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MÉTHODES DE DÉTECTION D' INTEIEZACTIONS ENTRE PLUSIEURS
PROTE INES
La présente invention concerne des méthodes de détection ou
d'identification de protéines impliquées .dans la formation d'un complexe
protéique, ou dans l'inhibition de la formation d'un complexe protéique.
Parmi les méthodes actuellement disponibles pour étudier des
interactions entre protéines, le système doul:~le-hybride, et plus récemment
celui
m du triple-hybride, s'avèrent être des méthodes particulièrement
performantes.
Le système double-hybride est basé sur la reconstitution d'un activateur
transcriptionnel dans la levure (Fields S. et Song O., 1989 ; Chien C.-T. et
al. ,
1991). Une première protéine est clonée en fusion avec le domaine de liaison à
l'ADN, alors qu'une deuxième protéine est clonée en fusion avec le domaine
i ~ d' activation de la transcription. Lors~iue les deux protéines d' intérêt
interagissent entre elles, un activateur transcriptionnel est formé permettant
la
transcription de gènes rapporteurs.
Un système triple-hybride, reprenant le principe du double-hybride, en
insérant dans les vecteurs utilisés une séduence d'ADN codant un troisième
?o partenaire, a été développé par Zhang et Lautar (Zhang J. et al. , 1996).
Toutefois, les systèmes double-hybride et triple-hybride actuellement
disponibles, présentent, comme inconvénient majeur, la nécessité de faire un
test
d' interaction avec un témoin négatif, ce caui correspond à effectuer les deux
expériences distinctes suivantes
z> - une première expérience où les cellules hôtes sont transformées avec
des vecteurs contenant la séquence d'ADN codant la protéine testée, et les
séquences d' ADN codant le ou les partenai~°es potentiels de cette
protéine testée,
et
- une deuxième expérience servant de témoin négatif, dans laquelle les
3o cellules hôtes sont transformées avec des vecteurs ne contenant pas la
séquence
d' ADN codant la protéine testée, mais seulement celles codant le ou les
partenaires potentiels de cette protéine testée.
Ces deux expériences sont distinctes car les cellules hôtes sont
transformées avec des vecteurs différents en fonction de l'expérience
effectuée.
Outre le fait que cette nécessité d'effectuer ces deux expériences
distinctes ne permet pas de contrôler rapidement l' influence de la protéine
testée
sur le ou les autres partenaires, il arrive fréquemment que l'absence de
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croissance de ces témoins négatifs, résulte de mutations ou de recombinaisons
éventuelles dans un des vecteurs, ce qui conduit à des résultats erronés.
Un des buts de la présente invention, est précisément de fournir de
nouvelles méthodes d'étude d'interactions entre protéines, ne nécessitant pas
la
ï mise en oeuvre de deux expériences distinctes, ces méthodes étant par
conséquent plus simples à mettre en oeuvre, plus rapides et plus fiables que
les
méthodes actuellement proposées.
L'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un promoteur
conditionnel pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection d'une (ou
m plusieurs) protéines) (ou polypeptides) interagissant directement ou
indirectement avec au moins deux autres protéines (ou polypeptides) dans le
cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de l'inhibition de la
fOI'lnat1011 d'un complexe protéique.
Par protéine interagissant directement avec au moins deux autres
na protéines dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, on entend
- toute protéine s'associant à au moins deux autres protéines pour
former avec ces dernières un complexe protéique constitué d'au moins trois
protéines, ou
- toute protéine catalysant la formation d'un complexe protéique entre
20 all n1o111s deux protéines (sans pour autant s'associer à ces dernières
pour former
un complexe protéique), notamment par un mécanisme de modification
conformationnelle d'un ou plusieurs des partenaires du complexe protéique.
Par protéine interagissant directement avec au moins deux autres
protéines dans le cadre de l'inhibition de la formation d'un complexe
protéique,
on entend
- toute protéine inhibant la formation du complexe protéique constitué
d' au moins ces deux autres protéines susmentionnées, notamment par un
mécanisme de compétition avec l'un des partenaires du complexe protéique. ou
- toute protéine catalysant l' inhibition de la formation du complexe
3O protéique constitué d'au moins ces deux autres protéines, notamment par un
mécanisme de modification conformationnelle d'un ou plusieurs des partenaires
dudit complexe protéique.
Parmi les promoteurs conditionnels susceptibles d'être utilisés dans le
cadre de la présente invention, on peut citer
,» - le promoteur Met25 (Kerjan P. et al. , 1986), régulable en fonction de
la concentration en méthionine, ou
- les promoteurs GAL1 ou GAL10 (Johnston and Davis, 1984),
régulables en fonction de la concentration en galactose.
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L'invention a également pour objet toute méthode de détection d'une _
protéine telle que définie ci-dessus interagissant avec au moins deux
protéines
déterminées, dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de
l'inhibition de la formation d'un complexes protéique, caractérisée en ce
qu'elle
comprend
- une étape de transformation de cellules hôtes, dont le génome contient
un ou plusieurs gènes rapporteurs, avec mn ou plusieurs vecteurs, de manière à
ce que le génome de ces cellules hôtes contienne la séquence d'ADN codant la
protéine testée susceptible d'être détectÉ:e, ainsi que les séquences d'ADN
~c> codant au moins deux protéines déterminées, la transcription de l'une au
moins
des séquences d'ADN étant placée sous le contrôle d'un promoteur conditionnel,
- la comparaison des effets de la répression du promoteur conditionnel,
avec les effets de l'activation de ce promoteur conditionnel, sur l'éventuelle
transcription du ou des gènes rapporteurs susmentionnés, les résultats de
cette
i ~ comparaison étant corrélables à la détection d' une interaction, ou au
contraire
d'une absence d'interaction entre la protéine testée et les protéines
déterminées.
De préférence, la méthode décrite ci-dessus de détection d'une protéine
interagissant directement ou indirectement avec au moins deux protéines
déterminées, comprend
?o - une étape de transformation de cellules hôtes, dont le génome contient
un ou plusieurs gènes rapporteurs, avec un ou plusieurs vecteurs, de manière à
ce que le génome de ces cellules hôtes contienne
. d'une part la séquence d'ADN codant ladite protéine testée
susceptible d' interagir avec au moins deux protéines déterminées. la
?â transcription de cette séquence d'ADN étant placée sous le contrôle d'un
promoteur conditionnel,
. et, d'autre part, les séquences d'ADN codant lesdites protéines
déterminées,
- la comparaison des effets de la répression du promoteur conditionnel,
3o avec les effets de l'activation de ce promoteur conditionnel, sur
l'éventuelle
transcription du ou des gènes rapporteurs susmentionnés, tes résultats de
cette
comparaison étant corrélables à la détection d'une interaction, ou au
contraire
d'une absence d'interaction entre ladite protéine testée et lesdites protéines
déterminées.
~s Par transformation de cellules hôtes avec un vecteur, dans ce qui
précède et ce qui suit, on entend toute méthode permettant d'ajouter dans le
~~énome desdites cellules, le contenu de séquences d'ADN d'un vecteur,
notamment de type plasmide ; les cellule; hôtes résultantes sont désignées
dans
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ce dui précède et ce qui suit par l'expression "cellules hôtes transformées".
Par _
génome d'une cellule, on entend l'ensemble de l'ADN contenu dans une cellule,
à savoir l'ADN des chromosomes, des mitochondries et des épisomes.
A111S1, la méthode de l'invention présente l'avantage de ne pas
a comprendre deux expériences distinctes telles que décrites ci-dessus, dont
une
expérience servant de témoin négatif par culture parallèle de cellules hôtes
transformées avec des vecteurs ne contenant pas de séquence d' ADN codant la
protéine testée, aux fins de comparaison avec l'étape de culture des cellules
hôtes transformées avec des vecteurs contenant l'ensemble des séquences
i U d' ADN codant les protéines susceptibles d' interagir entre elles.
En effet, les cellules hôtes mises en culture dans la méthode de la
présente invention, soit à titre de témoin négatif (ou de témoin interne),
soit
pour mettre en évidence une interaction entre les protéines, sont transformées
par les mêmes vecteurs, évitant ainsi de conduire à des résultats erronés,
comme
na indiqué ci-dessus dans le cadre des méthodes actuellement proposées dans ce
domaine.
Ainsi, un des aspects particulièrement avantageux des méthodes de
l' invention, est que le contrôle est interne à l'expérience, ce qui rend ces
méthodes particulièrement adaptées au criblage d'une banque d'ADNc, ou d'une
banque synthétique dégénérée d'oligonucléotides, susceptibles de contenir une
(ou plusieurs) séquence{s) d'ADN codant une (ou plusieurs) protéines)
interagissant avec au moins deux autres protéines déterminées.
L' invention a plus particulièrement pour objet, toute méthode telle que
décrite ci-dessus, dans laquelle
- deux des protéines codées par les séquences d' ADN contenues dans le
(ou les) vecteurs) utilisés) pour la transformation desdites cellules hôtes,
sont
en fusion, pour l'une d'entre elles, avec un domaine de fixation à l'ADN, et
pour l'autre, avec un domaine d'activation de la transcription, la
transcription
des séquences d'ADN codant ces deux protéines de fusion étant sous le contrôle
de promoteurs constitutifs,
- l'autre de ces protéines, ou l'une au moins des autres protéines codées
par la ou les séquences d' ADN contenues dans le ou les vecteurs
susmentionnés,
est codée par une séquence d' ADN dont la transcription est sous le contrôle
d'un promoteur conditionnel.
Avantageusement, les deux protéines déterminées, ou au moins deux
desdites protéines déterminées, codées par les séquences d'ADN contenues dans
le (ou les) vecteurs) utilisés) pour la transformation desdites cellules
hôtes,
sont en fusion, pour l'une d'entre elles, avec un domaine de fixation à l'ADN,
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et pour l'autre, avec un domaine d'activation de la transcription, la
transcription _
des séquences d'ADN codant ces deux protéines de fusion étant sous le contrôle
de promoteurs constitutifs.
Parmi les domaines de fixation à 1°ADN susceptibles d'être
utilisés dans
s le cadre de la présente invention, on peut citer
- LexA (décrit notamment dans Vojtek A. et al. , 1993), ou
- GAL4 DBD (décrit notamment dans Fields S. and Song O., 1989, et
Chien C.-T. et al., 1991, susmentionnés),
- ERE (Estrogen Response Ele~r~ent) (décrit notamment dans Klein-
m Hitpass L. et al. , 198G, et dans le Douarin B. et al. , 1995).
Parmi les domaines d'activation de la transcription susceptibles d'être
utilisés dans de cadre de la présente invention, on peut citer
- l'activateur transcriptionnel de 'VP16 (décrit notamment dans Vojtek
A. et al. susmentionné), ou
o - GAL4 AD (décrit notamment dans Fields S. and Song O., 1989, et
Chien C.-T. et al., 1991, susmentionnés).
La méthode susmentionnée de l'invention peut être effectuée à l'aide
d'un vecteur contenant l'ensemble des séquences d'ADN codant pour les
protéines en question, ou de préférence à l'aide de plusieurs vecteurs
construits
2o de telle manière que
- l'un d'entre eux contient la séduence d'ADN codant la protéine en
fusion avec le domaine de fixation à l'ADN, et dont la transcription est sous
le
contrôle d'un promoteur constitutif, tan3is qu'un autre vecteur contient la
séquence d'ADN codant la protéine en fusion avec le domaine d'activation, et
dont la transcription est également sous le contrôle d'un promoteur
constitutif,
- l'un des deux vecteurs susmentionnés, ou un autre vecteur, contient
une séquence d'ADN codant une protéine susceptible d'interagir avec les
précédentes, et dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur
conditionnel,
- le cas échéant, un ou plusieurs des vecteurs susmentionnés, ou un ou
plusieurs autres vecteurs, contiennent une ~~u plusieurs séquences d'ADN
codant
une protéine susceptible d'interagir avec lea précédentes, et dont la
transcription
est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel (avantageusement différent du
promoteur conditionnel précédent), ou d'un promoteur constitutif.
Avantageusement, la méthode susmentionnée de l' invention est
effectuée à l'aide de plusieurs vecteurs tels que
- i'un d'entre eux contient unc: séquence d'ADN codant une des
protéines déterminées en fusion avec le domaine de fixation à l'ADN, et dont
la
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transcr~ptoon est sous le contrôle d'un promoteur constitutif, tandis qu'un
autre _
vecteur contient une séquence d'ADN codant une autre protéine déterminée en
fusion avec le domaine d'activation, et dont la transcription est également
sous
le contrôle d'un promoteur constitutif,
- l'un des deux vecteurs susmentionnés, ou un autre vecteur, contient la
séquence d'ADN codant la protéine testée susceptible d'interagir avec les
précédentes, et dont ia transcription est sous le contrôle d'un promoteur
conditionnel,
- le cas échéant, un ou plusieurs des vecteurs susmentionnés, ou un ou
n? plusieurs autres vecteurs, contiennent une ou plusieurs séquences d'ADN
codant
une autre protéine déterminée susceptible d'interagir avec les précédentes, et
dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel
différent
du promoteur conditionnel précédent, ou sous le contrôle d'un promoteur
constitutif.
n A titre d'illustration, la détection d'une interaction entre une protéine
testée et deux protéines déterminées peut être effectuée à l'aide de deux
vecteurs
tels que
- l'un d'entre eux contient la séquence d'ADN codant la protéine en
fusion avec le domaine de fixation à l'ADN,
~t> - l'autre vecteur contient la séquence d'ADN codant Ia protéine en
tuSlOII avec le domaine d'activation,
- l'un des deux vecteurs susmentionnés contient la séquence d'ADN
codant pour la protéine testée susceptible d'interagir avec les précédentes,
et
dont la transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel.
25 La méthode susmentionnée de l'invention, pour la détection d'une
interaction entre une protéine testée et deux protéines déterminées, peut
également ëtre effectuée à l'aide de trois vecteurs tels que
- le premier vecteur contient la séquence d' ADN codant la protéine en
fusion avec le domaine de fixation à l'ADN,
- le deuxième vecteur contient la séquence d' ADN codant la protéine en
fusion avec le domaine d'activation,
- le troisième vecteur contient la séquence d'ADN codant pour la
protéine testée susceptible d' interagir avec les précédentes, et dont la
transcription est sous le contrôle d'un promoteur conditionnel.
Avantageusement, les vecteurs susmentionnés contiennent également
une séquence d'ADN correspondant à un gène de sélection, tel qu'un gène
codant une enzyme du métabolisme d'un acide aminé particulier pour lequel la
souche de cellules hôtes transformées est auxotrophe.
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Les cellules hôtes transformées pair les vecteurs susmentionnés dans le _
cadre de la mise en oeuvre d'une méthode selon l'invention, sont
avantageusement telles que leur génome comprend un ou plusieurs gènes
rapporteurs dont Ia transcription est placée, pour chacun d'entre eux, sous le
contrôle d' un opérateur reconnu par le domaine de fixation à l' ADN codé par
l'un des vecteurs susmentionnés, la transcription de ces gènes rapporteurs
ayant
i leu lorsqu' il y a formation, le cas échéant sous l' influence directe ou
indirecte
de la protéine testée, d'un complexe protéique entre les protéines déterminées
produites dans les cellules hôtes transformées mises en culture.
Parmi les gènes rapporteurs susceptibles d'être contenus dans le
génome des cellules hôtes, on peut citer, à titre d'exemple
- tout gène codant une enzyme susceptible de réagir avec un substrat
déterminé dans des conditions permettant de détecter, voire de mesurer, le
résultat de cette réaction enzymatique dans le milieu de culture des cellules
transformées, notamment une enzyme réagissant avec un substrat dans le cadre
d'une réaction colorée, par exemple le gène LacZ permettant de détecter, voire
de mesurer, une activité (3-galactosidase ; une telle activité ~3-
galactosidase peut
par exemple se traduire par une coloration bleue en utilisant le 5-bromo-4-
chloro-3-indolyl (3-D-galactoside (ou Xgal) à titre de substrat, ou encore par
une
'o coloration jaune en utilisant l'O-nitrophényl-~-galactoside (ONPG) à titre
de
substrat,
tout gène codant une enzyme responsable du métabol isme d' un
composé particulier, notamment d'un acide aminé, pour lequel la souche de
cellules hôtes transformées est auxotrophe.
?> Avantageusement, les cellules hôtes utilisées sont auxotrophes pour les
acides aminés dont le métabolisme est sous la dépendance des enzymes codées
par les gènes de sélection contenus dans l~~s vecteurs susmentionnés et, le
cas
échéant, pour l'acide aminé dont le métabolisme est sous la dépendance de
l'enzyme codée par un gène rapporteur conrenu dans le génome desdites cellules
hôtes.
A titre d'exemple, la souche de cellules hôtes utilisée est une souche de
levures, notamment la souche de levure L40, dont le génome contient à titre de
~~ènes rapporteurs le gène HIS3 (codant pour une enzyme du métabolisme de
l'histidine) et le gène LacZ codant la (3-galactosidase, la transcription de
ces
_s> ~~ènes rapporteurs étant sous le contrôle d'un opérateur reconnu par le
domaine
de fixation à l'ADN LexA.
Avantageusement, dans le cadre de la détection d'une protéine telle que
définie ci-dessus, susceptible d'interagir dürectement ou indirectement avec
au
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moins deux protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe _
protéique, les séquences d'ADN codant lesdites protéines déterminées sont
choisies parmi celles codant des protéines ne formant pas ou peu de complexes
protéiques entre elles.
Dans ce cas, il Il'y a pas de transcription, voire une faible transcription,
du ou des gènes rapporteurs des cellules hôtes transformées par le ou les
vecteurs définis ci-dessus, lorsque ces cellules sont mises en culture en
réprimant ledit promoteur conditionnel sous le contrôle duquel est placée la
transcription de la séquence d'ADN codant la protéine testée, ou une des
protéines déterminées.
La transcription du ou des gènes rapporteurs desdites cellules hôtes
mises en culture en activant ledit promoteur conditionnel, voire une
transcription accrue de ce ou ces gènes rapporteurs par rapport à la
transcription
de ces mêmes gènes en réprimant ledit promoteur conditionnel, est alors
ia corrélable à ta détection d'une interaction directe ou indirecte entre la
protéine
testée et lesdites protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un
complexe protéique.
Avantageusement, dans le cadre de la détection d'une protéine telle que
définie ci-dessus, susceptible d' interagir directement ou indirectement avec
au
~0 117o111S deux protéines déterminëes dans le cadre de l' inhibition de la
formation
d'un complexe protéique, les séquences d'ADN codant lesdites protéines
déterminées sont choisies parmi celles codant des protéines formant un
complexe protéique entre elles.
Dans ce cas, il y a transcription du ou des gènes rapporteurs des
?s cellules hôtes transformées par le ou les vecteurs définis ci-dessus,
lorsque ces
cellules sont mises en culture en réprimant ledit promoteur conditionnel sous
le
contrôle duquel est placée la transcription de la séquence d'ADN codant la
protéine testée.
L'absence de transcription du ou des gènes rapporteurs desdites cellules
hôtes mises en culture en activant ledit promoteur conditionnel, voire une
transcription plus faible de ce ou ces gènes par rapport à la transcription de
ces
mëmes gènes en réprimant ledit promoteur conditionnel, est alors corrélable à
la
détection d'une interaction directe ou indirecte entre la protéine testée et
lesdites
protéines déterminées dans le cadre de l'inhibition de la formation d'un
complexe protéique.
Selon un mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre des
méthodes décrites ci-dessus de l' invention
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- le promoteur conditionnei est le promoteur Met25 régulable en -
fonction de la concentration de méthionine clans le milieu de culture des
cellules
hôtes transformées, ledit promoteur étant acoivé en l'absence de méthionine
dans
le milieu de culture, et réprimé en présence de méthionine, et
- les gènes rapporteurs contenus dans le génome des cellules hôtes
transformées sont
~ un gène codant une enzyme du métabolisme d'un acide aminé
particulier, pour lequel la souche desdites. cellules hôtes est auxotrophe par
mutation dans ledit gène,
io . un gène codant une enzyme rfaponsable de la coloration de milieu
de culture lorsqu'elle réagit avec son substrat, tel que le gène LacZ codant
la y-
galactosidase.
Ainsi la détection, voire la mesure, de la croissance des colonies de la
souche de cellules hôtes transformées dans un milieu de culture sélectif M 1
qui,
i ~ d'une part ne contient pas l'acide aminé dont le métabolisme est sous la
dépendance de l'enzyme codée par le gène rapporteur contenu dans le génome
desdites cellules hôtes et, d'autre part, ne contient pas de méthionine, est
corrélable à la détection d'une interaction entre la protéine testée et les
protéines
déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protéique, dans la
?o mesure où la croissance de ces colonies dans un milieu de culture sélectif
M2
correspondant au milieu Ml précédent dans lequel de la méthionine est
rajoutée,
est nulle ou inférieure à celle mesurée en l'absence de méthionine.
De même, la détection, voire la mesure, d'une coloration dans le milieu
de culture des cellules hôtes transformées.. notamment d'une coloration bleue
?, dans un milieu contenant le substrat XGaI, mais ne contenant pas de
mëthionine,
est corrélable à la détection d'une interaction entre la protéine testée et
les
protéines déterminées dans le cadre de la formation d'un complexe protëique,
dans la mesure où cette coloration, dans le milieu de culture précédent dans
lequel de la méthionine est rajoutée, est nulle ou inférieure à celle mesurée
en
absence de méthionine.
En revanche, l'absence de croissance des colonies de la souche de
cellules hôtes transformées dans le milieu de culture M 1 susmentionné, ou la
détection d'une plus faible croissance de ces colonies dans le milieu Ml par
rapport à la croissance détectée pour ces colonies dans le milieu M2
~5 susmentionné, est corrélable à la détection d'une interaction entre la
protéine
testée et tes protéines déterminées dans le cadre de l' inhibition de la
formation
d'un complexe protéique.
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De même, l'absence de coloration dans le milieu de culture des cellules
hôtes transformées contenant le substrat spécifique de la coloration
(notamment
XGaI} mais ne contenant pas de méthionine, où la détection d'une plus faible
coloration dans ce milieu de culture par rapport au milieu de culture
contenant
de la méthionine, est corrélable à la détection d'un interaction entre la
protéine
testée et les protéines déterminées dans le cadre de l' inhibition de la
formation
d'un complexe protéique.
La présente invention a plus particulièrement pour objet l'application
des méthodes décrites ci-dessus au criblage d'une banque d'ADNc, ou d'une
m banque synthétique dégénérée d'oligonucléotides, lesdites banques étant
susceptibles de contenir une (ou plusieurs) séquences) d' ADN codant une (ou
plusieurs) protéines) telles) que décrites) ci-dessus, interagissant
directement
ou indirectement avec au moins deux protéines déterminées dans le cadre de la
f01'lllat1011 d'un complexe protéique, ou de l'inhibition d'un complexe
protéique.
i > A titre d' illustration, la détection d'une protéine interagissant
directement ou indirectement avec deux protéines déterminées A et B, dans le
cadre de la formation d'un complexe protéique, ou de l'inhibition de la
formation d' un complexe protëique, est avantageusement effectuée selon la
méthode suivante qui comprend
- la transformation de cellules hôtes avec
. un vecteur contenant
''' une séquence d'ADN de fusion entre une séquence d'ADN
codant une protéine déterminée A, et une séquence d'ADN codant: un domaine
d'activation de la transcription à l'ADN, et
'-s * un gène de sélection codant une enzyme du métabolisme
d'un acide aminé désigné ci-après AA1,
~ et un vecteur contenant
* une séquence d'ADN de fusion entre une séquence d'ADN
codant une protéine déterminée B différente de la précédente protéine A et une
~o séquence d'ADN codant un domaine de fixation à l'ADN, et
un gène de sélection codant une enzyme responsable du
métabolisme d'un acide aminé désigné ci-après AA2, AA2 étant différent de
AAI,
l'un des deux vecteurs susmentionnés contenant une séquence d'ADN
>> codant la protéine testée, la transcription de cette séquence d'ADN étant
sous le
contrôle du promoteur conditionnel Met25,
lesdites cellules hôtes étant telles que leur génome comprend, un Gène
rapporteur, notamment le gène LacZ, ainsi qu'un gène codant une enzyme du
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métabolisme d'un acide aminé désigné ci-après AA3, AA3 étant différent de _
AA1 et AA2, et telles qu'elles sont auxotrophes pour les acides aminés AAl.
AA2 et AA3.
- la sélection des cellules hôtes transformées par les deux vecteurs
SIISlnelltlOnnés par mise en culture de ces dernières dans un milieu sélectif
MO
comprenant AA3, mais ne contenant pas AA1 et AA2,
- la culture des cellules hôtes transformées sélectionnées lors de l'étape
précédente, en activant ledit promoteur conditionnel dans un milieu de culture
sélectif Ml ne contenant pas AA1, AA2 et AA3, et ne contenant pas de
m méthionine.
- une étape de culture des cellules hôtes transformées dallS llll n1111eU de
culture sélectif M2 en réprimant ledit promoteur conditionnel, M2
correspondant au milieu M1 auquel de la méthionine est rajoutée, cette étape
de
culture étant effectuée antérieurement, ou postérieurement, ou parallèlement à
~ 5 l' étape de culture précédente,
- la détection éventuelle d'une interaction entre la protéine testée et les
protéines déterminées, de la manière indiquée ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux des méthodes
de l'invention, la séquence d'ADN codant la protéine testée, ou l'une des
?o séquences d'ADN codant une protéine déterminée, est fusionnée, dans le ou
les
vecteurs susmentionnés, à une séquence d'ADN codant un peptide susceptible
d'être reconnu spécifiquement par un anticorps, notamment une séquence
d'ADN codant la tag Hémagglutinine (tag; HA) susceptible d'être reconnue par
l'anticorps anti-HA (décrit notamment dans Hanke et al., 1992).
2~ Ainsi, la formation d'un complexf; protéique dans le cadre de la mise en
oeuvre d'une méthode selon l'invention, peut encore être vérifiée par
immunoprécipitation dudit complexe à partir d'un extrait total des cellules
hôtes
mises en culture et d'un anticorps tel que décrit ci-dessus. Cette
imlnunoprécipitation permet de séparer et de purifier le complexe protéique à
_sU partir du milieu de culture desdites cellules, et, le cas échéant, de
vérifier la
structure et/ou l'activité biologique de ce ~~omplexe, notamment pour en
déduire
la nature de l'interaction entre la protéine testée et les protéines
déterminées
dans le cadre la formation de ce complexe (à savoir : interaction directe ou
indirecte telle que décrite ci-dessus).
Bien entendu, la présente invention ne se limite pas à l'étude de
l' interaction entre trois protéines entre elles, et la méthode décrite ci-
dessus dans
le cadre de l'étude d'interactions entre trois protéines, peut être adaptée à
l'étude de l'interaction entre quatre ou cinq protéines (voire plus encore).
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Dans ce cas, chaque séquence d'ADN codant une protéine _
supplémentaire à tester, est introduite dans un des deux vecteurs utilisés
dans la
méthode décrite ci-dessus, voire dans d'autres vecteurs supplémentaires, et
est
avaata~~eusement sous le contrôle d'un promoteur conditionnel de préférence
différent du ou des autres promoteurs conditionnels déjat utilisés pour
contrôler
la transcription de séquences d'ADN codant d'autres protéines au sein des
vecteurs susmentionnés.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples qui suivent
de l' étude d' interactions entre plusieurs protéines.
I - Etude de l'interaction entre les trois protéines Cdlc7, Cycline H
et MAT1.
Ces trois protéines sont des protéines du complexe multiprotéique
TFIII-~ essentiel pour la transcription et la réparation de l' ADN (Svejstrup
et al. ,
1996). Celui-ci peut se résoudre en deux sous-complexes : le "core" comportant
6 sous-unités et le complexe kinase formé des trois protéines, Cdk7, Cycline H
et MATI. Ce dernier complexe existe également sous forme libre in vivo. Des
expériences préalables de double-hybride et d' immunoprécipitation à partir
?U d' extraits de celluies eoinfectées avec des virus ayant intégré l' ADNc
correspondant, ont montré que les protéines Cdk7 et Cycline H interagissent
entre elles. II n'a pas été possible avec le système double-hybride, de
détecter
clos complexes de type Cdk7/MAT 1 ou Cycline H/MAT 1.
A ) Matériels et Méthodes
La souche de levure L40, auxotrophe pour l'histidine, la leucine, le
tryptophane et l'adénine ainsi que les plasmides pLex9-3H dérivés du vecteur
pBTMI 16 (Vojtek et al. ,1993), et pVPl6 ont été utilisés.
En plus du marqueur de sélection TRP1 (gène codant pour une enzyme
du métabolismè'~lu tryptophane) et de LexA (contenant un domaine de liaison à
l'ADN) cloné en aval du promoteur constitutif de l'alcool déshydrogènase
(ADH), pLex9-3H comporte une cassette d'expression constituée du promoteur
inductible Met25, un tag Hémagglutinine (tag HA), un signal de localisation
;> nucléaire (NLS), les sites de clonage Notl et Srfl permettant d'intégrer
l'ADN
codant pour un polypeptide d' intérêt et le terminateur de transcription de la
Phosphoglycérate kinase, tPGK (Figure 1).
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La plasmide pVPl6 contient un marqueur de sélection LEU2 (gène _
codant pour une enzyme du métabolisme de la leucine) et l'activateur
transcriptionnel de VP16 cloné en aval du promoteur de l'ADH.
Les ADNc codant pour Cdk7, Cycline H et MATI ont respectivement
été clonés en fusion avec LexA dans le plasmide pLex9-3H, sous la dépendance
du promoteur Met25 dans pLex9-3H et en fusion avec VP16 dans le plasmide
pVPl6 (Figure 2).
a) Construction des plasmides
o> Les ADNc codant pour chacune des trois protéines ont été amplifiés par
PCR à partir de constructions décrites dans ,Adamczewski .T.I'. et al. , 1996,
avec
des oligonucléotides spécifiques à chacun d'entre eux, avant d'être insérés
dans
les vecteurs adéquats.
La PCR permettant le clonage de Cdk7 en fusion avec LexA, dans le
i > site EcoRI de pLex9-3H a été faite avec les oligonucléotides
5'AGTCGTGAATTCATGGCTCTGGACCTGAAG3' pour la partie 5' de
l'ADNc et 5'GATCGTGAATTCTTA~~AAAATTAGTTTCTTGGGCAA3'
pour l'extrémité 3', la protéine de fusion rfaultante étant LexA-Cdk7. La PCR
permettant le clonage de cycline H en fusion avec le tag HA, dans le site NotI
?o de pLex9-3H en aval du promoteur pMet25, a été faite avec les
oligonucléotides
5'GATCGTGCGGCCGCAATGTACCACAACAGT3' pour la partie 5' de
l' ADNc et 5' GATCGTGCGGCCGCTTAGAGAGATTCTACCAG pour
l'extrémité 3', la protéine de fusion résultante étant TagHA-Cycline H. Enfin,
la
PCR permettant le clonage de MATI en fusion avec VP16, dans le site EcoRI
=de pVPl6, a été faite avec les oligonucléotides
S'GATCAGGAATTCCCATGGAGGATCA,GGGTT3' pour la partie 5' de
l'ADNc et 5'GATCAGGAATTCTTP,ACTGGGCTGCCAGAA3' pour
l'extrémité 3', la protéine de fusion résultante étant VP16-MAT1.
b) Transformation de la levure ea sélection des transformants
La souche L40 [MATa, trpl, his3, leu2, ade2, LYS2::(LexAop)4-
HIS3, URA3::(LexAop)g-LacZ] contient les gènes rapporteurs HIS3 (codant
pour une enzyme du métabolisme de l'hi~~tidine) et LacZ en fusion avec un
opérateur reconnu par LexA. Les cellules sont mises en culture pendant 16
heures dans du milieu complet (milieu YPD) et transformées par Cdk7-pLex9-
3H-CyclineH par la méthode à l'Acétate de Lithium (Schiestl R.H. et al.,
1993). pLex9-3H contenant le gène TRP1, la sélection des transformants se fait
sur milieu minimum HLA (contenant 0.06 s,;/I d'histidine, 0.12 g/l de leucine
et
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0.12 ~~/I d'adénine, en plus des 1.44 g/I de "yeast nitrogen base without
amino -
acids" et des 20 g/1 d'agarose, mais sans tryptophane). Un des clones
transformés est alors remis en culture dans 20 ml de HLA pendant une nuit,
puis transformê à son tour par MATIpVPI6 de la même façon que
précédemment. Puisque pVPl6 comporte le gène LEU2, la sélection des
doubles transformants se fera sur milieu minimum HA (contenant de l'adénine et
de l'histidine mais pas de tryptophane ni de leucine).
c) Expression des protéines
m L'expression des protéines est contrôlée par imlnunoblots réalisés à
partir des extraits de levures ayant poussé sur milieu HA, milieu sélectif
pour la
présence des plasmides. La répression induite par la présence de méthionine
est
é~~alement examinée (Rose M.D., 1990).
i , d) Test d' interaction entre les trois partenaires
Deux types de contrôles sont disponibles : le test de croissance et le test
d'activité de la ~3-galactosidase.
Pour le test de croissance, trois clones différents, isolés à partir de
cultures établies sur milieu HA, sont mis en suspension dans 50 ~,l d'eau
stérile
zo et dilués en cascade de 10 jusqu'à 10-4. Pour chacun des clones, une goutte
de
chaque dilution est déposée sur milieu sélectif pour l' interaction à trois
(A, ne
contenant que l'adénine) ainsi que sur un milieu inhibant l'expression de la
cycline H (AM, contenant l'adénine et méthionine 1mM).
L'activité ~3-galactosidase est évaluée sur des cellules ayant poussées
~5 une nuit dans le milieu adéquat (on mesurera la densité optique à 600nm
[D06o0]) Puis resuspendues dans un tampon phosphate (d'après Miller J.,
1972) auquel sont ajoutées trois gouttes de chloroforme et 2 gouttes de
détergent SDS 0,1 % pour incubation de 5 minutes à 28°C ; la
réactivation est
initiée par 200.1 d'O-nitrophényl-(3-galacatoside (ONPG) 4mglml puis arrêtée
dès l'apparition d'une couleur jaune pâle par 500,1 de bicarbonate Na2C03
1 mM. La D0420 est alors mesurée. L'activité (3-gaiactosidase (en ml-!.min-1)
est calculée par la formule : (D0420) / [D0600) x vol. de culture (ml) x temps
de réaction (min)]. (Rose M.D., 1990).
B) Résultats
:~$
Dans un milieu dépourvu de méthionine (permettant l'expression non
seulement de cdk7 et MATI mais également de la cycline H), on observe la
croissance de colonies pour des dilutions allant de 10-t à 10-4, alors que sur
un
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milieu riche en méthionine (répression de la cycline H), on observe des
colonies
uniquement pour les deux premières dilutions (figure 3). De plus, la mesure de
l'activité (3-galactosidase de la souche ayant poussé sur le milieu sans
méthionine
est de 115 Illl-t.tnln-1 alors que celle de la même souche ayant poussée en
présence de méthionine, a une activité de 18 ml-t.min-~, soit une inhibition
de
l'activité ~-Gal de plus de 6 fois (figure 4).
Ces résultats démontrent que le troisième polypeptide cycline H,
catalyse (stabilise) la formation du couple, d'activation Lex-cdk7/VP16-MATI,
ce dui pourrait être dû à la formation d'un complexe à trois entre Cdk7.
Cycline
m H et MATI.
La faible activité ~3-galactosidasc: visualisée lorsque la cycline H est
réprimée, suggère une association faible entre MATI et Cdk7 ; ce qui ne peut
être exclu d'après des expériences d'immunoprécipitation faites sur des
extraits
de cellules d'insectes, où une association f,~ible Cdk7/MATI a été visualisée.
n Afin de vérifier la spécificité de l'interaction, Cdk7/cycline H/MAT1,
nous avons intégré dans le vecteur pVPl6, les autres sous unités du complexe
TFIIH. Ainsi, cinq sous unités du core de TFIIH ont été testées pour une
association avec Cdk7 en présence de cyl;ine I-I. Aucune interaction n'a pu
être
visualisée que ce soit par le test de croissance ou le test ~3-galactosidase
comme
illustré (figure 4). L'expression de Cdk' et de Cycline H (Cdk7-pLex9-3H-
Cycline H), d'une part et de VP16 seul (n.° contenant pas de protéine
fusionnée)
d' autre part, donne une réponse équivalent au bruit de fond, que ce soit pour
le
test de croissance ou celuï de l'activité (3-galactosidase (figure 4).
Les résultats des tests d'interaction d'une part et la présence des trois
protéines mise en évidence par western blot d'autre part, suggèrent fortement
l'existence d'un complexe ternaire contenant les protéines Cdk7, cycline H et
MATI. Afin de visualiser un tel comple;ce ternaire, un extrait total de levure
avant poussé sur milieu A a été immunop:récipité par l' intermédiaire du
peptide
de fusion tag HA de I<i cycline H. Ainsi, l'anticorps anti-HA retient non
~c? seulement la cycline H, mais aussi Cdk7 ~~t MATl. De plus, le complexe
ainsi
purifié possède le mëme type d'activité CTD kinase que le complexe isolé
différenunent.
II - Inhibition de l'interaction entre les protéines Ras et Raf
;;
Ras et Raf sont deux protéines oncogènes qui interagissent entre elles
avec pour conséquence une implication potentielle dans la transduction de
si'=eaux contrôlant les phénomènes de croissance et de différenciation
cellulaire.
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L' inhibition de contact de ces deux protéines peut être étudiée soit par
criblage _
de banque d'oligopeptides soit en impliquant un troisième partenaire identique
à
l'un des deux autres polypeptides formant l'activateur transcriptionnel, mais
ne
contenant pas de séquence de fusion. Afin de contrôler la spécificité de
l' interaction Ras/Raf, le troisième partenaire sera sous le contrôle du
promoteur
inductible Met25.
A) Matériels et méthodes
m Une cassette contenant le promoteur Met25, un épitope HA et un
firagment d'ADN codant une séquence de localisation nucléaire, un site Notl,
soit un site Bgl2, soit un site Srfl, un codon Stop et le terminateur PGK, a
été
insérée au niveau du site unique PvuII des plasmides pGBT9 (I3artel et al. ,
1993), pGBTlO (Chardin et al., 1993), pHPS, pBTM116 (Vojtek et al., 1993)
na and pVJLlO (Julien-Flores et al., 1995), en donnant les plasmides pGBT9-3H,
pGBTlO-3H, pGBTII-3H, pLex9-3H et pLexlO-3H, respectivement.
L'expression du promoteur Met25 est réprimée en présence de 1 mM
Méthionine.
Les plasmides dérivés de pGBT9-3H ont été construits de la manière
?o suivante : Le cadre de lecture (ORF) de H-Ras(V 12) (Fragment EcoRI-Sal l
de
pBTM 116-Ras (Vojtek et al. , 1993)) a été cloné en phase avec le domaine de
liaison à l'ADN de GAL4, le plasmide résultant étant [pGBT-Ras/Met-0]. Le
plasmide [pGBT-Ras/Met-Raf] a été obtenu en ajoutant de part et d'autre du
fragment EcoRI-BamHI de cRaf-1 provenant du plasmide pGAD-Rat (Van Aelst
-a et al. , 1993) une séquence de liaison contenant le site de clonage NotI,
et en
clonant ensuite le fragment résultant dans le site NotI de la cassette
d'expression
Met25 de [pGBT-Ras/Met-Oj.
B) Résultats
.o
Les cellules cotransformées avec [pGBT-Ras/Met-Raf] et pGAD-Raf
sont LacZ+ {transcription du gène de la (J-galactosidase) en présence de
méthionine, c'est-à-dire dans des conditions de répression du promoteur Met25.
Les mêmes cellules sont LacZ- en absence de méthionine, à savoir dans des
sa conditions de dérépression du promoteur Met25. Cette observation peut
s'expliquer par le fait que la protéine sauvage Raf exprimée à partir du
promoteur Met25 entre en compétition pour l' interaction avec celle exprimée à
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partir de [pGBT9-Ras/Met-Raf], inhibant ainsi l'interaction entre les
protéines
de fusion GAL4DBD-Ras et GAL4AD-Raf.
Des contrôles préalables ont montré que la présence du promoteur
inductible Met25 n'affecte pas l'interaction entre les deux produits provenant
des séquences de fusion, que celui-ci soit actif ou réprimé.
Les plasmides décrits ci-dessus peuavent être utilisés pour identifier des
peptides inhibant une interaction entre des protéines, par exemple en
exprimant
une banque synthétique dégénérée d'oliE;onucléotides sous le contrôle du
promoteur Met25.
i v L' inhibition de l' interaction peut être détectée par un test LacZ dans
des
conditions de dérépression du promoteur Met25 ; le phénotype LacZ+ pourrait
être restauré en présence de méthionine, ;prouvant que I' inhibition est due à
l'expression du promoteur Met25 mais pas à d'autres événements tels qu'une
mutation.
Tableau 1
Nom sous promoteur ous promoteur
ADH, Met25,
fusionn au GAL-DBDfusionn au HA-NLS
pGBT935 ----- -----
pGBT935-Ras, Met25-0 c-H-Ras -----
pGBT935-Ras, Met25-Rafc-H-Ras c-Raf-I
~o
Légende du Tableau 1
Dans pGBT935, l'insertion de l'ADNc codant la protéine Ras (c-h-Ras
Vojtek, 1993) en phase avec la région codante du domaine de fïxation à l'ADN
GAL4 (GAL-DBD) conduit au plasmide [pGBT935, Met25-0] ; l'ADNc codant
pour la protéine Raf (c-Raf-1 ; Van Aelst, 1993) cloné en phase avec la région
codante du site de localisation nucléaire lié à l'épitope HA (HA-NLS) dans le
plasmide [pGBT935, Met25-0] conduit au plasmide [pGBT935, Met25-Raft. Le
plasmide pGAD-Raf permet l'expression d'une protéine c-Raf-i fusionnée au
domaine d'activation GAIS (AD-Raf).
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Légendes des figures
Figure 1
Le vecteur pLex9-3H dérivé du vecteur pBTMl I6. La partie pBTMll6
contient, en plus des séquences nécessaires à sa réplication dans E.coli, le
marqueur de sélection TRPl et l'activateur transcriptionnel LexA cloné en aval
m du promoteur (P) et en amont du terminateur (T) de l'ADH. pLex9-3H possède
é~~alement une cassette d'expression contenant le promoteur régulable Met25,
un
ta~~ HA, une séquence de localisation nucléaire (NLS), et un terminateur tPGK.
Les sites d'insertion de l'ADNc d'intérêt sont indiqués.
i;
Figure 2
L'ADNc codant Cdk7 est cloné en fusion avec LexA, celui de la
cyclise H est en fusion avec le tag HA, en aval du promoteur régulable Met25,
dans le plasmide pLex9-3H alors que l'ADNc et MAT1 est cloné en fusion avec
~o VP16 dans le plasmide pVPl6. Ce dernier contient le marqueur de sélection
LEU2 et le domaine d'activation de VP16 en aval du promoteur constitutif
ADH.
z> Fi ure
A : test de croissance de trois clones de ievures transformées par les
plasmides Cdk7-pLex9-3H-Cyclise H et MAT1-pVPl6 sur un milieu dépourvu
(Met- : méthionine dérépression) et riche (Met+ I mM : méthionine répression)
en méthionine. Les différentes dilutions sont indiquées au centre de la
figure.
~O
B : activtt.~ ~3-galactosidase des extraits de levures transformées par les
vecteurs Cdk7-pLex9-3H-Cyclise H d'une part et les vecteurs exprimant la
protéine VP16 fusionnée à XPB, XPD, p62, p44, p34 ou MATI ou VPI6 seul
(VP16) d'autre part, ayant poussé en présence (+) ou en absence (-) de
méthionine. Les unités (3-gal sont indiquées en ml-! .min t .
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Figure 4 : _
Les cellules de la souche de levure I-IF7c cotransformées avec des
couples de plasmides sont sélectionnées dans un milieu ne contenant pas de
tryptophane et de leucine (Rose, 1990) ; les colonies sont réparties dans un
milieu ne contenant pas de tryptophane, ni de leucine, et contenant ou ne
contenant pas de méthionine. Après 24 heures à 30°C, les boîtes ont été
répliquées pour tester l'hypotrophie à l'histidine (résultats non montrés) et
pour
l'expression de LacZ (Chardin, 1993), en présence ou en absence de
métl~ionine.
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