par rapport à la densité de la région cellulaire (`)/0). Les données
sont
présentées comme la moyenne SEM (n=6). (B) Images représentatives de
chaque condition, montrant la blessure d'origine, ainsi que la blessure 24 h
et 48 h
après. La barre d'échelle indique 300 pm.
Fig. 6
[0048] [Fig. 6] La figure 6 montre l'effet de CuPRiX20 (0 et 500 pM de chélate
libre
équivalent à environ 0 et 1500 pM de gadolinium) sur la motilité cellulaire de
cellules A549. Les cellules ont été traitées durant 72h par CuPRiX20 avant de
réaliser la blessure. (A) Analyse quantitative de la fermeture de la blessure
en
fonction du temps. La densité relative de la blessure est une mesure de la
densité
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de la région de la blessure par rapport à la densité de la région cellulaire
(`)/0). Les
données sont présentées comme la moyenne SEM (n=6). (B) Images
représentatives de chaque condition, montrant la blessure d'origine, ainsi que
la
blessure 24 h et 48 h après. La barre d'échelle indique 300 pm
Fig. 7
[0049] [Fig. 7] La figure 7 montre l'effet du CuPRiX20 (0 et 500 pM de chélate
libre
équivalent à environ 0 et 1500 pM de gadolinium) sur l'invasion cellulaire de
cellules A549. (A) Analyse quantitative de la fermeture de la blessure en
fonction
du temps. La densité relative de la blessure est une mesure de la densité de
la
région de la blessure par rapport à la densité de la région cellulaire (`)/0).
Les
données sont présentées comme la moyenne SEM (n=6). (B) Images
représentatives de chaque condition, montrant la blessure d'origine, ainsi que
la
blessure 24h et 48h après. La barre d'échelle indique 300 pm.
Fig. 8
[0050] [Fig. 8] La figure 8 montre l'effet du CuPRiX20 sur la migration par
chimiotactisme de cellules A549. La migration est exprimée comme un rapport de
la confluence des cellules ayant traversé la membrane sur la confluence
initiale
des cellules ensemencées sur la membrane. Les données sont présentées
comme la moyenne SEM (n=5).
Fig. 9
[0051] [Fig. 9] La figure 9 montre l'effet de l'association du CuPRiX30 à une
irradiation photonique sur la motilité des cellules A549. La densité relative
de la
blessure est une mesure de la densité de la région de la blessure par rapport
à la
densité de la région cellulaire (`)/0). Les données sont présentées comme la
moyenne SEM (n=6).
Fig. 10
[0052] [Fig. 10] La figure 10 montre l'effet radiosensibilisant du CuPRiX30
dans
les cellules A549.
Fig.11
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[0053] [Fig, 111 La figure 11 montre Veffet radiosensibilisant de CuPRiX et
AGuIX
sur les lignées (A) A549, (B) SQ20B-CD444- et (C) 4T1.
Fig.12
[0054] [Fig.12] La figure 12 montre l'efficacité de CuPRiX30 dans un modèle
murin
de cancer du sein triple négatif sur (A) la croissance tumorale et (B) la
formation
de métastases. (A) la croissance tumorale est exprimé comme volume tumoral
(1/2*L*I2, où L est la longueur de la tumeur et I est la largeur de la tumeur)
en
fonction du temps. Les résultats sont exprimés comme moyenne SD, *p=0.038.
AUC comparaison : Kruskal-Wallis test. (B) Nombre de colonies issues des
poumons selon le groupe de traitement. NaCI n=4, CuPRiX30 n=6.
Fig.13
[0055] La figure 13 représente un schéma d'injections/irradiation
Fig.14
[0056] La figure 14 montre l'efficacité d'une radiothérapie sur la croissance
tumorale et la survie
Description des modes de réalisation
[0057] Les dessins et la description ci-après contiennent, pour l'essentiel,
des
éléments de caractère certain. Ils pourront donc non seulement servir à mieux
faire comprendre la présente divulgation, mais aussi contribuer à sa
définition, le
cas échéant.
Nanoparticules
[0058] La présente divulgation concerne ainsi des nanoparticules de formule
suivante :
[Ch1]n-PS-[Ch2], dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Chi est un groupement chélateur non complexé ou complexé avec un cation
métallique Ml,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante
de
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complexation avec Chi est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en
particulier
au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les
alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2 est un groupement chélateur, identique ou différent du groupement
chélateur Chi, et complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z élevé
supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisé en ce que
(i) les groupements chélateurs Chi et Ch2 sont greffés sur la matrice PS de
polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40%
et
60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1
et
50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8
nm.
[0059] Les nanoparticules selon la présente divulgation sont avantageusement
des particules de taille de l'ordre du nanomètre. En particulier, les
nanoparticules
sont suffisamment petites pour cibler les cellules tumorales par effet EPR via
le
système vasculaire et être éliminées rapidement par les reins, après leur
administration par voie intraveineuse.
[0060] Selon la présente divulgation, on utilisera plus préférentiellement des
nanoparticules de très faible diamètre par exemple, compris entre 1 et 10 nm,
de
préférence entre 2 et 8 nm.
[0061] La distribution de taille des nanoparticules est par exemple mesurée à
l'aide d'un granulomètre commercial, tel qu'un granulomètre Malvern Zetasizer
Nano-S basé sur la PCS (Photon Correlation spectroscopy). Cette distribution
est
caractérisée par un diamètre hydrodynamique moyen.
[0062] Au sens de l'invention, par diamètre des nanoparticules, on entend
ainsi le diamètre hydrodynamique moyen, c'est-à-dire, la moyenne harmonique
des diamètres des particules. Une méthode de mesure de ce paramètre est
également décrite dans la norme ISO 13321:1996.
[0063] Les nanoparticules selon la présente divulgation sont des
nanoparticules
comprenant une matrice PS de polymère organique ou inorganique.
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[0064] Dans certains modes de réalisation, le polymère de la matrice PS est
choisi
parmi les polymères biocompatibles tels que le polyéthylène glycol, le
polyéthylèneoxide, polyacrylamide, biopolymères, polysaccharides ou les
polysiloxane, ou leurs mélanges, de préférence le polymère PS est un
polysiloxane.
[0065] Par nanoparticules comprenant une matrice de polymères de
polysiloxane , on entend en particulier des nanoparticules caractérisées par
un
pourcentage massique en silicium d'au moins 5%, par exemple entre 5 et 20% de
la masse totale de la nanoparticule.
[0066] Par polysiloxane , on désigne un polymère réticulé inorganique
consistant en un enchainement de siloxanes. Les unités structurales du
polysiloxane, identiques ou différentes, sont de formule suivante : Si(OSi)nR4-
n
dans laquelle
- R est une molécule organique liée au silicium par une liaison covalente Si-C
- n est un entier compris entre 1 et 4.
[0067] A titre d'exemple préféré, le terme polysiloxane englobe notamment
les
polymères issus de la condensation par procédé sol gel de
tetraéthylorthosilicate
(TEOS) et de aminopropyltriethoxysilane (APTES).
[0068] Par groupement chélatant , au sens de la présente divulgation, on
entend un groupement organique capable de complexer un cation métallique. De
préférence, lesdits groupements chélatants ci-dessus sont liés directement ou
indirectement par liaison covalente aux siliciums de polysiloxanes de la
matrice
PS des nanoparticules. Par liaison indirecte , on entend la présence d'un
linker moléculaire ou espaceur entre la nanoparticule et le groupement
chélatant, ledit linker ou espaceur étant lié de manière covalente à l'un des
constituants de la nanoparticule.
[0069] Le groupement chélatant Chi a en particulier pour fonction de capter le
cuivre endogène ou le fer endogène. Dans un mode de réalisation, pour
permettre
la captation in vivo du cuivre, on choisira avantageusement un groupement
chélatant Chi parmi ceux ayant une constante de complexation par rapport au
cuivre (II) supérieure à 1015, par exemple supérieur à 1020.
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[0070] Dans un mode de réalisation, pour permettre la captation in vivo du
fer, on
choisira avantageusement un groupement chélatant Chi parmi ceux ayant une
constante de complexation par rapport au fer (II) supérieure à 1016, par
exemple
supérieur à 1020.
5 [0071] Dans un mode de réalisation, le groupement chélatant Chi est libre,
ou
complexé (en partie au moins) avec un cation métallique Ml. Dans ce cas, le
cation métallique M1 est complexé à un groupement chélateur choisi
judicieusement pour permettre la transmétallation in vivo du cation métallique
M1
avec le cuivre et/ou le fer. Ainsi, dans un mode de réalisation spécifique, le
10 groupement chélatant Chi est avantageusement choisi parmi ceux ayant une
constante de complexation avec le cuivre (II) ou le fer au moins 10 fois
supérieure
à leur constante de complexation avec le zinc et au moins 106 fois supérieure
à
leurs constantes de complexation avec le magnésium et le calcium.
[0072] Le groupement chélatant Chi peut être obtenu par greffage (liaison
15 covalente) sur la nanoparticule d'agents macrocycliques, de préférence
choisis
parmi DOTA (acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N',N",N"-téracétique),
NOTA (acide 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacétique), NODAGA (acide 1,4,7-
triazacyclononane-1-glutarique-4,7-acide diacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10-
tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tétraazacyclododécan-1-yl)pentanedioïque), DOTAM
(1,4,7,10-tetrakis(carbamoylméthyl)-1,4,7,10 tétraazacyclododécane) et
1,4,8,11-
tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen), le
déferoxamine. Le déferoxamine est plus particulièrement intéressant en vue de
la
captation du fer.
[0073] Dans un mode de réalisation, en particulier dans les modes de
réalisation
décrits aux deux paragraphes précédents, le cation métallique M1 complexé avec
le groupement chélatant Chi est choisi parmi le zinc, ou les alcalino-terreux,
en
particulier le magnésium ou le calcium. De préférence, au moins 50%, 60%, 70%,
80%, voire au moins 90% des Chi est complexé avec le zinc, le calcium ou le
magnésium ou un autre alcalino-terreux.
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[0074] Dans un mode préféré, le groupement chélatant Chi est le DOTAGA de
formule (I) suivante [Chem. 1]
HO
eeir\ ................. -
= / OH
0 N
N N
HOOC /
(I)
[0075] Selon la présente divulgation, le groupement chélatant Ch2, identique
ou
différent de Chi, est complexé à un cation métallique M2 à numéro atomique Z
élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50. Ainsi une nanoparticule
comprend, greffé sur la matrice de polymère PS, un ou plusieurs groupements
Chi complexés ou non avec un cation métallique Ml, par exemple du zinc, du
magnésium, du calcium, ou autres alcalino-terreux, et un ou plusieurs
groupements Ch2 complexés avec un cation métallique M2 à numéro atomique Z
élevé, supérieur à 40.
[0076] Le groupement chélateur Ch2 est ainsi choisi de préférence parmi les
groupements chélateurs dont la constante de complexation avec le cation
métallique M2 est supérieure à 1015, voire supérieure à 1020. Dans un mode de
réalisation particulier, les cations métalliques M2 sont choisis parmi ceux
permettant d'utiliser ladite nanoparticule comme agent radiosensibilisant.
[0077] Au sens de la présente divulgation, on entend par agent
radiosensibilisant un composé permettant de rendre les cellules cancéreuses
plus sensibles aux rayons utilisés en radiothérapie.
[0078] Le groupement chélatant Ch2, identique ou différent de Chi peut être
choisi également parmi les agents macrocycliques, et de préférence parmi DOTA
(acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N',N",N"-téracétique), NOTA (acide
1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacétique), NODAGA (acide
1,4,7-
triazacyclononane-1-glutarique-4,7-acide diacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10-
tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tétraazacyclododécan-1-yl)pentanedioïque), DOTAM
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(1,4,7,10-tetrakis(carbamoylméthyl)-1,4,7,10 tétraazacyclododécane) et
1,4,8,11-
tetraazacyclotetradecan (Cyclam), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Cyclen), et
le
déferoxamine (DFO).
[0079] Plus particulièrement, les cations métalliques M2 sont choisis parmi
les
métaux lourds, de préférence parmi le groupe constitué de: Pt, Pd, Sn, Ta, Zr,
Tb,
Tm, Ce, Dy, Er, Eu, La, Nd, Pr, Lu, Yb, Bi, Hf, Ho, Sm, In et Gd, ou un
mélange de
ces derniers. De préférence, les cations métalliques M2 sont du Bi et/ou Gd.
[0080] Dans un mode de réalisation particulier, la nanoparticule pour
l'utilisation
selon l'invention comprend entre 3 et 100, de préférence entre 5 et 20 cations
métalliques M2, en particulier de Bi et/ou Gd.
[0081] La nanoparticule selon l'invention permet à la fois la captation du
cuivre
et/ou du fer, par le groupement chélatant Chi et/ou l'imagerie ou le
traitement de
tumeurs, par le groupement chélatant Ch2 complexé avec un cation métallique M2
présentant des propriétés d'agent de contraste ou d'agent radiosensibilisant
ou
d'agent pour la curiethérapie.
[0082]A titre d'exemples de cation métallique M2 utilisable comme agent de
contraste IRM, on citera Gd, Dy, Mn et Fe.
[0083]A titre d'exemples de cation métallique M2 utilisable comme agent
radiosensibilisant, on citera le Gd, Lu, Yb et Bi, Hf et Ho, de préférence le
gadolinium ou le bismuth.
[0084] L'homme du métier sélectionnera le ratio n/(n+m) en fonction de l'effet
souhaité, et notamment en fonction du traitement souhaité, du type de
patients, de
la dose utilisée, et/ou du patient à traiter. Par exemple, le ratio n/(n+m)
est
supérieur ou égal à 20% ; notamment compris entre 20% et 100%, de préférence
compris entre 40% et 60%. Dans un mode de réalisation, n/(n+m) est égal à
100%.
C'est-à-dire, m, représentant le nombre d'agent chélatant Ch2 complexé avec un
cation métallique M2 est égal à 0, et 100% des groupements chélatants Ch sont
complexés à un cation métallique M1 ou non complexés.
[0085] Dans un mode plus particulier, le groupement chélateur Chi est
identique
au groupement chélatant Ch2 et correspond au DOTAGA de formule (I) suivante
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[Chem. 1]
HO
. = ....o.
/ "-(õ.001¨i
0
"
HOõ- \-õ, CO OH
(1)
greffé sur une matrice PS de la nanoparticule, par exemple une matrice de
polysiloxane.
[0086] Dans un autre mode plus particulier, le groupement chélatant Chi est
identique au groupement chélatant Ch2 et correspond au DOTA de formule
suivante [Chem. 2]
../s--CO 0 H
N
H 00C 0 0 H
(II)
greffé sur une matrice PS de la nanoparticule, par exemple une matrice de
polysiloxane.
[0087] Ainsi ; dans un mode de réalisation, la présente divulgation concerne
une
nanoparticule [Ch1]n-PS-[Ch2], dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Chi est le DOTA ou DOTAGA non complexé ou complexé avec un cation
métallique Ml,
- M1 est absent ou choisi parmi les cations métalliques dont la constante
de
complexation avec Chi est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en
particulier
au moins dix fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc ou les
alcalino-terreux, notamment le calcium ou le magnésium,
- Ch2, identique à Chi, est le DOTA ou DOTAGA et complexé à un cation
métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence
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supérieur à 50, de préférence Gd,
caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Chi et Ch2 sont greffés sur la matrice de
polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40%
et
60%,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1
et
50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8
nm.
[0088] Dans un mode particulier et préféré, (n+m) correspondant au nombre de
groupements chélatants Chi et Ch2 greffés par nanoparticule (optionnellement
Chi et Ch2 étant le DOTA ou DOTAGA) est compris entre 3 et 100, de préférence
entre 5 à 50, et par exemple entre 10 et 30.
[0089] Outre la fonctionnalisation chélatante, les nanoparticules selon la
présente
divulgation peuvent être modifiées (fonctionnalisation) en surface par des
composés hydrophiles (PEG) et/ou chargées différemment pour adapter leur bio-
distribution au sein de l'organisme et/ou des molécules ciblantes pour
permettre
un ciblage cellulaire spécifique, en particulier pour le ciblage de tissus ou
cellules
tumorales spécifiques. Les agents de ciblage sont greffés à la matrice de
polymères et sont présents préférentiellement dans une proportion comprise
entre
1 et 20 agents de ciblages par nanoparticule et de préférence entre 1 et 5
agents
de ciblages.
[0090] Pour le greffage en surface des molécules ciblantes, on pourra utiliser
un
couplage classique avec des groupes réactifs présents, éventuellement précédé
d'une étape d'activation. Les réactions de couplage sont connues de l'homme du
métier et seront choisies en fonction de la structure de la couche
superficielle de la
nanoparticule et des groupements fonctionnels de la molécule ciblante. Voir
par
exemple, Bioconjugate Techniques , G.T Hermanson, Academic Press, 1996,
dans Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity , Second
Edition, W.T. Mason, ed. Academic Press, 1999. Des méthodes de couplage
préférées sont décrites plus loin. De préférence, ces molécules ciblantes sont
greffées aux liaisons amines des nanoparticules selon la variante des
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nanoparticules ultrafines ou AGuIX telle que décrite au paragraphe suivant. On
choisira les molécules ciblantes en fonction de l'application envisagée.
[0091] Dans un mode de réalisation spécifique, les nanoparticules sont
fonctionnalisées avec un agent de ciblage, tel qu'un peptide, une
immunoglobuline,
5 un nanobody, fragment VHH ou single domain , un anticorps, un aptamère ou
tout autre protéine ciblante, par exemple des zones tumorales, typiquement un
anticorps, immunoglobuline ou nanobody ciblant des antigènes associés à des
tumeurs ( tumor-associated antigens ) ou certains marqueurs cancéreux connus
de l'homme du métier.
10 Nanoparticules ultrafines et nanoparticules AGuIX
[0092] Dans un mode de réalisation plus particulièrement préféré, en raison
notamment de leur très faible dimension et leur stabilité, les nanoparticules
utilisables sont des nanoparticules comprenant une matrice PS de polysiloxane
et
qui ne comprennent pas de coeur à base d'oxyde métallique, à la différence des
15 nanoparticules de type coeur-coquille comprenant un coeur à base d'oxyde
métalliques et un enrobage de polysiloxane (qui sont décrites notamment dans
W02005/088314 et W02009/053644).
[0093] Aussi, dans un mode de réalisation spécifique, les nanoparticules selon
la
présente divulgation sont des nanoparticules à base de polysiloxane chélate au
20 gadolinium, de formule [Ch1]n-PS-[Ch2],õ dans laquelle
(i) PS est une matrice de polysiloxane,
(ii) Chi et Ch2 sont des groupements chélatants DOTAGA de formule (I) suivante
[Chem. 1]
HO
õ ,,,,,,,,, ,
F'COCE1-1
o
N
N
HOOC
(I)
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[0094] et greffés a la matrice de polysiloxane par liaison covalente,
(iii) M1 est absent et M2 est le cation gadolinium Gd3+,
(iv) n-Fm est compris entre 5 et 50, de préférence entre 10 et 30, et
(iv) le diamètre hydrodynamique moyen est compris entre 2 et 8 nm.
[0095] Plus spécifiquement, ces nanoparticules à base de polysiloxane chélate
au
gadolinium sont des nanoparticules ultrafines obtenues à partir de
nanoparticules
AGuIX comme matériel de départ.
[0096] De telles nanoparticules ultrafines AGuIX peuvent être obtenues par une
méthode de synthèse top-down décrites notamment dans Mignot et al Chem Eur J
2013 A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica
nanoparticles for theranostic applications D01: 10.1002/chem.201203003.
[0097] D'autres procédés de synthèse des nanoparticules ultrafines sont
également décrits dans W02011/135101, W02018/224684 et W02019/008040.
[0098] Les nanoparticules AGuIX, qui peuvent servir de matériel de départ pour
obtenir les nanoparticules selon la présente divulgation ont en particulier la
formule (III) suivante [Chem. 3]
"0 y:.0
= :
\N
.:Ga3+
0
is
HO
0- ?,
(III)
dans laquelle PS est une matrice de polysiloxane, et n est en moyenne, entre
10
et 50, et les nanoparticules présentent un diamètre hydrodynamique moyen de 4
2 nm et une masse d'environ 10 kDa.
[0099] Les nanoparticules AGuIX peuvent également être caractérisées par la
formule (IV) suivante [Chem. 4]
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(GdSi4-7C24-30N5-8015-25F140-60, 5-10 H2O)
(IV)
Procédé de synthèse des nanoparticules selon la présente divulgation
[0100] Les nanoparticules selon la présente divulgation peuvent être obtenues
par
le procédé de préparation d'une solution colloïdale de nanoparticules
comprenant
des groupements chélatants greffés sur une matrice de polymère, une partie
seulement des groupements chélatants étant complexés à un cation métallique,
l'autre partie étant non complexée, ledit procédé comprenant
(1) la synthèse ou la fourniture, à titre de matériel de départ, d'une
solution
colloïdale de nanoparticules NP1 de formule suivante [Ch2]-PS dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Ch2 est un groupement chélatant complexé à un cation métallique M2 à
numéro
atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence supérieur à 50,
caractérisé en ce que
(i) Ch2 est greffé sur la matrice de polymères,
(ii) n est compris entre Set 100, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule NP1 est compris
entre
1 et 50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2
et 8
nm
(2) une étape de traitement de la solution colloïdale de nanoparticules NP1
dans
un milieu acide, par exemple en ajoutant une solution d'acide chlorhydrique,
afin
d'obtenir un pH inférieur à 2,0, de préférence inférieur à 1,0 pendant une
durée
suffisante pour obtenir un relargage partiel ou complet des cations
métalliques M2,
(3) le cas échéant, une étape de dilution de la solution, par exemple avec de
l'eau,
(4) une étape de purification pour séparer les nanoparticules obtenues à
l'étape
(2) des cations métalliques M2 libres,
(5) le cas échéant une étape de concentration de la solution des
nanoparticules
obtenues à l'étape (4),
(6) le cas échéant la répétition des étapes (3), (4) et (5),
(7) le cas échéant, la congélation et/ou la lyophilisation de la solution de
nanoparticules obtenues à l'une des étapes (4), (5) ou (6).
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[0101] Un tel procédé permet d'obtenir les nanoparticules [Ch1]n-PS-[Ch2],
dans
lesquelles Chi et Ch2 sont identiques. Le procédé permet ainsi avantageusement
d'obtenir un relargage partiel ou complet des cations métalliques M2,
initialement
complexé au groupement chélatant Ch2 sur la nanoparticule NP1. L'homme du
métier pourra moduler le degré de relargage des cations métalliques M2, et
donc
le ratio n/(n-Fm) moyen dans la solution finale, en jouant notamment sur le pH
et la
durée de l'étape (2) de traitement.
[0102] Dans un mode de réalisation préféré, les nanoparticules NP1 sont des
nanoparticules ultrafines ou AGuIX comme définies à la section précédente et
complexées avec le cation gadolinium. Des modes de réalisation spécifiques
sont
donnés dans les Exemples. Typiquement, la durée du traitement de l'étape (2)
peut être comprise entre 0,5 et 8 heures, par exemple entre 2 et 6 heures à pH
inférieur à 1,0.
[0103] Les nanoparticules obtenues selon le procédé ci-dessus peuvent le cas
échéant être ensuite fonctionnalisées par d'autres groupements chélatants,
différent de Ch2 et/ou des agents de ciblage ou molécules hydrophiles.
[0104] Dans un mode de réalisation, les nanoparticules obtenues selon le
procédé
ci-dessus sont mis en présence de cation métallique Ml, afin d'obtenir la
complexation d'une partie au moins des groupements chélatants libres avec le
cation métallique Ml, de sorte à obtenir les nanoparticules de formule
suivante :
[Ch1]n-PS-[Ch2], dans laquelle :
- PS est une matrice de polymère organique ou inorganique,
- Chi est un groupement chélatant en partie complexé avec un cation
métallique
Ml,
- M1 est choisi parmi les cations métalliques dont la constante de
complexation
avec Chi est inférieure à celle du cuivre et/ou du fer, en particulier au
moins dix
fois inférieure, par exemple M1 est choisi parmi le zinc, le calcium ou la
magnésium ou autres alcalino-terreux,
- Ch2 est un groupement chélatant, identique à Chi, et complexé à un cation
métallique M2 à numéro atomique Z élevé supérieur à 40, et de préférence
supérieur à 50,
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caractérisé en ce que
(i) les groupements chélatants Chi et Ch2 sont greffés sur la matrice de
polymères,
(ii) le ratio n/(n+m) est compris entre 10% et 100%, de préférence entre 40%
et
60%, et,
(iii) le diamètre hydrodynamique moyen de la nanoparticule est compris entre 1
et
50 nm, de préférence entre 2 et 20 nm, et plus préférentiellement entre 2 et 8
nm.
Formulations pharmaceutiques des nanoparticules selon la présente
divulgation
[0105] Les compositions comprenant les nanoparticules selon la présente
divulgation sont administrées sous la forme de suspensions colloïdales de
nanoparticules. Elles peuvent être préparées comme décrits ici ou selon
d'autres
méthodes connues de l'homme du métier et administrées via différentes voies,
locale ou systémique, selon le traitement et la zone à traiter.
[0106] Aussi, la présente divulgation porte sur une suspension colloïdale de
nanoparticules de formule [Ch1]n-PS-[Ch2], telles que décrites aux sections
précédentes et les compositions pharmaceutiques comprenant ces suspensions
colloïdales, le cas échéant, en association avec un ou plusieurs excipients
pharmaceutiquement acceptables.
[0107] Les compositions pharmaceutiques peuvent être en particulier formulées
sous la forme de poudres lyophilisées, ou de solutions aqueuses pour une
injection intraveineuse. Dans un mode de réalisation préféré, la composition
pharmaceutique comprend une solution colloïdale avec une quantité
thérapeutiquement efficace de nanoparticules de formule [Ch1]n-PS-[Ch2],
telles
que décrites aux sections précédentes, en particulier des nanoparticules à
base
de polysiloxane chélate au gadolinium, et plus précisément, telles qu'obtenues
à
partir de nanoparticules AGuIX comme décrit plus haut.
[0108] Dans certains modes de réalisations, il s'agit de poudre lyophilisée,
comprenant entre 200 mg et 15 g par flacon, de préférence entre 250 et 1250 mg
de nanoparticules. La poudre peut comprendre en outre d'autres excipients, et
notamment du CaCl2.
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[0109] Les poudres lyophilisées peuvent être reconstituées dans une solution
aqueuse, typiquement de l'eau stérile pour injection. Ainsi, la présente
divulgation
porte sur une composition pharmaceutique pour son utilisation comme solution
pour injection, comprenant à titre de principe actif, les nanoparticules de
formule
5 [Ch1]n-PS-[Ch2], telles que décrites aux sections précédentes, en
particulier des
nanoparticules à base de polysiloxane chélate au gadolinium, et plus
précisément,
telles qu'obtenues à partir de nanoparticules AGuIX comme décrit plus haut.
[0110] Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique est
caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition injectable pour une
administration
10 intraveineuse ou intratumorale ou un aérosol pour un administration
intrapulmonaire, en particulier comprenant une quantité efficace de groupement
chélatant Chi pour la captation in vivo du cuivre et/ou du fer dans la tumeur,
le
chélatant Chi étant par exemple à une concentration d'au moins 10 mM dans la
composition.
15 [0111] Par exemple, pour ses utilisations comme décrites ci-après, en
particulier
pour le traitement de tumeur par la captation in vivo de cuivre et/ou du fer,
la
composition est une solution injectable comprenant des nanoparticules à base
de
polysiloxane chélate au gadolinium dans une concentration comprise entre 50 et
200 mg/ml, par exemple entre 80 et 120 mg/mL.
20 Utilisations des nanoparticules
[0112] Du fait de la présence de groupements chélatants Chi libres ou
complexés
avec des cations métalliques Ml, les nanoparticules selon la présente
invention
permettent la captation du cuivre et/ou du fer endogène après leur
administration
chez un sujet qui en a besoin. Par captation endogène du cuivre, on entend de
25 préférence la captation locale d'une quantité comprise entre 100 ppb (0.1
mg de
cuivre par litre) et 10 000 ppb (10 mg de cuivre par litre) du cuivre
endogène. Ainsi,
la présente divulgation vise plus particulièrement un procédé de captation du
cuivre endogène chez un sujet, en particulier un sujet souffrant de cancer.
[0113] Par captation endogène du fer, on entend de préférence la captation
locale
d'une quantité comprise entre 100 ppb (0.1 mg de fer par litre) et 10 000 ppb
(10
mg de fer par litre) du fer endogène. Ainsi, la présente divulgation vise plus
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particulièrement un procédé de captation du fer endogène chez un sujet, en
particulier un sujet souffrant de cancer.
[0114] Dans le cas d'une administration des nanoparticules par voie
intraveineuse,
ou pulmonaire, la captation du cuivre et/ou du fer peut se faire au sein de la
circulation sanguine générale puis après au sein des tumeurs, après
accumulation
des nanoparticules dans les tumeurs, notamment par ciblage passif lié à
l'effet
EPR. Cet effet de ciblage passif des tumeurs et d'accumulation a été bien mis
en
évidence en particulier par les nanoparticules ultrafines de type AGulX.
[0115] La divulgation porte donc également sur un procédé de traitement de
tumeurs chez un sujet, ledit procédé comprenant l'administration chez ledit
sujet,
d'une quantité efficace d'une composition pharmaceutique de nanoparticules de
formules [Ch1]n-PS-[Ch2], telles que décrites aux sections précédentes, en
particulier des nanoparticules à base de polysiloxane chélate au gadolinium,
et
plus précisément, telles qu'obtenues à partir de nanoparticules AGuIX comme
décrit plus haut, et caractérisé en ce que les nanoparticules permettent le
traitement de la tumeur en partie par la captation du cuivre et/ou du fer
endogène.
[0116] Dans un mode particulier dudit procédé, la composition comprend
également une quantité efficace de cation métallique M2, de préférence du
gadolinium ou du bismuth, pour une utilisation en tant qu'agent
radiosensibilisant
et le procédé comprend, après administration de la composition, une étape
d'irradiation du sujet par une dose efficace pour le traitement de la tumeur
par
radiothérapie.
[0117] Par patient ou sujet , on entend de préférence un mammifère ou un
être humain incluant par exemple un sujet ayant une tumeur.
[0118] Les termes traitement , thérapie , se réfèrent à n'importe quel
acte
qui a pour but d'améliorer l'état de santé d'un patient, tel que la thérapie,
la
prévention, la prophylaxie, et le retardement d'une maladie. Dans certains
cas,
ces termes se réfèrent à l'amélioration ou l'éradication d'une maladie ou des
symptômes associés à la maladie. Dans d'autres modes de réalisation, ces
termes se réfèrent à la réduction de la propagation ou l'aggravation de la
maladie
résultant de l'administration d'un ou plusieurs agents thérapeutiques à un
sujet
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atteint d'une telle maladie. Dans le cadre du traitement de tumeurs, le terme
traitement peut englober typiquement un traitement permettant l'arrêt de la
croissance d'une tumeur, la réduction de la taille de la tumeur et/ou
l'élimination
de la tumeur.
[0119] En particulier, les nanoparticules sont utilisées pour le traitement
des
tumeurs solides, par exemple le cancer du cerveau (primaires et secondaires,
le
glioblastome...), les cancers hépatiques (primaires et secondaires), les
tumeurs
pelviennes (cancer du col de l'utérus, cancer de la prostate, cancer
anorectal,
cancer colorectal), les cancers des voies aérodigestives supérieures, le
cancer
des poumons, le cancer de l'oesophage, le cancer du sein, le cancer du
pancréas.
[0120] Par quantité efficace de nanoparticules, il est fait référence à la
quantité
de nanoparticules telles que décrites précédemment qui administrée à un
patient
est suffisante pour être localisées dans la tumeur et permettre un traitement
de la
tumeur par la captation du cuivre et/ou du fer endogène, le cas échéant en
combinaison avec un effet radiosensibilisant et un traitement de
radiothérapie.
[0121] Cette quantité est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels
que
l'âge, le sexe et le poids du sujet.
[0122] L'administration des nanoparticules telles que décrites précédemment
peut
être réalisée par voie intratumorale, sous-cutanée, intramusculaire,
intraveineuse,
intradermique, intrapéritonéale, orale, sublinguale, rectale, vaginale,
intranasale,
par inhalation ou par application transdermique. De préférence, elle se fait
par
voie intratumorale et/ou intraveineuse.
[0123] Les méthodes d'irradiation pour le traitement de tumeurs après
administration de nanoparticules en tant qu'agent radiosensibilisant sont bien
connues de l'homme du métier et ont été décrites en particulier dans les
publications suivantes : W02018/224684, W02019/008040 et C. Verry, et al,
Science Advances, 2020, 6, eaay5279 ; et, C. Verry, et al, NANO-RAD, a phase I
study protocol , BMJ Open, 2019, 9, e023591.
[0124] La dose totale d'irradiation lors d'une radiothérapie sera ajustée
selon le
type de cancer, le stade et le sujet à traiter. Pour une dose curative, une
dose
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totale typique pour une tumeur solide est de l'ordre de 20 à 120 Gy. D'autres
facteurs peuvent être pris en compte tel qu'un traitement par chimiothérapie,
une
co-morbidité, et/ou le fait que la radiothérapie a lieu avant ou après une
intervention chirurgicale. La dose totale est en général fractionnée. L'étape
de
radiothérapie dans le procédé selon la présente divulgation peut comprendre
par
exemple plusieurs fractions entre 2 et 6 Gy par jour, par exemple 5 jours par
semaines, et notamment sur 2 à 8 semaines consécutives, la dose totale pouvant
être entre 20 et 40 Gy, par exemple 30 Gy.
[0125] Les nanoparticules selon la présente divulgation peuvent être
administrées
seules, ou en combinaison avec un ou plusieurs autres principes actifs, et
notamment d'autres médicaments tels que des agents cytotoxiques ou anti-
prolifératifs ou d'autres agents anti-cancéreux et notamment des inhibiteurs
de
checkpoint immunitaires. Par administration combinée, on entend une
administration simultanée ou séquentielle (à des temps différents).
Exemples
Matériel et méthodes
[0126] Les produits CuPRiXx sont obtenus en introduisant le produit de départ
AGuIXO, fourni par la société Nh TherAguix (France), dans un milieu fortement
acide obtenu à partir d'acide chloridrique 37% extra-pur provenant de chez
CarlRoth.
[0127] Les étapes de filtration sont réalisées grâce à une pompe péristaltique
et
une cassette Vivaflow 200 ¨ 5kDa de chez Sartorius Stedim Biotech (France)
utilisé comme dans les conditions décrites dans la notice reliée au produit
Vivaflow
200O.
[0128] La mesure du diamètre hydrodynamique ainsi que la titration du point
isoélectrique sont effectuées avec un Zetasizer Nano-S (633 nmHe-Ne laser) de
chez Malvern Instruments (USA). Pour la mesure du point isoélectrique, cet
appareil est couplé à un titrateur automatique MPT-2 de chez Malvern
Instruments
(USA).
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[0129] L'HPLC-UV est réalisée avec une Agilent 1200 avec un détecteur DAD. La
colonne phase inverse utilisée est une 04, 5 pm, 300 A, 150 x 4,6 mm de chez
Jupiter. La détection est opérée par un détecteur UV à une longueur d'onde de
295 nm. Le gradient des phases A (H20/ACN/TFA : 98,9/1/0,1) et B
(H20/ACN/TFA : 10/89,9/0,1) est le suivant : 5 minutes à 95/5 suivi d'un
gradient
linéaire sur 10 min qui permet d'atteindre le ratio 10/90 qui est maintenu
pendant
minutes. Au bout de ces 15 minutes le taux de A est repassé à 95% en 1
minute et est suivi d'un plateau 7 minute à 95/5. Les produits utilisés dans
la
composition des phases éluantes sont tous certifiés HPLC grade.
10 [0130] L'analyse élémentaire a été faite à l'Institut des Sciences
Analytiques, UMR
5280, Pole Isotopes & Organique, 5 rue de la Doua 69100 Villeurbanne.
[0131] L'HPLC-ICP/MS est réalisée avec Nexion 2000 de chez Perkin-Elmer
(USA). La mesure des éléments libres dans le milieu est effectuée en mode
isocratique avec une phase d'élution de la composition suivante : 95% A et 5%
B.
15 La composition des phases A et B est identique à la méthode HPL-UV. La
colonne
phase inverse utilisée est une 04, 5 pm, 300 A, 150x4,6 mm de chez Jupiter.
Les
produits utilisés dans la composition des phases éluantes sont tous certifiés
HPLC
grade.
[0132] La lyophilisation des particules est réalisée par l'intermédiaire d'un
lyophilisateur Alpha 2-4 LSC de chez Christ (Allemagne) en suivant le
programme
"dessiccation primaire".
[0133] Les cellules A549 (ECACC 86012804) sont cultivées dans du milieu F12-K
(GibcoTM, Thermofischer) supplémenté avec 10% de Sérum de Veau Foetal
(Dutscher) et 1`)/0 de pénicilline-streptomycine (GibcoTM, Thermofischer).
Pour
chaque expérience, les cellules sont rincées 2 fois au PBS 1X (GibcoTM,
Thermofischer), incubées 5 minutes dans un incubateur à 37 C, 5% CO2 avec de
la trypsine-EDTA, puis reprises dans du milieu complet.
[0134] Au minimum 1h avant le test, les produits CuPRiX20 et CuPRiX30 sont
repris dans de l'eau distillée stérile à une concentration en DOTA libre égale
à 10
mM (respectivement 30 mM et 16,7 mM de gadolinium) et conservé à 4 C.
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[0135] Pour le test de migration et d'invasion, les cellules A549 sont
ensemencées
(50,000 cellules/puits) dans des plaques 96-puits ImageLock (Essen BioScience)
et incubées pendant 16h à 37 C et 5% de CO2 jusqu'à atteindre 90-100% de
confluence. Le WoundMakerTm (Essen BioScience) est utilisé pour créer les
5 blessures dans la monocouche cellulaire de chaque puit. Ensuite, chaque puit
est
rincé 2 fois au PBS 1X. Pour l'invasion, 50 pl de Matrigel (Corning) ¨
préalablement dilué dans du milieu Fi 2-K contenant ou non du CuPRiX20 ¨ à une
concentration finale de 1 mg/ml, sont ajoutés à chaque puit. La plaque est
incubée
30 minutes à 37 C, pour permettre la polymérisation du Matrigel. Enfin, 100 pl
de
10 milieu contenant des concentrations croissantes de CuPRiX sont ajoutés dans
chaque puit (contenant ou non du Matrigel). La plaque est placée dans
l'Incucyte
(objectif 10x) et les images du comblement des blessures sont acquises
automatiquement toutes les 2h par le logiciel Zoom Incucyte (Essen BioScience)
dans l'incubateur à 002. Les données sont analysées par le logiciel et les
résultats
15 exprimés en pourcentage de confluence de blessures.
[0136] Pour le test de migration par chimiotactisme, les cellules A549 sont
trypsinées,
centrifugées puis remises en suspension avec du milieu appauvri (milieu F12-K
sans
SVF). Les cellules sont ensuite ensemencées (1000 cellules par puits, 40 pl
par puits)
dans l'insert IncuCyte Clearview (Essen BioScience). Dans les puits
correspondants,
20 20 pl de milieu appauvri contenant ou non du CuPRiX20 (500 pM de chélate
libre) sont
ajoutés. Enfin, 200 pl de milieu F-12K à 10 % de SVF contenant ou non du
CuPRiX20
(500 pM de chélate libre) sont ajouté dans le compartiment inférieur de la
chambre de
chimiotaxie. Des images de chaque insert sont prises toutes les heures. La
migration
chimiotactique du réservoir supérieur vers le réservoir inférieur est
quantifiée en tant que
25 confluence de cellules sur le dessous de la membrane par rapport à la
confluence initiale
des cellules ensemencées sur le dessus de la membrane. Le calcul est effectué
automatiquement avec le logiciel de microscopie IncuCyte ZOOM 2015A.
[0137] Pour le test de migration après irradiation, les cellules A549 sont
cultivées dans
des plaques de culture 96 puits ImageLock (Essen BioScience) à 20 000
cellules par
30 puits pendant une nuit à 37 C, 5% 002. Les cellules sont traitées avec du
milieu F-12K
sans SVF contenant ou non du CuPRiX30(500 pM de chélate libre équivalent à 800
pM de
gadolinium) pendant 24 h puis elles sont irradiées à 8 Gy (irradiateur X-
Rad320, 250 kV,
15 mA). Après irradiation, la blessure est réalisée avec le 96-well
WoundMaker' (Essen
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BioScience). Les cellules sont rincées 2 fois avec du PBS 1X pour ôter les
cellules
flottantes et 100 pl de milieu contenant du CuPRiX30 (0 et 500 pM de chélate
libre
équivalent à environ 0 et 800 pM de gadolinium) sont ajoutés dans chaque puit
correspondant.
[0138] Pour évaluer la survie clonogénique les cellules sont ensemencées à
40 000 cellules/cm2, soit 1 millions de cellules dans une flasque de 25cm2
(Dutscher) et
incubées sur la nuit à 37 C, 5 % de 002. Les cellules sont traitées avec du
milieu sans
SVF contenant ou non du CuPRiX30 (500 pM de chélate libre équivalent à 800 pM
de
gadolinium) pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été irradiées à différentes
doses (0, 2,
3, 4, 6 et 8 Gy). Après l'irradiation, les cellules sont lavées au PBS 1X,
trypsinées et
comptées. Les cellules sont ensuite reensemencées dans des flasques de 25 cm2
et se
développent pendant six divisions (7 jours) avant d'être fixées et colorées.
Les colonies
sont fixées avec une solution d'éthanol à 96% (VWR) pendant 30 minutes puis
colorées
avec une solution de Giemsa (Sigma-Aldrich) diluée au 1/20 pendant 30 minutes.
Les
flasques sont ensuite rincées, puis les colonies contenant 64 cellules ou plus
ont été
comptées numériquement à l'aide du compteur de colonies ColcountTm (Oxford
Optronix).
La survie clonogénique a été déterminée selon un modèle quadratique linéaire
de la
forme SF = e-(aD - F fi 'D2) , où SF est la fraction survivante, et a et p
représentent les
probabilités de dommages létaux et sublétaux, respectivement.
[0139] La lignée 4T1 est une lignée cellulaire de cancer du sein dérivée de la
glande
mammaire d'une souche BALB/c de souris. Les cellules sont cultivées dans du
milieu
RPMI (GibcoTM, Thermofischer) supplémenté avec 10 % de SVF et 1% de
pénicilline-
streptomycine.
[0140] La lignée de cancer des voies aérodigestives supérieures (VADS), SQ20B,
est
issue d'un cancer récurrent du larynx. La sous-population d'intérêt,
SQ20B/CSCs (Stem-
cell like cancer cells), a été collectée après deux étapes successives de tri
cellulaires
(efflux de Hoechst et marquage 0D44) réalisées par cytométrie en flux. Cette
population
présente une faible expression de l'EGFR et un phénotype mésenchymateux,
associé à
l'acquisition de propriétés migratoires et invasives. Ces cellules, SQ20B-CSCs
sont
cultivées dans du milieu DMEM:F12 (3:1, v:v) supplémenté avec 5% de SVF, 1 %
PS,
0,04 mg/mi hydroctorisone et 20 ng/ml d'epidermal growth factor (EGF).
[0141] Le protocole de l'étude in vivo (2021021714569264) a été accepté par le
comité
d'éthique de l'université Claude Bernard Lyon 1. L'étude a été réalisée sur un
modèle
murin de cancer du sein triple négatif (lignée cellulaire 4T1). Des souris
BALB/c femelles
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âgées de 7 semaines (Janvier Labs) ont été utilisées. Les cellules 4T1 (5 x
105, matrigel
50 :50) ont été injectées en sous-cutané dans le 4' coussin mammaire sous
anesthésie
à isoflurane. Cette localisation a été choisie afin d'épargner les tissus
vitaux lors du
traitement par radiothérapie. Dix jours après transplantation, les souris ont
été
aléatoirement réparties en 2 groupes : le groupe NaCI (contrôle) (n = 4) et le
groupe
CuPRiX (n = 6). Les souris ont reçu 3 injections de 50 pl chacune par voie
intraveineuse,
espacées de 48 h, de NaCI 0,9 % (contrôle) ou CuPRiX (200 mg/kg). Les souris
ont été
pesées, leur état général évalué et les tumeurs mesurées 3 fois par semaine.
Les souris
ont été mise à mort 5 jours après la dernière injection et les métastases ont
été
quantifiées dans les organes cibles (poumons, foie).
[0142] La quantification des métastases a été réalisée selon le protocole de
Pulaski et al
(2000). Pour cela, après mise à mort des souris par dislocation cervicale sous
anesthésie
à isoflurane, les poumons et les foies sont prélevés. Les organes sont lavés
avec de
l'HBSS, découpés mécaniquement puis soumis à une digestion enzymatique par de
la
collagénase de type IV (2 mg/mi) associés à de la DNAse 1 (Roche) pour les
poumons et
par un cocktail collagénase de type 1 (2 mg/mi), BSA (1 mg/mi) et
hyaluronidase (2 mg/mi)
pour les foies. Cette digestion a lieu pendant 2 heures (poumons) et 40
minutes (foies) à
37 C sur une roue rotative. Les organes digérés sont ensuite filtrés à travers
des filtres en
nylon de 70 pm. Ils sont centrifugés à 1500 G pendant 5 minutes et lavés deux
fois avec
du HBSS. Les culots cellulaires sont remis en suspension dans du milieu RPMI à
60 pM
de 6-thioguanine pour l'étude de la croissance clonogénique. Les suspensions
sont
remises en culture diluées au 1/6 pour les poumons et pures pour les foies
dans des
boites de pétri 10-cm. Après 8 jours, les cellules sont fixées à l'éthanol 96
% et colorées
au Giemsa (dilué au 1/20 dans de l'eau distillée). Les clones sont ensuite
comptés
numériquement à l'aide du compteur de colonies ColcountTm (Oxford Optronix).
Exemple 1: Acidification du milieu et relargage d'ion Gd3+
[0143] Afin d'obtenir une nanoparticule capable de complexer des ions cuivres
tout en conservant ses propriétés d'agent radiosensibilisant, le produit
AGuIXO a
été placé dans un milieu acide dans le but de protoner les groupements DOTA et
ainsi libérer une partie des ions Gd3+ initialement complexé.
[0144] Premièrement, une solution d'AGuIXO à 200 g/L a été préparée en
dissolvant 10 g de produit dans 50 ml d'eau UltraPure. La solution a été
laissée
sous agitations à température ambiante pendant 1h. En parallèle, une solution
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d'acide chlorhydrique 2M a été préparée en ajoutant 10 ml d'acide
chlorhydrique
37% (Acide chlorhydrique 37%, extra-pur, 2,5 L, plastique, CarlRoth) à 50 ml
d'eau UltraPure.
[0145] Après une heure d'agitation, 50 ml de la solution d'acide chlorhydrique
2M
sont ajoutés aux 50 ml d'AGuIXO. Le pH a été alors mesuré et est inférieur à
0,5.
La solution obtenue est de couleur marron-orangé. L'ensemble est laissé dans
une étuve préalablement chauffée à 50 C pendant 4 heures. Un prélèvement
d'échantillon chaque heure a été effectué afin d'observer par HPLC-ICP/MS le
relargage des ions gadolinium (Figure 1). On constate que le pic de Gd3+ libre
dans le milieu au temps de rétention Tr = 2,3 min augmente avec le temps de
réaction.
Exemple 2: CuPRiX20 : 4h de réaction
[0146] Après 4h, la solution a été diluée par 10 avec de l'eau UltraPure. Le
pH est
alors mesuré et remonté à 1 0,2 si nécessaire avec de la soude 1M afin de ne
pas détruire la membrane de filtration. Les 500 ml de solution ainsi obtenus
ont
été purifiés au moyen d'une pompe péristaltique et d'une cassette Sartorius
Vivaflow 200 - 5kDa afin de séparer les particules des ions Gd3+ libérés pour
éviter
la recomplexation de ces ions.
[0147] Le volume initial de 500 ml est concentré à 50 ml et l'opération est
répétée.
Au total, l'opération dilution/concentration a été répétée 4 fois et le volume
final est
de 50 ml. A la suite de la purification, les 50 ml de solution ont été
répartis dans
des flacons contenant chacun 2 ml de solution. Les flacons sont placés à -80 C
afin de congeler la solution puis lyophilisés pour obtenir notre produit final
sous
forme d'une poudre de couleur marron.
[0148] Une fois le produit obtenu, un flacon est retiré du lot pour faire les
caractérisations du produit. Une solution de 1 ml à 100 g/L du nouveau produit
est
préparée en ajoutant de l'eau UltraPure. Après 1 heure en solution, le
diamètre a
été mesuré par notre appareil de DLS indiquant un diamètre de 4,4 nm 1,2 nm.
Le chromatogramme HPLC-UV/Vis a été effectué et indique un temps de rétention
de 11 min 0,1 min, identique aux particules d'origines. Le point
isoélectrique du
CuPRiX20 a aussi été mesuré et est égale à 6,29, supérieur au point
isoélectrique
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de AGuIXO égal à 7,15. Le gadolinium ayant des propriétés magnétiques la
constante de relaxivité ri de CuPRiX20 a été mesurée, et est égale à 18,9 mM-
1.s-i
par atome de gadolinium.
Exemple 3: Dosage du nombre de DOTAGA libres par chélation et
fluorescence de l'europium
[0149] La quantité de chélates libres présente dans le CuPRiX20 peut être
déterminée par chélation de l'europium suivie d'une étude de luminescence.
L'europium présente en effet une luminescence principalement centrée autour de
590 (5D0 -> 7F1) et 615 nm (5D0 -> 7F2). Cette luminescence est éteinte en
présence de molécules d'eau. Le principe du dosage est d'ajouter des quantités
croissantes d'europium, tant que celui-ci est chélate, la luminescence
augmente,
puis lorsque tous les sites de chélation sont remplis la luminescence atteint
un
plateau comme montré en Figure 2.
[0150] Pour réaliser le dosage, le CuPRiX20 a été placé dans un tampon acétate
à
pH 5, un sel de chlorure d'europium dissous dans le tampon acétate est ajouté.
Une courbe de dosage est ensuite tracée en excitant à 396 nm et en relevant
l'émission à 590 nm. Ce dosage permet de remonter à une quantité de chélate de
0.16 pmol par mg de CuPRiX20. Sachant qu'il y a une quantité nulle ou alors
négligeable de gadolinium dans le produit initial AGuIXO alors la quantité de
gadolinium initiale est égale à la quantité de DOTA. La teneur initiale en
gadolinium du produit de départ, mesurée par analyse élémentaire, était de
0,81
pmol par mg d'AGuIXO.
[0151] Le produit CuPRiX20 présente donc 20% de ses groupements DOTA qui
sont libres.
Exemple 4: Chélation du cuivre
[0152] La présence de DOTA libres indique donc un potentiel d'application du
CuPRiX20 comme possible agent chélateur dans le cadre d'une thérapie par
chélation. Le potentiel complexant du CuPRiX20 a été déterminé par chélation
du
cuivre suivie d'une étude d'absorbance à l'aide de l'HPLC-UV/Vis. Le complexe
DOTA@Cu présente une absorbance à 295 nm bien supérieur à celles du
complexe DOTA@Gd, DOTA et des ions cuivre en solution.
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[0153] L'absorbance du CuPRiX20 augmentera à mesure que les groupements
DOTA libres complexeront les ions cuivre disponibles, jusqu'à atteindre un
plateau
où l'ajout de cuivre supplémentaire n'entrainera pas d'augmentation de
l'absorbance. Pour réaliser cette expérience une série d'échantillon a donc
été
5 préparée avec une quantité croissante de solution de chlorure de cuivre et
une
quantité constante de CuPRiX20. Les volumes de tous les échantillons sont
égalisés. Cette expérience permet de remonter à une quantité de cuivre
complexable de 0.18 pmol par mg de CuPRiX20. Une expérience identique menée
sur le produit de départ AGuIXO indique la forte augmentation du potentiel
10 chélateur de CuPRiX20 (Figure 3).
Exemple 5: CuPRiX30 : 5h de réaction
[0154] Le taux de DOTA libre est modulable en fonction du temps de réaction
d'AGuIX en milieu acide. Après 5h, la solution a été diluée par 10 avec de
l'eau
UltraPure. Le pH est alors mesuré et remonté à 1 0,2 si nécessaire avec de
la
15 soude 1M afin de ne pas détruire la membrane de filtration. Les 500 ml de
solution
ainsi obtenus sont purifiés au moyen d'une pompe péristaltique et d'une
cassette
Sartorius Vivaflow 200 - 5kDa afin de séparer les particules des ion Gd3+
libérés
pour éviter la recomplexation de ces ions Le volume initial de 500 ml est
concentré
à 50 et l'opération est répété.
20 [0155] Au total, l'opération dilution/concentration a été répétée 4 fois et
le volume
final est de 50 ml. A la suite de la purification, les 50 ml de solution sont
répartis
dans des flacons contenant chacun 2 ml de solution. Les flacons sont placés à -
80 C afin de congeler la solution puis lyophilisé pour obtenir notre produit
final
CuPRiX30 sous forme d'une poudre de couleur marron. Une fois le produit
obtenu,
25 un flacon a été retiré du lot pour faire les caractérisations du
produit.
[0156] Une solution de 1 ml à 100 g/L du nouveau produit a été préparé en
ajoutant de l'eau UltraPure. Après 1 heure en solution le diamètre a été
mesuré
par notre appareil de DLS indiquant un diamètre de 5,7 nm 1 nm. Le
chromatogramme HPLC-UV/Vis a été effectué et indique un temps de rétention de
30 10,8 min 0,1 min, identique aux particules d'origines.
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Exemple 6: CuPRiX30 : amélioration du potentiel complexant par rapport à
CuPRiX20
[0157] La présence de Dota libre indique donc un potentiel d'application du
CuPRiX30 comme possible agent chélateur dans le cadre d'une thérapie par
chélation. Le potentiel complexant du CuPRiX20 a été déterminé par chélation
du
cuivre suivie d'une étude d'absorbance à l'aide de l'HPLC-UV/Vis. Le complexe
DOTA@Cu présente une absorbance à 295 nm bien supérieur à celles de du
complexe DOTA@Gd, DOTA et des ions cuivre en solution. L'absorbance du
produit augmentera à mesure que les groupements DOTA libres complexeront les
ions cuivre disponibles, jusqu'à atteindre un plateau ou l'ajout de cuivre
supplémentaire n'entrainera pas d'augmentation de l'absorbance.
[0158] Pour réaliser cette expérience une série d'échantillon a donc été
préparée
avec une quantité croissante de solution de chlorure de cuivre et une quantité
constante de CuPRiX20. Les volumes de tous les échantillons sont égalisés.
Cette
expérience permet de remonter à une quantité de cuivre complexable de 0.24
pmol par mg de CuPRiX30. Le produit CuPRiX30 présente donc 30% de ses
groupements DOTA qui sont libres.
Exemple 7 : Analyse de l'effet du CuPRiX20 sur la motilité de cellules A549
[0159] La migration cellulaire est un processus en plusieurs étapes qui est
une
composante fondamentale de nombreux processus biologiques et pathologiques
parmi lesquelles les métastases tumorales. In vitro, le test de blessure est
basé
sur la formation d'une blessure sur un tapis cellulaire et de l'étude de la
motilité
cellulaire, c'est-à-dire la capacité des cellules à se déplacer sur une
surface en
réponse à un changement de densité, pour refermer la blessure. C'est une
mesure directe de la motilité des cellules sur un substrat solide en 2D.
[0160] L'objectif de cet exemple a été de montrer la capacité du CuPRiX20 à
réduire la motilité cellulaire. Les cellules A549 ont été cultivées dans du
milieu
F12-K (Gibco) contenant 8 nM de CuSO4-5H20. Après avoir été cultivées
pendant 72 h avec ou sans CuPRiX20 (500 pM de chélate libre), les cellules ont
été trypsinées puis ensemencées à 40 000 cellules par puit dans une plaque de
culture 96 puits ImageLock0 (Essen BioScience). La plaque a été placée pendant
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une nuit à 37 C, 5% 002. La blessure a ensuite été réalisée avec l'IncuCyte
WoundMaker (Essen BioScience). Les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS
pour ôter les cellules flottantes puis traitées avec 100 pl de milieu
contenant des
concentrations croissantes de CuPRiX20 (0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 et
1000 pM de chélate libre équivalent à environ 0, 150, 300, 600, 900, 1200,
1500 et
3000 pM de gadolinium).
[0161] Les images du comblement des blessures ont été acquises
automatiquement toutes les 2 h pendant 72 h par le logiciel Zoom lncucyte
(Essen
BioScience) dans l'incubateur à 002. Les données ont été analysées par le
logiciel et les résultats exprimés en pourcentage de confluence de la
blessure. Les
résultats obtenus ont permis de mettre en évidence un ralentissement de la
motilité cellulaire des A549 dû au traitement par le CuPRiX20 à des
concentrations différentes (Figure 4, Figure 5 et Figure 6)
Exemple 8: Comparaison de l'effet du CuPRiX20 et du CuPRiX30 sur la
motilité de cellules A549
[0162] L'objectif de cet exemple est de montrer la capacité des CuPRiX20 et
CuPRiX30 à réduire la motilité cellulaire et de comparer leurs effets. Les
cellules
A549 ont été cultivées dans des plaques de culture 96 puits ImageLock0 (Essen
BioScience) à 40 000 cellules par puits pendant une nuit à 37 C, 5% 002. Le
test
de blessure a été réalisé avec le 96-puits IncuCyte WoundMaker (Essen
BioScience). Les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS pour ôter les
cellules
flottantes et ont ensuite été traitées avec 100 pl de milieu contenant du
CuPRiX20
(0, 125, 250 et 500 pM de chélate libre équivalent à environ 0, 375, 750 et
1500 pM de gadolinium) ou du CuPRiX30 (0, 125, 250 et 500 pM de chélate libre
équivalent à environ 0, 200, 400 et 800 pM de gadolinium.
[0163] Les images du comblement des blessures ont été acquises
automatiquement toutes les 2h par le logiciel Zoom lncucyte (Essen BioScience)
dans l'incubateur à 002. Les données ont été analysées par le logiciel et les
résultats exprimés en pourcentage de confluence de blessures.
[0164] Les résultats obtenus ont permis de montrer qu'a concentration de
chélate
libre constante, l'effet des deux types de CuPRiX est équivalent.
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Exemple 9 : Analyse de l'effet du CuPRiX20 sur l'invasion de cellules A549
[0165] L'invasion cellulaire est l'une des caractéristiques du cancer. Elle
est liée à
la migration cellulaire et joue un rôle clé dans le développement de
métastases.
La capacité des cellules tumorales à former des métastases est principalement
déterminée par la capacité de la cellule à changer et à réorganiser sa
morphologie
cellulaire ainsi qu'a dégrader la matrice extracellulaire (MEC). In vitro, les
tests
d'invasion sont basés sur l'approche du test de blessure mais comprennent
l'ajout
d'une matrice de gel mimant la MEC. L'ajout de la matrice 3D exige que les
cellules dégradent cette matrice pour se déplacer.
[0166] L'objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiX20 à
réduire
l'invasion cellulaire ¨ i.e. la capacité des cellules à décomposer une matrice
extra-
cellulaire et à se déplacer. Les cellules A549 ont été cultivées dans des
plaques
de culture 96 puits ImageLock0 à 40 000 cellules par puit pendant une nuit à
37 C,
5% CO2. La blessure a ensuite été réalisée avec l'IncuCyte0 WoundMaker (Essen
BioScience) puis les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS. 50 pl de
Matrigel
(corning) ¨ préalablement dilué dans du milieu F12-K contenant ou non du
CuPRiX20 ¨ à une concentration finale de 1 mg/ml, ont été ajouté à chaque
puits.
La plaque a été incubée 30 minutes à 37 C, pour permettre la polymérisation du
Matrigel. Enfin, 100 pl de milieu contenant ou non du CuPRiX20 (0 et 500 pM de
chélate libre) ont été ajouté. Les images du comblement des blessures ont été
acquises automatiquement toutes les 2 h pendant 72 h par le logiciel Zoom
lncucyte (Essen BioScience) dans l'incubateur à CO2 Les données ont été
analysées par le logiciel Zoom lncucyte (Essen BioScience) et les résultats
exprimés en pourcentage de confluence de la blessure. Les résultats obtenus
ont
permis de mettre en évidence un ralentissement de l'invasion cellulaire des
A549
dû au traitement par CuPRiX20 (Figure 7).
Exemple 10: Effet du CuPRiX20 sur la migration par chimiotactisme des
cellules A549
[0167] La migration par chimiotactisme est le mouvement directionnel des
cellules
en réponse à un stimulus. Ce test consiste en un insert de culture placé au
sein
d'un puits de plaque de culture cellulaire. Les cellules sont ensemencées dans
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l'insert ¨ qui contient une membrane avec une taille de pores définie ¨ avec
du
milieu sans sérum pour les affamer. Le milieu chimio-attractant est placé dans
le
puits en dessous. Dû à ce gradient chimique, les cellules capables de migrer
sont
attirées par le milieu chimio-attractant et passent à travers les pores.
L'objectif de
cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiX20 à réduire la mobilité
cellulaire par un test de chimiotactisme. Pour cela, le module de chimiotaxie
IncuCyte ZOOM a été utilisé. Les cellules A549 (1 000 cellules/puits) ont été
remises en suspension dans du milieu F-12K contenant 0% de SVF et ont été
ensemencées dans le compartiment supérieur d'une plaque 96-puits Oeil
Migration lncucyte ClearView avec des pores de 8 pm (40 pl/puits). Dans les
puits
adéquats, 20 pl de milieu F12-K sans SVF contenant ou non du CuPRiX20
(500 pM de chélate libre final) ont été ajouté. Enfin, 200 pl de milieu F-12K
à 10 %
de SVF contenant ou non du CuPRiX20 (500 pM de chélate libre) ont été ajoutés
dans le compartiment inférieur de la chambre de chimiotaxie. Des images de
chaque insert ont été prises toutes les heures. La migration chimiotactique du
réservoir supérieur vers le réservoir inférieur a été quantifié en tant que
confluence
de cellules sur le dessous de la membrane par rapport à la confluence initiale
des
cellules ensemencées sur le dessus de la membrane. Le calcul a été effectué
automatiquement avec le logiciel de microscopie IncuCyte ZOOM 2015A.
[0168] Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence une forte
diminution de la migration par chimiotactisme des cellules par CuPRiX20
(Figure
8).
Exemple Il: Effet de l'association du CuPRiX30 à une irradiation
photonique sur la motilité de cellules A549
[0169] L'objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiX30 à
réduire
la motilité cellulaire après une irradiation photonique. Les cellules A549 ont
été
cultivées dans des plaques de culture 96 puits ImageLock0 à 20 000 cellules
par
puits pendant une nuit à 37 C, 5% 002. Les cellules ont été incubées avec du
milieu F-12K sans SVF contenant ou non du CuPRiX30 (500 pM de chélate libre
équivalent à 800 pM de gadolinium) pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été
irradiées à 8 Gy (irradiateur X-Rad320, 250 kV) puis la blessure a été
réalisée.
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Les cellules ont été rincées 2 fois avec du PBS pour ôter les cellules
flottantes et
100 pl de milieu contenant du CuPRiX30 (0 et 500 pM de chélate libre
équivalent
à environ 0 et 800 pM de gadolinium) ont été ajoutés dans chaque puit
correspondant.
5 [0170] Les images du comblement des blessures ont été acquises
automatiquement toutes les 2h par le logiciel Zoom lncucyte dans l'incubateur
à
002. Les données ont été analysées par le logiciel et les résultats exprimés
en
pourcentage de confluence de blessures. Les résultats obtenus ont permis de
montrer une efficacité supérieure (effet additif) de l'association
10 CuPRiX30/irradiation pour limiter la motilité en comparaison d'un
traitement par
irradiation seul ou par CuPRiX30 seul (Figure 9).
Exemple 12 : Effet de l'association du CuPRiX30 à une irradiation
photonique sur la survie cellulaire de cellules A549
[0171] Les cellules A549 ont été ensemencées à 40 000 cellules/cm2, soit 1
15 millions de cellules dans une flasque T25cm2 et incubées sur la nuit à 37
C, 5%
de 002. Les cellules ont été traitées avec du milieu F-12K sans SVF contenant
ou
non du CuPRiX30 (500 pM de chélate libre équivalent à 800 pM de gadolinium)
pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été irradiées à différentes doses (0,
2, 3, 4,
6 et 8 Gy). Après l'irradiation, les cellules ont été lavées au PBS,
trypsinées et
20 comptées. Les cellules ont ensuite été réensemencées dans des flasques de
25 cm2 et ont pu se développer pendant six divisions (7 jours) avant d'être
fixées
et colorées. Les colonies contenant 64 cellules ou plus ont été comptées
numériquement. La survie clonogénique a été déterminée selon un modèle
quadratique linéaire de la forme SF = e-(aD
où SF est la fraction survivante,
25 et a et p. représentent les probabilités de dommages létaux et sublétaux,
respectivement. Les résultats obtenus montrent une diminution de la survie
cellulaire après irradiation en présence de CuPRiX30 (Figure 10).
Exemple 13 : Effet de l'association de CuPRiX30 à une irradiation photonique
sur la
survie cellulaire des cellules A549, SQ20B-CD44+ et 4T1.
30 [0172] Pour chaque lignée cellulaire, les cellules ont été ensemencées à 40
000
cellules/cm2, soit 1 million de cellules dans une flasque de 25 cm2 et
incubées sur
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la nuit à 37 C, 5 % de 002. Le milieu est ensuite ôté et remplacé par du
milieu
sans SVF seul, contenant du CuPRiX30 (500 pM de chélate libre équivalent à
800 pM de gadolinium) ou du AGuIX (800 pM de gadolinium) pendant 24 h. Les
cellules sont ensuite irradiées à différentes doses (0, 2, 3, 4 et 6 Gy).
Après
l'irradiation, les cellules sont lavées au PBS, trypsinées et comptées. Elles
sont
ensuite réensemencées dans des flasques de 25 cm2 et peuvent se développer
pendant six divisions (7 jours) avant d'être fixées avec de l'éthanol à 96% et
colorées au Giemsa. Les colonies contenant 64 cellules ou plus sont comptées
numériquement. La survie clonogénique a été déterminée selon un modèle
quadratique linéaire de la forme SF = e-(aD- où SF
est la fraction survivante,
et a et p. représentent les probabilités de dommages létaux et sublétaux,
respectivement. Pour les 3 lignées cellulaires, les résultats obtenus montrent
une
diminution de la survie cellulaire après irradiation après traitement par
AGuIX et
CuPRiX30. Dans le cas des lignées A549 et SQ20B-0D44-F, l'efficacité de
CuPRiX30 semble égale à celle de AGuIX, tandis qu'elle est supérieure aux
AGuIX
dans le cas de la lignée 4T1 (Figure 11).
Exemple 14: Efficacité de CuPRiX30 sur la croissance tumorale et la formation
de
métastases dans un modèle murin de cancer du sein métastatique
[0173] L'objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiX30 à
ralentir
la croissance tumorale et à diminuer la formation de métastases. Pour cela, 10
souris femelles BALB/c âgées de 8 semaines ont reçu une injection sous-cutanée
de 50 000 cellules 4T1 (cellules de cancer du sein triple négatif, 50:50,
PBS:matrigel). Dix jours après (J10), lorsque les tumeurs ont atteint 100 mm3
en
moyenne, les souris ont reçu une première injection de 50 pl de CuPRiX30
(200 mg/kg, n=6) ou de NaC1 (0,9%, n=4) par voie intraveineuse. Deux nouvelles
injections ont été administrées 48 h (J12) et 96 h (J14) après la première.
Dix-neuf
jours après l'inoculation des tumeurs, soit 5 jours après la dernière
injection, les
souris ont été mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie à
isotlurane
et les organes pouvant présenter des métastases (poumons et foie) ont été
prélevés.
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[0174] Pour la quantification des métastases, les poumons et foies ont été
dissociés mécaniquement puis ont subi une digestion enzymatique avant d'être
filtrés. Les suspensions cellulaires sont ensuite mises en culture pures
(foies) ou
diluées (poumons) dans du milieu de culture à 60 pM de 6-thioguanine (agent de
sélection des cellules 4T1), et incubées à 37 C dans un incubateur à 002. Huit
jours après, les cellules sont fixées, colorées et les colonies sont comptées
automatiquement, les résultats sont répertoriés dans le tableau 1.
[0175] [Tableau 1] : Nombre de colonies clonogéniques métastatiques 19 jours
après inoculation des cellules tumorales
Poumons
NaCI 0,9% 223 (12 ¨ 767)
CuPRiX (200 mg/kg) 16,3 (0 ¨ 44)
Résultats exprimés comme moyenne et
(gamme), n=4 ou 6
[0176] Les résultats obtenus montrent un ralentissement de la croissance
tumoral
ainsi qu'une diminution du nombre de métastases aux poumons après traitement
des souris par CuPRiX30. Les 4 souris du groupe contrôle présentaient des
métastases aux poumons tandis que 2 souris sur les 6 traitées par CuPRiX n'en
présentaient aucune. Aucune métastase au foie n'a été observé dans les deux
conditions (figure 12).
Exemple 15 : Efficacité de l'association CuPRiX30 et radiothérapie sur la
croissance tumorale et la survie dans un modèle murin de cancer du sein
métastatique
[0177] L'objectif de cet exemple est de montrer la capacité du CuPRiX30 à
augmenter l'efficacité d'une radiothérapie sur la croissance tumorale et la
survie.
Pour cela, 42 souris femelles BALB/c âgées de 8 semaines ont reçu une
injection
sous-cutanée de 50 000 cellules 4T1 (cellules de cancer du sein triple
négatif,
50:50, PBS:matrigel). Dix jours après la greffe tumorale, les souris ont été
réparties aléatoirement en 4 groupes pour recevoir les traitements : le groupe
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NaCI (contrôle, n = 12), le groupe CuPRiX (n = 10), le groupe NaCI +
radiothérapie
(RT, n = 9) et le groupe CuPRiX + RT (n = 11).
[0178] Les souris ont reçu au total 3 injections de 50 pl de CuPRiX (200
mg/mi) ou
NaCI (0,9 %) espacées de 48 h associées à une radiothérapie fractionnée de 5 x
2
Gy (2 Gy par jour pendant 5 jours) (Figure 13). Les irradiations ont eu lieu 1
heure
après administration du traitement, sous anesthésie à isotlurane.
[0179] Pour suivre l'évolution tumorale et établir des courbes de survie de
Kaplan-
Meier, les souris ont été pesées et les tumeurs mesurées 6 fois par semaine. A
la
fin de la séquence thérapeutique, les souris ayant atteint un des points
limites
suivant : perte de 15 % de son poids ; volume tumoral 1000 mm3 ; ulcération
persistante ; observation de signes de détresse (prostration, poil non lisse,
dos
vouté) pendant 2 jours consécutifs ; ont été mises à mort.
[0180] L'évolution du volume tumoral a été calculé comme suit : (Volume
tumoral
au temps t)/(Volume tumoral au temps de référence) avec le temps de référence
correspondant au premier jour du traitement soit J10. Les résultats obtenus
montrent une diminution de la croissance tumorale plus importante après la
combinaison de traitement CuPRiX + RT par rapport à un traitement par RT seule
ou CuPRiX seul. L'association de CuPRiX avec la RT a également permis de
prolonger la survie des animaux comparé la RT seule (figure 14).
Application industrielle
[0181] Les présentes solutions techniques peuvent trouver à s'appliquer
notamment dans le domaine de la médecine, en particulier pour le traitement de
tumeurs.
[0182] La présente divulgation ne se limite pas aux exemples décrits ci-avant,
seulement à titre d'exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra
envisager l'homme de l'art dans le cadre de la protection recherchée.
