Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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ACIDE NUCLÉIQUE COMPRENANT LA SÉQUENCE D'UN PROMOTEUR INDUCTIBLE PAR UN STRESS
ET UNE
SÉQUENCE D'UN GENE CODANT POUR UNE STILBENE SYNTNASE
S La présente invention concerne des plantes
présentant des résistances améliorées à certains agents
pathogènes sensibles aux stilbênes, et concerne plus
particulièrement un ensemble de constructions associant un
promoteur végétal inductible par un stress biotique,
l0 engendré notamment par lesdits pathogènes, à un ou des
gènes) codant pour une stilbène synthase.
Une grande partie de la récolte mondiale de
plantes cultivées est constamment détruite par les
parasites et les pathogênes. Parmi les possibilités
15 permettant de diminuer ou d'empêcher l'attaque des plantes
cultivées par ces parasites, la lutte chimique (traitements
phytosanitaires) est la méthode la plus utilisée.
Néanmoins, l'application de produits chimiques n'est pas
sans conséquence pour l'environnement et pose parfois des
20 problèmes technologiques comme par exemple l'apparition de
nouvelles souches pathogènes résistantes ou, dans le
domaine de l'oenologie, les difficultés qui peuvent
survenir au cours des fermentations (l'utilisation
d'inhibiteurs de la biosynthèse des stérols peut bloquer la
25 croissance des levures en fin de fermentation) ou la
présence de produits chimiques retrouvés parfois dans les
vins comme la procymidone, produit anti-Eotrytis.
Pour pallier les inconvénients liés à la lutte
chimique, la méthode de lutte consistant à améliorer la
30 résistance des plantes cultivées aux maladies provoquées
par ces pathogènes a été envisagée. I1 est possible par
exemple, dans une première approche, d'obtenir cette
amélioration par voie sexuée, par la génétique classique,
en hybridant les plantes dont on veut améliorer la
35 résistance avec des variétés tolérantes. Néanmoins, cette
approche n'est pas toujours réalisable (variété naturelle
tolérante non connue) ou n'est pas autorisée par la
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législation comme par exemple en viticulture de par la
législation française sur les Appellations d'Origine
Contrôlée (A.O.C.) qui limite les cépages à utiliser pour
une appellation donnée.
Dans une deuxiême approche, il est possible, en
utilisant les techniques modernes de la biologie cellulaire
et moléculaire, d'intégrer dans le génome de la plante un
ou plusieurs gènes homologues ou hétérologues permettant la
surexpression ou l'expression d'une molécule d'intérêt de
nature protéique afin d'augmenter la production d'un
métabolite ou d'une voie métabolique ou d'ouvrir une
nouvelle voie de biosynthèse ou de synthétiser une nouvelle
molécule permettant par exemple d'accroitre l'ouverture
d'une nouvelle voie de biosynthèse, permettant par exemple
d'accroftre la résistance de la plante en renforçant ses
mécanismes de défense vis-à-vis des pathogènes en cause.
Chez les végétaux, ces mécanismes de défense sont
de plusieurs ordres. Les uns peuvent être considérés comme
passifs et sont liés aux caractéristiques physico-chimiques
des cellules, des tissus épidermiques et/ou des organes de
la plante. Les autres appartiennent à la dynamique des
interactions gène à gène (gènes de résistance du végétal et
d'avirulence du pathogène, mécanismes des interactions
hôte-pathogène). Ces interactions peuvent conduire au
développement de la réaction d'hypersensibilité (mort
rapide des cellules du végétal autour du point d'infection
pour bloquer la colonisation de la plante par le micro-
organisme) mais aussi à la synthêse et à l'accumulation de
toute une série de composés. Parmi ceux-ci, certains
peuvent être des constituants pariétaux, impliqués dans la
formation d'une barrière « physique ~ autour du point
d'infection (callose, lignine, protéine riche en
hydroxyproline . HRGP, etc.), d'autres composés peuvent
être des molécules aux fonctions antimicrobiennes plus ou
moins bien définies (phytoalexines, protéines associées aux
pathogènes . PR protéines (Pathogenesis Related protein),
etc.). Parmi les molécules de type phytoalexines qui sont
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synthétisées et accumulées par les plantes lors, par
exemple, des interactions hôte-pathogène, on trouve
notamment les stilbènes qui sont toxiques, notamment pour
les micro-organismes. Le terme de stilbêne désigne un
groupe de substances chimiques possédant le squelette
trans-diphényl-1,2-éthylène comme structure de base
commune, le resvératrol et la pinosylvine étant parmi les
plus simples. Ce squelette de base est synthétisë dans les
plantes par une stilbêne synthase ou des enzymes ap-
parentées, à partir de substrats comme le malonyl-CoA, le
cinnamoyl-CoA ou le coumaroyl-CoA, substances que l'on
trouve dans toutes les plantes (précurseurs des
flavonoïdes). Les gènes de stilbène synthase ou des enzymes
apparentées ont été isolés, séquencés et clonés, notamment
à partir de l'arachide, de l'orchidée et de la vigne. On a
pu réaliser â partir de ces gènes la transformation de
plantes telles que la pomme de terre, la luzerne ou le
tabac, présentant, par comparaison aux plantes non
transformées, une résistance supérieure à l'attaque par des
pathogènes (EP-309862 ; EP-648839 ; MELCHIOR, F. et al.,
Arch. Biochem. Biophys. 1991, 288, 2, 552-557 ; WIESE, W.
et al., Plant Mol. Biol. 1994, 26, 2, 667-677 ; HAIN, R. et
al., Nature 1993, 361, 153-156).
L'expression ou la surexpression de ces molécules
aux fonctions antimicrobiennes peut permettre d'obtenir une
résistance « naturelle ~ des plantes en réponse à des
stress, notamment des stress de type microbien. Cependant,
une surexpression constitutive de ce type de protéines ne
peut être envisagée sans inconvénient pour la plante (coût
énergétique, ralentissement de la croissance, etc.)
(FISCHER, R. et al., The plant Journal 1997, 11, 3, 489-
498) .
D'autre part, dans le cas de certaines plantes
comme par exemple la vigne ou des plantes herbacées, on
trouve des stilbènes uniquement dans certains tissus sains
et â des concentrations très faibles. Par contre, à la
suite d'une infection ou d'une lésion, ces stilbènes
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augmentent fortement au niveau du site infecté ou lésé, les
gènes de stilbène synthase étant inductibles en conditions
de stress biotique ou abiotique (par exemple blessures,
ultraviolets, etc.).
Néanmoins, cette régulation est rarement présente
chez les plantes d'intérêt agronomique ou lorsqu'elle est
présente, elle peut ne pas être suffisamment efficace. Par
exemple, dans le cas de la vigne, l'étude de la synthèse de
phytoalexines a montré la présence de stilbènes, dont le
resvératrol, dans les tissus sains seulement pour le bois.
Dans les tissus de la baie de raisin, la présence de
stilbènes est trouvée lorsque, d'une part, la baie est
soumise à un stress comme l'attaque par un pathogène
(Botrytis cinerea pour la pourriture grise ou Plasmopora
IS viticola pour le Mildiou), et, d'autre part, uniquement
jusqu'à la véraison du jeune fruit. En revanche, la
concentration de stilbênes diminue fortement de la véraison
à la maturation. Or, les dégâts dus par exemple à 9otrytis
sont rarement rencontrés jusqu'à la véraison mais plutôt
lorsqu'on se situe près de la maturation de la baie. C'est
pourquoi il est nécessaire de contrôler l'expression de
gènes de stilbène synthase par des promoteurs forts,
échappant à la régulation naturelle du gène, promoteurs
devant être inductibles et en particulier inductibles par
le stress lui-même. C'est précisément l'objet de la
présente invention.
La présente invention concerne des acides
nucléiques comprenant la séquence du promoteur d'une PR
protéine de la luzerne associée à au moins une séquence
d'un gène codant pour une stilbène synthase.
L'invention concerne particuliêrement des acides
nucléiques selon l'invention, caractérisés en ce que le
promoteur d'une PR protéine de la luzerne est un promoteur
inductible dans les plantes, tissus spécifiques ou non, par
un stress biotique ou abiotique.
L'invention concerne également des acides
nucléiques selon l'invention, caractérisés en ce que la
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séquence du promoteur d'une PR protéine de la luzerne est
choisie dans le groupe comprenant .
a) la séquence IND S1,
b) toute séquence correspondant à un fragment de la
5 séquence IND S1 et ayant effet de séquence promotrice chez
les plantes.
On préfère les séquences du promoteur d'une PR
protéine de la luzerne qui présentent au moins 80 %
d'homologie avec la séquence IND S1. Particulièrement
préférêes sont celles qui présentent au moins 90 % ou 95 %
d'homologie avec ladite sëquence.
Les séquences de promoteurs de PR protéines chez
la luzerne selon l'invention ont été obtenues à partir des
séquences régulatrices de gènes de PR protéines en mettant
IS à profit la réponse incompatible (réaction d'hyper-
sensibilité HR) obtenue dans la relation hôte-parasite
entre la luzerne (Medicago sativa) et Pseudomonas syringae
pv pisi pour isoler des séquences régulatrices de gènes
responsables de cette réaction.
Lors de l' attaque de la luzerne par Pseudomonas,
l'apparition d'une réaction de la plante est observée dans
la zone voisine de la nécrose provoquée par l'infection
bactérienne.
Le matériel végétal a donc été prélevé après
l'attaque bactérienne afin de constituer une banque d'ADNc
à partir des ARNs messagers produits dans les zones
voisines de la nécrose. Une amplification par réaction
de polymérisation en chafne (PCR), utilisant des poly
nucléotides de synthèse correspondant à des motifs
conservés de gènes de PR protéines de légumineuses, a
permis d'obtenir une sonde radioactive qui a été ensuite
utilisée pour sélectionner des transcrits dans la banque
d'ADNc. Parmi ceux-ci, l'un d'entre eux (ADNc-PR7) a été
retenu car, après séquençage, il présentait une bonne
homologie avec des gènes équivalents codant pour des PR
protéines, connus pour d'autres plantes (cf. Figures 1 et
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Ibis représentant le schéma général de la méthode
d'isolement du promoteur).
L' analyse a montré qu' il correspondait à un gène
codant pour une PR protéine de classe l0 selon la
classification de VAN LOON (1994). C'est pourquoi ce gène a
été dénommë Ms PR10-1 (Medicago saCiva PR protéine classe
10, clone 1). L'ADNc PR7 isolé et cloné a permis d'obtenir
deux sondes grâce à la présence d'un site Bam HI interne (B
sur la Figure 1). Celles-ci, EB et BE (E correspondant au
l0 site Eco RI sur la Figure 1) nommées respectivement 5' et
3', ont été utilisées pour cribler une banque génomique de
luzerne. Parmi les clones obtenus, reconnus par les sondes
5' et 3', l'un d'entre eux, C15, a été sélectionné et
sêquencé (6,1 kb). I1 possêde lui aussi comme il est
logique un site Bam HI qui a permis d'obtenir deux nouveaux
fragments EB de 2,4 kb et BE de 3,7 kb nommés
respectivement E-B(g) et B-E(g), g indiquant la nature
génomique des fragments obtenus (voir Figure lbis). Le
fragment E-B(g), situé en 5' du clone C15, comprenant le
promoteur et une partie de sa séquence codante du gène Ms
PR10-1 a été inséré dans les sites Eco RI et Bam HI du
plasmide bluescript. Le plasmide a été linéarisé grâce à un
site Pst I, situé en amont de Bam HI dans le fragment E-
B(g). Sur ce fragment, une délétion de 3' en 5' a été
réalisée jusqu'à obtenir la séquence promotrice IND S1
(Figure 3). Une ligature en bout franc a permis de
repositionner un autre site Bam HI, interne au clone C15, à
la fin de la séquence promotrice du gène Ms PR10-1. Dans
ces conditions, 13 nucléotides de la séquence codante du
gène Ms PR10-1, situés en amont de ce site Bam HI interne
du clone C15, ont été ainsi intégrés â la séquence
promotrice IND S1, l'ensemble peut être isolé par une
digestion Eco RI / Bam HI (voir Exemple 1).
Dans la description, on entend également par PMs
PR10-1 tout fragment d'acide nucléique de la séquence IND
S1 â effet de promoteur chez les plantes et la séquence IND
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S1 avec 13 nucléotides de la séquence codante du gène Ms
PR10-1 telle que décrite ci-dessous.
L'invention concerne également des acides
nucléiques selon l'invention, caractérisés en ce que la
séquence d'un gêne codant pour une stilbène synthase, qu'il
soit homologue ou hétérologue, est choisie parmi les gènes
isolés à partir des génomes de l'arachide, de l'orchidée,
de la vigne et du pin (EP-309 862, EP-464 461).
Parmi lesdits acides nucléiques, on préfère les
acides nucléiques codant pour une stilbène synthase de
vigne, notamment celles décrites dans l'article de NAIN, R.
et al., Nature 1993, 361, 153-156 et dans celui de WIESE,
W. et al., Plant Mol. Biol., 1994, 26, 2, 667-677, l'acide
nucléique correspondant â la séquence vstl desdits articles
est le plus préféré.
Les acides nucléiques permettant l'expression du
ou des gènes) de stilbêne synthase pourront bien entendu
comporter, outre ledit ou lesdits gène(s), des séquences
notamment de polyadénylation â l'extrémité 3' du brin
codant, ainsi que des séquences « enhancer ~ dudit gène ou
d'un gène différent.
Bien entendu, les séquences des acides nucléiques
devront être adaptées afin de s'assurer que le gène sera
effectivement lu en phase de lecture correcte avec le
promoteur et il sera évidemment possible de prévoir
d'utiliser, si cela est nécessaire, plusieurs promoteurs du
même type ainsi que plusieurs séquences « enhancer
I1 est êgalement possible d'exprimer â l'aide des
acides nucléiques selon la présente invention plusieurs
gènes de stilbène synthase, soit placés en cascade, soit
portés par des systèmes d'expression diffêrents.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent
être utilisés pour la réalisation de systèmes d'expression
dans les plantes, systèmes pouvant être inductibles et/ou
constitutifs suivant les tissus ou organes de la plante
transformés (cf. Exemples 2, 3 et 4).
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La présente invention a donc également pour objet
des systèmes d'expression d'au moins un gène de stilbène
synthase chez les plantes, caractérisés en ce qu'ils
comportent au moins un acide nucléique selon l'invention.
S Parmi les systêmes selon l'invention, on préfère les
vecteurs de transformation et notamment les vecteurs de
transformation de type plasmidique. Avantageusement,
lesdits vecteurs de transformation sont caractérisés en ce
qu'ils peuvent être transférés dans des souches
d'Agrobacterium.
Les gènes de stilbène synthase pouvant être
exprimés par les acides nucléiques selon la présente
invention sont placés sous le contrôle du promoteur PMs
PR10-1 afin de déclencher chez les plantes des mécanismes
de résistance aux pathogènes qui sont sensibles aux
stilbênes, notamment au resvératrol, à la pinosylvine ou à
leurs dérivés glycosylés comme le picëïde ou à des
oligomères comme les viniférines. Parmi ces parasites
sensibles aux stilbènes, on peut citer Botrytis cinerea,
P.Iasmopora vi ticola, Eu typa 1a ta, etc . .
Parmi les systèmes d'expression selon
l'invention, on préfère ceux caractérisés en ce qu'ils sont
inductibles dans les plantes par un stress biotique ou
abiotique.
Parmi lesdits stress biotiques selon l'invention,
on préfêre en particulier les stress biotiques engendrés
par l'attaque d'un parasite sensible aux stilbënes tel
qu'un virus, une bactérie, une levure, un champignon,
notamment Botrytis cinerea ou Plasmopora viticola.
Parmi lesdits stress abiotiques selon
l'invention, on préfêre en particulier les stress
abiotiques engendrés par une blessure mëcanique, telle que
celle causée notamment par un insecte ou par un phénomène
physique tel que le vent ou le gel.
La présente invention a également pour objet des
cellules végétales transformées par un système ou un
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vecteur selon l'invention. Avantageusement, lesdites
cellules végétales sont des cellules de vigne.
La présente invention concerne ëgalement des
procédés permettant de transformer des cellules végétales à
l'aide d'un procédé microbiologique incluant les systèmes
ou les vecteurs selon la présente invention.
L'invention concerne en outre des procédés
d'obtention de plantes exprimant un (ou plusieurs) gènes)
de stilbène synthase, caractêrisés en ce qu'on transforme
des cellules végétales desdites plantes à l'aide d'un
système ou d'un vecteur selon l'invention, on sélectionne
les cellules exprimant ledit ou lesdits gènes) et l'on
régénère une plante à partir de ces cellules.
Parmi les méthodes de transformation les plus
utilisées, il faut citer notamment les méthodes mettant en
oeuvre Agrobacterium, qu'il s'agisse d'Agrobacterium
tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes, de bialistique ou
toutes autres techniques (électroporation, etc.).
Ces méthodes sont connues (REAM, W., 1989 ;
NEGRETIU, I. et GHARTI-CHHETRI, G.B., 1991 ; CASSE-DELBART,
F., 1996 ; STANFORD, J.C., 1990) et elles ne seront pas
décrites de nouveau en détail.
La technologie, partant notamment de systèmes
plasmidiques, permet d'effectuer une première trans
formation d'une souche de bactéries compétentes, en général
E. coli, ce qui permet de cloner et de contrôler 1a
structure des plasmides. La souche est ensuite utilisée
pour transférer les plasmides recombinants dans des souches
d'agrobactéries qui seront ensuite utilisées pour
transformer les cellules végétales.
Les plantes comportant un système d'expression ou
des cellules selon l'invention font partie de l'invention.
Font également partie de l'invention, les plantes
obtenues par la mise en oeuvre des procédés selon
l'invention.
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Enfin, l'invention concerne les plantes selon
l'invention, caractérisées en ce qu'il s'agit de plantes
d'intérêt agronomique, notamment la vigne.
D'autres caractëristiques et avantages des
5 constructions et des procédés selon la présente invention
pourront être mis en évidence dans les exemples qui vont
suivre.
Légendes des Figures
l0
Fi4ures 1 et 1 bis . Schéma général représentant les
différentes étapes de la méthode d'isolement du promoteur
inductible PMs PR10-1 correspondant à la séquence IND S1.
Fiaure 2 . Présentation des divers clones isolés et
correspondant au Southern blot, hybridé avec les parties 5'
et 3' de l'ADNc-PR7, délimitées par un site Bam HI (B)
interne, détecté dans cet ADNc.
Sites de restriction . E = Eco RI, B = 8am HI.
Les valeurs indiquées sur la figure sont exprimées en
kb (kilo bases).
Fiaure 3 . Séquence d'ADN correspondant à la séquence IND
S1, séquence génomique isolée du promoteur inductible de
luzerne PMs PR10-1.
Figure 4 . Séquence d'ADN correspondant à la séquence d'un
gène de stilbène synthase de vigne modifiée par l'ajout
d'un adaptateur (vstl modifié).
La partie modifiée est représentée en caractère
italique.
Les parties codantes et non codantes (intron) sont
représentées respectivement en lettres majuscules et
minuscules.
Figure 5 . Séquence d'ADN comprenant la sêquence du
promoteur inductible PMs PR10-1 (correspondant à la
séquence IND S1 en minuscule) associée à la séquence d'un
gène de stilbêne synthase de vigne modifiée par l'ajout
d'un adaptateur (vatl modifië, correspondant à la Figure
4). Entre les deux (encadré dans la séquence) se trouvent
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(écrits en minuscule, fin du promoteur et en majuscule,
début du gène contenant le codon d'initiation de la
traduction) les 13 nuclêotides venant d'une séquence
interne de la phase codante du gène Ms PR10-1, l'ATG ayant
été mis en phase de lecture avec le gène vstl modifié, ces
nucléotides sont donc intégrés à la phase codante de vstl.
La séquence du promoteur inductible PMs PR10-1 inclut
les 7 des 13 nucléotides de la séquence du gène Ms PR10-1
(en minuscule dans l'encadré).
Les parties codantes et non codantes (intron) de la
partie correspondant à la séquence du gène de stilbène
synthase de vigne sont représentées respectivement en
lettres majuscules et minuscules.
Fic~,ure 6 . Mise en évidence de l' induction de gène codant
pour une stilbène synthase par les U.V..
Les ARNs sont extraits d'environ 1 g de feuilles
17 heures aprês induction aux U.V.. 10 à 20 ug sont déposés
sur gel dénaturant formaldéhyde-formamide. Après migration
(3 V.cm-1) , les ARNs sont transférés sur membrane nylon et
fixés par exposition aux U.V. (254 nm, 33 mJ.cm-2). Le
Northern blot est obtenu par hybridation à 65°C pendant une
nuit avec la sonde vstl biotinylée.
L'explant de départ est constitué de feuilles isolées
de vitroplants de 41B (témoin) ou de 41B transformés
génétiquement avec une construction (insert 13 kb,
comprenant deux gènes de stilbène synthase complets vstl,
vst2, un morceau d'ADN génomique de vigne et un autre gène
de stilbène synthase de vigne (vst3) tronquê) intégrant des
copies surnuméraires de gènes codant pour des stilbènes
synthases de vigne sous contrôle de leurs propres
promoteurs (clones 2 et 3 correspondant respectivement aux
clones 55-2 et 55-3). 41B . porte-greffe hybride V.
vinifera, Chasselas x V. berlandieri.
Ficrure 7 . Cinétique d'accumulation des ARNms de stilbène
synthase après induction aux U.V..
Les ARNs sont extraits d'environ 1 g de feuilles. 10 à
20 ~.g sont déposés sur gel dénaturant formaldéhyde-
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formamide. Après migration (3 V.cm-I), les ARNs sont
transférés sur membrane nylon et fixés par exposition aux
U.V. (254 nm, 33 mJ.cm-2) . Le Northern blot est obtenu par
hybridation à 65°C pendant une nuit avec la sonde vstl
biotinylée.
Les expiants sont des feuilles isolées de vitroplant5
de 41B. Le témoin est un clone non transformé génétiquement
contrairement aux clones 2 et 3 (correspondant
respectivement aux clones 55-2 et 55-3) qui ont intégré
dans leur génome l'insert 13 kb (voir ci-dessus) contenant
des gênes codant pour des stilbënes synthases de vigne
(vstl + vst2). 418 . porte-greffe hybride V, vinifera,
Chasselas x V. berlandieri.
Figure 8 . Quantités de resvératrol présentes dans les
feuilles de vitroplants, traitées 8 min aux U.V, et
analysées à différentes périodes après induction.
Les quantités sont exprimées en ~eg par g de matiëre
fraiche .
NI . non induit.
Le témoin est constitué par des feuilles prélevées sur
41B non transformé. PCT 55-2 et 55-3 représentent deux
transformants ayant intégré l'insert de 13 kb comprenant
deux gènes de stilbêne synthase complets (vstl et vst2).
Figure 9 . Inhibition de croissance du mycélium de Botrytis
cinerea, souche 916T, après 7 jours à 20°C.
La culture du mycélium est réalisée sur milieu malt-
glucose contenant les différentes concentrations de
resvératrol.
Ficture 10 . Planche photo 1
Observations macroscopiques caractéristiques des
différentes variétés de vigne en interaction avec Botrytis
cinerea 5 jours après inoculation des feuilles de
vitroplants par une suspension de conidies - Plantes non
transformées.
En haut
- Gauche . Cépage Folle blanche, clone 280 sensible.
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- Droite . Cépage Pinot noir, clone 386 moyennement
tolérant.
En bas .
- Gauche . Cépage Ugni-blanc, clone 479 tolérant.
$ - Droite . Porte-greffe 418 tolérant.
Figure 11 . Planche photo 2
Observations macroscopiques caractéristiques de clones
de porte-greffe 41B, transformés par différentes
constructions (145 . Promoteur PMs PR10-1 - gène vstl ;
55 . insert de 13 kb comprenant deux gènes vstl et vst2
sous contrôle de leurs propres promoteurs), en interaction
avec Botrytis cinerea, 5 jours après inoculation de
feuilles de vitroplants par une suspension de conidies.
En haut .
- Gauche . Clone 145-2.
- Droite . Clone 145-5.
En bas
- Gauche . Clone 145-6.
- Droite . Clone 55-3.
Figure 12 . Planche photo 3
Observations caractéristiques, en microscopie à
fluorescence, de différentes variétés de vigne en
interaction avec 9otrytis cinerea, 5 jours après
inoculation de feuilles de vitroplants par une suspension
de conidies.
Fluorescence . bloc de filtres A (excitation de 340 â
380 nm ; filtre d'arrêt à 425 nm). Le resvératrol émet une
lumière de fluorescence en blanc bleuté et bleu (selon sa
concentration), la chlorophylle en rouge. La zone noire
correspond â la zone d'infection par le champignon ou à des
zones nécrotiques lorsqu'elles sont petites.
En haut .
- Gauche . Cépage Folle blanche, clone 280 sensible,
peu ou pas de synthèse de resvératrol.
- Droite . Cépage Pinot noir, clone 386 moyennement
tolérant. Synthêse de resvératrol dans les nervures et dans
la zone de macération du champignon.
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En bas
- Gauche . Porte-greffe 41B (tolérant) non
transformé. Synthèse de resvératrol intense dans les
nervures et dans le limbe autour des zones d'infection
petites et très localisées (zones nécrotiques).
- Droite . Porte-greffe 41B transformé par la
construction 145, c'est-à-dire le promoteur PMs PR10-1 gène
vstl, clone 145-5 très tolérant. Forte synthèse de
resvératrol autour et, dans la zone d'infection, dans les
nervures et sur la presque totalité du limbe de la feuille.
Exemple 1
Obtention de clones aénomiaues comprenant des séquences
réaulatrices de aènea PR protéine de luzerne
A) Qbtention d'une sonde pour la recherche des promoteurs
(cf. Fiaures 1 et 1 bis)
La réponse incompatible (réaction d'hyper
sensibilité HR), obtenue dans la relation hôte-parasite
luzerne (Medicago sativa) et Pseudomonas syringae pv pisi a
permis de constituer une banque d'ADNc. Elle a été réalisée
à partir d'ARNs messagers extraits et purifiês de la zone
voisine de la nécrose provoquée par l'infection
bactérienne. Les prélèvements de matériel végétal ont été
effectués 6 heures après l'infiltration par la suspension
bactérienne.
Chez les légumineuses, les PR protéines sont
connues pour avoir des motifs conservés, ceci a permis la
synthêse d'oligonucléotides correspondant à ces motifs
définis à partir des séquençages déjà réalisés sur PR
protéines de pois et de soja. Une amplification par PCR a
permis d'obtenir une sonde radioactive, utilisée ensuite
pour sélectionner dans la banque d'ADNc des transcrits.
Parmi ceux-ci, un des clones . ADNe-PR7 a été retenu car
après séquençage il a présenté 87 % d'homologie avec les
gènes codants pour les PR protéines de pois et de soja.
L'analyse a montré qu'il correspondait en fait â un gène
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codant pour une PR protéine de classe 10 selon la
classification de VAN LOON et al. (1994). I1 a été nommé Ms
PR10-1 (Medicago sativa PR protéine classe 10, clone 1).
Un contrôle, effectué chez la luzerne par
5 Northern blot, a montré que le transcrit correspondant
s'accumulait dès 3 heures après l'infection dans le cas de
la réaction incompatible, passait par un maximum entre 24
et 48 heures et diminuait lentement à partir de 72 heures.
Ce fragment est caractérisé par l' existence d' un
10 site Bam HI interne (noté B sur la figure 1) qui délimite
deux parties .
- l'une dite 5', d'environ 340 bases, inclut la région
amont de l'ATG (qui est transcrite mais non traduite) et
une séquence aval correspondant à 306 bases,
15 - l'autre dite 3', correspond à la fin de la partie
codante soit 165 bases et à la région 3' non traduite soit
186 nucléotides du codon stop jusqu'au début du poly A.
B) Isolement de clones Qénomiques comprenant des
promoteurs de PR r~rotéines
1) Isolement de clones génomiques
Une banque génomique de luzerne, préparée dans
EMBL4 (titre . 7. 10a p. f .u. (plate forming units) . ml-1) ,
a été utilisée â cette occasion et 6.105 p.f.u. étalées.
Pour cribler cette banque, le fragment 5' de Ms PR10-1
(ADNc-PR7) a servi de sonde et 45 clones ont donné un
signal, intense sur 1.3 d'entre eux. Les cartes de
restriction et les hybridations, réalisées avec les
fragments 5' et 3' de Ms PR10-1, ont permis de conclure à
l'existence de 7 clones distincts (cf. Figure 2). La
comparaison des tailles des 7 clones (9,3 ; 6,5 ; 6,1 ;
5, 8 ; 4, 8 ; 4 , 2 ; 2, 2 kb) obtenus à partir du criblage de
la banque, à celle des bandes détectées sur blot d'ADN
génomique de luzerne a montré une bonne concordance entre
ces deux types de données expérimentales (cf. Figure 2). I1
a donc été possible d'en dêduire que les gènes codant pour
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la protéine PR7 correspondaient à une petite famille
multigénique.
Les fragments (sites EcoRI/EcoRI) de ces clones
(hormis le clone C12) ont ensuite été sous clonés en
S totalité ou en partie et les séquençages entrepris.
2) Séquençages réalisés
Un clone a été choisi pour être séquencé en
premier, le clone C15 (cf. Figure 1 bis).
Les premiers travaux de séquençage ont mis en
évidence la présence d'un intron d'environ 315 nucléotides
dans le cadre ouvert de lecture du gène codant pour la PR
protéine. Le clone étudié a été analysé ensuite après
digestion par Bam HI (cf. Figure lbis).
Clone C15 . 6,1 kb
1$ L'analyse du clone par Eco R1 et Bam HZ a permis
d'obtenir deux fragments E-B (environ 2,4 kb) et B-E
(environ 3,7 kb). Après séguençage et comparaison de la
séquence codante (interrompue par un intron de 600
nucléotides) avec celle du Ms PR10-1 (ADNc-PR7), il est
apparu que ce clone génomique était absolument identique à
cet ADNc de référence.
3) Analyse de l'expression des clones isolés dans le
système luzerne-Pseudomonas
Les expériences ont porté sur le clone C15, en
utilisant la technique d'extension en 5', pour déterminer
les messagers effectivement transcrits lors de l'induction
des réactions de défense. Cette technique a en outre
l'avantage de permettre de localiser le site d'initiation
de la transcription. Les rêsultats ont montré que le clone
C15 était effectivement exprimé lors de l'induction des
réactions de défense dans les feuilles, lors de l'inter-
action luzerne-Pseudomonas.
Exemple 2
Transformations aénéticiues réalisées four vërifier
l'activité promotrice du clone isolé
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A) Récrions promotrices utilisées
Pour ces transformations de contrôle, deux
promoteurs ont été retenus . un promoteur témoin et le
promoteur PR isolé du génome de la luzerne, issu de C15
S (correspondant au promoteur PMs PR10-1).
1) Promoteur CaMV-35S
Ce promoteur, dit constitutif, est classiquement
utilisé. I1 correspond à la séquence de régulation de la
transcription du gène de la sous unité ARN 35S du virus de
la mosaïque du chou-fleur (CaMV) . La région promotrice qui
a été utilisée pour réaliser la construction avec le gène
rapporteur gus, correspond en fait à une fraction de ce
promoteur, isolée de nouveau sous forme d'un fragment
EcoRI/BamHI â partir du plasmide pDH51 (PIETRZAK et al.,
1986) .
2 ) Promoteur PR
La région promotrice du clone génomique C15 a été
étudiée. Ce promoteur a été appelé par la suite PMs PR10-1.
PMs PR10-1 .
I1 provient du fragment EcoRI/BamHI (E/B) de
2,4 kb du clone C15 (Figure lbis). L'intégration de ce
fragment dans le plasmide binaire, en amont du gène
rapporteur (voir ci-après), a été rendue délicate car aucun
site de restriction n'existait sur le clone C15 entre la
boîte TATA (initiation de ia transcription) et 1'ATG
(initiation de la traduction). Des expériences de délétion
ont donc été réalisées jusqu'à obtenir un fragment de
1,5 kb environ (séquence IND S1). Puis, par ligation en
bout franc, un autre site Bam HI a étê ajouté au fragment
ainsi obtenu pour permettre son insertion en amont des
différentes séquences codantes utilisées par la suite. Ce
fragment comprend donc en se référant à l'ADNc qui a servi
à le cloner et outre la région promotrice amont . 39
nucléotides terminaux de la 5'UTR (UnTranslated Region) du
gène Ms PR 10-1, située à 10 bp du codon ATG initiateur,
l' ATG du gène Ms PR10-1 et un court fragment de sa région
codante (10 bp), juste en amont du site Bam HI intégré.
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Tenant compte des sites de clonage, le promoteur ainsi
construit présente un ATG potentiel ce qui pourrait
conduire à la présence de deux codons ATG, à faible
distance l'un de l'autre, lors des constructions de gènes
S chimériques. Un risque de modification de la phase codante
du gêne utilisé (gène rapporteur ou gène de stilbène
synthase) pourrait alors exister.
Pour les expériences de transformation avec le
gène rapporteur, PMs-PR10-1 (PRI) a été utilisé tel quel
après clonage dans le plasmide pSK+/- Bluescript de
STRATAGENE. I1 a pu être de nouveau isolé sous la forme
d'un fragment EcoRI/BamHI de 1,5 kb environ.
3) Plasmides utilisés
a) p35S - gus intron (VANCANNEYT et al. 1990)
Ce plasmide est un dérivé de pBinl9 (BEVAN, 1984)
et possède comme tel les bordures droite et gauche des
plasmides binaires permettant l'insertion de la partie
comprise entre ces bordures dans les plantes via
agrobactéries.
Le développement du gène rapporteur gus intron
(intron dérivé du gène LSI de la pomme de terre) a permis
d'ëliminer les faux positifs (notamment en expression
transitoire) dus aux agrobactéries contaminantes. Elles
sont incapables d'épisser les introns.
Classiquement ce gène, codant pour une (i-
glucuronidase, permet, en utilisant un substrat particulier
(le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl j3 glucuronide), d'obtenir
une coloration bleue. Celle-ci indique alors la nature
transformée de la plante analysée et par voie de
conséquence la transcription de la séquence codante du gêne
correspondant à l'enzyme, donc l'induction du promoteur qui
la commande.
b) pPR97
Ce plasmide a été construit par l'un des
laboratoires participant au projet pour tester l'efficacité
de promoteurs (P. RATET, ISV, cité dans SZABADOS et al.,
1995). I1 a notamment l'avantage de posséder un site de
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clonage multiple, permettant une fusion transcriptionnelle
avec la phase codante du gène gus (uid ~ d'E. soli)
contenant l'intron LSI. I1 possède en outre certaines des
caractéristiques du plasmide précédent p35S - gus intron
S (bordures d'intégration dans le génome des plantes, gène de
sélection permettant la résistance aux antibiotiques de
type néomycine . npt II gêne).
L'activité du promoteur peut être révélée et
mesurée par des tests histochimique et enzymatique de type
GUS .
4) Dérivés de pPR97
Deux constructions principales ont été faites et
utilisées par la suite pour la transformation de plantes
modèles.
a) pPR97 - 35S
Le promoteur 35S, cloné dans le plasmide pDH51
(cf. paragraphe 5 ci-dessous), a été extrait et inséré dans
le site de clonage multiple de pPR97, en amont du gêne
rapporteur, sous forme d'un fragment EcoRI/BamHI. Ce
plasmide est à la fois un contrôle positif, pour démontrer
que la construction est fonctionnelle, et une référence car
le promoteur 35S a été placé dans le même environnement que
1e promoteur isolé des clones de PR protéine.
b) pPR97-PMs PR10-1
Les 1,5 kb ont été insérées dans le même site de
clonage que celui défini ci-dessus, sous la forme là aussi
d'un fragment EcoRI/HarnNI.
c) pG3-3
I1 a permis de réaliser un contrôle positif fort
pour les tests histochimique et enzymatique en clonant deux
promoteurs 35S en tandem inversé. Les séquences
activatrices des promoteurs agissent alors en synergie. La
phase codante du gène gus intron a été alors placée sous le
contrôle de l'un des deux promoteurs 35S.
5) Les souches d'agrobactéries réalisées
Les différents plasmides ont été utilisés pour
transformer des bactéries compétentes E. soli souche DH5a
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par choc thermique en milieu chlorure de calcium. Après
sélection des bactéries transformées sur milieu anti-
biotique (Kanamycine) et contrôle par miniprep de leur
nature recombinante, elles ont servi à transférer lEs
S plasmides recombinants dans des souches d'agrobactêries par
conjugaison triparentale, en utilisant la souche d'E. coi
HB101 contenant le plasmide pRK2013 autotransférable (DITTA
et al . , 1985) .
Deux souches d'agrobactéries ont êtê retenues .
10 EHA 105, Agrobacterium tumefaciena désarmée, permettant la
rêgênération de plantes transformées (transformations
stables), et A4TC24, Agrobacterium rhizogenes utilisée pour
obtenir la réaction de type chevelu racinaire (Hairy root)
et des plantes composites, possédant des racines
IS transformées mais dont le reste de la plante est de
phénotype identique à celui d'origine.
6) Transformations génétiques aur plantes modèles
Deux types de transformations (transitoires et
stables) ont été réalisés en utilisant trois plantes
20 modèles Nicotiana benthamiana, Medicago truncatula et Lotus
corniculatus.
On exposera principalement les résultats obtenus
avec N. benthamiana.
7) Transformations transitoires
Cette première série d' expérience a été réalisée
pour permettre une vérification rapide de la fonctionnalité
des constructions réalisées avec le gène gus dans les
cellules d'eucaryotes.
Des feuilles de N. benthamiana ont donc été
excisées et mises en coculture sur milieu gêlosé avec les
différents dérivés de la souche EHA 105. Des tests
histochimiques ont été ensuite pratiqués 48 h après la
transformation puis examinés après une nuit d'incubation
(12 h) .
Les plasmides de contrôle p35S-gus intron et
pPR97-35S ont donné une coloration GUS positive bien que
faible avec le second plasmide.
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Cette faible réactivité vient sans doute d'un
problème de construction car à proximité du site
d'initiation de la transcription et de l'ATG du gène gus
une partie du polylinker a dQ être gardée. Celle-ci
S comportant une séquence répétée peut gêner la transcription
du gène.
La construction pPR97-PMs PR10-1 a montré une
activité du gène gus semblable à celle du contrôle positif
35S-gus intron. Ce promoteur que l'on attendait inductible,
a donc présenté un effet comparable à un promoteur
constitutif.
Ce résultat peut être expliqué comme la
conséquence soit de l'infection bactérienne soit des
blessures effectuées sur les feuilles lors du prélèvement
1S ou de la mise en culture. La premiëre hypothèse ne pouvant
être vérifiée, le protocole expérimental a été modifié pour
diminuer le stress causé aux explants (élévation de
l'osmolarité du milieu de coculture en utilisant des
concentrations de saccharose de 10 à 30 g.l-1, réalisation
d' une gamme de vide plus ou moins poussée . de 10 à 80 mm
de mercure de vide relatif et création de lésions plus ou
moins fortes sur les feuilles avec écrasement important ou
moyen de l'épiderme).
Les résultats ont montré que plus la pression
était importante, plus le nombre de cellules transformées
était élevé. Cependant, un compromis doit être trouvé pour
obtenir des transformations stables car les nombreuses
transformations transitoires, obtenues dans ce cas, se
révèlent par la suite souvent létales pour les cellules.
Elles sont alors incapables de donner des cals et donc de
régénérer des bourgeons puis des plantes. Par ailleurs, la
nature inductible du promoteur est en partie confirmée car
si la coloration due à la construction 35S-gus intron est
détectable jusqu'à 5 jours après la coculture, celle
obtenue avec pPR97 - PMs PR10-1-gus intron apparaît plus
rapidement à 98 heures mais décroit ensuite très vite.
8) Transformations stables
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a)Tabac . N. benthamiana
Une série de transformations a été réalisée avec
pPR97-35S, pPR97-PMs PR10-1 et pG3-3. Un nombre important
de plantules a été obtenu pour cette série de
transformations. Pour chacun des plasmides utilisés, on a
cherché à obtenir au moins 7 plantes acclimatëes.
Cependant, cela n'a pas été possible pour p35S-gus intron
oa seulement 5 plantes ont été régénérées et acclimatées.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le Tableau 1.
Tableau 1 . Transformations stables obtenues sur N.
benthamiana par transformation avec la souche EHA 105
d'Agrobacterium turnefaciens et ses dérivés.
Cals/explants Bourgeons Plantules
Constructions mis en obtenus
culture In vivo
Accl.
p35S-gus intron 10 (45) 6 (1) 5 5
pPR97-35S gus 115/122 23 13 12
intron
pPR97-PMs PR10-1 135/139 27 20 7
gus intron
pG3-3-35S en
tandem invers non valu 37 28 20
(promot. Fort)
Lécrende du tableau 1
Les résultats sont exprimés en quantitë obtenue.
Accl. . plantules acclimatées.
Nombre de bourgeons par explants . le chiffre entre
parenthèses correspond au nombre de bourgeons obtenus à un
mois, pour la première série. Pour celle-ci (comportant la
construction 35S gus intron), les cals ont été laissés plus
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longtemps Sur le milieu de culture afin d'obtenir un
maximum de bourgeons et donc de plantes à acclimater. Pour
la seconde série, après un mois, un nombre suffisant de
bourgeons a été obtenu et l'expérience a alors été arrêtée.
S Les transformations génétiques . elles sont faites
classiquement sur des morceaux de limbe de feuilles de
1 cm2, immergés 30 secondes dans la suspension
d'Agrobacterium puis, cocultivés 48 heures avant repiquage
sur milieu gélosé de division cellulaire et de caulogénèse
(MUR.ASHIGE et al., 1962), ANA (acide naphtalène acétique)
0,1 mg.l-l, BAP (benzyl amino purine) 1 mg. l-1, cefotaxime
400 mg. l-' (élimination des agrobactéries) et kanamycine
70 mg. l-1 (agent de sélection des cellules transformées).
Dès l'apparition des premiers bourgeons (environ un mois
après coculture), ils sont placés sur milieu d'enracinement
identique au premier mais ne comprenant pas d'hormones
végétales.
L'analyse rapide des résultats, en fonction de
l'expression du gène gus intron selon la nature du
promoteur situé en amont de la phase codante du gène,
montre que le promoteur PMs PR10-1 donne les meilleurs
résultats de l'ensemble des promoteurs testés. Une analyse
plus détaillée est présentée ci-après.
9) Caractéristiques du promoteur PMs PR10-1
PlasmidepPR~7-PMs PR10-1-crus intron
Ce promoteur a donné les meilleurs résultats avec
des différences d'expression constitutive du gêne gus selon
les organes testés.
a) Activité dans les cals
Une expression constitutive forte a été trouvée .
Quelques minutes d'incubation ont suffi pour obtenir un
test histochimique positif. Le promoteur est donc fortement
induit dans ce type de matériel, ce qui est en accord avec
les résultats obtenus par VAN LOON (1985). Les cals en
culture in vitro sont en état de stress et dans ces
conditions les PR protéines sont exprimées.
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b) Activité sur plantes entières acclimatées
Le promoteur est induit et le test histochimique
est positif après 2 heures d'incubation (contre 5 heures
avec le promoteur 35S). L'activité du gène gus n'est pas
uniforme dans les racines de tabac, seuls l'épiderme des
parties âgées et le méristème apical ont donné la
coloration bleue caractéristique du test. Selon la
littérature une activité des gènes de défense dans les
racines est aussi classiquement observée.
F rs
Chez tous les tabacs transformés par cette
construction, une forte activité constitutive a été trouvée
dans les fleurs et plus particulièrement dans les anthères
et le pollen. Une activité du gène gua a aussi été décelée
dans les trichomea des sépales et plus faiblement dans les
pétales. Ces résultats sont aussi en accord avec ceux de
VAN LOON (1985) qui indiquent une induction des gènes de
défense dans les pièces florales.
Feuilles
Une faible activité constitutive gus a été
observée dans les trichomes de jeunes feuilles de plantes
adultes. Chez le tabac, le stade rosette â larges feuilles
correspond au stade juvénile et le stade vieillissant à
celui de la formation des graines. Cette faible activité a
été constatée majoritairement dans les trichomes pluri-
cellulaires. L'expression d'une protéine PR dans de telles
structures n'a jamais été décrite à notre connaissance.
Une activité inductrice constitutive du promoteur
isolé PMs PR10-1 est donc possible dans les trichomes des
feuilles de tabac (3 plantes sur 7) mais elle semble sous
l'influence des stades de développement.
En l'absence d'induction par. un pathogène,
l'activité du promoteur chez le tabac est donc limitée â la
racine, aux pièces florales (anthères et pollen) et à
quelques cellules de la partie aérienne (trichomes
essentiellement).
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Exemple 3
Autres esnêces véQêtalea transformgea
1 ) Medicago trunca Cula
Pour cette espèce, on a cherché â réaliser des
plantes composites, c'est-à-dire possédant à la fois une
partie aérienne de type sauvage 1 (non transformée
génétiquement) et des racines transformées.
De jeunes germinations ont été utilisées. Après
développement de la racine principale, les hypocotyles
10 excisés, ont été trempés dans une suspension
d'Agrobacterium tumefaciena EHA 105 possédant soit le
plasmide p35S-gus intron soit le plasmide pPR97-PMs PR10-1-
gus intron, de façon à obtenir par la suite des racines
néoformées transformées. Après une semaine, des racines ont
15 été obtenues et un test histochimique GUS a été réalisé.
Pour cette expérimentation, le témoin a été constitué par
de jeunes germinations traitées de manière identique aux
lots précédents (hypocotyles excisés mais non trempées dans
la suspension d'agrobactéries).
20 Tous les explants du lot témoin ont néoformé des
racines en une semaine, par contre, 50 % seulement ont
réagi pour les lots traités par les agrobactéries. Quel que
soit le traitement, aucune racine n'a donné de réponse
positive au test GUS. En revanche, la base des hypocotyles
25 des lots traités, bien que nécrosée, a souvent réagi pour
donner une coloration bleue (présence de cellules
transformées). La partie nêcrosée des explants a alors été
excisée et ils ont été remis en enracinement. SO % ont
alors développé des racines néoformées dont certaines se
sont rëvélées, dans quelques zones, positives au test.
Ce sont donc des racines chimériques (cellules
transformées et non transformées) qui ont été obtenues, les
parties transformées correspondant à des lignées
cellulaires ayant intégré la construction dans une cellule
souche de base.
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Les deux constructions testées, p35S-gus intron
et pPR97-PMs PR10-1-gus intron, ont donné ces lignées
cellulaires racinaires transformées dans respectivement 3
et 2 explants sur les 6 mis en expérimentation pour chaque
lot.
Bien que le modèle expérimental ne soit pas
adapté à l'étude poursuivie (étude de l'expression des
protéines PR lors du phënomène de nodulation par
Rhizobium), il n'en a pas moins démontré que le promoteur
PMs PR10-1 est tout aussi fonctionnel dans cette plante que
dans la plante d'origine (Medicago sativa).
2) Lotus corniculatus
L'expérimentation avait, là aussi, pour but
d'étudier l'induction du promoteur lors de la nodulation
par la bactérie symbiote Rhizobium meliloti NZP 2037 (PETIT
et al., 1987). Des plantes composites ont donc été
réalisées en transformant des cellules de l'hypocotyle de
jeunes germinations de Lotier par Agrobacterium rhizogenes
souche A4TC24, pour obtenir le phénomène de chevelu
racinaire (phénotype hairy root). Une fois celui-ci
développé, les racines principales ont été excisées et les
plantules ont été placées en milieu liquide pour accroitre
le développement du phénomène. Une fois les plantes
acclimatées, l'étude de l'induction des promoteurs lors de
la symbiose fixatrice d'azote a été réalisée en plaçant les
plantules en conditions de nodulation (BLONDON, 1964). Les
deux promoteurs d'étude retenus ont été les mêmes que
ceux utilisés lors de l'expérimentation menée avec
M. truncatula . 35S et PMs PR10-1. Pour ces deux
constructions, moins de 10 % des racines à phénotype hairy
root ont montré des racines positives au test GUS. D'une
maniére générale, les racines ayant ce phénotype ont donné
moins de nodules que les racines témoins.
Pour celles obtenues avec la construction
comportant le promoteur 35S, seuls les nodules ont présenté
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une réponse positive au test GUS, alors que pour l'autre
(promoteur PMs PR10-1), la coloration s'est développée sur
toute la racine, exceptée au point d'initiation des racines
secondaires. Par ailleurs, cette dernière construction n'a
pas permis d'obtenir de nodules sur les racines issues de
chevelu racinaire en interaction avec Rhizobium melilori.
Exemple 4
Étude de réa i n d'h ra neib 1 té du bac o é
avec les constructions utilisant des promoteurs du cxëne PR
de luzerne et le aéne gua intron
A) Réaction d'hypersensibilité sur N bent-hamiana
Crans ormé avec les cçnstructions associant le
p~çmoteur du cxène PR de luzerne et le crèn crus intron
1) Test de réaction d'hypersensibilité (HR)
La réaction d'hypersensibilité (HR), développée
dans l'interaction N. benthamiana - Pseudomonas syringae
pv. pisi, a été utilisée dans cette étude. Des plants de
tabac transformés, ayant incorporé dans leur génome les
différents inserts des plasmides p35S gus intron et pPR97-
PMs PR10-1-gus intron, ont été acclimatés puis infiltrés
par une suspension de P. syringae (ESNAULT et al., 1993) à
une concentration de 109 bactéries par ml. La solution a
été injectée dans le limbe à l'aide d'une seringue
hypodermique. Avec un tel modèle, en 48 heures, la réaction
de type HR est considérée comme bien développée. Les
feuilles, infiltrées par les suspensions de bactéries, ont
été prélevées 24, 48 et 96 heures après inoculation pour
évaluer, par test histochimique GUS, l'induction des
différente promoteurs étudiés. L'analyse d'une éventuelle
réponse systémique a été aussi évaluée, en utilisant le
même test histochimique, sur des feuilles situées en
dessous de la feuille infiltrée.
2) Étude de l'induction des promoteurs en conditions
de réaction de type HR
a) Promoteur constitutif 35S
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Dans le cas du promoteur constitutif 35S
(plasmide pG3-3 par exemple), l'inoculation par P. syringae
n'a pas modifié la réponse au test et cela en quelques
minutes d'incubation. L'infiltration par les bactéries
n'altère donc pas l'activité glucuronidase de type
constitutif obtenue avec le promoteur 35S.
b) Promoteurs de gènes de protéines PR
Promoteur PMs PR10-1
Comme le montre le tableau 2, ce promoteur est
bien inductible par l'attaque par un pathogène. A 24
heures, la réaction de type HR n'est pas encore entièrement
développée (48 heures pour l'exposition complète),
cependant, le test GUS est dêjâ positif. Avec les jeunes
plants de tabac transformés obtenus, la coloration est
faible et produite majoritairement dans le limbe de la
feuille infiltrée.
En réponse systémique, réponse au niveau de la
feuille inférieure à la feuille infectée, la coloration est
uniquement dans le limbe. Les plants de tabac adultes
(tiges développées mais n'ayant pas encore fleuries) et
juvéniles (en rosette) ont le même type de réponse avec une
activité faible du gêne gus, déterminée par le test
histochimique.
Pour les tabacs plus âgés, en fleur ou portant
des graines, la coloration obtenue lors du test est plus
intense, surtout dans les nervures et les trichomes de la
feuille infectée et uniquement dans ces tissus pour la
rëponse systémique.
Des différences d'expression du gëne rapporteur
sont donc mises en évidence selon l'âge de la plante. Cette
réponse, dépendante du stade de développement de la plante,
a été trouvée dans la plupart des études menées sur les
protéines PR des végétaux. L'induction du promoteur PMs
PR10-1 est un phénomène transitoire puisque l'expression du
gène rapporteur n'est plus visible 96 heures après
l'inoculation par les bactéries.
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L'induction n'est pas non plus limitée à la
réaction de type HR obtenue lors de l'interaction
plante/bactérie. Le même type de réponse a été obtenu avec
la construction PMs PR10-1-gus intron lors d'une infection
de l'un des explants par un champignon. Une expression
homogène du gène gus a alors été visible sur l'ensemble de
la feuille infectée, hormis la zone de contamination qui,
elle, s'est nécrosée.
Tableau 2 . Induction des différents promoteurs étudiés
lors de la réaction de type HR entre N. benthamiana et P.
syringae.
24h aprs 96h aprs inoculat
inoculation
Construction Feuille feuille infiltre
Feuille raction type HR
infiltre
infrieure
PMs PR10-1 6/7 6/7 0/3
pG3-3 (35S) 3/3 3/3 2/2
,L~~c ende du tableau 2
Les résultats sont présentés en nombre de plantes répondant
positivement au test histochimique GUS par rapport au
nombre de plantes analysées.
B) Expression auantitative du gène crus intron sous
contrôle des différents promoteurs
La méthode est basée sur un test enzymatique.
Elle utilise .
a) un extrait brut de l'enzyme codée par le gène gus
obtenu à partir des plants de tabac transformés, et
b) un substrat, le p nitrophényl glucuronide. La
vitesse d'hydrolyse du substrat est suivie au
spectrophotomètre et est rapportée à la quantité totale de
protéines de l'extrait. La méthode nécessite par contre la
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présence d'un promoteur fort, en amont du gène gus, car
elle est peu sensible.
En conséquence, elle n'a pas été appliquée aux
essais pour lesquels 12 heures ou plus d'incubation avec le
5 substrat, utilisé pour le test histochimique (X gluc . 5
bromo - 4 - chloro - 3 - indolyl - ~3 glucuronide), ont été
nécessaires.
Dans ces conditions expérimentales, le promoteur
355, placé dans le plasmide pG3-3, a donné une vitesse
10 d'hydrolyse du substrat (exprimée en unité arbitraire) 5
fois plus élevée que le promoteur PMs PR10-1, placé quant à
lui dans le plasmide pPR97. Par contre, le promoteur PMs
PR10-1 a donné une plus forte expression du gène gus que le
promoteur 355, si celui-ci eat placé dans le plasmide p35S-
15 gus intron. En effet, dans ce dernier cas, aucune détection
d'hydrolyse du substrat n'a été obtenue.
De même, les autres constructions n'ont pas
permis de donner de valeurs détectables au spectro-
photomètre.
Exemple 5
Isolement de l'ADN correspondant à un g~ëne de stilbëne
eynthase et expression de la etilbène synthase
Deux méthodes ont été utilisées pour obtenir un
gène codant pour une stilbène synthase de vigne. D'une
part, les données de la littérature (WIESE et al., 1994)
ont permis de connaftre la séquence d'un gène. D'autre
part, un insert génomique de 13 kb environ a été fourni par
BAYER AG (Agrochemical Division Research / Biotechnology
Pflanzenschutzzentrum, MONHEIM, D-51368 LEVERKUSSEN). I1
est précisé que la société BAYER a déposé auprès du
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), en Allemagne,
des souches d'E. coli contenant des plasmides portant des
gënes de stilbëne synthase de vigne (cf. EP-464 461) . la
souche E. coli Fier 1 pVst 1 (DSM 6002, déposée le 18 Juin
1990), la souche E. coli Fier 2 pVst 2 (DSM 6003, déposée
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le 18 Juin 1990), et la souche E. coli Fier pVst 1 2 t 3
(DSM 6346, déposée le 11 Février 1991). BAYER a également
déposé la souche E. soli Nurdug 2010 (DSM 4243, déposée le
17 Septembre 1997) qui contient le plasmide pGS 828.1 qui
S porte un gène de stilbène synthase d'arachide (cf. EP-309
862). L'insert utilisé pour réaliser les travaux rapportés
ci-aprês correspond en fait â un clone génomique complexe
comprenant deux séquences complètes fonctionnelles de gènes
de stilbène synthase (gènes vstl et vst2) et une séquence
incomplëte vst3. Par la suite, la séquence du gène vstl a
été sélectionnée pour être incorporée aux constructions
réalisées. Elle correspond à un fragment génomique de 4,9
kb (séquence fonctionnelle dont le promoteur) qui ne
possède pas de sites de restrictions adéquates pour
permettre un clonage direct dans les plasmides utilisés
habituellement comme vecteurs de transformation. I1 a donc
été ajouté des sites complémentaires par clonage
intermédiaire dans un plasmide pCDNA II.
A) A-iout de sites complémentaires par clonacre
intermédiaire dans un plasmide pCDNA II
Le fragment génomique du gène vstl déjà indiqué a
été isolé, du plasmide d'origine dans lequel il avait été
cloné, sous forme d'un fragment EcoRI/Pstl (2,1 kb) et
cloné à nouveau dans un plasmide pUCl9. Une fois cloné, le
fragment vstl a été incorporé dans les mêmes sites
(EcoRI/Pst1) du plasmide pCDNA II pour changer les sites de
restriction, supprimer le terminateur du gène et permettre
l'isolement d'un insert BamHI/BamHI (1,8 kb). C'est ce
fragment, correspondant au cadre ouvert de lecture du gène,
qui a été utilisé pour faire les constructions avec les
différents promoteurs dont ceux isolés de la banque
génomique de luzerne (cf. Figure 4). Cet insert a par la
suite été cloné dans pBIN 19 après vérification par
Southern blot des tailles des différents fragments obtenus
après digestion par les enzymes de restriction adéquates.
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B) Etude de l' expressi5~n du crène vstl
Poux vérifier l'expression des gènes codant pour
la stilbëne synthase dans les plants de vigne, une sonde
(1,8 kb), comprenant le gëne vstl, a été préparée à partir
du plasmide pCDNA II multiplié dans la bactérie E, coli HB
101. La sonde a été ensuite biotinylée par random priming,
avec le kit Polar Plex (Plex chemiluminescent kits,
Millipore), pour permettre une détection des gènes ou des
transcrite codant pour une stilbène synthase par chimio-
luminescence sur des Southern et Northern blots, réalisés à
partir d'acides nucléiques extraits de plants de vigne
témoins ou transformés.
1) Utilisation de la sonde vstl pour l'analyse d'ADN
génomique extrait de vigne 41B (Hybride V. vinifera
Chasselas x V. berland.ieri ; porte greffe)
Des analyses par Southern blot ont été réalisées
après extraction d'ADN génomique puis digestion de celui-ci
par EcoRI. La sonde vstl a permis d'obtenir un grand nombre
de bandes (environ 15). Celles-ci correspondent en fait à
des fragmenta contenant des séquences codant pour une
stilbène synthase qui constituent une famille multigénique
(6 à 8 gênes selon WIESE et al., 1994). Parmi ceux-ci,
vstl, vst2 et vet3 sont fortement homologues entre eux. En
outre d'autres gènes peuvent être reconnus par cette sonde,
notamment ceux correspondant à la famille multigénique de
la chalcone synthétase. Les deux enzymes sont en effet de
même stucture et de même taille (dimères de sous unité de
41 à 44 kb). Elles utilisent aussi le même substrat et leur
séquence d'acides aminés présente un fort taux d'homologie,
au moins au niveau du site actif.
Pour vérifier si une telle hybridation croisée
était possible, l'ADN de deux plasmides a été extrait.
L'un, pCDNA II, contenait le gêne vstl, et l'autre, pPCV
002, un gène de chalcone synthase de Rosier, disponible au
laboratoire. Une sonde biotinylée correspondant au gëne de
chalcone synthase de Rosier a aussi étë préparée. Les
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Southern blots obtenus, en rêalisant les hybridations
croisées, ont montré que la sonde vstl reconnaissait
effectivement le fragment de chalcone synthase de Rosier et
inversement. Les signaux émis sont alors plus faibles dans
S ce cas d'hybridation croisée.
2) Dosage du resvératrol â partir de feuilles de
plantes de vigne
Le matériel végétal frais, feuilles ou tiges, est
réduit en poudre dans un mortier contenant de l'azote
liquide et les composés apolaires sont extraits par le
méthanol (1 ml pour 100 mg de matière frafche . m.f.).
Après centrifugation pour éliminer les débris,
l'extrait méthanolique est filtré sur filtre 0,45 ~.m puis
évaporé à sec sous azote. Le résidu est repris dans le
1S méthanol pur (100 ~1 / 100 mg m.f.). Afin d'éliminer les
pigments (chlorophylles notamment), l'échantillon est passé
ensuite sur une colonne C18 (Sep-pack WATERS),
préalablement équilibrée au méthanol. L'analyse qualitative
et quantitative des extraits est réalisée par C.L.H.P.
(Chromatographie Liquide Haute Pression) sur une C.L.H.P.
WATERS (Modêle 600 E), couplée à un détecteur à barrette de
diodes (Modèle 990. WATERS). Le support de chromatographie
est composé d'une colonne C18 phase inverse (ultra base
C18, 205 x 4,6 mm, 5 um ; Shandon). L'analyse des composés
de l'extrait est effectuêe en conditions isocratiques, la
phase mobile étant constituée d'un mélange acétonitrile-eau
35/65, V/V avec un débit de 1 ml.min-1.
Un spectre d'absorption est réalisé toutes les
deux secondes entre 200 et 400 nm et le resvératrol est
détecté à son maximum d'adsorption à 305 nm.
La quantification du resvératrol est réalisée par
étalonnage externe à partir d'une droite étalon, obtenue
par chromatographie de solutions â 5, 10, 20, 50 et
100 ~,g . ml'1, rêalisées à partir de resvêratrol du commerce
3S (Sigma). La concentration en resvératrol, mesurée à partir
de l'aire du pic correspondant à la molécule, est rapportée
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à l'unité de masse de m. f. ou de m. s. (matière sèche) ou
de masse de chlorophylle de l'échantillon dosé.
Exemple 6
nstru i n ' 1 e ss an 1 'n
ur une s ilb n ha e vi e iff r nte r m ur
1) Constructions utilisant des promoteurs constitutifs
Deux promoteurs apparentés ont été utilisés pour
réaliser les constructions génétiques devant permettre une
expression constitutive.
Dans la première construction, l'ADN de etilbène
synthase de vigne (vstl) a été placé sous contrôle d'une
séquence de régulation constituée par une cassette
contenant deux promoteurs 35S du CaMV montés en série (dans
la même orientation). A la fin de la séquence codante du
gêne vatl on a aussi ajouté une séquence de polyadénylation
du 35S. La construction chimérique ainsi réalisée peut donc
se résumer ainsi . p35S (CaMV) - p35S (CaMV) - vstl - poly
A 35S (CaMV).
Dans la deuxième construction, la séquence
codante vstl a été placée sous le contrôle de quatre
séquences « enhancer x isolées du promoteur 35S du CaMV et,
montées en série devant le promoteur CaMV 35S et la propre
séquence « enhancer ~ du promoteur du gène de vigne (vstl).
Les deux séquences chimériques ainsi réalisées ont été
d'abord insérées dans le plasmide PMP 90RK puis les
plasmides ont été incorporés par la suite dans la souche
d'agrobactéries GV3101.
Ces deux séquences de régulation sont considérées
comme des promoteurs constitutifs « forts ~.
2) Construction homologue utilisant l'insert de 13 kb
(gènes vst sous contrôle de leurs propres promoteurs)
Le fragment d'environ 13 kb d'ADN génomique de
vigne a été décrit ci-dessus. I1 comprend notamment 2 gènes
fonctionnels (vstl et vst2) codant pour des enzymes
stilbène synthases et un gène (vat3) incomplet (non
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fonctionnel). Cette séquence vigne a été co-intégrée à un
plasmide pGV3850 qui a ensuite été introduit dans une
souche d'agrobactéries. Elle correspond donc à des cadres
ouverts de lecture de gènes vst (stilbène synthase de
5 vigne) sous contrôle de leurs propres promoteurs.
Plusieurs séries de plantes 41B, transformées par
le plasmide comportant le fragment de 13 kb, ont été
obtenues et ont été étudiées et analysées par Southern bloc
en utilisant 3 sondes différentes (sonde de 1, 8 kb du gène
10 nptll ; de 2,4 kb du gêne de résistance à l'ampicilline et
de 1 kb de la bordure gauche du plasmide pBIN 19 comprenant
la séquence de fin d'intégration du TDNA). La majorité des
plantes retenues a réagi à l'une ou l'autre de ces sondes.
Ces clones ont été numérotés selon un code . 55 pour la
15 construction et 2, 3, 5, 6, 7, 9 pour les différents
transformants obtenus.
3) Constructions utilisant le promoteur inductible PMs
PR-10-1
La construction comprenant le promoteur PMs PR
20 10-1, isolé à partir des clones génomiques PR de luzerne, a
été réalisée (cf. Figure 5).
çQnstruction du plasmide pain 19 - PMs PR-10-1 - crène vst2-
Terminateur 35S
Le promoteur PMs PR10-1 isolé de la luzerne et le
25 gêne vatl comportant chacun un codon ATG initiateur de la
traduction, un adaptateur a été réalisë pour cloner le gène
vstl sans ATG supplémentaire dans la construction. Cet
adaptateur a été synthétisé sous la forme de deux oligo
nucléotides de 11 bp chacun, l'un Bam HI compatible,
30 l'autre Mun I compatible. L'adaptateur a ensuite été
incorporé au site Mun I du gène vstl cloné dans le plasmide
pUCl9. L'insert a alors été récupéré par une digestion 9am
HI, puis cloné dans pBIN 19 entre le promoteur PMs PR10-1
et le terminateur 355. L'insertion du gène vetl avec son
35 adaptateur s'est donc située entre le promoteur PMs PR10-1
et le terminateur 35S. Dans ces conditions, l'ATG du gène
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vstl a été éliminé et 3 codons supplémentaires ont été
inclus dans la phase codante de vstl, en amont du gène. I1
a été vérifié par séquençage que le cadre ouvert de lecture
du gène se trouvait toujours en phase avec le reste de la
construction.
Aprës transformation des plants de 41B, avec
l'insert comprenant entre autre la séquence chimérique .
promoteur PMs PR10-1-gène vetl terminateur 355, les
transformants ont été analysés par Southern blot, en
utilisant la sonde nptll déjà décrite. Néanmoins,
l'intégration complète ne peut être démontrée pleinement
par cette méthode et surtout par cette sonde, puisque dans
le système d'Agrobacterium il est admis que l'insertion
dans le génome de la plante commence à la bordure droite
pour se terminer â celle de gauche. Le gène nptll étant
situé, dans la construction utilisée, près de la bordure
droite, une intégration partielle, gène nptll inséré mais
blocage ultérieur de l'intégration avant la bordure gauche,
est donc possible. Les transformants ont été codés 145 et
affectés des numéros 2, 5, 6 pour ceux dont les résultats
sont présentés ci-dessous.
Exemple 7
Transformation Qêngtic~ue de la vicxne et analyse de
l'efflcacitê des promoteurs étudiés
Comme il a été décrit ci-dessus (Exemple 6),
quatre constructions principales ont été réalisées pour
transformer le système modèle du laboratoire porte-greffe
41B (V. vinifera x V. berlandieri) . Ce dernier a en effet
l'avantage de donner de bons résultats en transformation de
suspensions cellulaires embryogènes par les agrobactéries.
Environ 50 transformants sont obtenus en moyenne par
expérimentation en utilisant 0,1 à 1 ~.1 de P.C.V. (Packed
Cell Volume) de cellules embryogènes. De plus, la
sélection, le développement des embryons transformés et la
régénération en plantes sont rapides. Des plantules in
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vitro, ayant 6 à 8 feuilles bien développées, peuvent être
obtenues en deux mois de culture.
A) Transformation crénétiaue du 418 avec des vecteu
v
constitutifs
Deux constructions ont été testées, l'une
comprenant le promoteur double 35S monté en série devant le
gène vstl et la seconde, constituée par une séquence de
régulation composée de 4 séquences « enhancer x 35S (CaMV)
montées en série devant le promoteur 35S du CaMV, le tout
situé en amont du gène vstl possédant sa propre séquence
« enhancer x. Quatre séries d'essais ont été réalisées
(deux pour chacune des constructions) afin de transformer
les cellules embryogènes de vigne. Aucune n'a permis de
régénérer des plantes ni même des embryons. Dans tous les
cas, une nécrose rapide des suspensions cellulaires
embryogènes a été obtenue après les 48 heures de coculture
avec les agrobactéries. Ces constructions ne permettent
donc pas d'obtenir des plantes transformêes exprimant, de
manière constitutive, le gène vstl sous contrôle de ces
promoteurs « forts ~o. Une hypothèse peut être avancée,
l'expression de ce gène pourrait bloquer la régénération en
embryons par nécrose rapide des cellules à potentiel
embryogêne en réponse à la production de phytoalexines
stilbéniques.
Ces résultats nêgatifs, obtenus avec les
constructions comportant des promoteurs constitutifs de
type 35S, démontrent l'intérêt de contrôler une sur-
expression du gêne vstl par un promoteur homologue ou
hétérologue inductible notamment par un pathogène.
Ces résultats obtenus sont à rapprocher de ceux
publiés par FISHER et NAIN en 1994 qui soulignent le fait
qu'ils n'ont pas réussi à faire exprimer de façon
constitutive un gêne de stilbêne synthase de l'arachide à
un taux êlevé chez le tabac, en utilisant le promoteur 35S
du CaMV. Selon ces auteurs il y aurait, avec une telle
construction, une rêgulation négative de l'expression du
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gène en condition d'attaque de pathogène. Celle-ci, selon
leur hypothèse, pourrait résulter de la mise en place par
la plante de mécanismes de défense, induite normalement par
les pathogènes (synthèse de PR protéines notamment) qui
S exerceraient une inhibition sur les promoteurs viraux.
B) T m u B s v
a e v n 1 e m
s r s s s i i e u bi t' u s
1) Etude de l'expression des gènes vat et de leurs
cinétiques d'induction par U.V. sur feuilles excisées,
isolées en survie et sur plante entière de vitroplants de
vigne 41B témoins ou transformés par l'insert de 13 kb
I1 a été montré que la synthèse de resvératrol
(phytoalexine principale de la vigne), produit de la
rëaction catalysée par une enzyme stilbène synthase, était
inductible par les ultraviolets (U.V.), donc sous
conditions de stress abiotique (LANGCAKE et al., 1977 ;
SBAGHI et al., 1993). En conditions normales, la vigne ne
synthétise pas ou très peu de resvératrol, par contre après
induction aux U.V. (exposition de 10 minutes aux U.V. à
254 nm, pour une lampe dissipant 600 uW.cm-2), suivie d'une
période de 20 heures d'obscurité, la phyto-alexine est
synthétisée dans les feuilles excisées.
a) Méthode utilisée
Irradiation des feuilles .
- feuilles de vitroplants . à 254 nm pendant 13 minutes
pour une lampe dissipant 600 uW.cm-2,
- feuilles isolées de vitroplants ou vitroplants . à 254 nm
pendant e minutes pour une lampe dissipant 600 ~.W.cm-2,
- extraction et analyse des ARNms du matériel végétal et
estimation du resvératrol par fluorescence après
excitation à 365 nm à un temps donné après l'induction.
Chaque échantillon est constitué par 3 feuilles
isolées d'un même plant, induites séparément aux U.V. mais
réunies pour l'extraction et le dosage. Le test est réalisé
sur des feuilles excisées, isolées de vitroplants, ou sur
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des vitroplants en culture sur milieu gélosé, possédant 6 à
7 feuilles bien développées. Les trois feuilles les plus
âgées de chaque plantule sont prélevées et utilisées pour
le test. L'exposition aux U.V. est effectuée sur leur face
supérieure. Aprés analyse, les quantités de resvératrol
obtenues sont exprimées en ~tg de produit rapportés soit au
gramme de poids frais de feuilles analysées, soit au gramme
de matiëre sèche (évaluée sur le culot, après
centrifugation après l'extraction méthanolique) ou en mg de
resvératrol par g de chlorophylle.
Dans les tableaux ci-dessous, sont indiquées les
valeurs obtenues pour des clones de 41B, 55-X, transformés
par la construction du clone génomique de 13 kb, où sont
présents, dans la séquence utilisée comme insert, deux
gènes complets vatl et vst2, gènes tous deux sous contrôle
de leurs propres promoteurs.
b) ~i~de de stress abiotique (U V ) sur feuille
excisée (expérience N° 1)
Les résultats, correspondant â la construction 55
(insert 13 kb) et aux clones 2 (55-2) et 3 (55-3), sont
présentés dans les tableaux 3 et 4 ci-dessous (dosage du
resvératrol) et représentés par les figures 6 et 7 (analyse
des transcrits). L'étude de la cinétique d'induction par
U.V. de l'expression des gènes codant pour la stilbène
synthase a été réalisée après une période séparant
l'induction par les U.V. des analyses fixée à 17 heures
(cf. tableau 3 et Figure 6), ou variant de 0, 8, 17, 24 ou
32 heures après induction (cf. tableau 4 et Figures 7 et
8) .
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Tableau 3 . Quantités de resvératrol détectées dans les
feuilles témoins et transformées, non induites ou 17 heures
après induction aux U.V. (exprimées en ~cg.g'1 de matière
frafche)
S
Tmoins Clone 55-2 Clone 55-3
non
transforms
Non Induit Non Induit Non Induit
induit induit induit
0 12 0 11 0 13
~écrende du tableau 3 . Les feuilles ont été excisées de
vitroplants de 41B avant induction aux U.V.. Les clones 55-
2 et 55-3 correspondent à des plantes transformées ayant
10 intégré un insert de 13 kb contenant des gènes codant pour
une stilbène synthase.
La fluorescence, observée dans le bleu-violet à
environ 450 nm, est três forte dans les nervures des
15 feuilles excisées et répartie uniformément sur la totalité
de la surface de la feuille. Les feuilles témoins, non
induites aux U.V., ne présentent pas, quant â elles, de
fluorescence. Ces résultats mettent en évidence une
expression spécifique des gênes codant pour des stilbène
20 synthases. L'analyse des transcrits par Northern blot,
réalisée par la sonde vstl, montre la présence d'un
fragment d'environ 1,8 kb dont le signal émis est très
intense chez les feuilles induites aux U.V. alors qu'il est
absent ou très faible chez les plantes non induites (cf.
25 Figure 6 ) .
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Tableau 4 . Cinétique de l'évolution des concentrations en
resvératrol sur des feuilles de vitroplants de 41B,
induites aux U.V. prélevées sur les plants en culture sur
milieu gélosé, puis isolées et analysées pour leur contenu
en resvêratrol à différentes périodes après induction.
Temps aprs Quantit de resvratrol
induction (h) (en ~g.g-1 de
Matire Frafche)
Tmoin PCT 55-2 PCT 55-3
NI 0 0 0
0 0, 6 0 0
8 30,8 12,1 9
17 56,8 71,7 47
24 83,2 81,4 35,2
32 15,5 7,7 151,8
Légende du tableau 4 . Les résultats sont exprimés en ~g.
g-1 de matière frafche. Deux plantes transformées PCT 55-2
et PCT 55-3 ont été analysées en comparaison avec le
témoin.
NI . Non induit aux U.V..
Dans ces conditions, après stress aux U.V., la
quantité de resvêratrol retrouvée dans les feuilles témoins
est maximale 24 heures après l'induction {de l'ordre de
80 ~.g.g'1 m. f . pour le 41B) . Cependant, des variations
importantes existent selon la date de l'analyse dans le
cycle de repiquage des vitroplants . cycle de micro
bouturage.
Les résultats obtenus après analyse par Northern
blot, en utilisant la sonde vstl sont prêsentés à la Figure
7. Au moins deux types de transcrits, de tailles très
proches (environ 1,8 kb), ont été détectés. Bien qu'une
hybridation croisêe avec un tanscrit de chalcone synthase
ne soit pas â exclure, les différente ARNs messagers
reconnus correspondent vraisemblablement à l'expression de
différents gènes de stilbène synthase. I1 a en effet été
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montré chez la vigne (WIESE et al., 1994 ; KINDL,
communication personnelle) que des différences existaient
dans les cinétiques d'induction des différents gènes de la
famille multigénique codant pour les stilbène synthases.
L'analyse par Northern blot a mis en évidence que
chez les feuilles excisées de vigne 418, soumises ensuite
au stress abiotique que constitue l'exposition aux U.V.,
les transcrits de stilbène synthase présentent un maximum
d'expression environ 17 heures à 32 heures après induction.
Ces résultats sont comparables à ceux obtenus avec des
cultures de cellules de vigne qui ont montré elles aussi le
même modèle d'expression mais avec la présence de deux
maxima (WTESE et al., 1994).
c) Ei~ude de stress abiotiaue fU.V ) sur feuille isolée
e~ survie (expérience N° 2) induction sur vitro-plants
avant isolement dis feuilles
Le tableau 5 ci-dessous présente les résultats
obtenus pour une seconde série de transformants ayant
intégré l'insert de 13 kb. L'étude de la cinétique
d'induction par U.V. de l'expression des gènes codant pour
la stilbène synthase a été réalisée après une période
séparant l'induction par les U.V. des analyses variant de
20, 40 ou 60 heures.
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Tableau 5 . Concentration en resvératrol de feuilles
isolées de vitroplants de vigne après induction aux ultra-
violets et extraction à différents temps de survie.
Temps de survie
des feuilles
isoles de
vitroplants
aprs induction
aux U.V. (8mn
254 nm) et avant
extraction
du resvratrol
Clone tudi 20 heures 40 heures 60 heures
41B - Tmoin 0 0 p
non induit
41B - Tmoin 281 165 6
induit
Clone 55-2 135 918 58
induit
Clone 55-3 44 931 301
induit
Clone 55-5 392 83 657
induit
Clone 55-6 339 235 43
induit
Clone 55-7 263 411 148
induit
Clone 55-9 386 823 54
induit
S
Lécrende du tableau 5
Les concentrations en resvératrol sont exprimées en ~.g.g-1
de matière sèche.
41B porte-greffe hybride V. vinifera Chasselas x V.
Berlandierri .
Les rêsultats présentée dans le tableau 5
permettent de distinguer deux groupes de plantes .
- le premier correspond au témoin et à deux des
transformants 55-6 et 55-7. Ils présentent en général un
maximum de concentration en resvératrol compris entre 280
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et 410 ug.g~l matière sèche et cela en général 20 heures
après l'induction sauf pour le clone 55-7 0~l il est situé
â 40 heures ;
- le second groupe présente quant à lui des maxima plus
élevés soit presque le double du premier (820 à 930 ~tg.
g-1 matiëre sèche). I1 est constitué uniquement de
transformants (55-2, SS-3 et 55-9). Le maximum est
exprimé 40 heures après l'induction aux U.V., par contre,
20 heures après induction, ces plantes ont souvent des
concentrations très inférieures à celles du premier
groupe. C'est le cas par exemple des clones 55-2 et 55-3
(135 et 44 ~tg.g'1 de matière sèche respectivement). L'un
des clones, S5-9, est cependant intéressant puisqu'il
montre des concentrations en resvératrol supérieures à
celles du témoin dans tous les cas (386, 823 et 54 ~tg.g'1
de matière sèche pour des temps de 20, 40 et 60 heures
aprês induction).
Dans ce système de feuille en survie, un témoin
non induit ne présente jamais de resvératrol et dans
presque tous les cas (hormis le clone 55-5 qui a un
comportement particulier), la concentration en resvératrol
chute de manière drastique 60 heures après induction.
d) Etude de stress abiotique (U.V.) effectuée sur
vitroplants en culture sur milieu ctélosé
Cette étude, effectuée sur plante en croissance
sur milieu gélosé, permet d'analyser la production de
resvératrol en condition d'expression éventuelle d'autres
mécanismes de défense de la plante, tout au moins ceux
susceptibles de s'exprimer dans les conditions de culture
in vitro. De plus, elle permet de suivre la synthèse de
resvératrol sur une période plus longue (dans les études
précédentes, la feuille isolée se nécrose au-delà de 72
heures ) .
Quatre clones de vitroplants en culture de 41B
transformés (55-2, 3, 5, 6) ont été traités par les U.V.
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dans les mêmes conditions que précédemment (8 min à
254 nm), les feuilles n'étant prélevées sur la plante que
20 heures après induction. Les résultats obtenus ont été
comparés au témoin non transformé ainsi qu'â un clone de
5 Vi tis rupestria et à 3 clones de cépage Vi tis vinifera,
connus eur le terrain pour avoir une sensibilité plus ou
moins grande aux attaques de BotryCis sur les baies.
La littérature (SBAGHI et al., 1993) montre en
effet qu'une corrélation existe entre la sensibilité des
10 baies à Botrytis, évaluée au vignoble, et la teneur en
resvératrol de feuilles de vitroplants induites aux U.V..
Les résultats sont présentés au tableau 6 ci-dessous.
Tableau 6 . Résultats des dosages du resvératrol par
15 H.P.L.C. réalisée 20 h aprës induction 8 mn aux U.V. 254 mn
sur différentes variétés de vigne.
Varit teste (resvratrol)
~tg . g~ 1 poids sec
Rupestris 215 351
Porte-greffe 41B 237
Ugni-blanc 479 209
Pinot noir 386 86
Folle blanche 280 37
Pct 55-2 361
Pct 55-3 235
Pct 55-5 115
Pct 55-6 539
Légende du tableau 6 .
20 L'induction aux U.V. est réalisée eur des vitroplants en
culture sur milieu gélosé. Les feuilles sont prélevées et
extraites pour analyse 20 heures aprês le traitement.
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PCT SS-2, 3, S, 6 - transformants ayant intégré l'insert
13 kb dans leur génome. Les résultats représentent la
moyenne de 3 répétitions.
S Ces résultats indiquent bien qu'une corrélation
existe chez les variétés et cépages entre sensibilité à
Botrytis et teneur en resvératrol des feuilles 20 heures
aprês induction. Deux groupes sont identifiables parmi les
variétés et cépages non transformés. Le premier, formé de
V. ruspestris, V. vinifiera x V. berlandieri (41B) et Ugni
blanc, correspond à celles et à ceux qui sont relativement
tolérants au champignon. Le second, constitué du Pinot noir
et de la Folle blanche représente ceux considérés comme
moyennement tolérants voire très sensibles (Folle blanche
1S par exemple).
Les transformants ont, quant à eux, en moyenne,
des teneurs en resvératrol, 20 heures aprês induction,
supérieures ou égales au témoin non transformé 41B (539,
362 et 236 ~g.g-1 matiêre sèche pour respectivement les
clones 55-6, 55-2 et 55-3 et 237 pour le témoin).
Pour le clone transformé 55-5 par contre, la
concentration obtenue est la moitié de celle du témoin. Si
l'on compare ces valeurs, exprimées en ~g.g-1 de poids sec,
~ celles des feuilles isolées (tableau 5), on s'aperçoit
2S qu'elles sont similaires pour le témoin mais par contre que
les variations existent pour les transformants analysés 20
heures après induction. Celles-ci sont quelquefois très
importantes (135 pour l'induction sur feuilles isolées et
362 pour induction sur vitroplants pour le clone 55-2 ; 44
contre 236 pour le clone 5S-3 ; 392 contre 116 pour le
clone 55-5 et 339 contre 540 pour 55-6). De plus, une
grande variabilité existe entre les différentes
répétitions.
2) Etude comparée de l'expression du gêne vst et de sa
3S cinétique d'induction par stress biotique sur vitroplants
de vigne 418, transformés par l' insert de 13 kb et par 1a
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construction comprenant uniquement le gène vstl sous
contrôle du promoteur PMs PR10-1.
Les résultats ci-dessus (chapitre 1), obtenus sur
des vitroplants ayant intégré par transformation génétique
des copies supplémentaires des gènes de stilbène synthase
(sous forme d'un insert de 13 kb comprenant deux sëquences
fonctionnelles vatl et vst2), montrent qu'une surproduction
de resvératrol, produit de la réaction catalysée par
l'enzyme stilbéne synthase, est possible dans certains
transformants lorsque ces gènes sont sous contrôle de leurs
propres promoteurs et en réponse à un stress abiotique tel
que l'irradiation par les U.V..
Par rapport à ces résultats, la production de
resvératrol sur deux types de transformants a ensuite été
l5 vérifiée, le premier représentant un clone de 41B ayant
intégré l'insert de 13 kb (gënes de stilbêne synthase vstl
et vst2 sous contrôle de leurs propres promoteurs), le
second plusieurs clones ayant incorporé le gène vatl seul
sous contrôle de la séquence de régulation de gênes de
défense de la luzerne PMs-PR10-1. Cette comparaison a été
faite après induction par un stress biotique causé par
9otrytis cinerea.
a) Méthodes utilisées
a) Mise en évidence de la fonczitox~cité de la
molécule resvératrol sur 9ot~rtis cinerea
Les données de la littérature sur la molécule en
tant que fongitoxique sont contradictoires. Selon DAò
(1994), le resvératrol montre bien une action inhibitrice
sur le développement des zoospores de Plasmopora viticola
(agent du Mildiou). Par contre, selon PONT et PEZET (1990)
il ne bloque pas la germination des conidies de Botrytis
cinerea.
L'action de la molécule a été étudiée sur la
croissance des hyphes mycéliens de Botrytis cinerea en
culture sur un milieu Malt-Agar, comprenant une gamme de
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dilution de resvératrol variant de 10-1 M à 3,7.10-3 M et
incubés à température ambiante 7 jours. Les résultats ont
montré une action inhibitrice de la molécule (CIso e 500
~imoles.l~l), avec diminution exponentielle du diamètre
S moyen de croissance du champignon pour des concentrations
supérieures â 125 ~tmoles.l'1. Par contre, des concen-
trations de 37 ~tmoles.l-1 n'inhibent que très peu la
croissance du mycélium (cf. Figure 9). Cette inhibition est
cependant levée progressivement après 7 jours de culture
dans ces conditions, par ailleurs trës favorables à la
croissance du champignon. Au bout de 20 jours, le
champignon finit par contaminer l'ensemble de la surface de
culture.
Test de criblage de la tolérance de
vitroplants de victne à Botrytis cinerea
Le test mis au point a consisté à inoculer des
feuilles de plantules, cultivées in vitro sur milieu de
microbouturage, par dépôt sur leur face supérieure de 20 ~cl
d'une suspension de conidies â 1.10-4 conidies.ml-1 (200
conidies par dépôt) dans un milieu malt-glucose. Les
plantules, ainsi inoculées sur 4 feuilles différentes, sont
cultivées ensuite en chambre climatique (photopériode 16 h
jour, 8h nuit ; température 24°C ; humidité 70 %). Deux
jours après l'inoculation, les feuilles de rang 4, les plus
jeunes, ont été observées (nécroses et macérations
présentes dénombrées grâce à une caméra reliée à un
moniteur de télévision) et extraites au méthanol pour
permettre de doser le resvératrol synthétisé en réponse à
l'attaque par Botrytis. A 5 jours, les feuilles numéro 2
ont été prélevées poux être observées en microscopie à
fluorescence. Une observation macroscopique (nécroses et
macérations sur les feuilles) et un dénombrement des
feuilles présentant des organes de fructification' du
champignon (conidiophores) ont aussi été réalisés sur les
feuilles numéro 3. Enfin à 9 jours, des feuilles en
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interaction avec le champignon, prélevées sur trois plantes
différentes, ont été extraites par le méthanol pour doser
le resvêratrol.
induction de stress biotiau oar dépôt de
n B s
v r - e
Ce test de confrontation directe a été réalisé
selon la technique déjà décrite (cf. paragraphe précédent).
I1 en est de même pour les observations effectuées. Pour
chaque variété ou clone transformé, quatre vitroplants ont
êté utilisês et pour chacun d~entre eux trois feuilles
développées de rang 2, 3, 4 ont été inoculées par la
suspension de conidies (200 conidies dans 20 ~1 de milieu
malt-glucose). Douze inoculations ont donc été réalisées
pour chaque variété ou clone et les analyses et les
observations suivantes ont été faites .
Deux jours après inoculation .
- observation des feuilles de rang 4 pour les symptômes
foliaires (zone de macération du champignon ou spots
nécrotiques, constitués de petites zones brun noir,
localisées autour des spores de champignon, ou sans
symptômes visibles), et
- dosage du resvératrol sur ces mêmes feuilles.
Cinq jours après inoculation .
- observation des feuilles de rang 3 pour les symptômes
foliaires avec dénombrement de celles qui portent des
conidiophores (organes de fructification du champignon), et
- observation en microscopie à fluorescence des feuilles
de rang 2 pour localisation des zones de synthèse du
resvératrol.
Neuf jours après inoculation .
- dosage du resvératrol dans trois feuilles, issues de
trois plantes différentes, en interaction avec le parasite.
Pour chaque série expérimentale, trois cépages de
Vitis vinifera ayant des sensibilités différentes aux
attaques de Botrytis sur les baies ont été étudiés . Folle
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blanche (sensible), Pinot noir (moyennement tolérant),
Ugni-blanc (tolérant) et le porte-greffe 41B (tolérant)
ainsi que quatre de ses transformants . l'un ayant inséré
des copies surnuméraires des gênes codant pour une stilbène
5 synthase (insert 13 kb), clone 55-3 et les trois autres,
reprësentant des transformants de la construction promoteur
PMs PR10-1-gène vstl soient les clones 145-2, 145-5 et 145-
6.
b) Résultats obtenus
10 Les résultats sont présentés dans les tableaux 7
et 8, pour les symptômes foliaires observés 2 ou 5 jours
aprês l'inoculation et, dans les tableaux 9 et 10, pour les
dosages de resvératrol rapportés soit au poids sec, soit à
la teneur en chlorophylle.
IS
Tableau 7 . Observations macroscopiques des interactions
feuilles de vitroplants-botrytis cinerea à 2 jours
Nombre de
Varit teste feuilles
n 4, observes
sur
4 plantes
diffrentes,
0~1 apparaissent
les s tmes
suivants
Zones de Spots Aucun
macration ncrotiques symptme
visible
Folle blanche 280 4 1 0
Pinot noir 386 3 4 0
Ugni-blanc 479 1 2 1
41B 0 4 0
Pct 55-3 2 3 0
Pct 145-2 0 3 1
Pct 145-5 0 1 3
Pct 145-6 1 1 2
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Légende du tableau 7 .
- Zones de macération . zone large et diffuse o~
Botrytis détruit rapidement les cellules végétales. Ces
zones ont une couleur beige marron clair.
- Spots nécrotiques . zones très petites circonscrites
autour du champignon. Ces spots sont de couleur brun-noir.
Tableau 8 . Observations macroscopiques des interactions
feuilles de vitroplants-Botrytis cinerea à 5 jours
Nombre de
Varit teste feuilles
n 3, observes
sur
4 plantes
diffrentes,
oa apparaissent
les s tmes
suivants
Zones de Spots Aucun
macration ncrotiques symptme
visible
Folle blanche 280 4 0 4
Pinot noir 386 3 1 2,5
Ugni-blanc 479 2 1 0,5
41B 1,5 2 0,5
Pct 55-3 2 2 1
Pct 145-2 1,5 2 1
Pct 145-5 0,5 4 0
Pct 145-6 3 2 1
Légende du tableau 8 .
- Zones de macération . zone large et diffuse oQ
Botrytis détruit rapidement les cellules végétales. Ces
zones ont une couleur beige marron clair.
- Spots nécrotiques . zones très petites circonscrites
autour du champignon. Ces spots sont de couleur brun-noir.
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Tableau 9 . Résultats des dosages du resvératrol par
H.P.L.C. sur différentes variétés de vigne en interaction
avec Botrytis cinerea depuis 2 jours
Varit resvrat . mg . g' 1 resvrat . ~~g , g'
teste chloroph. 1
oids sec
Folle B280 5,1 101
Pinot N386 4,3 102
Ugni B479 3,9 86
Porte-g4lB 5,7 112
Pct 55-3 4,6 118
Pct 145-2 6,9 170
PCt 145-5 2,2 83
Pct 145-6 4,3 107
~écrende du tableau 9
- resvérat. . resvératrol ; chloroph. . chlorophylle
Folle B 280 . Folle blanche 280 ; Pinot N 386 . Pinot noir
386 ; Ugni B 479 . Ugni-blanc 479 ; Porte-g41 B . Porte-
greffe 418.
Tableau 10 . Résultats des dosages du resvératrol par
H.P.L.C. sur différentes variétés de vigne en interaction
avec Botrytis cinerea depuis 9 jours
Varit teste resvratrol mg.g-1 resvratrol ~g.g'1
chlorophylle nids sec
Folle blanche 280 4,0 38
Ugni-blanc 479 31,7 145
Porte-greffe 41B 11,9 59
Pct 145-5 . 602,1 2558
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~1 Deux jours après inoculation .
L'observation a porté sur les feuilles les plus
jeunes (rang 4). Dans presque tous les cas, hormis le 41B
et les clones 145-2 et 145-5, des zones de macération ont
été observées (colonisation du champignon). Lee cépages
sensibles en ont présenté plus que les cépages tolérants .
Folle blanche et Pinot noir respectivement 4 et 3 zones
contre 1 seulement pour le cépage Ugni-blanc. Seuls les
transformants 145 (promoteur PMs PR10-1-gène vstl) et
l'Ugni-blanc ont donné des feuilles sans symptômes
visibles. Les zones nécrotiques, réaction de défense de la
plante, sont apparues principalement sur le 41B et ses
transformants et, pour les cépages, sur Pinot noir et Ugni-
blanc.
Si l'on compare ces observations aux dosages de
resvératrol (tableau 9), aucune corrélation ne peut être
établie puisque, ramenées au poids sec, les teneurs en
resvératrol de ces feuilles sont comparables avec environ
100 ~g.g-1 de matiëre sèche. Elles s'établissent pour
l'ensemble des vitroplants examinés â des valeurs comprises
entre 4 et 5 mg. g-1 chlorophylle.
Seuls le porte-greffe 41B et surtout le
transformant 145-2 ont des valeurs supérieures. Le clone
145-5 quant à lui a une valeur plus faible (de moitié
environ).
Une comparaison peut aussi être établie avec les
teneurs en resvératrol obtenues précêdemment 20 heures
aprês induction des vitroplants aux U.V. (tableau 6). Bien
que la période de prélèvement ne soit pas comparable (20
heures pour le stress abiotique contre 48 heures pour les
stress biotiques, mais il faut prendre en compte le temps
nécessaire à la germination des spores), on constate en
général des teneurs plus faibles en resvératrol après un
stress biotique (de moitié ou du tiers, cas de l'Ugni-
blanc), sauf pour le Pinot noir où elle est comparable et
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pour la Folle blanche o~ elle est environ trois fois plus
f orle .
Dans tous les échantillons analysés, on peut
souligner une forte dispersion des valeurs obtenues dans
S les différentes répétitions effectuées. Cette variabilité
entre différentes feuilles d'un même plant, déjà observée
avec les échantillons ayant subi les inductions aux U.V.,
pourrait, lâ aussi, avoir plusieurs origines. Parmi les
hypothèses les plus plausibles, on peut citer .
Une grande variabilité de réaction entre
vitroplants d'un même clone face à l'agression du
champignon. Les symptômes foliaires variables, obtenus
après inoculation par les spores de Botrytis semblent le
confirmer (variabilité dans l'infection, dans l'état
physiologique de chaque plante, etc.).
Le dosage, effectué sur la feuille entière, n'est
pas représentatif des variations de synthèse du resvératrol
existant au niveau de chaque cellule qui la compose. I1
est, en effet, généralement admis que, dans les réactions
d'hypersensibilité à un parasite, toutes les cellules du
limbe ne synthétisent pas les molécules de défense. Seules
sont induites à la synthèse de phytoalexines les cellules
situées près des zones d'attaque du champignon. Les
analyses, réalisées dans ce test, ne représentent donc que
des valeurs correspondant à un taux moyen de resvératrol
présent dans le limbe des feuilles en interaction avec le
parasite. Un phënomène de dilution important peut donc se
produire, notamment pour les plantes résistantes, entre les
concentrations présentes dans les cellules induites à la
synthèse de la phytoalexine et la valeur trouvée lors de
l'analyse de la feuille entière. Ceci est sans doute plus
marqué dans la première période d'expression des réactions
de défense de la plante.
Cinq jours après l'inoculation .
Les observations des symptômes montrent (planches
photos n° 1 et 2 (Figures 10 et 11) et tableau 8) que des
zones de macération sont formées, en plus ou moins grand
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nombre, chez tous les cépages, porte-greffe et
transformants étudiés. Celles-ci sont souvent associées à
la présence de conidiophores (organes de fructification du
champignon). Parmi les cépages et le porte-greffe 418
5 témoin, la Folle blanche, espèce la plus sensible à
Botrytis, présente des attaques sur toutes les feuilles
étudiées et aussi des conidiophores. Si l'on établit une
hiérarchie dans la gravité des symptômes viennent ensuite
le Pinot noir, puis l'Ugni-blanc et enfin le 418.
10 Cependant, pour ces deux derniers, les conidiophores ne
sont développés que sur une demi-feuille seulement. En ce
qui concerne les clones transformants, trois clones ont
donné des réactions plus ou moins similaires . 55-3, 145-2
et 145-6. Seul le clone 145-5 a présenté une bonne
15 tolérance au parasite, puisqu'une demi-feuille seulement a
permis le dëveloppement d'une zone de macération et aucun
conidiophore n'est visible.
Par contre, pour ce clone, la majorité des
feuilles a réagi à l'agression en formant des zones
20 nécrotiques. Un exemple est d'ailleurs présenté sur la
planche photo 2 (Figure 11).
Pour vérifier si ces résultats correspondaient
bien à des différences notables dans l'induction de la
synthèse du resvératrol et donc â l'expression de gènes)
25 codant pour une stylbène synthase, des feuilles, inoculées
par les spores de Botrytis, ont été observées en
microscopie à fluorescence (équipé du filtre A . filtre
excitation de 340 à 380 nm ; filtre d'arrêt à 425 nm). Dans
ces conditions, la chlorophylle fluoresce en rouge, le
30 resvératrol en blanc bleuté ou bleu plus foncé selon sa
concentration. Deux cépages, Folle blanche (sensible) et
Pinot noir (moyennement tolérant), le porte-greffe 41B
(tolérant) et un de ses transformants 145-5 (construction
Promoteur PMs PR10-1-gène vstl) ont été étudiés par cette
35 méthode. Les photographies de ces observations sont
présentées planche photo 3 (Figure 12). Des différences
remarquables sont visibles. Sur la Folle blanche, le
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mycélium du parasite (en noir sur la photo) s'est développé
et a colonisé les tissus. Pratiquement aucune cellule
bleutée n'est observable. Sur le cépage Pinot noir on note
une zone bleutée formant barrière autour et dans la zone
d'inoculation et de début de colonisation du champignon. La
croissance du mycélium est ralentie voire bloquée par cette
barrière, même si un processus de macération des tissus a
déj~ été engagé. Une coloration bleue plus intense existe
aussi dans les nervures. Sur le porte-greffe 418 témoin,
dans la zone étudiée, des cellules éparses, réparties dans
tout le limbe, montrent une fluorescence bleue claire avec
une intensité plus grande dans les nervures. Aucun
processus de colonisation du champignon n'a été engagé et
dea zones nécrotiques éparses, limitées à quelques
IS cellules, sont visibles. Sur le 41B transformé par la
construction promoteur PMs PR10-1-gène vstl, les résultats
sont spectaculaires pour le clone 145-5. Un début de
colonisation des tissus par le champignon a été engagé
(zone noire) mais, três vite, une barrière cellulaire,
synthétisant du resvératrol, s'est formée autour de cette
zone, bloquant ainsi son extension. Dans la zone de
macération du champignon des cellules bleues sont encore
visibles. En outre, une grande partie des cellules du limbe
de la feuille qui ne sont pas en contact avec le
champignon, ont synthétisé, elles aussi, du resvératrol.
Les nervures aussi présentent une intense coloration bleue.
Ces observations mettent en évidence qu'il existe
donc une corrélation entre l'intensité des symptômes
foliaires, développés après inoculation de vitroplants par
des spores de Botrytis, et la teneur en phytoalexine de
type stilbénique des feuilles. Les plantes les plus
tolérantes sont celles qui présentent une synthèse de
resvêratrol répartie sur une grande partie du limbe. Ceci
est réalisé avec le transformant 145-5, comportant un gêne
codant pour une stilbène synthase sous contrôle du
promoteur PMs PR10-l, isolé de la luzerne.
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Neuf jours après inoculation .
Les observations des symptômes ont montré que les
vitroplants de Folle blanche étaient aussi dans ce test
particulièrement sensibles aux attaques de 9otryCis. A neuf
jours, ils sont tous envahis par le champignon et ont, dans
la plupart des cas, une forte dégradation de leur
chlorophylle. En ce qui concerne le cépage Ugni-blanc et le
porte-greffe 41B, aucune différence n'a pu être constatée
dans l'expression des symptômes foliaires. D'une manière
générale, les résultats des observations des symptômes
effectuées â cinq jours sont retrouvés en un peu plus
développés pour les zones de macération. Par contre, les
feuilles qui présentaient des conidiophores se sont
nécrosées dans la plupart des cas.
4 variétés ont été analysées pour leur teneur en
resvératrol . la Folle blanche (sensible), l'Ugni-blanc
(tolérant), le 41B (tolérant) et le 145-5 (41B transformé
Promoteur PMs PR10-1-gène vstl). Pour le 145-5, neuf jours
aprês inoculation, il, ne présentait toujours pas de
symptômes notables d'attaque par Botrytis. Les résultats
des analyses de teneur en resvératrol sont présentés
tableau 10. Exprimées en ~tg de resvératrol.g'1 de poids sec
ou en mg.g'1 de chlorophylle, les concentrations de
resvératrol permettent le classement suivant des variétés,
en allant de la plus faible valeur vers la plus forte .
Folle blanche < 41 B < Ugni-blanc < 41B transformé 145-5.
Les différences de concentration sont très
importantes, puisque le transformant 145-5 a une valeur
près de 43 fois supérieure à celle du 41B témoin (en g-1 de
poids sec) et de 50 fois supérieure si elle est exprimée en
g~l de chlorophylle. Les dosages confirment donc bien les
évaluations effectuées en microscopie â fluorescence à cinq
jours (voir planche photo 3, figure 12).
En ce qui concerne l'Ugni-blanc et le 41B, le
tableau 10 montre que le premier a environ 3 fois plus de
resvératrol que le second, quelles que soient les unitës
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choisies. Pourtant, ces deux variétés réagissent de manière
identique en terme de symptômes foliaires. D'autres
phénomènes que la synthèse de resvératrol peuvent être mis
en jeu pour expliquer cette similitude de tolérance. I1
S faut noter aussi que dans les conditions du test, la
confrontation plante-Botrytis est particulièrement
favorable à ce dernier. Les conditions d'environnement
existant dans un conteneur in vitro font qu'après 20 jours
de culture environ, tous les vitroplants quels qu'ils
soient, sont infectés par le champignon.
c) Conclusions sur la transformation cténéti,~ue de la
v' n l' n 1 l' ff' a 't r mo r udi
Les expériences sur cellules embryogènes de 41B
(porte-greffe hybride V. Vinifera x V. &erlandieri)
1S transformées par Agrobacterium tumefaciens comprenant les
différentes constructions, n'ont pas permis de régénérer
des plantes avec les constructions qui comportaient le gène
vstl sous contrôle du promoteur 35S ou de ses dérivés.
Aucune activité constitutive forte sur l'ensemble de la
plante n'a donc pu être obtenue.
Par contre, des plants de vigne ayant incorporé
les constructions PMs PR10-1-gène vstl et insert 13 kb
(gènes vstl et vst2 sous contrôle de leurs propres
promoteurs) ont été obtenus. Ces plantes, transformées
2S génétiquement, ont pu être comparées au témoin (41B non
transformë) et multipliées par micropropagation.
Comparées aux témoins non transformés, peu de
différences ont pu être constatées sous stress U.V. (stress
biotique) dans les concentrations en resvératrol des
différents transformants obtenus avec l'insert de 13 kb, où
sont présents dans la séquence utilisée comme insert deux
gènes vstl et vst2, gènes tous deux sous contrôle de leurs
propres promoteurs.
Par contre, les résultats montrent que la
3S construction chimérique PMs PR10-1-gêne vstl permet une
surexpression de la phytoalexine resvératrol (produit de la
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réaction catalysée par une stilbène synthase), en présence
d'un stress biotique causé par Botrytis c.inerea de l'ordre
de 50 foie plus, 9 jours après infection. Ces plantes
montrent alors une meilleure tolérance si on les compare
soit au témoin, soit à des transformants obtenus avec
l'insert 13 kb.
Ainsi, la transformation avec la construction
associant le promoteur inductible PMs PR10-1 de luzerne
avec les gènes de stilbène synthase, permet de surexprimer
dans les plants de vigne les gènes de stilbène synthase en
réponse à un stress comme par exemple l'attaque d'un
pathogêne.
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