Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
~L~6~;831
La presente invention concerne de nouvelles
compositions cosmetiques renfermant des extraits lyses
d'Hafnia.
L'invention a pour objet de nouvelles composi-
tions cosmetiques pour les soins de la peau, caracterisees
en ce qu'elles renferment des glycoprotines extraites de
corps microbiens lyses de l'espece ou souche Hafnia prepa-
rees selon les etapes successives suivantes:
a) mise en culture d'une souche microbienne d'Hafnia;
b) lyse apres complet developpement des corps microbiens;
c) delipidation et depigmentation du lysat obtenu par
traitement avec un ou plusieurs solvants;
d) mise en solution du produit brut obtenu precedemment,
centrifugation et ultrafiltration de la solution obtenue.
Ce procede de lyse de la souche bactexienne
d'Hafnia et les glycoproteines ainsi obtenues ont deja fait
l'objet du brevet ~rançais n 2378855. La souche d'Hafnia
utilisee preferentiellement est celle deposee a l'Institut
Pasteur a Paris sous le n 5731.
Dans ce brevet fran~ais n 2378855, les glyco-
proteines obtenues apres lyse des corps Hafnia subissent
une ultrafiltration avec une membrane ne retenant que les
glycoproteines ayant un poids moleculaire egal ou superieur
a 300 000~
Ce brevet fran~ais n 2378855 decrit aussi la
tres bonne tolerance et l'application comrne medicaments
anti-inflammatoires et immunostimulants des ~lycoproteines
isolees d1Hafnia ayant un poids moleculaire apparent égal
ou superieur à 300 000.
Cependant jamais encore n'avait ete decrite
l'utilisation en cosmetologie des proprietes topiques
reelles de ces extraits bacteriens.
En effet, il vient d'être demontre que ces
extraits bacteriens possedent un remarquable pcuvoir anti-
~2~
irritant cutané et qu'ils sont doués d'un effet stimulant
sur la croissance cellulaire.
Par ailleurs, les glycoproteines extraites de
corps l~sés d'Hafnia ont un pouvoir protecteur contre les
agressions extérieures: soleil, chaleur, froid, deter-
gents, pollution
Ces différentes propriétes illustrees plus loin
dans la partie experimentale, peuvent donc être avantageu-
sement mises à profit en cosmetologie.
Les compositions de l'invention peuvent notamment
être utilisees pour apaiser les peaux irritees, qu'elle
qu'en soit la cause. Par e~emple, les compositions de
l'invention peuvent être appli~uées pour apaiser les peaux
à tendance acnéique.
En particulier, appliquées le matin, elles cal-
ment les sensations de picotement et de brulures dûes aux
traitements médicaux locaux de l'acné appliqués le soir,
qui sont souvent très irritants. Elles peuvent aussi être
utilisees pour calmer les rougeurs des erythèmes solaires.
Comme il a dejà ete dit plus-haut, elles protè-
gent aussi efficacement la peau contre les agressions
exterieures et sont donc avantageusement utilisees pour
proteger les peau~ fragilisees à problemes (couperosee,
rosacee...).
Par ailleurs, les proprietes regenératrices
cutanees par stimulation de la croissance cellulaire des
compositions se~on l'invention leur conferent une effica-
cite dans la lutte contre le vieillissement de la peau.
Les compositions de l'invéntion renferment des
glycoproteines obtenues par lyse des corps d'Hafnia ayant
subi ou non une ultrafiltration finale.
L'ultrafiltration finale peut être celle decrite
dans le brevet français n~ 2378~55 et ainsi consister en
une dialfiltration utilisant une membrane poreuse presentant
~2G~L
un seuil de retention de substances dont le poids molecu-
laire est egal ou supérieur à 300 000.
En fait, la membrane utilisee peut presenter un
autre seuil de retention, le choix de celui-ci dependant
des substances que l'on veut separer.
L'invention concerne notamment des compositions
cosmetiques, caracterisees en ce qu'elles renferment des
glycoproteines extraites de corps microbiens lyses d'Hafnia
n'ayant pas subi d'ultrafiltration finale.
De preference, les glycoproteines correspondent
aux produits intermediaires obtenus à la fin du stade C
du procede illustre aux exemples 1 et 2 du brevet français
n 2378855. Ce procede comporte notamment les stades
suivants:
Stade A) l'on cultive une souche d'Hafnia
(Institut Pasteur 5731) dans un milieu de culture jusqu'à
developpement complet des germes;
Stade B) l'on lyse le bouillon de culture obtenu
au stade A) par action du lysozyme, recueille le lysat,
l'homogeneise puis le lyophilise pour obtenir une poudre;
et
Stade C) l'on traite la poudre obtenue au Stade
B) par l'acetone, et obtient, après filtration une poudre
que l'on traite par le methanol, obtient une suspension
dont on decante le surnageant par siphonage, puis filtre
le reste de la solution pour enfin obtenir une poudre de
glycoproteines dont les caracteristiques physico-chimiques
sont donnees plus loin à l'exemple 1 de la partie experi-
mentale.
Dans les compositions de l'invention, l'extrait
d'Hafnia peut être utilise sous forme pulverulente ou sous
forme de solution aqueuse.
L'invention concerne notamment des compositions
cosmetiques, caracterisees en ce qu'elles renferment
~2~,3~
5.10 5% à 1~ en poids de glycoprotéines extraites de corps
microbiens lyses d'Hafnia.
Les compositions de l'invention peuvent renfer-
mer en plus des extraits lyses d'Hafnia, d'autres composes
actifs ayant des proprietes cutanees particulières.
Ainsi, les compositions de l'invention peuvent
contenir egalement l'acetate d'oleyle. Ce produit a des
proprietes anti-lipasique et prévient directement la forma-
tion de comedons et de points noir.
Les compositions ainsi obtenues renferment deux
constituants qui par leur action combinee constituent un
produit bien adapte aux peaux à tendance acneique.
Les compositions de l'invention peuvent aussi
renfermer un compose favorisant la cicatrisation des
lesions de l'acne, tel que par exemple, un extrait de
Centella Asiatica et plus particulièrement un extrait gly-
colique de Centella Asiatica.
D'autres substances telles que l'huile d'onagre,
les acides amines peuvent aussi y être incorpores.
L'invention a donc plus particulièrement pour
objet des compositions, caracterisees en ce qu'elles ren-
ferment un ou plusieurs des produits suivants: acetat~
d'oleyle, extrait glycolique de Centella Asiatica, huile
d'onagre, acides amines.
Les compositions cosmetiques selon l'invention
peuvent se presenter sous toutes les formes utilisees en
cosmetologie: creme ou gel en pots ou en tubes, lait,
huile ~u lotion en flacons de verre ou de matière plasti-
que et eventuellement en flacon-doseur, ampoule, aerosol.
L'invention concerne donc des compositions
cosmetiques, caractérisees en ce qu'ell~s se presentent
sous forme de creme, gel, lait, lotion ou huile pour la
peau.
Pour chaque forme, on a recours à des excipients
12~;83~.
appropries. Ces excipients doivent avoir toutes les
qualites habituellement demandées. Ils doivent être doues
d'une grande affinite pour la peau, être parfaitement bien
toleres, stables, presenter une consistance ade~uate,
permettant une utilisation facile et agreable.
A titre d'exemples d'excipients, on peut citer
les derives palmitates, stearates, les triglycerides
d'acides gras, la lanoline, la glycerine, le propylène
glycol (creme), l'alcool ethylique (lotion), les huiles
vegetales, animales ou minerales, les cires, les mouillants,
les epaississants, les stabilisants, les emulsionnants cou-
ramment utilises.
Eventuellement, les compositions selon l'inven-
tion peuvent contenir des filtres, des ecrans aux radiations
solaires, des bloqueurs de radicaux libres et d'Oxygène
singulet, des extraits vitamines, des parfums, des conser-
vateurs, des anti-oxydants, des colorants.
Les differentes formes cosmetiques mentionnees
ci-dessus peuvent être obtenues selon les methodes usuelles
utilisees dans ce domaine.
Les exemples donnes ci-dessous illustrent l'inven-
tion sans toutefois la limiter.
EXEMPLE 1
L'extrait bacterien d'Hafnia (souche de l'Institut
Pasteur N 5731~ est ohtenu à la fin du stade C des exemples
1 et 2 du brevet français N 2378855. Pour memoire, rappe-
lons que les stades A a C de l'Exemple 1 de ce brevet fran-
çais n 2378855 comportent:
Stade A . culture.
On prepare un milieu de culture repondant à la
formule suivante:
- extrait de viande..... OO..... O................. 690 g
- chlorure de sodium........... .................. 690 g
- peptone de caseine.... O....... OO.. O............ 690 g
~266~
- autolysat de levure........................... .690 g
- phosphate bipotassique............ ~........... .483 g
- phosphate monopotassique...................... .207 g
- glucose........................... ~........... 4104 g
- peptone papainique de soja.................... 2760 g
- eau distillée q.s.p........................... 138 litres
On prepare le mi~ieu de culture en melangeant
successivement l'extrait de viande, le chlorure de sodium,
la peptone de caseine, l'autolysat de levure, le phosphate
bipotassique, le phosphate monopotassique dans environ 20
litres d'eau distillee. On ajuste le pH aux environs de 7.
On sterilise le milieu à 120C pendant ~0 minutes.
Les solutions de glucose et de peptone papalnique de soja
sont introduites dans le milieu de culture au moment de
l'ensemencement apres avoir ete sterilisees au prealable.
La souche d'Hafnia (Institut Pasteur n 5731)
cultivee sur milieu gelose, est ensemencee dans 50 cm3 de
milieu de culture. ~ette solution, servant d'inoculum est
introduite dans le reste du bouillon de culture. On ajuste
le volume total du milieu de culture a 138 litres par addi-
tion d'eau distillee sterile.
Le milieu de culture est maintenu a 37C et le
pH est ajuste automatiquement à 7 (par addition d'une solu-
tion d'ammoniaque ou par addition d'une solution d'acide
chlorhydrique).
La croissance des germes est appreciee au photo-
mètre; ~e nombre de germes est calcule en fonction de la
densite optique determinee en comparaison avec une courbe
etalon.
Après complet developpement, soit environ après
7 heures, le milieu renferme environ 1 milliard de germes
au cm3.
Stade B l~se.
A 138 litres de bouillon de culture obtenu au
~Z~31
stade A ci-dessus, on ajoute une solution aqueuse de
chlorhydrate de lysozyme, (sterilisee par filtration sur
membrane millipore~0,22 ~) afin d'avoir une concentration
finale de 160 y de chlorh~drate de lysozyme par cm3 de
milieu de culture.
On laisse en contact une heure à 56C en presence
de 0,25 g d'EDTA par litre de bouillon, de 862,5 mg de
mercurothiolate sodique et de 80 g de polysorbate (commer-
cialise sous le nom de Tween 80t~par litre de bouillon de
culture.
On poursuit la lyse pendant 7 jours à 37C dans
des conditions steriles.
On recueille le lysat, homogeneise par agitation
puis lyophilise.
On obtient 7900 g d'une poudre brune.
Stade C : traitement
____________________
a) Par l'acetone
On met en suspension dans 138 litres d'acetone
froid la totalite de la poudre obtenu au stade B ci-dessus,
puis agite vigoureusement pendant 3 heures à 3500 tours/
minute.
Après 3 heures, la suspension est filtree sur
verre fritte. On recueille une poudre jaune que l'on
essore xapidement.
b) Par le methanol
La poudre obtenue precedemment (7295 g) est mise
en suspension dans 138 litres de methanol froid et agitee
vigoureusement pendant 3 heures à 1500 tours/minute.
Après 3 heures, la suspension obtenue est decan-
tee, la plus grande partie du surnageant est soutiree par
siphonnage, le restant de la solution est filtre sur verre
fritte.
La poudre essoree est sechee à temperature am-
biante sous vide pendant 24 heures. On obtient alors 3988 g
t (marque de commerce)
d'une poudre beige claire.
Pareillement, les stades A à C de l'exemple 2
du brevet français n 2378855, comportent les stades A et
B de l'exemple 1 de ce brevet françaisl sauf qu'on prepare
90 litres de lysat que l'on lyophilise pour obtenir 4570 g
d'une poudre jaune-brun; et
Stade C . traitement~
a~ Par l'acetone
On extrait la poudre obtenue ci-dessus au moyen
de 90 litres d'acetone froid, comme indique au stade C a)
de l'exemple 1 du brevet francais n 2378855.
b) Par le methanol
On extrait le produit obtenu ci-dessus au moyen
de 90 litres de methanol froid comme indique au stade C b)
de l'exemple 1 du bre~et français n 2378855. On seche a
froid sous vide et obtient 1765 g d'une poudre beige.
Les extraits bacteriens d'Hafnia obtenus aux
exemples 1 et 2 du brevet français n~ 2378855 presen-
tent les caracteristiques suivantes:
a) Aspect : poudre beige clair hydrosoluble.
b) Analyse elementaire:
Carbone 31,6 % + 3
hy~drogene 4,9 % + 0,6
azote 6,6 % + 0,4
c) Nature et proportion des divers constituants.
Les resultats sont exprimes en moyenne ~ ecart
type (*):
proteines : 26,4 % I+ 5,2*)
glucides : hexoses neutres 18,3 % (+ 3,7*)
acides uroniques 0,6 % (+ 0,9*)
osamines 8,7 % (+ 2,4*)
acides ribonucleiques 17,4 ~ (+ 2,35*)
acides desoxyribonucleiques 5,4 % (+ 2~1*)
humidite 8%
d) Spectre ultra violet
Le spectre ultraviolet trace entre 190 nm et
350 nm a 125 mcg/ml est classique d'un produit contenant
des proteines (Do 0,73 + 0,2) et des acides nucleiques
(1,4 + 0,4).
e) Chromatographie de gel filtration
La chromatographie de gel filtration sur
Sephacryl S 300t dans un tampon carbonate d'ammonium 0,1 M
revèle la presence de 3 familles moleculaires:
- 1 famille de haut poids moleculaire ~ 300 000 de nature
glycoproteique,
- 2 familles de poids moleculaires voisins de 12 000 de
nature acides nucleiques.
EXEMPLE 2 : creme pour le visage.
- extrait Hafnia.................................. 0,5 g
- acetate d'oleyle.................................. 2,0 g
- alcoyle phosphate de diethanol amine..... O........ 2,0 g
- palmitate d'ethyl hexyle.......................... 8,0 g
- lanoline hydrogenee............................... 5,0 g
- triglycerides d'acides gras....................... 4,0 g
- stearate de so:rbitan............................. 1,0 g
- pclymere carboxyvinylique......................... 0,4 g
- conservateurs....................~...................... 0,4 g
- composition aromatique............................ ...... 0,4 g
- eau purifiee q.s.p. 100 g
E~EMPLE 3 : gel ~our le visage.
. _~
- extrait <~Hafnia................................. ...... 0,5 g
- extrait glycolique de Centella Asiatica........... 5,0 g
- propylene glycol.................................. 5,0 g
- polymere carboxyvinylique..~..................... 0,8 g
- conservateurs.................................... 0,35 g
- composition aromatique........................... 0,1 g
- eau purifiee q.s.p. 100 g
t (marque de commerce)
~3~
EXEMPLE 4 : crème pour le corps.
- extrait aHa~nia.,,.,.,.,....................... 0,2 g
- stearate de glycerol............................ 4,0 g
- palmitate de sorbitan........................... 6,0 g
- perhydrosqualene~............................... 5,0 g
palmitate d'isopropyle.......................... 7,0 g
- triglycerides d'acides gras... ..O................ 9,0 g
- glycerine..................... ~.................. 5,0 g
- conservateurs................................... 0,35 g
- composition aromatique........ .........,......... 1,0 g
- eau purifiee q.s.p.............................. 100 g
EXEMPLE 5 : lotion tonique pour le_v sage.
- extrait Hafnia................................ 0,05 g
- propylène glycol................................ 5,0 g
15 - - conservateurs................................... 0,3 g
- composition aromatique.......................... 0,1 g
- alcool ethylique.........O........................ 10,0 g
- eau purifiee q.s.p............................... . 100 ml
EXEMPLE 6 : lait solaire.
-
- extrait Hafnia................................. .. 0,1 g
- filtres solaires................................. .. 5,0 g
- huile de vaselinet............................... . 10,0 g
- palmitate d'isopropyle........................... 9,0 g
- huile de silicone................................ 2,5 g
- ether cetylique P.O.E............................ 2,C g
- stearate de sorbitan............................. 1,0 g
- conservateurs.................................... 0,35 g
- composition aromatique........................... 0,5 g
- eau purifiee q.s.p................................ 100 ml
ETUDE PHARMACOLOGIQUE
a~ Tol rance cutanee
Six lapins albinos de souche RIVER ont ete
tondus au niveau du dos sur une sur~ace d'environ 14x14 cm
De chaque côte de l'axe vertebral sont pratiquees trois
t (marque de commerce)
-- 10 --
~83~
incisions paralleles par scarification.
On depose ensuite sur la peau (zone scarifiee et
non scarifiee), du côte droit, 0,5 ml d'une crème dosee a
0,05 % d'extrait lyse d'Hafnia decrit à l'exemple 1, le
côte gauche servant de zone temoin.
On apprecie l'irritation cutanee respectivement
24 et 72 heures apres l'application du produit.
Les observations sont faites sur les deux zones
scarifiees et non scarifiees, selon l'echelle numerique
indiquee ci-apres.
Erytheme et formation d'escarres:
_
- pas d'erytheme........................................... 0
- leger erythème, à peine visible
- erytheme bien visible.................................... 2
- 15 - erytheme modere a important.............................. 3
- erytheme grave (rouge pourpre), avec formation
de legeres escarres, lesions profondes................... 4
Formation d'oedeme:
- pas d'oedeme........................... ~.... O............ 0
- tres leger oedème, a peine visible..... ~................. 1
- leger oedeme (contours bien definis, gonflement
apparent).............................................. .. 2
- oedeme moyen (epaisseur environ 1 mm).................. .. 3
- oedème grave (epaisseur superieure a 1 mm et
surface superieure à celle du carre)................... .. 4
La determination de l'indice d'irritation
primaire est calculee en additionnant les chiffres
obtenus pour l'erytheme et pour l'oedème, après 24 heures
et 72 heures, d'une part sur les six zones non scarifiees,
d'autre part sur les six zones scarifiees.
~ nsuite, il faut calculer la moyenne en divisant
le total par 24. Cette moyenne represente l'indice
d'irritation primaire cutanee (IP):
-- 11 --
,~1
- non irritant IP < 0,5
- legèrement irritant 0,5 ~ IP ~ 2
- moyennement irritant 2 s IP < 5
- très irritant 5 < IP < 8
CONCLUSION
. _ .
L'ensemble de ces resultats permet de constater,
qu'en utilisant la cotation officielle, la crème dosee à
0,05 ~ d'extrait lyse d'Hafnia possède un indice d'irrita-
tion cutanee IP ~ 0,05, soit NON IRRITANT.
b~ Action sur la croissance cellulaire des fibroblastes en
culture
On teste une solution contenant des glycopro-
teines d'Hafnia de l!exemple 1 à la dose de 5.10 6 g/ml
sur une culture de fibroblastes de prepuce d'embryon humain.
Le milieu de culture utilise est un milieu conte-
nant divers acides amines, des vitamines, des sels inorgani-
ques, du glucose, du serum de veau foetal, des antibiotiques
(Penicilline, Streptomycine, Fungizone, Kanamyaire), de la
biotine.
Le milieu est tamponne par du bicarbonate de
sodium et le pH est ajuste a 7,2.
Les cultures sont ensemencees à la concentration
de 40 x 103 cellules par ml en flacons pour culture de
tissu de differentes surfaces.
Les cuLtures sont placées dans une etuve thermo-
statee à 37C dont l'atmosphère est regulee en CO2 (5 %).
Pour effectuer une numeration et une evaluation
de la croissance cellulaire, les fibroblastes doivent être
detaches du support de culture par action d'une solution
de trypsine.
La numeration est effectuee au microscope à con-
traste de phase. Les cellules vivantes apparaissent
réfringentes.
La figure I represente l'ensembie des experiences
- 12 -
effectuees avec la dose de 5 x 10 6 g/ml en comparaison
avec les cultures temoins.
Dans toutes les experiences, l'adjonction de la
solution à base d'extraits lyses d'Hafnia stimule la
croissance cellulaire.
c) Recherche d'un effet sur l'erythème cutane che~ le
cobave ex~ose aux radiations ultra-violettes
On utilise 20 cobayes males de souche HARTLEY,
pesant entre 350 et 400 grammes dont la region costale a
ete rasee et epilee sur une surface de 6 cm x 3 cm.
L'erythème solaire est realise par irradiation
d'U.V. au moyen d'une lampe a usage therapeutique, a tube
à quartz.
Pour empêcher l'irradiation U.V. de tout l'animal,
celui-ci est habille d'un corset de tissu epais presentant
quatre perforations circulaires de 8 mm de diamètre cha-
cune (=spots d'irridiation).
On applique au niveau de ~ spots (les 2 autres
spots servant de temoins) immediatement après l'exposition,
0,25 ml d'une creme contenant l'extrait lyse d'Hafnia
decrit à l'exemple 1.
Les concentra-tions etudiees sont 0,01 ~ et 0,05 %.
Deux heures après l'irradiation, on note l'inten-
site de l'erythème obtenu au niveau des spots, selon une
25echelle de 0 à 3.
Cotation
0......................... pas d'erythème
1.................. ~...... spot juste discernable
2......................... erytheme plus accuse
3......................... erytheme très visible
On etabli-t la moyenne du degré d'erytheme pour
chaque groupe et on l'exprime ensuite en pourcentage de
protection par rapport aux spots temoins.
- 13 -
~2~1
Moyenne de la cotation Moyenne de la cotation
des témoins - des traités
- x 100
Moyenne de la cotation
des temoins
Resultats : Les pourcentages d'activite inhibitrice sur le
développement de l'érythème cutané expérimental sont les
suivants:
- crème dosée à 0,01 ~ d'extrait lysé d'Hafnia....... 32,2 %
- crème dosée a 0,05 % d'extrait lyse d'Hafnia....... 44 %
d) Action sur la denaturation des proteines (serum
albumine) par la chaleur : test de Mizuschima
Principe du test de Mizuschima
Les substances antiinflammatoires protègent les
proteines (serum album~ne) de la dénaturation par la
chaleur en milieu tamponné acide.
~2~3~
Resultats_du dosage nephelom ~
._ ......... ... _ ._
Densite optique a
Produit 650 D m DO moyenne
ler 2e 3è
essai essai essai _ _
Temoin avec serum
albumine bovine à0,71 0,66 0,69 0,58
Extrait lyse
d'Hafnia de 0,41 0,40 0,48 0,43
l'exe~ple 1:1 mg/ml
_ _ ~
2 mg/ml 0,29 0,28 0,32 0,30
._ _ . _ .
2,5 mg/ml 0,23 0,20 0,22 0,22
_ __ . _ _ _
3 mg~ml 0,20 0,19 0,21 0,20
5 mg/ml 0,02 0,03 0,02 0,02
_ _ __ .. ._ ._
10 mg/ml0,01 0,01 0,01 0,01
L'extrait a base de glycoproteines lysees
d'Hafnia exerce un effet protecteur contre la denaturation
de la serum albumine pax la chaleur.
