Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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PROCEDE POUR REMODELER LE tJENOME D'UN ANIMAL
PAR TRANSFERT ZYGOTIQUE D'UNE RECOMBINASE SPECIFIQUE DE SITE.
s La présente invention concerne un procédé pour transférer dans un oocyte
d'un
mammifère une recombinase spécifique de site, en particulier Cre, sous sa
forme active.
Ladite recombinase est exprimée sous le contrôle; d'un promoteur spécifique
dans des
cellules germinales mâles comportant au moins un site spécifique et reste
associée à la
chromatine des spermatoztiides. Ce procédé est paarticulièrement utile pour
remodeler le
lo génome d'un animal, par exemple pour insérer une séquence étrangère dans le
génome
d'un animal, et pour remplacer une séquence par une autre. Dans le cas où
ledit
pronateur est le promoteur Sycpl, un mode d'application permet de réaliser des
recombinaisons entre chromosomes paternels et maternels. La présente invention
porte
également sur les animaux susceptibles d'être obtenus par ce procédé, et sur
l'utilisation
ls de ces animaux transgéniques dans les industries pharmaceutiques,
cosmétiques, et
agro-alimentaire.
Le procédé de recombinaison site spécifique reprE;sente un outil puissant pour
effectuer
des modifications prédéterminées dans le génome des animaux. Plusieurs enzymes
de
2o recombinaison, dont Ia recombinase Cre du bactériophage P1 (Sauer &
Henderson,
1989, 1990 et Porter, 1998) catalysent un événement de recombinaison entre
deux
séquences désoxyribonucléotidiques double brin définies (séquence cible LoxP
pour
l'enzyme Cre). Ces opérations de recombinaison par Cre ont été réalisées dans
des
cellules en culture (Sauer et Henderson, 1990) et dans les cellules des
plantes (Albert et
2s al. 1995), mais pas sur la lignée germinale d'un animal.
La réaction de recombinaison a été Ie plus souvent utilisée pour la délétion
ciblée "knack-out" de régions génomiques spécifiques dites « floxées » par
recombinaison intramoléculaire entre deux sites LoxP d'une même molécule. En
3o particulier, des délétions dans des types cellulaires déterminés ont été
réalisées à partir
de diverses constructions génétiques permettant de faire exprimer
spécifiquement la
recombinase Cre (Brocard et al. .1997). L'intégration ciblée "knock-in"
pourrait
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représenter une possible application de la recombinaison spécifique de site et
serait d'un
grand intérêt, mais certaines limitations n'ont pas permis un tel
développement. De
manière générale, une recombinase pourrait catalyser une recombinaison
intermoléculaire entre deux molécules d'ADN portant chacune un site spécifique
(ou
s site de recombinaison) et servirait à l'intégration d'un ADN hétérologue
(introduit dans
la cellule) en un site défini (une région du génome de la cellule).
L'application à Ia lignée germinale d'un rnammifère pourrait être envisagée
chez
les mammifères par les méthodes actuellement disponibles, mais l'opération
exigerait
lo une suite de longues étapes techniquement difficiles, impliquant la
sélection de clones
recombinants dans des cellules ES en culture, Polbtention de chimères
germinales, et une
série de croisements avant l'obtention d'une lignée recombinante stable. D'une
part, le
temps requis pour l'ensemble de ces opérations se chiffrerait en mois, sinon
en années et
le rendement serait faible. D'autre part, la sélection des clones recombinants
exigerait
15 l'introduction de gènes de résistance à des antibiotiques. Ces sélections
pourraient
introduire des distorsions imprévisibles de l'expression génétique.
En l'état actuel de la technique, les mutations introduites par recombinaison
homologue ou excision sont fréquemment létales. pour les animaux. De ce fait,
l'effet de
2o ces mutations dans la lignée germinale mâle ne peut être évalué puisque le
processus
cyclique de la spermatogenèse implique un nombre de gènes de régulation qui
exercent
des fonctions critiques dans d'autres organes. Un exemple de cette situation a
été décrit
pour le gène Brcal (Gowen et al. 1996, Zabludoi~' et al. 1996).Cette
limitation peut être
surmontée en établissant un contrôle spatial et temporel de l'expression de la
25 recombinase. L'utilisation de promoteurs de tissus spécifiques et de
promoteurs
inductibles, l'utilisation de vecteurs adénoviraux et de formes de la
recombinase
activées par des hormones ont été considérées pour palier ce problème (Akagi
et al.
1997, Brocard et al. 1997, Gu et al. 1994, Kühn e;t al. 1995, Porter, 1998 ,
Wagner et al.
1997).
Ces problèmes sont résolus par la présente invention puisque la recombinase,
n'est exprimée que dans les cellules germinales rr~âles. De manière
inattendue, elle reste
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associée à la chromatine des spermatozoïdes et est transférée par les
spermatozoïdes
dans les ooeytes sous forme active aprës la fécondation. Ceci permet in fine
de
remodeler le génome.
Une application supplémentaire pourrait être la recombinaison méiotique
homologue spécifique de site entre chromosomes paternels et maternels. Ceci
exigerait
la présence de l'enzyme pendant la premiére division de méiose
(essentiellement au
stade pachytène}, ce qui est précisément ie cas dans les expériences menant à
la présente
invention.
La méiose réduit la taille du génome et génère une diversité génétique par
recombinaison homologue, tout en maintenant l'intégrité génétique par un
processus de
réparation. Il existe peu de connaissances concernant les processus de
régulation
transcriptionnelle lors des premiers stades de la méiose. Cependant, des
études avec des
1s souris transgéniques ont conduit récemment à l'identification de promoteurs
spécifiques
des cellules mâles; par exemple HSP70-2 (Dix et al. 1996), Pdha-2 (Iannello et
al.
1997}, Pgk2 (Robinson et al. 1989), Tcp-lObt (Ewulonu et al. 1993) et
Hox-a.4 (Berhinger, 1993).
2o L'adressage de l'expression de Cre vers la lignée germinale, publié dans
O'Gorman et al. 1997, utilise Ie promoteur de la protamine Prml, qui est actif
seulement après la méiose. Lors des expériences décrites dans cette
publication, aucun
transfert zygotique de Cre n'a été observé. Or, dans Ie cadre de la présente
invention, on
a trouvé que le transfert peut être mis en évidence dès lors qu'un site
spécifique LoxP
2s est présent dans le génome des spermatozoïdes.
Le gène Sycp1 a été identifié, cloné et localisé sur le chromosome 3 de la
souris
(Sage et al. 1997). La protéine est un composant majeur de l'élément central
du
complexe synaptonemal (Meuwissen et al. 1992). Elle est présente exclusivement
3o pendant la méiose du mâle et de la femelle du début du stade zygotène
jusqu'au stade
diplotène (Meuwissen et al. 1992, Heyting et al. 1989, Offenberg et al. 1991,
Dietrich et
al. 1992, Moens et al. 1992, Dobson et al. 1994), L'expression concomitante de
l'ARNm
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et de la protéine montre que la régulation de l'expression se situe au niveau
transcriptionnel (Meuwissen et al. 1992).
Contrairement aux promoteurs ci-dessus mentionnés, qui sont exprimés à des
stades relativement tardifs de la différenciation l;erminale, Sycp i présente
l'intérêt d'être
exprimé lors de la phase précoce de la méiose; des spermatocytes. Il a été
nécessaire
d'identifier et de sélectionner les éléments responsables de l'expression
spécifique de
Sycpl. Vu qu'il n'a pas été possible d'établir une lignée cellulaire qui
exprime le gène
endogène, des expériences à partir de souris transgéniques ont été effectuées.
Ainsi, on a
lü trouvé qu'une région du prômoteur de Sycpl de souris, localisée jusqu'à 2b0
pb en
amont du site d'initiation de la transcription du gène Sycpl, est non
seulement suffisante
pour diriger l'expression d'un transgène pendant la période initiale de la
méiose chez le
mâle, mais est aussi est Ia plus efficace chez les mâles sans pour autant être
active dans
(ovaire. Cette région de Sycpl se trouve donc utile pour la recombinaison
méiotique
entre des sites LoxP soit portés sur le même chromosome, soit à des
localisations
distinctes des chromosomes paternels et maternels.
L'ensemble des opérations nécessaires à la mise en, oeuvre de la présente
invention n'exige qu'une série de microinjections et réimplantations,
technique
2o aujourd'hui de routine, sur un nombre limité d'oeufs fécondés (une portée
est le plus
souvent suffisante). Contrairement à une opération menée à partir de cellules
ES, la
procédure présentée n'implique pas l'utilisation de systèmes de sélection, et
le temps
nécessaire à l'obtention de lâ souris recombinante est de quelques semaines,
ce qui est
considérablement plus rapide que pour la sélection de recombinants. En outre,
les
animaux transgéniques obtenus et leurs descendances sont totalement stables.
Ainsi, aucun des documents de la technique antérieure ne décrit, ni ne suggère
la
présente invention telle que définie ci-dessous.
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Description
Ainsi, la présente invention concerne un procédé d'insertion d'une séquence
étrangère
dans le génome d'un animal comprenant les étapes suivantes
5 a) expression d'une recombinase spécifique dfe site dans les spermatocytes
d'un mâle
portant au moins un site spécifique dans aon génome, ladite recombinase
restant
associée à la chromatine des spermatozoïdes.
b) Fécondation des oocytes et transfert de la re;combinase par lesdits
spermatozoïdes.
c) Microinjection d'un ADN recombinant possédant la structure « site
spécifique
Io séquence étrangère » dans le pronucleus mâile après fécondation.
d) Insertion du transgène d'intérêt au site spécifique dans le génome dans le
pronucleus mâle de l'embryon au stade 1 cellule, catalysée par la recombinase
libérée lors de la décondensation de la chromatine du spermatozoïde.
1s Avantageusement, ladite recombinase est Cre et le site spécifique est un
site LoxP.
Dans ce procédé, ladite séquence étrangère comporte un gène d'intérêt, â
exprimer sous
le contrôle d'un promoteur éventuellement tissus) spécifique. Le gène
d'intérêt peut
posséder en outre un élément accepteur d'épiss;age (SA), une séquence IRES
(Interna!
Ribosome Entry Site) et/ou un signal de polyadénylation (par exemple AATAAA)
et Ie
2o gène d'intérét peut coder pour une protéine d'intérêt ou être un gène
rapporteur
permettant d'identifier des promoteurs tissus spécifiques.
Dans un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de remplacement
d'une
séquence X par une séquence Y dans le génome d'un animal qui consiste à
croiser un
2s mâle de gënotype «site spécifique-séquence X- cite spécifique » dont les
spermatocytes
expriment une recombinase spécifique de site, ladite recombinase restant
associée à la
chromatine des spermatozoïdes, puis à introduire par micrainjection une
molécule de
structure « site spécifique -séquence Y- site spécif que » dans son génome,
ladite
recombinase catalysant l'excision de la séquence X pendant Ia méiose des
3o spermatocytes et l'intégration de la séquence Y dans le site spécifique
juste après
fécondation des oocytes. On entend par séquence X ou séquence Y, n'importe
quelle
séquence codante ou non codante. Ce procédé peut être utilisé pour
l'inactivation d'un
gëne de séquence X.
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Selon les procédés évoqués su ra et pour la suite de la description de
l'invention, ladite
recombinase peut être Cre et ledit site spécifique un site LoxP et être
exprimée sous ie
contrôle d'un promoteur permettant une expression efficace dans les cellules
germinales
s d'un mammifère. Lors du transfert, Cre demeure; donc associée à la
chromatine.
N'importe quelle protéine Cre, ses mutants, et variants, et n'importe quel
mutant et
variant de 1a séquence LoxP, peuvent être utilisés dans le cadre de la
présente invention.
Cre, bien connue de l'homme du métier, a été décrite notamment dans EP 300 422
(page 4 lignes S-33} et EP 220 009 (page 3 lignes 31-39), incorporés dans la
description
l0 par référence. De nombreux plasmides contenant la séquence de Cre y sont
divulgués et
ont été déposés à l'American Tissue Culture Collection tels que BSY90
(n° d'accession
ATCC 53255) et pBS39 (n° d'accession ATCC: 20772). La séquence de Cre
peut être
isolée de pBS39 par les enzymes de restriction XhoI et SaII. D'autres systèmes
Recombinase/site spécifique peuvent être utilisés dans le cadre de la prësente
invention.
is On peut citer notamment le système FLP/FRT dérivé de Saccharomyces
cerevisiae, le
système S/RS de Zygosaccharomyces rouxü et le système Crin/gix dérivé du
bactériophage Mu qui sont décrits dans EP 814 165, incorporé dans la
description par
référence.
2o La présente invention concerne également un I>rocédé pour transférer dans
un oocyte
une recombinase spécifique de site, notamment Cre, sous sa forme active. Ce
procédé
consiste à faire exprimer dans les cellules germinales mâles la recombinase
possédant
une forte affinité pour son site d'action sur l'ADN, ladite protéine restant
associée à la
chromatine des spermatozoïdes en son site spécifique (par exemple en son site
LoxP
25 dans le cas de Cre), à fertiliser des oocytes et â transférer la protéine
par lesdits
spermatozoïdes. La protéine est ensuite libérée sous sa forme active lors de
la
décondensation de la chromatine après la fécondation.
Parmi les promoteurs qui permettent une expression efficace dans les cellules
3o germinales d'un mammifère, on retient notamment les promoteurs Sycp1
(N°
d'accession dans les banques de données U 35665), Tcp-lObt (M 84175), Pgk-2,
HSP-
70-2, Pdha-2 ou Prml (X 07626), ou au moins une région de ces promoteurs. Par
exemple, ledit promoteur peût comporter au moins une séquence ayant au moins
80
d'identité avec la région -260/+5 (SEQ ID n° 1} du promoteur Sycpl de
souris. Cette
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région est suffisante pour induire efficacement l'expression d'un gène
d'intérêt
spécifiquement lors de la méiose précoce des spermatocytes d'un mammifère.
Des exemples de promoteurs pouvant servir pour l'accomplissement de la
présente
invention sont illustrés au tableau 1 ci-dessous. Les références du tableau
sont
incorporées par référence dans Ia description.
Tableau i : Promoteurs actifs à différents stades de la spermatogenèse.
Promoteur
Gne Minimal de'finiSpcificit d'expression Rfrences
EF-lalpha[-1200 ;-lJ Spermatogonies (Furuchi, 1996)
LTR Spermatogonies (Dupressoir,
1996)
FRMlf [-2800 ; Spermatogonies
lJ
(Hergersberg,
Pdha-2 (_lg~~_lJ Spermatocytes prcoces 1995)
Hsp70-2 (_640 ~+287JLeptotnes spermatides (Iannello,
y rondes 1997}
(Dix, 1996)
Sycpl (-54,+SJ Leptotne/zygotne pachytneprsente invention
CamII (-294 ;+68J Spernnatocytes (Ikeshima,
. 1994)
-1000 ~ 1 SPe~atocytes primaires
[ ' J (Bartell
1996)
H 1 t et spermatides ,
(34-Gtase(_543 ;+253J
Spermatocytes pachytnes (Shaper
1994)
et sperma~tides rondes ,
Zfyl~ (-4300 ;-1]
Spermatocytes pachytnes (Zambrowicz
,
et sperrnaaides rondes 1994)
Tcp-lUbt (-973 ;-lJ Spermatocytes pachytnes
spermatid.es allonges (E~lonu, 1993)
Pgk-2 (-515 ;-1] Spermatocytes pachytnes
sperrnatides allonges (Robinson 1989)
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Hst70 [-800 ;-1] Spermatocytes pachytnes
et
cellules post-miotiques
(Widlak, 199s)
Hox-a.4f (-4000 ;+1000]Spermatocytes pachytnes
et
cellules post-miotiques
(Berhinger,
1993)
Proacrosin(-2300 ;-1] Spermatides rondes allonges
c-Kit (-6232 ~+526] Nayernia, 1994)
(16~"'e intron)Spermatides rondes
spermatozodes. {protine
tronque)
(Albanesi,
1996)
ACE [-698 ;-1] Spermati~des allonges
et sperniatozodes
(Langford,
1991)
pal [-2400 ;-1] Spermades alionges et
,
spermatozodes
peschon, 1987
La présente invention vise également les animaux transgéniques susceptibles
d'être
obtenus par les procédés décrits ci=dessus:
s
Un autre objet de la présente invention est une séquence nucléotidique
permettant de
promouvoir efficacement l'expression d'un gène d' intérêt pendant la première
phase
méiotique des spermatocytes d'un mammifère caractérisée en ce qu'elle comporte
au
moins une séquence ayant au moins 80 % d'idc;ntité avec la séquence SEQ m
n°1. De
l0 préférence ladite séquence nucléotidique comporte au moins la séquence SEQ
ID n° I
ou SEQ m n°2.
La région -54/+5 du promoteur Sycpl (SEQ 1D n°3) est Ia séquence
minimale pour
l'adressage de l'expression dans les spermatocytes. La région -260/+5 est
toutefois
1s requise pour une expression à un taux maximal.
Ainsi on définit la séquence nucléotidique du promoteur Sycpl minimale pour
promouvoir une expression efficace et adressée dans les spermatocytes comme
comportant au moins une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la
séquence
20 SEQ 1D n° 1.
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Les SEQ m n° 1 et SEQ ID n°2 sont les séquences -260/+5 chez la
souris et -316/+5
chez le rat respectivement. De préférence, cette séquence nucléotidique est
caractérisée
en ce qu'elle comporte au moins la séquence S~EQ m n°1 ou SEQ 1D
n°2. Il va de soi
s que toute séquence équivalente aux séquences SEQ ID n°1 et SEQ ID
n°2, sont visées
par la présente invention. On entend par séquence équivalente toute séquence
d'un
promoteur de Sycpl de mammifère suffsante pour induire effcacement
l'expression
d'un géne d'intérét spécifiquement dans les spermatocytes des mammifères, tel
que par
exemple les porcins, les ovins, les bovins, et les rongeurs.
Dans un aspect supplémentaire, l'invention concerne une séquence nucléotidique
comprenant au moins une desdites séquence fusionnée à une séquence codante
pour un
gène d'intérêt. Le gène d'intérêt est de préférence un gène codant pour une
recombinase
spécifique de site, notamment Cre. Elle porte aussi sur une molécule d'ADN
ls comportant au moins cette séquence sous la forme d'un plasmide, d'un
vecteur viral,
d'un pseudo-vecteur, ou d'un ADN nu linéaire ou circulaire.
La présente invention vise également un animal transgénique possédant dans son
génome ladite séquence nucléotidique permettant l'expression d'un gène
d'intérêt
2o spécifiquement dans les spermatocytes, de préférence une recombinase
spécifique de
site, notamment Cre. La recornbinase demeure associée à la chromatine des
spermatozoïdes.
Cet animal est utile pour les procédés précédemment mentionnés.
25 La présente invention vise également un procédé de recombinaison entre
chromosomes
paternels et maternels qui consiste à croiser un animal mâle portant dans son
génome un
ou plusieurs sites) spécifique(s), avec un animal femelle portant dans son
génome un
ou plusieurs sites) spécifiques) caractérisé en c;e que la recombinase,
exprimée lors de
la première phase de la méiose, catalyse la recombinaison entre sites
spécifques.
Dans un autre aspect, l'invention porte sur un animal susceptible d'être
obtenu par ce
procédé et un animal mufti transgénique obtenu en croisant les animaux
susceptibles
d'être obtenus par les procédés décrits suera. L'animai transgénique selon
l'invention
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est un mammifère, notamment sélectionné parnv les ovins, les porcins, les
bovins, et les
rongeurs.
Un aspect avantageux de la présente invention concerne l'utilisation dudit
animal
transgénique pour la préparaüon de substances utiles en médecine, en
cosmétique, et/ou
5 en agro-alimentaire, notamment de substances actives, de prëférence des
peptides ou
polypeptides, des anticorps, des antigènes, des lhormones, ou des facteurs de
croissance,
et/ou pour la fabrication de suppléments alimentaires. Par exemple, on peut
faire
produire une protéine d'intérêt dans le lait de mammifères sous le contrôle
d'un
promoteur tissu spécifique ; par exemple WAP lapin ou WAP souris (demande de
l0 brevet Européen n° 92401635.5-2105).
On peut aussi utiliser ledit animal comme modèle expérimental pour
l'identification de
gènes, de promoteurs, de protéines, notamment de gènes impliqués dans les
maladies
génétiques, et/ou pour tester l'action de substances actives, pour la
préparation
d'organes ou de cellules présentant une meilleur immuno-compatibilité avec les
15 humains que les organes ou cellules de type sauvage ou susceptibles d'avoir
un faible
taux de rejet par les défenses immunitaires des humains, et pour l'élevage.
La présente invention concerne également l'ensemble des éléments tels que
décrits dans
les revendications, lesdits éléments étant incorporés dans la description par
référence.
Pour la suite de la description, on se référera aux légendes des figures
présentées ci-
dessous.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : la recombinaison spécifique de sites.
A- Représentation schématique de la délétion de région génomique spécifique
par
recombinaison intramoléculaire entre des région dites floxées situées entre
deux sites
LoxP.
3o B- Intégration ciblée d'une séquence étrangère catalysée par une
recombinaison
intermoléculaire entre deux ADN portant chacun un site LoxP.
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Figure 2 : recombinaison méiotique homollogue entre chromosomes paternel et
maternel en un site spécifeque LozP.
Figure 3 : activation du transgène Lo~P-~3ge,~ sans promoteur après
microinjection
de la construction Pgkl-Loge.
A. Le plasmide pGK-LoxP comprend un fragment BamHi-HindIIi, de PGK~igeobpA
(Friedrich and Soriano, 1991) contenant le promoteur du gène Pgkl, inséré
entre Ies
sites BamHI (B) et HindIII (H) de pBSIl2 (Sauer and Henderson, I990). L'ADN
plasmidique a été clivé avec HindIII et PwI (P) avant microinjection, ce qui a
pour
conséquence de supprimer le site LoxP en 5'. La microinjection a été effectuée
selon les
techniques standards (Hagan, 1986) dans les c~eufs fertilisés provenant du
croisement
entre une femelle de type sauvage et un mâle double transgénique portant les
transgënes
Tcp-lObt-cre et LoxP-(3geo.
B, C et D. Les neufs microinjectés ont été maintenus en milieu de culture
pendant 24
heures et ont été colorés avec X-Gal pour détecter l'activité ~3-
galactosidase. B est le
contrôle (pas de rnicroinjection). Aucune a<:tivité ~3-galactosidase endogène
n'est
détectée. C et D sont deux séries d'oeufs dans lesquels on a microinjecté la
construction
décrite en A. L'activité ~i-galactosidase est détectée (coloration et
flèches).
2o Figure 4 : insertion site spécifique de GFP au locus Rxra.
A. Représentation schématique du génome de la souris mâle parente Sycp I -Cre
Itxra°'~~~Ll dans les cellules somatiques et dans les gamètes.
B. Carte du vecteur d'insertion de LoxP-GFP. L~e plasmide a été construit par
insertions
successives à l'intérieur du plasmide pBS112 (pBR322 contenant un site LoxP,
Sauer
and Henderson, 1990) des fragments suivants
- BamHI-Ncoi provenant de pGTl.8 IRES (3;geo (Mountford, 1994) avec une partie
de l'intron En-2 du gène "engrailed" de la Drosophile, un accepteur d'épissage
(Sa),
et un Ires (Internai Ribozomal entry site).
- HindIII-EcoRI provenant de pEGFP (Ctont~ech) contenant la région codante
pour
3o GFP.
- r SacI-Xhoi provenant de pSAj3geo avec le signal de polyadenylation (pA).
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C. Schémas représentant la ~recornbinaison effectuée par Cre conduisant à
Yintégration
dans Rxra°~~~'~ et le locus modifié résultant de; la recombinaison
spécifique de site.
D. Résultats de (amplification PCR de (ADN ;génomique de 13 bébés obtenus à
partir
des neufs microinjectés en utilisant les amorces GFP1 et GFP2, et les amorces
RXRl et
int2 (montre la jonction RXR-int. La présence ou l'absence de Sycpl-Cre est
vérifiée
par southern blot.
Figure 5 : structure et séquence de !a rêgion :>' du gène Sycpl de !a souris
A- Carte schématique de la région 5' de Sycp 1
lo Les exons 1 et 2 sont numérotés, la présence du premier ATG et du site
d'initiation de ia
transcription (+1) sont indiqués. Les limites des fragments utilisés pour la
construction
des différentes lignées transgéniques sont représentées. Les sites de
restriction sont : B
pour BamHI, P pour Pst l, S pour SacII, et A pour ApaI.
B- Comparaison de la séquence de Sycpl de la souris (M) et du rat (R).
Les sites de liaison putatifs pour les facteurs de transcription sont indiqués
(encadrés
dans des rectangles). La séquence transcrite (exc>n 1 ) est soulignée.
Figure 6 : expression des diverses constructions Sycpl/luc dans une lignée
cellulaire somatique
2o Chaque bar représente la moyenne de trois expériences, chacune réalisée
trois fois. Les
bars d'erreur indiquent l'erreur standard à la moyenne. Les valeurs
statistiques ont été
calculées en utilisant le test de Student pour ceti:e figure et les autres.
Tous les résultats
sont relatifs au contrôle interne CMV/lacZ. Le vecteur contrôle (pXP 1 )
contient le gène
rapporteur de la luciférase sans promoteur. L'ac;tivité du plasmide SV40-luc a
été fixé
2s arbitrairement à 100.
Figure 7 : l'expression spéeifïque dans les testicules des gènes rapporteurs
dans les
lignées transgéniques (-722/+102]lacZ, (-260/+102]IacZ, [-260/+i02]luc et[-
54/+102]luc.
3o Chaque bar représente la moyenne de Yactivité; d'au moins cinq mâles
transgéniques
provenant de lots différents. Les bars d'erreur indiquent l'erreur standard à
la moyenne.
Cette activité est normalisée à la quantité de protéines et au bruit de fond
des souris non
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transgéniques appartenant au même lat. Le faible niveau de l'activité lacZ est
due à un
niveau endogène élevé de type (3 galactosida.se dans les cellules
testiculaires. Pour
chacun des chimères, deux lignées ont été étudiées en détail (1 et 2). Te
représente les
testicules, Li le foie, Sp 1a rate, Ki les reins, He :le coeur et Lu les
poumons.
Figure 8 : expression du gène rapporteur luciférase dans les testicules de
souris
transgéniques [-S4/+102] luc et [-260/+102]iu<; lors de leur développement.
Des extraits de foie ont été utilisés comme contrôle négatif. Chaque bar
représente la
to moyenne d'au moins quatre mâles transgéniquea provenant de lots différents.
Les bars
d'erreur indiquent (erreur standard à la moyenne. P8 à P14 sur l'axe des
abscisses
représentent les stades de dëveloppement du huitième jour au quatorzième jour.
Figure 9 : expression du gène rapporteur luc dans la souris transgénique j-
260/+S)
dans différents organes.
L'expression spécifique dans les testicules du g~;ne rapporteur luciférase
dans les souris
transgéniques [-260/+5]luc est représentée. Trois lignées indépendantes ont
été testées
pour l'expression du gène rapporteur. Chaque b2~r représente l'activité
moyenne pour au
moins cinq mâles transgéniques. Les bars d'e:rreurs indiquent l'erreur
standard à la
2o moyenne parmi des expériences.
La légende des divers organes testés est identique à la légende de la figure
7.
Figure IO : expression du gène rapporteur luciférase dans les testicules et le
foie de
souris appartenant à la lignée transgénique [-a60/+5~ au cours du
développement.
Les barres rayée horizontalement représentent fexpressian dans les testicules
et les
barres rayées en diagonale représentent l'expression dans le foie.
P8 jusqu'à P15 représentent les stades de développement du huitième jour au
quinzième
four respectivement.
Les bars d'erreurs indiquent l'erreur standard à la moyenne parmi des
expériences.
Figure 11. : Les transgènes Sycpl/lacZ ne sont pas exprimés pendant la méiose
chez
la femelle.
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Des tests PCR ont été réalisés sur l'ARN provenant des testicules du foie de
l'ovaire
foetal E17 de souris transgéniques [-260/+102]lacZ et sur l'ARN de l'ovaire
foetal E16
de souris transgéniques [-1848/+102)IacZ. L'ARN a été préiraité avec la DnaseI
et a été
soumis ou pas à la digestion par la RnaseA (+ et -) avant la réverse
transcription. Les
transcripts Sycp l sont détectés dans l'ARN des testicules adultes et l'ARN
provenant
des ovaires au stade embryonique du seizième joui- (E16) et du dix-septiëme
jour (E17),
mais dans l'ARN du foie. L'ARNm de IacZ est seulement détecté dans les
testicules
adultes transgéniques.
l0 Figure 12 : Excision des séquences flogées dans la descendance d'un mâle
Sycpl-
Cre/Rxra°~'~~'NL~.
Les séquences Cre identifiées par amplification PCR avec une paire d'amorces
Crel et
Cre2 (Rxra allèle sauvage), Rxra°'~~~'~ (allèle dé;Iétée), et
Rxra°'~~~'~ (allèle cible),
avec RXRI et RXRII et tk-neo, avec tkrieo 1 et tkneo2 (Feil et al. 1996). La
colonne 1
correspond à la souris progénitrice, et les colonnes 2 à 10 représentes des
bébés
appartenant à la même portée.
Figures x3 et 14 : délétion ciblée de gènes fl~ozés multicopies dans des
cellules
germinales.
2o L'ADN a été préparé à partir de diverses tissus provenant de màles double
transgénique
progéniteur et extrait de la queue de leur descendance, digéré avec l'enzyme
de
restriction HindIIi et en utilisant l'ADN plasmidique de pSA(3geo (colonne 1 à
7) ou par
pPGKA(3geobpA (colonne 8 à 13) comme sonde, qui révèle les séquences floxées
et Ies
séquences pBR322 du transgène Cre. Les colonnes 1 à 3 ont été chargées avec
l'ADN
d'un progéniteur double transgénique Sycpl-Crel[igeo floxé (l représente le
foie, 2 les
reins et 3 les testicules). Les colonnes 4 à 6 correspondent à l'ADN extrait
des queues de
trois bébés obtenu avec une souris normale. La colonne 7 correspond à l'ADN
d'une
souris portant le trangène Sycpl-Cre (contrôle). Ia colonne 8 représente l'ADN
et la
colonne 9 l'ADN des testicules d'un progéniteur double transgénique Sucpl/Cre
Pgkl
3o floxé. Les colonnes 10 à 13 correspondent à l'.ADN des queues de quatres
bébés
obtenus. Les fragments de restriction sont indiqués par "c" gui est le
fragment du
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transgène Cre ; "in" qui représente les fragments internes des transgènes
prédits à partir
de leur séquences nucléotidiques (les tailles respectives sont 3,9 et 2,4 kb
pour (igéo et 3
pour Pgkl) ; ",j" correspond aux fragments de jonction avec les séquences
cellulaires
avoisinantes. Le transgène est représenté pair une ligne simple, la séquence
s chromosomique par une double ligne, et les sites L,oxP par un triangle.
Description détaillée.
Le procédé original de la présente invention permet donc de transférer une
1o recombinase dans les oocytes afin d'effectuer rapidement et avec une
efficacité élevée
toutes les opérations de recombinaison spécifique de site dans 1e génome des
mammifères, en particulier .l'insertion d'une séquence étrangère (knock in),
le
remplacement de séquences ou l'inactivation de gènes, et la recombinaison
méiotique
entre chromosomes parentaux (Voir figures 1 et 2). Cette méthode est fondée
sur la
15 surprenante démonstration que la recombinase, exprimée pendant la méiose,
est
transmise en association avec Ia chromatine du spermatozoïde et est donc
capable de
catalyser une recombinaison de site prédéfini dans l'embryon avant Ia première
division.
Il est à noter que le transgène Cre est présent chez Ie père à l'état
hémizygote. Ceci a
pour conséquence que seulement 50% des descendants le reçoivent. En revanche,
tous
2o reçoivent l'enzyme associée à la chromatine du gamète, et la recombinaison
a lieu
efficacement et uniquement dans les embryons au stade i cellule, ce qui assure
la
stabilité ultérieure des sites LoxP recombinés.
De plus, si le transgène est transmis, l'activité du promoteur s' éteint dans
les
cellules somatiques durant toute la vie de l'organisme, du développement
embryonnaire
jusqu'à sa sénescence. Ainsi, les modifications gÉ;nétiques réalisées sont
reproduites au
cours du développement dans toutes les cellules de l'organisme, sans
chimérisme
décelable, lesdites modifications demeurant stables et immédiatement
héréditaires. La
méthode présentée est applicable âux organismes pour lesquels les techniques
de
3o transgenèse ont été jusqu'ici difficiles à développer (absence de lignées
de cellules ES).
Transfert de la recombinase Cre par la chromatine du spermatozoïde.
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Dans le cas du transgène Tcp-10-bt-Cre d'abord, puis dans celui du transgène
Sycpl-Cre, on a montré que des molécules d'enzyme Cre synthétisées pendant la
spermatogenèse restent associées à la chromatine compactée du spermatozoïde.
inactives dans ce contexte, elles peuvent néanmoins effectuer la recombinaison
entre
sites LoxP Lors du retour à une structure nucléaire décampactée. Cette
opération, qui
peut être effectuée sur le sperme dans des conditions expérimentales, a lieu
naturellement après la fécondation dans le pronucleus mâle du zygote.
Io L'activité de la recombinase a été testée dans les e;~cpériences suivantes
Lors d'une première série d'expériences, des aeuf~ fertilisés ont été obtenus
à partir de
femelles de type sauvage croisées avec des mâles hemizygotes pour le transgène
Tcp-
lObt-cre et pour une insertion multicopie de la région codante floxée du gène
~3geo sans
Is promoteur. Une construction avec un site LoxP localisée en 3' du promoteur
Pgkl a été
microïnjectée (figure 3A). selon les techniques standards (Hogan, 1986). Après
24
heures de culture, environ un embryon sur quatre révèle une coloration
positive avec X-
Gal (figure 3B, C, et D). L'expression du gène (3l;eo est due à l'intégration
efficace du
promoteur microinjecté en amont de la région cod<~nte.
Une plus simple configuration génétique telle que. Ia structure
Rxra°'~~L~ a été utilisée
afm de mettre en évidence l'intégration site spécifique de l'ADN microinjecté.
Cette deuxième série d'expériences a démontré la présence d'une activité Cre
latente
2s dans les spermatozoïdes des souris trangéniques Sycpl-Cre, dans lesquelles
l'excision
des séquences floxées a lieu pendant la gamétogenëse laissant seulement un
seul site
LoxP au moment de la fécondation. De surcroît, ces expériences ont permis de
savoir si
la recombinase est toujours active dans le pronucleus mâle et pourrait
permettre
l'intégration d'un transgène flôxé dans un site LoxP prédéterminé. Des mâles
qui
3o possèdent le transgène Sycp-1-Cre et le locus Rxroc°'~F2(LNL) floxé
ont été obtenus
(Figure 4A). Dans le sperme de ces mâles, les séquences tkneo ont été
abondamment
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excisées pour générer l'allèle recombiné Rxra°'~tL~. Cet allèle est
transmis à l'ensemble
de Ia descendance qui ne conserve qu'un seul site LoxP restant. Les souris
double
transgéniques ont été croisées avec des femelles de type sauvage ; les
embryons
fertilisés ont été isolés ; et un ADN recombinant comportant la séquence
codante pour la
s protéine paur la protéine GFP (Green Fluroesce;nt Protein) en amont d'un
accepteur
d'épissage et d'un IRES (Internai Ribosomal :Entry Sequence) (figure 4B) a été
microinjecté. L'analyse PCR de la structure génomnque, présentée à Ia figure
4D, montre
que Ia séquence codante pour GFP a été insérée à :l'intérieur du locus
Rxra°'~2tL~ (figure
4C) pour de nombreux bébés et qu'aucun animal conserve le locus LoxP intact.
Les
lo animaux du type Rxra+/+ sont sous-représentés.
Le locus Rxra-LoxP-GFP-LoxP résultant de la recombinaison est transmis et
retrouvé
dans les tissus somatiques de la descendance des femelles et des mâles Crè .
L'expression de GFP a été mise en évidence par microscopie par fluorescence
dans la
15 peau et les testicules de ces souris. Parmi les multiples applications
offertes par Ie
transfert efficace d'une recombinase par la chromatine du sperme, des souris
rapporteuses, chacune possédant un locus génomique portant une insertion avec
un site
LoxP et une région codante pour une protéine rapporteur (GFP, luciferase, (3-
galactosidase) peuvent être obtenues.
L'introduction d'un transgène en une seule étape de microinjection peut servir
à
identifier un promoteur, ou analyser un promoteur mutant dans un contexte
génomique
connu et dans tous les organes de la souris. De même, il est possible
d'insérer diverses
séquences rapporteurs, des régions codantes mutées, des gènes codants pour des
toxines, et n'importe quelle région codante d'intérêt sous le contrôle d'un
promoteur
donné.
La méthode pour l'insertion ciblée d'une séquence portant un site LoxP
microinjectée
dans l'oeuf fécondé praduit du croisement d'un mâte double transgénique Sycpl-
Cre
3o LoxP est présentée à la figure 4 et est résumée ci-après
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1 ) La constitution par croisement d'une souris double transgénique portant le
transgène Sycpl-Cre et une structure dans laquelle deux sites LoxP
entourent une séquence étrangère (gène tkneo) ;
2) les deux transgènes sont maintenus intacts dans les tissus somatiques de la
souris; la synthèse de Cre dans la lignée germinale résulte en fexcisian de
la séquence floxée (tkneo) dans Ie sperme des mâles ;
3) un mâle est croisé avec une souris d.e type sauvage pour le locus Rxra et
lo Cre; l'enzyme Cre reste associé au site LoxP de l'allèle Rxra muté dans la
chromatine {50% des embryons); indépendamment 50% des embryons
reçoivent le transgène Cre ;
4) la recombinase est libérée après décondensation de la chromatine ;
5) un ADN recombinant LoxP-SA-IRES.-GFP-polyA est microinjecté dans le
pronucleus mâle 15 heures après fécondation par les techniques classiques
(Hogan et aI 1986) ;
6) tous les embryons, Cre+ ou Crs , ayant reçu Ie gène comportant un site
LoxP,
y ont inséré la région codant pour la protéine GFP grâce à l'action de Ia
recombinase;
7) expression : Ie site LoxP avait été inséré dans un intron du gène Rxra. La
présence d'un accepteur d'épissage (SA) permet l'inclusion de la séquence
IRES-GFP dans un messager fonctionnel, celle d'un site IRES (Intemal
Ribosome Entry Site) permet la traduction de TARN dont l'extrémité 3' est
définie par Ie signal de poly-adénylavtion ("polyA") ajouté en aval de Ia
région codante. La fluorescence verl;e caractéristique de l'expression du
34 nouveau rapporteur est mise en évidence dans les organes connus pour
exprimer le récepteur Rxra.
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Dans les expériences menées lors de l'accomplissement de la présente
invention,
l'efficacité de recombinaison a été comprise entre 50 et 84% {recornbinants
rapportés au
nombre de souriceaux nés après microinjection).
Il va de soi que le procédé de la présente invention, notamment illustré ci-
dessus,
n'est aucunement limité à une région particulière pour l'insertion du
transgène, à un
transgène particulier, à un promoteur particulier contrôlant l'expression
d'une
reeombinase spécifique de site, ou encore à une recombinase spécifique de site
lo particulière.
L'étendue des applications rendues possibles grâce aux transfert d'une
recombinase par
la chromatine des spermatozoïdes est notamment illustrée par les diîférents
cas de
figures suivants
Identification d'un promoteur spécifïque d'un tissu.
Une "souris rapporteuse" est réalisée qui porte un transgène comportant les
séquences LoxP-IRES-GFP-polyA intégrées en un site chromosomique, soit par
transgénèse et recombinaison illégitime, soit par recombinaison homologue.
L'inserüon
2o en amont de fragments génomiques clonés dans un vecteur comportant
également un
site LoxP permet, dès la première génération de souris, d'identifier Les
animaux, donc le
fragment qui expriment Ia GFP dans le tissu d'intérêt. Plusieurs "souris
rapporteuses"
peuvent être utilisées en parallèle, avec des gènes. rapporteurs différents
{notamment (3
galactosidase ou Iuciférase), à différentes Localisations chromosomiques. On
peut
également insérer un gène d'intérêt codant pour une protéine d'intérêt exprimé
par
exemple dans le lait de mammifère.
Analyse du patron d'expression d'un promoteur.
3o L'insertion d'un rapporteur en aval d'un promoteur (GFP en aval de Rxra)
permet d'établir avec précision le patron d'expression du promoteur intact
dans sa
localisation génomique naturelle.
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Expression de gènes hétérologues ("knock in").
Selon le patron d'expression après (insertion d'un gène rapporteur, on pourra
5 réaliser l'expression de tout gène biologiquement actif sous le contrôle
transcriptionnel
du promoteur d'intérêt. Par exemple, on peut insérer un gène codant pour une
toxine,
notamment la toxine diphtérique, sous le contrôle d'un promoteur tissu
spécifique; et
provoquer ainsi la destruction de cellules données éventuellement à un stade
donné du
développement.
Analyse de mutants.
L'insertion de cassettes comportant diffén-ents mutants d'une même séquence
permet de comparer leurs propriétés dans un contexte chromosomique constant,
et dans
des conditions physiologiques constantes ou variables.
Le uromoteur Scyp,1 peut-être utilisé dans le ürocédé selon l'invention.
Le gène Sycp 1 est exprimé uniquement pendant la prophase de la première
2o division méiotique dans Ies cellules germinales :mâles et femelles
(Meuwissen et al,
1992 ; Heyting et al. 1989 ; Offenberg et al. 199:1 ; Dietrich et al. 1992 ;
Moens et al.
1992 ; Dobson et al. 1994 et Dietrich et al. 198.3). La séquence nucléotidique
de la
région 5' du gène Sycp 1 de Ia souris a été décrite par Sage et al. 1997
(figure 5A). La
région en amont du gène ne contient pas de TA'.CA box, mais le site de
transcription
comprend (élément initiateur CCA*1GTCC (Sm~ale et al. 1989). Le criblage d'une
librairie génomique avec un fragment Pstl de l'ADNc de rat (692 bp) qui couvre
les
585 bp de l'extrémité 5' de la région codante de Sycpl et un morceau de la
séquence
leader non traduite (Meuwissen et al. 1992 ; Sage et al. 1995), a conduit à
l'identification de cinq clones génomiques, , dont l'un d'entre eux comprend
la région 5'
3o en amont du site d'initiation de la transcription.
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Le fragment BamHl s'étendant le plus loin du côté 5', qui hybride avec la
sonde
ADNc 692 bp, a été sous-cloné et sa séquence nucléotidique a été établie. La
séquence
nucléotidique dans la région analysée, s'étendant des positions -324 à +268
montre une
identité globale de 80 % entre les deux espèces (:figure 5b).
Le haut degré de conservation entre les deux espèces est une indication claire
que cette région contient d'importants éléments régulateurs.
L'analyse transgéniqué et plusieurs séries de délétions à (intérieur du
promoteur
lo Sycpl ont permis de définir deux régions fonctionnelles différentes. Un
enhancer fort
est présent entre les position -260 et -54. Un élÉiment proximal de 59 bp de
long (-54 à
+5), est suffisant pour diriger (expression de l;ènes rapporteurs hétérologues
(lacZ et
Luc) dans les cellules germinales mâles appropriE;es (figure 5).
1s Puisque fenhancer présent dans le promoteur Sycpl est actif dans des
lignées
cellulaires de diverses origines, il est clair que ce promoteur dépend de
l'action de
facteurs de transcription ubiquitaires. Le fragment entre les positions -54 et
+5 est
suffisant pour diriger l'expression de la Luciférase dans les spermatocytes
primaires. Les
comparaisons de séquences entre les quatre grènes méiotiques précoces de la
souris
20 (Sycp 1, Hsp70-2, Pdha-2, et Xmr), n'ont révélé aucune conservation d'un
site de Liaison
pour des facteurs de transcription. Il existe cependant, un haut degré de
similarité (80%)
entre les séquences du promoteur Sycp 1 chez ia souris et Ie rat. Par exemple,
une E-box
et un site potentiel pour des facteurs de transcription du type Myb sont
conservés.
25 Dans les ovaires, où La méiose est initiée lors des phases prëcoces de
développement, aucune expression des gènes rapporteurs n'est observée dans Les
oocytes. Ainsi le promoteur Sycpl est très avantageux comme outil pour diriger
l'expression de la recombinase Cre, car son proi:il d'activité permet la
stabilité génétique
des organismes et de leurs descendances.
3o La recombinaison induite par Cre au site. LoxP a été programmée pour avoir
lieu
pendant la méiose dans les cellules germinales mâles. Le gène Cre, a été
exprimé sous
le contrôle transcriptionnel d'une région du promoteur du gène Sycpl, qui est
active au
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stade leptotène-zygotène de la méiose chez les mâles. Malgré le fait que le
gène est
exprimé chez les gonades mâles et femelles, la région sélectionnée du
promoteur qui a
été utilisée dans la construction Sycpl-Cre a conduit à l'expression du
transgène
exclusivement dans les testicules.
En conséquence, les sites floxés n'ont jamais été altérés dans la descendance
des
femelles. Les séquences floxées ont été maintenues de manière stable dans les
tissus
somatiques (sauf dans les testicules. Aucune expression n'a été détectée lors
des stades
embryonnaires postérieurs à (implantation et dan,. les tissus adultes même en
utilisant Ia
technique très sensible RT-PCR (Meuwissen et al.. 1992).
to La recombinaison induite par Cre dans les testicules représente un procédé
avantageux comparé à celuï décrit lors de précédentes études sur l'activité de
la
recombinase dans d'autres tissus de la souris (Akagi et al. 1997 ; Gu et al. i
994 ;
Wagner et al. 1997). En effet, lorsque l'on teste 1;~ descendance obtenue par
le procédé
de la présente invention, on s'aperçoit que tous les allèles floxés transmis
par les mâles
1s ont subi une recombinaison. Une telle fréquence de recombinaison est
particulièrement
adaptëe pour le système de recombinaison Cre/lox.
La recombinase Cre peut être exprimée au stade précoce de la spermatogénèse.
2e On a isolé le promoteur du gène Sycpl (Synaptonemal Complex Protein I),
actif
exclusivement pendant les premiers stades de la méiose et obtenu l'expression
ciblée
lors des stades zygotène à pachytène de gènes rapporteurs dans des souris
transgéniques. On a utilisé ce promoteur, ainsi que; celui d'un promoteur
méiotique plus
tardif (Tcp-10-bt, Ewunolu et al. 1993) pour faire exprimer l'enzyme CRE au
cours de
25 la spermatogenèse chez des souris transgéniques. Dans le cas de Sycp 1, on
constate
chez les mâles qui portent également un transgène floxé, l'excision de ces
séquences
pendant la spermatogenèse. Cette excision n'a pas lieu chez les mâles porteurs
du
transgène TcplO-bt-Cre. La recombinase est bien synthétisée, mais à une
période où
débutent la restructuration et le compactage de la chromatine; ce qui est très
3o probablement la cause de l'absence de recombinaison avant la formation du
spermatozoïde.
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Recombinaison des sites LoaP pendant ta méiose.
On a montré que (expression à partir du transgène Sycpl-Cre pendant le stade
pachytène de la première division de méiose permet Ia recombinaison entre des
sites
LoxP à des positions non identiques sur les chromosomes d'origine paternelle
et
maternelle, selon le schéma de la figure 2. Les marqueurs moléculaires
disponibles sur
les chromosomes paternels et maternels permettent de montrer un échange entre
chromatides appariées aux sites LoxP. La fréquence de l'événement de
recombinaison
dans la descendance des mâles Sycpl-Cre portant les deux chromosomes floxés
est de
l'ordre de 30%. A partir de cet exemple, toute construction de chromosomes
recombinés
est possible à partir de sites LoxP introduits par les méthodes classiques de
recombinaison homologue dans Ia cellule ES, de sites insérés par transgenèse
et
recombinaison illégitime, ou de sites introduits pair les méthodes d'addition
ciblée.
Activité du promoteur Sycpl dans diverses lignées cellulaires.
On a construit une série d'ADN recombinants avec différentes parties de la
séquence 5' en amont de la région transcrite de Sycp1 (figure 5a) liée soit au
gène
codant pour Ia ~i-galactosidase ou pour Ia iuciférase. On a d'abord effectué
une
2o recherche des Lignées ceiïulaires qui exprime le gène Sycpl afin d'obtenir
une base
expérimentale pour l'identification des éléments génétiques importants pour
l'expression
pendani la méiose.
On a ensuite utilisé une série de lignées cxilulaires d'origine non germinale
pour
mesurer l'expression des gènes rapporteurs après transfection des ADN
recombinants,
dans l'espoir qu'au moins une faible activité pouvait révéler la présence du
promoteur.
De manière inattendue, toutes ces lignées cellulaires ont montré à un haut
niveau
d'activité Iuciférase après transfection des divers ADN recombinants (figure
6). Ces
résultats démontrent que même le plus petit fragment Sycp I s'étendant
seulement
jusqu'au nucléotide -54 permet l'expression de la. luciférase (à un niveau
faible mais
détectable).
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Une activité distincte du promoteur, bien que non apparentée à une activité
spécifique de la méiose, est donc contrôlée par l.es séquences de la région 5'
proche du
gène Sycp I . On peut donc conclure que soit des éléments silencer non compris
dans le
fragment le plus long testé (1950 bp) empêche :l'expression de Sycpl dans les
cellules
somatiques in vivo, soit Ia spécificité germinale; dépend d'un système de
signal perdu
dans les cellules somatiques en culture.
Expression spécifique dans les testicules des sa~uris transgéniques
to Quatre fragments différents du promoteur de Sycp 1 ont été testés pour leur
capacité à diriger l'expression de gène reporteur dans des souris
transgéniques ([-
1848/+102], (-722/+102], [-260/+102] et [-54/+1t72]).
Les trois plus longs fragments du promoteur ont été testés sur la base de
l'expression du gène lacZ. Sachant que le faible niveau d'expression par le
fragment [
1s 54/+102] et que le bruit de fond de l'activité (3-galactosidase dans les
extraits de
testicules est relativement élevé (Shaper et al. 1594) la luciférase a été
utilisée dans ce
cas comme rapporteur. Par comparaison, l'expre;ssion de la luciférase a été
testée en
parallèle pour ie fragment [260/+102]. Les résultats, présentés au tableau 2
ci-dessous,
démontrent que, dans chaque cas, au moins dieux familles expriment le
transgène
20 exclusivement dans les testicules. Ceci a été constaté même pour ia souris
qui porte Ia
plus courte séquence Sycpl [-54/+102].
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Cependant, le niveau d'expression est plu:. faible dans les familles[-
54/+102], ce
qui implique que la séquence s'étendant jusqu'au nucléotide -54 exerce un
effet
enhancer in vivo, comme cela est le cas dans les lignées cellulaires
somatiques
s transfectées.
Cet effet quantitatif a été évalué en comparant les activités enzymatiques
dans
les testicules de souris portant le reporteur luciff;rase contrôlé soit par le
promoteur [-
54l+102], soit par le promoteur [-260/+102] de S~ycpl. Ce dernier a montré de
manière
io constante un niveau d'activité 10 à 100 fois supérieures (figure 7).
Expression lors de la méiose dans les testicules adultes.
L'expression spécifique de la ~i-galactosidase dans les testicules a été
confirmée
15 par coloration X-gal de plusieurs organes. A,îm d'identifier les types
cellulaires
exprimant les transgènes, on a ensuite analysé l'activité (3-galactosidase in
situ dans des
sections de testicules.
Les cellules X-gal positives des animaux [-260/+102]lacZ correspondent à la
2o seconde couche des cellules germinales situées à la périphérie des tubules.
Une sur-
coloration avec l'hématoxyline a confirmé que les cellules lacZ positives font
partie des
spermatocytes au stade ITi-IV à pachytène du cycle de l'épithélium séminifère
(Clermont et al. 1972). Au stade zygotène et pachytène précoce, une plus
faible
expression (3-galactosidase a pu ëtre détectée dans certaines sections. Aucune
coloration
25 des cellules n'a été observée dans Ie compartiment postméiatique des
tubules ni pour les
spermatocytes zygatènes précoces et diplotènes.
L'expression endogène du gène Sycpl est absente ou très faible pendant ces
stades (figure 8). Ces résultats indiquent que les séquences impliquées dans
l'induction
30 ou ia suppression de l'expression de Sycp1 sont localisées parmi les
fragments du
pramoteur analysés.
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Afin de déterminer si la partie du promoteur de Sycpl (+1 à +102) présent dans
ces fragments joue un rôle dans l'établisseme:nt du profil d'expression des
gènes
rapporteurs, deux familles transgéniques supplémentaires ont été générées par
s microinjection d'ADN recombinant délétés de ces fragments, mais conservant
l'initiateur de ia transcription de Sycpl avec les séquences en amont jusqu'au
nucléotide
-260. Les expériences enzymatiques démontrent que la spécificité et le niveau
d'expression du promoteur [-260/+5] sont comparables à ceux du promoteur [-
260/+102] dans les cellules transfectées (figure 6) et dans les animaux
transgéniques
(figures 9 et 10, comparées à la figure S).
Régulation lors du développement chez les souris prépubères.
L'expression des gènes reporteur chez les animaux immatures a été mesurée afin
de démontrer que l'expression d'un transgène E;st identique à celle du gène
Sycp 1
endogène. La première vague de méiose dans les testicules juvéniles est
synchrone avec
l'apparence des premières cellules méiotiques, les spermatocytes leptotènes,
environ 10
jours après ia naissance.
Les premières cellules pachytènes sont apparues au 14è"'e jour et les
premières
cellules haploïdes après trois semaine (Bellvé e,t al. 1977). Nous avons
analysé les
familles transgéniques [-260/+I02]lacZ, [-260/+102]luc, [-260/+S]luc, et [-
54/+102)luc.
L'analyse in situ (figure 8) a permis de détecter l'expression de la ~3-
galactosidase
2s dans les spermatocytes primaires pour la souris [-260/+i02]lacZ au l3eme et
lSe"'e jour
après la naissance, mais pas au 8e"'e jour. Au l0è"'~ jour, l'expression a été
détectée
seulement sur certaines souris, et dans les cas où le résultat est positif,
elle n'a été
observée que dans certains tubules. Ces résultats ont été confirmés par les
mesures
réalisées sur les souris transgéniques [-260/+102]luc. Aucune expression de la
luciférase
3o n'a été détectée avant le 10'"'e jour après la naissance.
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Dans les souris [-54/+102]luc et [-260/+Sjjluc, le profil temporel de
l'activité de
la luciférase est le même, est identique que celui du gène endogène (Sage et
al. 1997).
L'ensemble de ces résultats a permis de conclure qu'un fragment de 59 bp (-
54/+5) du promoteur Sycpl, couvre une séquence initiatrice de 7 bp et un
fragment
immédiatement en amont de 52 bp qui est suffisant pour diriger l'expression
d'un
transgène au début de la première division méiotique dans les gonades mâles.
Aucun des transgènes qui sont exprimés dans les testicules ne sont transcrits
dans
lo (ovaire.
Chez les mammifères, la gamétogénèse femelle a lieu pendant le développement
embryonnaire et est arrêtée avant la naissance au stade dictyotène. Lors de la
prophase
de la première division méiotique, le complexe synaptonérnal est
morphologiquement
is identique que celui des cellules spermatogéniques (Dietrich et al. 1983 ,
Scherthan et al.
1996) ; et est plus visible au stade pachytène (Dietrich et al. 1992). On .
observe ce
phénomène dans l'ovaire foetal pendant les IS~'"e et I7è"'~ jours
embryonnaires (E15 et
E17). Les expériences d'irnmunolocalisation réalisées sur des cryosections
avec un
anticorps dirigë contre la protéine SCP1 du rat (IVieuwissen et al. 1992 ;
Dietrich et al.
20 1992) ont permis de détecter la protéine SCPI (codée par Sycpl) dans les
ovaires de la
souris E16 et E17. On a ensuite analysé l'expression dans les ovaires des
gènes
rapporteurs exprimés par diverses familles transgéniques pendant la méiose
mâle. Ni la
détection in situ de la ~-galactosidase; ni le test à I;a luciférase plus
sensible n'ont permis
de détecter une expression du transgène.
25 Des expériences RT-PCR réalisées avec l'ARN des ovaires E16 de[-
1848/+102]lacZ et des ovaires E17 de [26I/+102]IacZ souris transgéniques n'ont
pas
permis de détecter les transcrits fusionnés entre le premier exon de Sycpl et
la séquence
lacZ; alors que l'expression du gène endogène a été détectée dans les mêmes
échantillons (figure 11).
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Une possible explication de l'absence ~de l'expression est (utilisation d'un
promoteur Sycpl alternatif dans la lignée germinal femelle, comme cela était
montré
pour le cas du gène de l'ADN méthyltransférase (~viertineit et al. 1998).
Pour confirmer cette hypothèse, an a utilisé la technique 5' RACE pour
déterminer le site d'initiatïon de ia transcription de Sycpl dans les cellules
méiotiques
provenant des ovaires E16. Douze clones contenant les plus longs fragments
d'ADNc
parmi 48 clones analysës, ont été séquencés. Ces séquences indiquent
clairement que la
transcription du site d'initiation de la transcription chez les cellules
germinales de la
1o femelle est identique à celle précédemment définie chez les cellules
germinales mâles. Il
apparaît ainsi que les signaux qui assurent i'expression temporelle et
spatiale du gène
Sycpl lors de la méiose mâle ne sont pas sui~'rsants pour son expression chez
la femelle.
Maintenance somatique des séquences fla~xées dans les tissus de mâles
t5 transgéniques Sycp1-Cre/LoxP.
On a établi quatre familles transgéniques indépendantes portant le transgène
Sycpl-Cre. Aucune différence au niveau des propriétés de ces familles ayant
été notée,
on a choisi aléatoirement une famille pour la suite; des études. Les résultats
obtenus ont
20 démontré que le transgène, maintenu de manière stable, n'a été transcrit
que dans les
testicules.
Des lignées doubles transgéniques, qui. maintiennent Sycp1-Cre avec un
transgène floxé ont été obtenues en croisant une souris Sycpl-Cre avec une
souris dont
25 son génome porte un transgène floxé. Les techniques d'intégration d'un
transgène floxé
dans le génome d'un mammifère sont notamment décrites dans Kuhn and Schwenk,
1997, Galli-Taliadoros et al. 1995; et Feil et al. 1996. En l'espèce, deux
sites cibles ont
été créés par microinjection à l'intérieur des neufs fertilisés d'un ADN cloné
: une
répétition en tandem d'une séquence (3geo flanquÉ;e de site LoxP (Friedrich et
Soriano,
30 1991 ) et une insertion en tandem à faible nombre de copies (moins de deux
copies) d'un
promoteur actif (LoxP-Pgkl). Un troisième site cible correspond à l'allèle
Itxrcc°~2~~L~
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(Feil et al. 1996), dans lequel une cassette LoxP-tk-neo-LoxP a été insérée
par
recombinaison homologue dans Ie 8~'"e intron de. Rxra. Chez les mâles portant
des
transgènes LoxP-J3geo et LoxP-Pkgl, l'hybridation "Southern blot" indique une
stabilité
totale de ces loti dans les organes somatiques.
5
Une analyse plus détaillée réalisée sur des animaux Sycpl-
Rxra°'~Zt~'L~ a
montré que une partie des mâles (2 sur 8 testés) maintiennent dans leur ADN
somatique
à la fois des séquences floxées recombinées et intactes: Cette observation est
en accord
avec les résultats des études sur Ie promoteur Sycpl mentionnées ci-dessus.
Ainsi, la
1o structure des transgènes floxés établie à la naissance demeure stable dans
tous les
organes somatiques, même en ce qui concerne les mâles sénescents. Les animaux
chimères ont été écartés et de plus amples études ont été conduites avec les
mâles dans
lesquels le test PCR sensible n'a pas permis de détecter une recombinaison
somatique.
Les séquences floxées modifiées ont été dans chaque cas seulement détectées
dans les
ls testicules et dans fADN du sperme.
Délétion du lochs floxé lors de la transmission yar les mâles Sycpl-Cre/LoxP.
Dans la descendance des croisements entre des animaux doubles transgéniques
2o avec des partenaires non transgéniques, l'excisüon des séquences
intervenantes ont
toujours été observées lorsque le locus floxé a été transmis par les mâles
Sycpl-
Cre/LoxP, alors que les mêmes loti ont été totalement stables lorsqu'ils ont
été transmis
maternellement. Ces résultats sont montrés à la figure 12 pour la descendance
d'une
femelle de type sauvage avec un mâle hétérozygote pour l'allèle floxé
Rxra°'°'~~~~'~ et
25 hémizygote paur ie transgène Sycpl-Cre. L'ampl.ification PCR de l'ADN
extrait de la
queue du père (colonne 1) n'a pas détecté la présence de séquences floxées
(fragment
appelé "tkneo"). Aucun des neufs bébés (colonne;s 2 à IO) ne possède ce
fragment. Ce
résultat correspond en fait à deux situations distinctes
30 - Deux bébés (colonnes 4 èt 10) ont reçu l'all~;le sauvage Rxroc du père
(identifié par
l'amplification caractéristique du produit ("Rxra").
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- Les autres bébés ont hérité de l'allèle Rxra°'''~~LNL~ pour lesquels
les séquences tk-
neo ont été excisées.
L'amplification avec les deux amorces RXI~I et RXR2 ont généré un plus large
fragment caractéristique du locus recombiné ("Rxra°'°'F2~L~.
L'excision a été constatée
indépendamment de la présence (colonnes 2, 6, .B, 9) ou l'absence {colonnes 3,
4, 5, 7,
10) du transgène Sycpl-Cre.
Des résultats similaires ont été obtenus pour le transgène multimérique (3-geo-
LoxP et le
transgène Pgkl-LoxP (figure 13). L'excision dans ce cas est mise en évidence
par Ia
lo disparition des bandes qui correspondent sur les "~Southern Mots" aux
fragments internes
prédits à partir de la séquence du transgène ("in"), alors que ies fragments
des jonctions
avec les séquences endogènes ("j") ont été, dans tous les cas, maintenues.
Chez les
parents mâles, les séquences floxées n'ont pas été modifiées (colonnes 1, 2,
8, figure
i4), à l'exception de l'ADN des testicules (colonnes 3 et 9).
is
Mise en oeuvre du procédé selon l'invention avec le promoteur Tcn-IObt:
Dans le cadre de I'inventian, le promoteur de l'un des gènes du locus t Tcp-
l0bt a également été utilisé pour diriger l'expre;ssion de la recombinase Cre
dans les
2o cellules germinales mâles. L'homme du métier a accès à toutes les
informations
nécessaires dans Ewunolu et al., Development, 1993 117 :89-95 sur la
caractérisation du
promoteur Tcp-lObt dans les souris transgéniques. L'analyse de l'expression de
gènes
rapporteurs (par exemple le gène codant pour la (3-galactosidase) a permis de
conclure
que ce promoteur permet de marquer la population de cellules germinales en
phase
25 tardive de la méiose (Pachytène tardive au stade haploïde).
On a effectué une délétion ciblée de gi~nes floxés par le transgène Tcp-lObt-
Cre. A cet effet, deux lignées indépendantes portant le transgène Tcp-lObt-Cre
ont été
établies. On a d'abord examiné l'activité de l'en:ayme Cre dans trois types
différents de
3o souris transgéniques « floxées ». Quelles que soient les constructions, un
gène sans
promoteur (~-geo), un promoteur non actif dans le testicule (pgk-I) en copies
multiples
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ou la cassette tk-néo en copie unique introduite lpar recombinaison homologue
dans le
locus Rxroc, celles-ci restent complètement intaci:es dans les cellules
germinales mâles
(y compris dans les spermatozoïdes purifiés de l'épidydime).
Par contre, la majorité des descendants obtenus par ces mâles ont excisé le
fragment
s fioxé. L'analyse de la recombinaison dans les speirnatozoïdes purifiés et
les descendants
de ces mâles a montré la présence de l'enzyme Cre inactive dans ces cellules
germinales
par le fait que la recombinase Cre retrouve son activité à la suite de la
décompaction de
noyau du sperme dans l'oeuf fécondé de la souris ou dans un tube à essai par
des
procédés biochimiques.
1o Cette observation du maintien de la protéine Cre associée à la chromatine
compactée du spermatozoïde, de son transfert au zygote, où elle est active
dans le
pronucleus mâle après fécondation, a ouvert la voie pour l'opération de
l'insertion d'une
séquence étrangère en un site LoxP génomique ;par simple microinjection dans
l'oeuf
fécondé. L'opération, relativement simple,, consiste à établir par croisement
un mâle
15 portant deux transgènes. L'un est Tcp-lObt-Cre, le; second est au minimum
un site LoxP
en un locus chromosomique (si le locus contient cieux séquences LoxP, la
région floxée
sera éliminée lors de la décompaction, ramenant an cas d'un site unique).
L'enzyme Cre
ne sera synthétisée que dans le stade tardif de la nnéiose, mais sera présente
dans toutes
les cellules haploïdes, le gène Cre lui-même n'étant hérité que par 50 % des
gamètes.
2o La présence dans le noyau du spermatozoïde, et clone dans le pronucleus de
l'embryon
au stade 1 d'un site LoxP chromosomique et de la recombinase active, permet
l'intégration ciblée d'un ADN exogène portant un site LoxP introduit par
microinjection. L'eWcacité de cette intégration a été mesurée avec deux
combinaisons
différentes d'insert et de locus receveur : intégration d'un promoteur (pgkl)
en amont
25 d'une séquence codante IacZ du promoteur de c-myc en amont des mêmes
séquences.
Dans les deux cas, l'e~cacité d'intégration au site ciblé a été égale ou
supérieure à SO
des naissances.
Exemple 1 : Culture cellulaire et expériences de transfection.
La lignée cellulaire BALB/3T3 (clone A31 American Type Culture Collection
n°CCL-163) et a été transfectées avec 2 p,g du promoteur chimère avec
0,1 p,g d'une
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construction CMV-lacZ Contrôle, en utilisant la méthode de la co-précipitation
au
phosphate de calcium {Sambrook et al. 1989). 2: x 104 cellules ont été
inoculées par
boîte de 35 mm. Les tests enzymatiques ont été ré~~lisés deux jours après la
transfection.
Exemple 2 : Microinjection et analyse des souris transgéniques.
Les souris transgéniques ont été générées par microinjection d'un ADN
plasmidique à l'intérieur des neufs fertilisés selon les techniques couramment
utilisées
par l'homme du métier (Hogan et al. 1986). La, vérification des animaux
trangéniques a
été réalisée par Southern et/ou Analyse dot bloc de l'extrémité de l'ADN
(Sambrook et
aI. 1989). Toutes les familles transgéniques ont été générées et maintenues
dans un
amère-plan génétique C57BL/6xDBAl2 F1.
Exemple 3 : Isolation des clones gënomiques de rats
Les clones génomiques de rats ont étE; isolés par criblage d'une banque
génomique (Sambrook et al. 1989) dans un vecteur lambda DASH {stratagène) avec
une
amorce d'ADNc de rat (Meuwissen et al. 1992).
2o Exempie 4 : Analyse de la séquence
Le séquençage de l'ADN a été réalisé en utilisant le kit Sequenase TI
(Amersham). Le programme informatique FAST,A du Genetic Computer Group a été
utilisé poux les comparaisons de séquences dans des banques de données. Les
numéros
d'accession dans les bases de donnëes Genbanl{ et EMBL pour les séquences du
promoteur chez le rat et la souris sont respectivemE:nt AF020295 et AF020296.
Exemple 5 : Construction plasmidique
Tous les fragments du promoteur Sycpl proviennent d'un clone génomique
contenant l2Kb de séquences en amont du site d'initiation de la transcription
de Sycp l
{figure 5) {Sage et al. 1997). A leur extrémité 3', tous les fragments testés
du promoteur
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(à (exception d'un fragment, voir infra) s'étendent au site SacII qui se situe
dans le
premier exon à la position +102 (Sage et al. 1(95). La coupure du clone
génomique
avec BamHI et SacII a conduit à un fragment d~e 2Kb qui a ensuite été traité
avec le
fragment Klenow de (ADN polymèrase {Biolabs) et inséré au site EcoRV dans le
vecteur pBluscript KS (-) (stratagème). Un fragment EcoRl-Xhol de 1950 pb a
ensuite
été subcloné dans le plasmique pnass[3 (clontech, numéro d'accession U02433)
portant
le gène rapporteur lacZ ([-1848/+102] IacZ pla.smide). ~n d'obtenir des
chimères
comprenant de plus courtes séquences génomiques, des amplifications PCR ont
été
réalisées en utilisant des oligonucléotides internes de 18 bp amorce 5' en
conjonction
lo avec (amorce T3 sur le même fragment BamHI-SacII subscloné dans
pBluescript. Les
fragments PCR ont été clonés dans le vecteur pBluescript KS(-), vérifié par
séquençage
et transféré dans les sites EcoRI-Xhol du plasmi~.de pnass~3. Les mêmes
fragments du
promoteur ont ensuite été transférés devant le gène rapporteur luciférase dans
le
plasmide pXP 1 {Lee et al. 1994} (ces plasmides portent les mêmes noms que
is précédemment avec "luc" à la place de "IacZ". Un plasmide supplémentaire a
été
construit avec les séquences 5' en amont entre les positions -260 et +5. Un
fragment
PCR a été amplifié avec la même amorce 5' utilisée pour le chimère [-260/+102)
lacZ,
l'autre amorce couvre le site d'initiation de transcription de Sycpl {position
+5/-15). Ce
fragment de 275 bp a été subcloné dans pXPl pour former le plasmide [-
260/+5]Iuc.
Exemple 6 : Isolation de 1'ARN et analyse
L'ARN total a été préparé selon la méthode isothïocyanate (Chomezynski et al.
1987). Des échantillons d'ARN du contrôle et de souris Myb'~~A ont été
utilisés (Toscani
et al. 1997}. Des ovaires foetaux provenant d'une fèmelle enceinte ont été
rassemblés, et
afin de s'assurer que les préparations ARN sont comparables, la même quantité
de
testicule et de foie a été utilisée. L'ARN totale a été traitée avec DNaseI
(Boehringer),
puis extrait au phénol et précipité à l'éthanol. 2 p,g d'ARN a été reverse
transcrit et
amplifié en utilisant le kit Titan de Boringer. lin ce qui concerne les
réactions de
contrôle, l'ARN a été prétraité avec la RnaseA. Les séquences des amorces
utilisées
pour détecter les transcrits Sycpl correspondent aux positions I15-135 et 495-
475 dans
l'ADNc {Sage et al. 1995}, conduisant à un produit de 380 pb de long. Les
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oligonucléotides utilisés pour détecter les transcri~pts de fusion entre eux
Sycpl et lacZ
se trouve à la position SO-68 dans fADNc de Sycpl et à position 444-425 dans
le
rapporteur IacZ du plasmide pnass(3. Les conditions des cycles PCR ont été 30
secondes
à 94° C, une minute à SS° C et 30 secondes à 72° C
pendant 32 cycles. Les produits de
5 cette réaction ont été hybridés avec une sonde interne (position 245-26S
dans l'ADNc
Sycpl et 358-378 dans 1e plasmide pnassj3. Les fi~agments d'ADNc Sycpl-lacZ
ont été
subclonés dans pBluescript et séquençés afin de confirmer le correct épissage
de l'intron
SV40.
La détermination de (extrémité S' du gène Sycpl dans les oocytes a été
réalisée en
lo utilisant le kit S' RACE de B~oehringer en suivant la procédure
précédemment décrite
dans Sage et al. 1997.
Exemple 7 : Test de l'activité des gènes ràpportc:urs
I5 L'activité ~i galactosidase a été testée sur des extraits de tissus en
utilisant le
substrat Galacton tel que décrit dans Shaper et al. 1994. La détermination in
situ a été
effectuée en utilisant une procédure alternative à la cryosection, ce qui a
permis une
meilleure conservation de la structure de l'épithélium seminifère. L'albuginea
a été
enlevée et le tissu a été soigneusement étendu avec l'aide de forceps afin de
faciliter la
2o pénétration de X-gal. Une fixation dans 2% de paraformaldéhyde pendant une
heure à
4°C précède une incubation pendant 16 heures à température ambiante
dans 0,2% de X-
gal. Aprés la coloration, les testicules ont été post-iExés pendant 24 heures
dans 10% de
paraformaldéhyde et (inclusion a été réalisée dans la « Leica Historesin » en
suivant les
instructions du fabricant (Leica Instruments). Des sections de 5 p,m
d'épaisseur ont été
25 sur-colorées avec l'hématoxyline Harris. L'activité luciférase a été
mesurée à l'aide du
"Luciferase Asay System" (Promega) selon ies instmctions du fabricant.
Exemple 8 : ImmunolocaIisation de la protéine f~CPl de la souris
3o La cryosection de 8 p.m d'épaisseur de testicules embryonnaires àgées de 15
ou
16 jours {E15 ou E16) ont été incubés avec des anticorps polyclanals dirigés
contre la
protéine du rat comme précédemment décrit dans Meuwissen et al.
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Exemples 9 : Constructions des plasmides et production des souris
transgéniques.
Le plasmide Sycp 1-Cre a été construü; en deux étapes. Un fragment du
promoteur [-722/+102) du gène Sycp 1 s'étendant; de -722 à +I02 relativement
au site
d'initiation de la transcription (Sage et al. 1997, voir supra) a été
transféré dans le
plasmide pBluescript KS {Stratagène) entre les sites EcoRI et Xhol. La
séquence
codante pour la recombinase Cre {Numéro d'acceasion Genebank X03453) et un
signal
de polyadénylation a été ensuite inséré dans le premier plasmide digéré avec
les
1o enzymes de restriction SaII et KpnI. Dans le plasmide p~igeo-LoxP
(Friedrich et Soriano
1991), le gène de fusion ~igeo a été intégré entre deux sites sites LoxP. Ce
plasmide a
été construit en insérant un fragment HindIII-l3amHI correspondant à la
séquence
codante provenant du plasmide p(3geo à l'inté:rieur des sites HindiI-BamHI
d'un
plasmide pBS 112 contenant deux sites LoxP (lFriedrich et Soriano 1991 ). Dans
le
plasmide pPGK-LoxP, le promoteur du géne Pgkl de la souris (Numéro d'accession
Genebank M18735)est inséré entre deux sites LoxP. Ce plasmide a été construit
en
insérant le promoteur de Pgkl à l'intérieur des sites HindIII-BamHI de pBS112.
Exemples 10 : Les souris transgéniques
Les souris transgéniques ont été obtenu~,es par microinjection des chimères
linéarisés par PwI à l'intérieur des neufs fertilisés selon les techniques
bien connues de
l'homme du métier (Hogan et al. 1986). L'ADN a été purifié sur des colonnes
Qiagen en
respectant les instructions du fabriquant puis linéarisé, et suspendu à une
concentration
de 5 ng/~.l dans de l'eau stérile avant microinjection. La vérification des
animaux
transgéniques a été réalisée par Southern et/ou analyse dot blot de l'ADN
extrait de la
queue des souris. Toutes les familles transgéniques ont été générées et
maintenues dans
un arrière fond génétique C57BL/6 x DBA/2 F I . Le mutant
I~croc°~2tLNL~ possède une
cassette LoxP-tk-neo-LoxP, inséré par recombinaison homologue a l'intérieur du
genre
3o intron du gène Rxroc {Feil et al. 1996).
CA 02340594 2001-02-28
WO 00!82742 PCT/FR99102053
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Exempte 11 : Expression des transgènes Cre
Le niveau des ARNm de Cre a été estimé par analyse reverse transcriptase {RT-
PCR). L'isolation de l'ARN à partïr du cerveau d.u foie du rein et des
testicules a été
réalisée en utilisant une extraction par phénol aci~.dique. Les préparations
d'ARN total
ont été traitées par la DNaseI (purifiées de toute; RNase résiduelle) et
l'ADNc a été
synthétisé pendant 30 minutes à 50°C en utilisant 50 UI de la reverse
transcriptase du
virus murin de Maloney de la leucémie (Boehringer Mannheim) en utilisant 1 p,g
d'ARN comme matrice. ll a ensuite été amplifié pendant 35 cycles de PCR en
utilisant
les amorces Crel (5'-TGA TGG ACA TGT TCA (iGG ATC-3') (SEQ ID n°4) et
Cre2
(S'- CAG CCA CCA GCT TGC ATG A-3') (SEQ ID n°S) constituant un fragment
de
fADNc de Cre de 865 pb.
Exemple 12 : Génotypage de la souris
L'extrémité de l'ADN de la souris a été préparée comme décrit dans Hogan et
al.
1986 et analysée par hybridation slot blot en utilisant une série de sonde. La
sonde Cre
peut être obtenue par amplification PCR de tout plasmide qui contient Ia phase
ouverte
de lecture complète pour la protéine Cre en utilisant les amorces Crel et
Cre2. Tous ces
2o fragments ont été purifiés deux fois sur gel d'agarase. Des sondes peuvent
également
être préparés à partir des séquences du transgène « floxé ».
Exemple 13 : Détection de l'excision induite par Cre
2s L'analyse Southern blot a été réalisée selon les techniques bien connues de
l'homme de l'art (Sambrook et ai, 1989). L'ADN a été digéré pendant la nuit
avec ies
enzymes de restriction indiqués supra (dix fois en e~s:cès). Les fragments
d'ADN ont été
ensuite soumis à électrophorèse et transférés sur nitroceIlulose. Les
hybridation ont été
réalisées en utilisant les plasmides pSA~igeo ou pPK:(3geobpa radiomarqués
(Soriano et
3o al, 1991 ). En plus des "transgènes floxés", les séquences du plasmide
pBr322 présentes
dans ces chimères permettent la détection du transgér~e Cre.
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38
L'analyse des souris double transgéniques portant; le vecteur d'expression Cre
et l'allèle
Rxra°~~L~ a été réalisée par amplification PCR. telle que décrite dans
Feil et al. 199b.
En ce qui concerne la détection de l'allèle Rxra°'u~t~L~, les séquences
tlçneo floxées ont
été amplifiées en utilisant les amorces S' et 3', 5'- i ifiT TCT CCG GCC GCT
TGG GT
3' (SEQ ff~ n°6) et 5'- GGA GGC GAT GC(J CTG CGA AT-3' (SEQ ID
n°7),
respectivement. Pour ce qui est de la détection du transgène Cre, les amorces
Crel et
Cre2 ont été utilisées. La visualisation de l'excision du marqueur tkneo floxé
de l'allèle
cible Rxra°~~L~ a été utilisée en utilisant les amorces RXRl (5'- CCA
GGA GCC
TCC TTT CTC CA-3') (SEQ ID n°8} et RXR2 (;5'- CCT GCT CTA CCT GGT
GAC
1o TT-3') (SEQ ID n°9). Ces amorces ont amplifié un fragment de 156 bp
à partir de
l'allèle Rxra de type sauvage et un fragment de a 90 bp à partir de l'allèle
recombiné
Rxra°'~~~. Les produits amplifiés ont été analysé;; par électrophorèse
sur gel d'agarose
à 2%.
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WO 00112742 PCT/FR99/02053
39
RET'ERENCI~S
s - Albanesi, C., Geremia, R., Giorgio, M., Dolci, .5., Sette, C., and Rossi,
P. (1996). A
cell- and developmental stage-specific promoter drives the expression of a
truncated c-
kit protein during mouse spermatid elongation. Development 122, 1291-1302.
Albert H., Date E.C., Lee E. and Ow D.W. (1995). Plant J. 7 : 649-659.
- Akagi K, Sandig V, Vooijs M, Van der Valk M, Giovannini M, Strauss M, Berns
A
(1997): Cre-mediated somatic .site-specific recombination in mice. Nucleic
Acids Res
25:1766-73.
- Bartell, J. G., Davis, T., Kremer, E. J., Dewey, M. J., and Kistler, W. S.
(1996).
Expression of the rat testis-specific hïstone Hlt gene: in transgenic mice.
One kilobase of
S'-flanking sequence mediates correct expression of a lacZ fusion Bene. J Biol
Chem
271, 4046-4054.
2o - Bellvé, A.R., Cavicchia, J.C., Millette, C.F., O'Brie,n, D.A., Bhatnagar,
Y.M., and
Dym, M. (1977). J Cell Biol 74, 68-85.
- Behringer, R. R., Crotty, D. A., Tennyson, V. M., Etrinster, R. L.,
Palmiter, R. D., and
Wolgemuth, D. J. (1993). Sequences 5' of the homeo~box of the Hox-1.4 gene
direct
2s tissue-specific expression of lacZ during mouse deve:(opment. Development
117, 823-
833.
- Brocard J, Warot X, Wendling O, Messaddeq N, Vonesch JL, Chambon P, Metzger
D
(1997): Spatio-temporally controlled site-specific sornatic mutagenesis in the
mouse.
3o Proc Natl Acad Sci USA 94:14559-63.
CA 02340594 2001-02-28
WO 00/12742 PCTIFR99/02053
- Chomczynski P, Saachi N (i987): single-step rruethod ofRNA isolation by acid
guanidium thyocyanate-phenol-chloroform extrai~ion. Anal. Biach. 162:152-159.
Clermont, Y. (1972). Physiol Rev 52, 198-236.
5
- Dietrich, A. J. J., Kok, E., Offenberg, H.H., Heyting, C., de Boer, P., and
Vink, A. C.
G. (1992). Genome 35, 492-497.
- Dietrich, A. J., and Mulder, R. J. (1983). Chromosoma 88, 377-85.
Dix, D.J., Rosario-Herrle, M., Gotoh, H., Mori, C., Gouiding, E.H., Barrett,
C.V., and
Eddy, E.M. (I996). Dev Biol 174, 310-21.
- Dobson, M.J., Pearlman, R.E., Karaiskakis, A., ~>pyropoulos, B.; and Moens,
P.B.
I5 (1994). J CeII Sci 107, 2749-2760.
- Dolle P., Fraulob V., Kastner P. and Charnbon P. ( 1994). DevelopmentaI
expression of
murine retionoid X receptor (RXR) genes. Mech. Dev. 45, 91-104.
- Dupressoir, A:,and Heidmann, T. (1996). Germ lune-specifc expression of
intracisternal A-particle retrotransposons in transgE,nic mite. Mol Cell Bi:ol
16, 4495-
4503.
- Ewuionu, U.K., Snyder, L., Silver, L.M., and Schimenti, J.C. (1996). MoI
Reprod Dev
43, 290-7.
- Feil R, Brocard J, MasCrez B, Lenteur M, Metzg~er D, Chambon P (1996):
Ligand-
activated site-specific recombination in mite. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:10887-
10890.
- Friedrich G, Soriano P (1991}: Promoter traps in e;mbryonic stem tells: a
genetic
sCreen to identify and mutate developmental genes in mite. Genes Dev. 5:1513-
1523.
CA 02340594 2001-02-28
WO 00/12742 PCT/FR99/02053
41
- Furuchi, T., Masuko, K., N shimune, Y., Obinai;a, M., and Matsui, Y. (
1996).
Inhibition of testicular gerrn tell apoptosis and differentiation in mite
misexpressing
Bcl-2 in spermatogonia. Development 122, 1703-1709.
- Galli-Taliadoros L. A., Sedwick J. D., Wood S. A., Korner H. (1995). Gene
Knock-out
technology : a methodical overview for the interested novice. J. Immunol
Methods Apr
12 ; 181(1) : 1-15.
- Goto, M., Masamune, Y., and Nakanishi, Y. (1993). Nucleic Acids Res 21, 209-
14.
- Gowen LC, Johnson BL, Latour AM, Sulik KK, Koller BH (1996): Brcal
deficiency
results in early embryonic lethality characterized by neuroepithelial
abnormalities. Nat
Genet 12:191-194.
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., and Nairn, R. (1977). J Gen Virol
36, 59-74:
- Gu H, Marth JD, Orban PC, Mossmann H, Rajewsky K (1994): Deletion of a DNA
polymerase beta gene segment in T tells using ce:ll type-specific gene
targeting. Science
265:103-6.
- Hergersberg, M., Matsuo, K., Gassmann, M., Schaffner, W., Luscher, B.,
Rulicke, T.,
and Aguzzi, A. (1995). Tissue-specific expression of a FMRI/j3-galactosidase
fusion
gene in transgenic mite. Hum Mol Genet 4, 359-366.
- Heyting, C., Dietrich, A., Moens, P.B., Dettmer:>, R., Offenberg, H.H.,
Redeker, E.J.,
and Vink, A.C. (1989). Genome 31, 81-7.
- Hoess, R.H., and Abremski, K. (1984). Proc Nat:l Acad Sci USA 81, 1026-9.
- Hogan B, Costantini F, Lacy L (1986): "Manipulating the mouse embryo - a
laboratory manual". Cold Spring Harbor, NY. ColLd Spring Harbor Laboratory.
CA 02340594 2001-02-28
WO 00/12742 PCT/FR99/02053
42
- Iannello, R. C., Young, J., Sumarsono, S., Tymms, M.J., Dahl, H. H., Gould,
J.,
Hedger, M., and Kola, I. (1997). Mol Cell Biol 17, 612-9.
- Ikeshima, H., Shimoda, K., Matsuo, K., Hata. J.., Maejima, K., and Takano,
T. (1994).
Spermatocyte-specific transcription by calmodulin gens II promoter in
transgenic mice.
Mol Cell Endocrinol 99, 49-53.
- Kühn R. and Schwenk F. (1997). Advances in gens targeting methods. Curr.
Opin.
l0 Immûnol Apr ; 9(2) : 183-188.
- Kühn R., Schwenk F., Aguet M., Rajewski (199.'ï): Inducible gens targeting
in mice.
Science 269:1427-1429.
I5 - Langford, K. G., Shai, S.-Y., Howard, T. E., Kovac; M. J., Overbeek, P.
A., and
Bernstein, K. E. (1991). Transgenic mice demonstrate a testis-specific
promoter for
angiotensin-converting enzyme. J Biol Chem 26b, 15559-155562.
- Li, Y. C., Hayes, S., and Young, A.P. (1994). Gens 138, 257-8.
McLaren, A., and Southee, D. (1997). Dev Biol 187, 107-13.
Mertineit, C., Yoder, J.A., Taketo, T., Laird, D.W., Trasler, J. M., and
Bestor, T.H.
(I998). Development 125, 889-897.
- Mettus, R. V., Litvin, J., Wali, A., Tascani, A., L;~tham, K., Hatton, K.,
and Reddy,
E.P. (1994). Oncogene 9, 3077-86.
- Meuwissen RLJ, Offenberg HH, Dietrich AJJ, Riesewijk A, van Iersel M,
Heyting C
(I992): A coiled protein specific for synapsed regions of meiotic prophase
chromosomes. EMBO J. 11:5091-5100.
CA 02340594 2001-02-28
w0 00/12742 PCT/RR99/02053
43
- Moens, P.B., Spyropoulos, B., Dobson, M., Karaiskakis, A., and Pearlman,
R.E.
(1992). Dev Genet 13, 435-9.
- Mountford P., Zevnik B., Duwel A., Nichols J., L,i M., Dani C., Robertson
M.,
s Chambers L, and Smith A. (1994). Dicistronic trageting constructs:
reporters.and
modifiers of mammalian Bene expression. Proc. Na~tl. Acad. Sci. USA 91, 4303-
4307.
- Nayemia, K., Nieter, S., Kremling, H., Oberwinkler, H., and Engel, W.
(1994).
Functional and molecular characterization of the tra~nscriptional regulatory
region of the
lo proacrosin gene. J Biol Chem 269, 32181-32186.
- Offenberg, H. H., Dietrich, A. J., and Heyting, C. (1991). Chromosoma I01,,
83-91.
- O'Gorman S, Dagenais NA, Qian M, Marchuk Y (1997): Protamine-Cre recombinase
ls transgenes efficiently recombine target sequences in the mate germ fine of
mice, but not
in embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:14602-14607.
- Peschon, J. J., Behringer, R. R., Brinster, R. L., ancl Palmiter, R. D.
(1987). Spermatid-
specific expression of protamine 1 in transgenic mica. Proc Natl Acad Sci U S
A 84,
20 5316-5319.
- Porter A (1998): Controlling your fosses: conditional gene silencing in
mammals.
Trends Genet. 14:73-79.
25 - Rassoulzadegan, M., Paquis-Flucklinger, V., Bertino, B., Sage, J., Jasin,
M.;
Miyagawa, K., van Heyningen, V., Besmer, P., and Cuzin, F. (1993). Cell 75,
997-1006.
- Robinson, M. O., McCarrey, J. R., and Simon, M. I. ( 1989). TranscritpionaI
regulatory
regions of testis-specifc PGKZ defined in transgenic mice. Progc Natl Acad Sci
U S A
30 86, 8438-844/.
CA 02340594 2001-02-28
WO 00/I2742 PCT/FR99/02053
44
- Sage J, Yuan L, Martin L, Mattei M, Guénet J-L., Liu J-G, Hong C,
Rassoulzadegan
1V>; Cuzin F (1997): The Scpl loci of the mouse genome: successive
retropositions of an
meiotic gene during the recent evolution of the genus. Genomics 44: I 18-I26.
s - Sage, J., Martin, L., Cuzin, F., and Rassoulzadeg;an, M. (1995). Biochim
Biophys Acta
1263, 258-60.
- Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989): "Molecular cloning: a laboratory
manual"
2na Ed.. Cold Spring Harbor, NY. Cold Spring Harbor Laboratory.
~o
- Sauer B, Henderson N (I989): Cre-stimulated recombination at loxP-containing
DNA
sequences placed into the mammalian genome. Nucleic Acids Res 17:147-61.
- Sauer B, Henderson N (1990): targeted insertion of exogenous DNA into the
15 euIcaryotic genome by the Cre recombinase. New Biol 2:441-9.
Scherthan, H., Weich, S., Schwegler, H., Heyting, C., Harle, M., and Cremer,
T.
(1996). J Cell Biol 134, 1109-25.
20 - Shaper, N.L., Harduin, L.A.; and Shaper, J.H. (1954). J Biol Chem 269,
25165-2s171.
- Smale,. S.T., and Baltimore, D. (1989). Cell s7, 103-13
- Soriano P., Friedrich G. and Lawinger P. J. (1991). Virola 65 : 2314-2319.
zs
- Toscani, A., Mettus, R. V., Coupland, R., Simpkins, H., Litvin, J., Orth,
J., Hatton, K.
S., and Reddy, E.P. (I997). Nature 386, 713-7.
- Vidal, F., Sage, J., Cuzin, F., and Rassoulzadegan, IVI. (1998). Mot Reprod
Dev, in
3o press.
CA 02340594 2001-02-28
WO OO/I2742 PCT/FR99/02053
- Wagner KU. Wall RJ, St Onge L, Gruss P, Wynshaw BA, Garrett L, Li M, Furth
PA,
Hennighausen L (1997): Cre-mediated gene deletion in the mammary gland.
Nucleic
Acids Res 25:4323-30.
s - Widlak, W., Markkula, M., Krawczyk, Z., Kana:nen, K., and Huhtaniemi, I.
{I99S).
A 2S2 bp upstream region of the rat spermatocyte-specific hst70 gene is
sufficient to
promote expression of the hst70-CAT hybrid gene; in testis and brain of
transgenic mice.
Biochim Biophys Acta 1264, 191-200.
Io - Yuspa, S.H., Hamley-Nelson, P., Koehler, B., St~anley, J.R. {1980).
Cancer Res. 40,
4694-4703.
- ZabludoiT SD, Wright WW, Harshman K, Wold 1BJ (1996): BRCA1 mRNA is
expressed highly during meiosis and spermiogenesis but not during mitosis of
mate
I5 germ cens. Oncogene 13:649-653.
- Zambrowicz, B. P., and Palmiter, R. D. (1994). Testis-specific and
ubiquitous proteins
bind to functionally important regions of the mouse; protamine-1 promoter.
Biology of
Reproduction S0, 6S-72.
CA 02340594 2001-02-28
WO 00/12742 PCTIFR99/02053
1
L=sxE DE s~QvEN~cEs
( ~: ) INFORM~rxioNS GE ~ ~ s
(i) DEPOSANT:
{A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA
RECHERCHE MEDICALE (INSERM)
(B) RUE: 101, RUE DE TOLBIAC
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75654 CEDEX 13
(ü) TITRE DE L'INVENTION: PROCEDE POUR REMODELER LE GENOME D'UN ANIMAL
PAR TRANSFERT ZYGOTIQUE D'UNE RECOP~IBINASE DE SITE
SPECIFIQUE
(i ü ) NOMBRE DE SEQUENCES: 9
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/NIS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2} INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
{i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 392 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
fC) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
{ü) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
NOM/CLE: -260/+5 souris
{xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CATCCACATG AAACACTCTA TAACACGCAC CAGAACATAA TAAP~TACAGC CTTGAAAAGG 60
RAAGCACTGA GACGCCTTTA AATGGCTATA CACCAACGAG GGGGTTGGGG GGGGGCTTTC 120
CCAGCATCCT CCGACAATTT TGAGCGCAGA CTTGGTAGAG AACC:CGGCAC GTGGAAGGAA 180
ATCTCGCGAG AAGTCGTGCG CGCAGAGATC CCGGCCAGCT GGACCAACCG TTAAATTGAG 240
CCGGTCGCGG CCAGCCTCCC AGTCC 265
CA 02340594 2001-02-28
WU 00i12~42 PCT/FR99/02053
2
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i} CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
{A) LONGUEUR: 392 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
NOM/CLE: -316/+5 rat
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
CATTCACACG AAATACTCAA TAACACAAAC CAGAAAGTAA TAPvATCATTR 60
AFIAAAGAAA
GAAGGAAAGA AA.TGAGACTC CTTTARATGG CTATAAGCCA ATGTGATAGT 120
TGGACGTTAA
GGTTGTGAGC GCCTCAGCTC TTTTGTCTGA GCACCAGCCA GGAAAGCTTT 1$0
CCCAGAGTCC
TCTGACAATT CTGACTGCAG AGTTGGTGGA GAATCAGAAC TCGGCCCCGT 240
GGGAAGGGAA
ATCCCGCGAG AAGTGTGCAC GAGATCCCGG CCAGCTGGAT CAACGGTTAA 300
ATTTAGCCAG
TACAGCCCAG CTGCCCAGTC C 321
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARäCTERISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A} LONGUEUR: 186 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(ix) CARACTERTSTIQUE:
NOM/CLE: -54/+5 souris
CA 02340594 2001-02-28
WO 00/12742 PCT/FR99/02053
3
(xi.) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO~: 3:
GATCCCGGCC AGCTGGACCA ACCGTTAAAT TGAGCCGGTC GCGGCCAGCC TCCCAGTCC 59
(2) INFORMATIONS 80UR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERiSTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
NOM/CLE: amorce Crel
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCÉ: SEQ ID N0: 4:
TGATGGACAT GTTCAGGGAT C 21
(2) INFORMATIONS POi7R LA SEQ ID N0: 5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
NOM/CLE: amorce Cre2
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 5:
CAGCCACCAG CTTGCATGA 19
CA 02340594 2001-02-28
WO 00/12742 PCT/FR99/02053
4
(2) INFORMATIONS POUR I~A SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linëaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
NOM/CLE: amorce 5'
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 6:
GGTTCTCCGG CCGCTTGGGT 20
(2) INFORMATIONS POUR ?,Pr, SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIøUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
NONf/CLE: amorce 3'
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 7:
GGAGGCGATG CGCTGCGAAT 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTTQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
CA 02340594 2001-02-28
WO 00/12742 PCT/FR99/02053
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CCAGGAGCCT CCTTTCTCCA
(ix) CARACTÉRISTIQUE:
NOM/CLE: amorce RXR1
(21 INE'ORMATIONS POUR LA SEQ ïD NO~ 9~
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATTON: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(ix) CARP,CTERISTIQUE:
NOM/CLE: amorce RXR2
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ Ib NO: 9:
CCTGCTCTAC CTGGTGACTT
