Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-PROTEINE OZF ET LEURS APPLICATIONS
DANS LE DOMAINE DIAGNOSTIC ET THERAPEUTIQUE.
La présente invention concerne un anticorps monoclonal spécifique de la
s protéine OZF ainsi qu'une composition pharmaceutique comprenant ledit
anticorps
destinée à la prévention, le traitement ou le diagnostic de pathologie liée à
(expression
anormale de protéine OZF telle que le cancer. L'invention comprend en outre
des
méthodes de détection de la protéine OZF ainsi que des méthodes de sélection
de
composés capables d'interagir avec la protéine OZF.
lo La plupart des protéines à motifs doigt à zinc sont caractérisées par leur
capacité à se fixer sur des ARN ou des ADN. Ce motif doigt à zinc a été
retrouvé dans
des gènes contrôlant le développement, des gènes de facteur de transcription
ou des
gènes liés à la formation de tumeurs, attestant ainsi l'importance de cette
structure
doigt à zinc dans la régulation de l'expression des gènes.
15 Parmi les gènes codant pour oes protéines à motifs doigt à zinc, un gène
codant pour une protéine constituée uniquement de motifs doigt à zinc, dénommé
gène
OZF (OZF pour « Only Zinc Fingers ») a été isolé (Le Chalony et al., 1994) et
fADNc
correspondant a été cloné et séquencé. La séquence d'acides aminés de la
protéine
putative codée par le gène OZF comporte 292 résidus d'acides aminés, dont 10
motifs
2o doigt à zinc de 28 résidus d'acides aminés, pour un poids moléculaire
estimé de
33 kDa. L'analyse comparative de ta protéine OZF a montré que le domaine
contenant
la structure doigt à zinc comporte de grandes homologies avec d'autres
protéines à
motifs doigt à zinc.
D'autre part, Ferbus et al. (Ferbus et al., 1996) ont pu mettre en évidence
25 certaines caractéristiques de ta protéine OZF à partir d'une protéine
recombinante OZF
produite chez E. soli. En particulier, ces auteurs ont montré que la protéine
OZF
recombinante était capable de fixer des ions de zinc, de (ADN et de fhéparine.
En
outre, ces auteurs ont également pu montrer, en utilisant un anticorps
poiydonal
obtenu à partir d'une protéine recombinante OZF fusionnée avec une protéine
fixant le
30 maltose (MBP) que la protéine OZF était exprimée dans des cellules
mammaires
humaines de type épithélial, préférentiellement dans le noyau, alors qu'elle
était très
faiblement exprimée dans les cellules myoépithéliales et stromatiques de ce
tissu
mammaire. Ces auteurs ont également pu mettre en évidence que la protéine OZF
était exprimée dans une lignée cellulaire tumorale établie à partir d'une
tumeur de
3s pancréas.
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Les inventeurs ont mis en évidence de maniëre surprenante, en utilisant des
anticorps polyclonaux anti-protéine OZF, que la protéine OZF était surexprimée
dans
des tumeurs primaires qui présentaient une amplification du gène OZF mais
aussi
dans des tumeurs primaires qui ne présentaient pas d'amplification du gène.
D'autre part, les inventeurs ont également mis en évidence que la
surexpression de la protéine OZF dans ces tumeurs primaires était restreinte
aux
cellules tumorales.
Ces résultats montrent ainsi que la protéine OZF apparaît comme un marqueur
de cellules tumorales.
lo L'obtention d'anticorps capables de reconnaître de manière spécifique la
protéine OZF permettrait ainsi de détecter des cellules tumorales
caractérisées par une
expression anormale de protéine OZF.
Des anticorps polyclonaux anti-protéine OZF ont déjà été décrits (Ferbus et
al.,
1996). Ces anticorps ont été préparés par immunisation de tapins contre une
protéine
recombinante obtenue par fusion de la protéine OZF et de la protéine MBP, puis
purifiés sur immunoabsorbant constitué de la protéine recombinante fusionnée
OZF-
MBP couplée sur colonne de sépharose 4B. Ces anticorps polytonaux peuvent
ainsi
reconnaitre plusieurs épitoges de la protéine OZF et en particulier certains
épitoges
communs aux protéines humaines ou de mammifères à motifs de doigt à zinc,
compte
2o tenu de la grande homologie de séquence constatée entre la protéine OZF et
d'autres
protéines à motifs doigt à zinc.
Les inventeurs ont pu ainsi mettre en évidence des réactions non spécifiques
obtenues avec certaines protéines à motifs de doigt à zinc pour ces anticorps
polyclonaux.
Si ces anticorps polyclonaux peuvent s'avérer de spécificité suffisante pour
des
applications particulières telles que la détection de protéine OZF dans des
cellules ou
des tissus homogènes isolés, leur spécificité et éventuellement leur affinité
pourraient
s'avérer insuffisantes comme le reconnaissent d'ailleurs les auteurs de la
publication
décrivant ces anticorps polyclonaux. Ces auteurs précisent en effet dans leur
3o conclusion qu'il serait nécessaire de disposer d'anticorps anti-OZF
permettant
d'identifier avec précision les types de cellules exprimant la protéine OZF.
L'obtention
de tels anticorps, dirigés contre un épitoge spécifique de la protéine OZF
humaine,
permettrait sans aucun doute non seulement d'identifier les types de cellules
exprimant
normalement ou anormalement la protéine OZF mais également de rechercher ies
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séquences nucléiques cibles de la protéine OZF, notamment nuGéaires, et
d'identif'~er
les gènes susceptibles d'être régulés par la protéine OZF.
Ainsi, il existe aujourd'hui un besoin de disposer d'un anticorps monoclonal
dirigé spécifiquement contre la protéine OZF humaine. Un tel anticorps
pourrait non
seulement être utile pour étudier et ainsi mieux connaître le rôle joué par la
protéine
OZF dans la régulation des gènes mais également serait utile au regard des
résultats
présentés par les inventeurs dans la présente invention, pour d'autres
applications
comme les applications thérapeutiques, diagnostics, notamment in vivo ou in
vitro à
partir d'échantillon biologique hétérogène, ou pour le ciblage de composés
capables de
1o moduler l'activité biologique de la protéine OZF.
La présente invention est basée sur la découverte de la possibilité d'obtenir
par
une approche particulière de préparation un anticorps monoclonal caractérisé
par une
spécificité jamais encore obtenue antérieurement. II a ainsi été découvert
qu'en
immunisant une souris avec une protéine OZF recombinante, il est possible
d'obtenir
un anticorps reconnaissant un épitoge spécifique de la protéine OZF et qui ne
reconnaît pas d'autres protéines à motifs doigt à zinc de mammifères.
Ainsi, ta présente invention a pour objet un anticorps monoGonal ou ùn de ses
fragments capables de se fixer spécifiquement sur un épitoge de la protéine
OZF, de
préférence humaine.
2o On entend désigner par épitoge dans la présente description, tout
déterminant
de !a protéine responsable de l'interaction spécifique avec l'anticorps. Les
déterminants épitopiques consistent habituellement en des groupes de molécules
présentant des surfaces chimiquement actives telles que des acides aminés ou
des
chaïnes latérales de sucres et ayant une stucture tridimentionnelle spécifique
et/ou une
charge spéc~que caractéristique.
Les fragments d'anticorps monoclonal selon l'invention comprennent tout
fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur l'épitoge de la
protéine
OZF sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal dont ledit fragment est issu.
Des
exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux
simple
3o chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents
tels que
F(ab')2, qui possèdent 1a même spécificité de fixation que (anticorps
monoclonal dont
ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également ëtre un
fragment Fv
simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles
que
décrites par exemple par Skerra et al., 1988 et King et al., 1991.
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Selon la présente invention, des fragments d'anticorps monoclonaux de
l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux tels que
décrits
précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme
la
pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction
chimique.
s D'une autre manière les fragments d'anticorps monoclonaux compris dans la
présente
invention peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de
peptides tels
que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être
préparés
manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles
que
décrites par exemple par Geysen et al., 1978.
1o En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments,
on
pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans !e
manuel
« Antibodies » (Harlow et al., 1988) ou à la technique de préparation à partir
d'hybridomes décrite par Kohler et Mllstein en 1975.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être obtenus par exemple
15 à partir de cellule d'un animal immunisé contre la protéine OZF, ou un de
ses
fragments, comportant fépitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps
monoclonaux selon !'invention. Ladite protéine OZF, ou un de sesdits
fragments,
pourra notamment être produite, selon les modes opératoires usuels, par
recombinaison génétique à partir d'une séquence d'acide nucléique contenue
dans la
2o séquence de l'ADNc codant pour la protéine OZF ou par synthèse peptidique à
partir
d'une séquence d'acides aminés comprise dans la séquence peptidique de la
protéine
OZF.
Les anticorps monoGonaux selon (invention pourront par exemple être purifiés
sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisée la
protéine OZF
25 ou un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par
lesdits
anticorps monoclonaux selon l'invention.
De préférence, l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon la présente
invention se fixe sur l'épitope linéaire ou conformationnel du domaine N-
terminal de !a
protéine OZF humaine dont la séquence présente un faible taux d'homologie
3o comparée avec les séquences d'autres protéines à motifs doigt à zinc.
De manière plus préférée, (anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon
l'invention se fixe sur un épitope situé sur les quinze premiers acides
aminés, du
domaine N-terminal de la protéine OZF telle que décrite par Le Chalony et al.,
1994,
aux figures 1 B et 1 C page 400.
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Ainsi, l'invention concerne un anticorps monoclonal ou un de ses fragments
selon (invention, caractérisé en ce que fépitope de la protéine OZF est située
sur la
partie N-terminale.
De manière préférée, l'invention concerne un anticorps monoclonal ou un de
5 ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce que fépitope de la
protéine OZF est
situé sur la partie N-terminale comprenant le résidu tyrosine situé en
position 10 de la
séquence de la protéine OZF humaine telle que décrite par Le Chalony et al.,
1994, à
la figure 1 B page 400, de préférence ledit épitope est porté par le fragment
de
séquence aa7-aa17 de ladite séquence OZF humaine.
lo De manière également préférée, l'invention concerne un anticorps monoclonal
ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est capable
de
reconnaître en outre la protéine OZF humaine dont la séquence présente un
polymorphisme lysinelarginine en position 8 de la séquence de la protéine OZF
humaine telle que décrite par Le Chalony et al., 1994, à la figure 1 B page
400.
Parmi les anticorps monoGonaux selon l'invention, on préfère notamment
l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments caractérisé en ce qu'il est
produit par
une cellule telle que déposée au Centre National de Culture de Microorganisme
(CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 6 Septembre 1999 sous le numéro I-
2308.
L'hybridome tel que déposé â la CNCM le 6 Septembre 1999 sous le numéro I-
2308, fait également partie de la présente invention.
L'invention comprend en outre un anticorps monoGonal ou un de ses fragments
selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les anticorps
humanisés,
chimériques ou anti-idiotypes.
Les anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention ou leurs fragments
peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (Carter
et al.,
1992 ; Singer et al., 1992 et Mountain et al., 1992). De tels anticorps
monoclonaux
humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des
méthodes de
diagnostic in vivo et thérapeutiques.
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments de type chimérique selon
l'invention peuvent être réalisés en utilisant les techniques de recombinaison
génétique. Par exemple, l'anticorps monoclonal chimérique pourra être réalisé
en
clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour
la
région variable d'un anticorps monoclonal selon l'invention et une séquence
codant
pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de
l'invention
codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la
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spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée
de l'ADN
marin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain
(Verhoeyn et al., 1988).
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon la présente invention
incluent également des anticorps anti-idiotypes produits par des méthodes
connues de
l'homme de l'art {Cozenza, et al., 1976 et Harlow et al., 1988).
Sont également compris dans l'invention, les anticorps monoclonaux ou leurs
fragments selon la présente invention obtenus par recombinaison génétique ou
par
synthèse chimique.
lo L'invention comprend également un anticorps monoclonal ou un de ses
fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est marqué.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent
également, selon l'invention, se présenter sous forme d'anticorps marqués afin
d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Les anticorps monoclonaux marqués selon l'invention ou leurs fragments
incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être
conjugués
par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase
alkaline, la (3-
D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase
carbonique,
l'acétyl-cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6
2o phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la
digoxigénine ou
la 5-bromo-désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également
conjugués aux anticorps monoclonaux ou leurs fragments de l'invention et
incluent
notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses
dérivés, la GFP (GFP pour « Green Fluorescent Protein »), le dansyl,
I'umbelliférone
etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps monoclonaux de l'invention ou
leurs
fragments peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art.
Ils
peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou
par
l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un
polyaldéhyde,
comme le glutaraldéhydeque, l'acide éthylénediaminetétraacétique (EDTA),
l'acide
3o diéthylénetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage
tels
que le périodate etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type
fluoréscéine
peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.
D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs
chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs
bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine.
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Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur l'anticorps monoclonal ou un de ses
fragments selon l'invention, on préfère également les marqueurs radioactifs
tels que
'4C, ICI, 5'Co, ~Co, 5'Cr,'SZEu, S9Fe, 3H, 'zsl, '3~1, 3zP, ~sS, 'SSE et ~"'Tc
qui peuvent
être détectés par des moyens connus tels que le compteur gamma ou à
scintillations,
s par autoradiographie, etc..
La présente invention comprend également les anticorps monoclonaux
marqués ou leurs fragments selon l'invention dans lesquels le conjugué peut
être un
marqueur détectable choisi parmi les marqueurs pouvant être utilisés dans
l'application
imagerie in vivo. Des exemples de tels marqueurs selon l'invention sont 'zAs,
6'Cu,
l0 6'Ga, ~Ga, ~r31~ ~a.~l~ ts~l~ »yn~ a~Ru~ ss""Tc, zo~Tl et ~Zr.
Le terme u imagerie in vivo » doit être entendu dans la présente description
comme toute méthode permettant la détection d'un anticorps monoclonal marqué
selon
la présente invention ou un de ses fragments qui se fixe spécifiquement sur
l'épitope
de la protéine OZF dans le corps du patient. Le patient sera de préférence un
homme
15 susceptible de présenter des cellules tumorales exprimant de manière
anormale la
protéine OZF.
La présente invention comprend également les anticorps monoGonaux
marqués ou leurs fragments selon l'invention dans lesquels le conjugué peut
être un
marqueur choisi parmi les marqueurs paramagnétiques pouvant être utilisés dans
2o l'application imagerie in vivo. De tels marqueurs selon l'invention sont
par exemple les
isotopes paramagnétiques particulièrement utilisés dans l'imagerie par
résonance
magnétique (IRM) et qui incluent notamment SzCr, '6zDy, ~Fe,'S'Gd et ~Mn.
Tel que mentionné précédemment, pour la préparation de conjugués
d'anticorps monoclonaux, le marqueur isotopique ou paramagnétique pourra être
fixé
25 sur l'anticorps selon l'invention ou un de ses fragments soit directement
ou soit
indirectement en utilisant un groupe fonctionnel intermédiaire. Selon
l'invention,
l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments peut être marqué par toute
technique
connue de l'homme de l'art telle que par exemple celles décrites par Wagner et
al.,
1979 et Saha et al., 1976. Les conjugués monoclonaux radiomarqués selon la
3o présente invention peuvent par exemple être iodinés par contact avec du
iodure de
sodium ou de potassium et d'un agent chimique oxydant tel que l'hypochlorite
de
sodium ou un agent oxydant enzymatique tel que la lactopéroxydase.
Le type de détection de l'instrument utilisé sera un facteur majeur dans la
sélection du marqueur. Par exemple, les isotopes radioactifs ou
paramagnétiques
35 seront choisis, en particulier pour l'imagerie in vivo, en fonction du type
d'instrument
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utilisé qui guidera la sélection de ces marqueurs. De préférence, les
marqueurs
radioactifs choisis devront avoir une période qui est détectable par le type
d'instrument
choisi. Ces anticorps monoclonaux pourront ainsi ëtre utilisés par exemple
comme
agent d'imagerie, in vivo ou ex vivo sur des prélèvements biologiques dans
toute
s méthode conventionnelle permettant de visualiser par image un diagnostic de
pathologie lié à l'expression anormale de la protéine OZF. Ces agents
d'imagerie ou
les réactifs pour diagnostic in vitro caractérisés en ce qu'ils comprennent un
anticorps
monoclonal marqué selon l'invention ainsi que leurs utilisations dans des
méthodes de
diagnostic in vitro ou de diagnostic par imagerie in vivo pour le diagnostic
de pathologie
lo liée à l'expression anormale de la protéine OZF font bien entendu partie de
la présente
invention.
L'invention comprend également un anticorps monoclonal ou un de ses
fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est couplé à un composé
cytotoxique.
1s Les agents cytotoxiques qui peuvent ètre conjugués aux anticorps
monoclonaux selon l'invention incluent notamment, mais sans s'y limiter, des
composés alkylants tels que la méchloréthamine, la méthylène phosphoramide, la
triaziquone, la camustine, la sémustine, le méthotrexate, la mercaptopurine,
la
cytarabine, le fluorouracile, des antibiotiques tels que l'actinomycine, des
hormones ou
2o des antagonistes d'hormones tels que les corticostéroïdes, comme la
prednisone ou
les progestines. Les conjugués anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent
être
préparés en conjuguant des substances cytotoxiques contenant soit la toxine
intacte
ou soit leur chaîne A dérivée avec l'anticorps monoclonal ou un de ses
fragments selon
des techniques de l'homme de l'art (Chaudry et al., 1993 ; Sung et al., 1993
et
2s Selvaggi et al., 1993).
L'anticorps monoclonal selon l'invention peut également étre un anticorps
monoctonal hétéroconjugué tel qu'une molécule hybride composée de deux ou
plusieurs anticorps. Un hétéroconjugué inclut par exemple un anticorps
monoclonal
simple chaîne selon l'invention et un anticorps monoclonal simple chaîne qui
est
3o spécifique d'un récepteur cellulaire (Kerr et al., 1990 et Hsieh-Ma et al.,
1992).
Sous un autn: aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique
pour ie traitement, la prévention ou pour le diagnostic in vivo de pathologie
liée à
l'expression anormale de la protéine OZF, caractérisée en ce qu'elle comprend
a) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments, selon l'invention ; et
35 b) un excipient pharmaceutiquement acceptable.
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De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention, est
caractérisée en ce que ladite pathologie est choisie parmi les cancers,
notamment le
cancer du pancréas, du côlon ou du sein.
L'invention a également pour objet futilisaüon d'un anticorps monoGonal ou un
de ses fragments selon (invention pour la fabrication d'un médicament destiné
à la
prévention ou au traitement du cancer, notamment le cancer du pancréas, le
cancer du
côlon ou le cancer du sein.
En général, la dose d'anticorps monoclonaux marqués ou un de leurs
fragments pour le diagnostic in vivo de pathologie liée à (expression anormale
de ia
lo protéine OZF, pourra varier en fonction de paramètres tels que l'âge, les
conditions, le
sexe, de l'étendue de fa maladie du patient, de contre-indications s'il en
existe, de
thérapies concomittantes ou d'autres variables qu'un homme de l'art saura
ajuster.
L'administration de ces composés au patient peut ëtre locale ou systémique et
accomplie par voie intraveineuse, infra-artérielle, par !'intermédiaire du
liquide spinal,
etc.. L'administration peut ëtre également effectuée par voie intradermique ou
par voie
intracavitaire, orale ou nasale, en fonction de la partie du corps qui doit
ëtre examinée.
Après un temps suffisant permettant à l'anticorps monoclonal de se fixer sur
la protéine
OZF, par exemple de 30 minutes à 48 heures, on examine la partie du corps qui
doit
ëtre examinée par les techniques d'imagerie classiques telles que fIRM, ou
l'imagerie
2o par scintillation. Le protocole exact dépendra nécessairement de facteurs
spécifiques
liés au patient, de la partie du corps à examiner, de la méthode
d'administration et du
type des marqueurs utilisés. Les procédures spécifiques pourront être
déterminées par
l'homme de l'art. La distribution des isotopes radioactifs fixés et leur
décroissance avec
le temps sera ensuite enregistrée et contrôlée. En comparant les résultats
obtenus
avec ceux obtenus pour des individus cliniquement normaux, la présence et la
localisation de cellules tumorales pourront être déterminées et contrôlées.
La quantité d'anticorps monoclonaux comprise dans les compositions
pharmaceutiques selon la présente invention et nécessaire pour une thérapie
efficace
dépendra de différents facteurs tels que le mode d'administration, la partie
du corps
3o ciblée, l'état physiologique du patient, de l'administration d'autres
médicaments, des
éventuels effets secondaires, etc.. Le dosage pour de telles préventions ou
traitements
thérapeutiques devra être réalisé de manière à optimiser sa sécurité et son
efficacité.
En général, les dosages utilisés in vitro peuvent fournir une indication pour
les
quantités utilisées pour l'administration d'anticorps monoclonaux in situ et
ainsi des
3s modèles animaux peuvent être utilisés pour déterminer les quantités
efficaces
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d'anticorps monoclonaux selon l'invention pour le traitement de pathologie
particulière.
Ces méthodes sont en particulier discutées dans les ouvrages tels que Gilman
et al.
(1990) et Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) pour des méthodes
d'administration telles que les méthodes par voie orale, intraveineuse,
intrapéritonale,
5 intramusculaire ou transdermique. Les excipients pharmaceutiquement
acceptables
incluent notamment l'eau, les solutions saunes, les tampons ou tout autre
composé
décrit par exemple dans l'Index de Merck.
L'invention comprend en outre l'utilisation d'un anticorps monoclonal ou un de
ses fragments pour le traitement, la prévention ou pour le diagnostic in vifro
ou in vivo
lo de pathologie liée à l'expression anormale de la protéine OZF, notamment
pour le
traitement, la prévention ou le diagnostic de cancer comme le cancer du
pancréas, du
côlon ou du sein, ladite utilisation étant comprise dans l'invention.
L'invention concerne également une méthode de détection et/ou de dosage de
la protéine OZF dans un échantillon biologique caractérisée en ce qu'elle
comprend les
1s étapes suivantes
a) la mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps monoclonal
selon
l'invention ; et
b) la détection et/ou le dosage de la fixation dudit anticorps sur la protéine
OZF
contenue dans (échantillon biologique.
2o Par ailleurs, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon
l'invention,
peuvent également être utilisés pour l'identification, ia localisation,
notamment
tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage de la protéine OZF, ladite
utilisation étant
comprise dans l'invention.
Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon l'invention constituent
25 également un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique de
l'expression de la protéine OZF sur des coupes de tissus spécifiques, par
exemple par
immunofluorescence, par marquage enzymatique, radioactif ou à l'or. Ils
permettent
notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique
normale ou
anormale de la protéine OZF dans les tissus ou prélèvements biologiques, ce
qui les
3o rend utiles pour (identification et la localisation de l'expression de la
protéine OZF,
pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de la protéine
OZF
mais également pour le suivi de l'évolution de méthodes de prévention ou de
traitement de pathologie nécessitant ladite détection ou ledit dosage.
Plus généralement, les anticorps monoclonaux ou leurs fragments selon
35 l'invention peuvent ëtre avantageusement mis en oeuvre dans toute situation
où
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l'expression de la protéine OZF doit être observée de manière qualitative
et/ou
quantitative.
De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide
biologique, tel
que le sérum, le sang total, des cellules, un échantillon de tissu ou des
biopsies
d'origine humaine.
Toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une
telle détection et/ou dosage. Ledit test peut être un test par compétition ou
par
sandwich, ou tout test connu de l'homme de l'art dépendant de la formation
d'un
complexe immun anticorps-antigène. Suivant les applications selon l'invention,
l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments peut être immobilisé ou marqué.
Cette
immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme
de
l'art. Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le
polypropylène, ie polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses
naturelles ou
modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles.
A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus
immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radio-
immunologique (RIA) ou équivalent.
L'invention comprend également une trousse pour la détermina~on de la
présence de protéine OZF dans un échantillon biologique comprenant un
anticorps ou
2o un de ses fragments selon l'invention.
Entre également dans le cadre de l'invention, une trousse pour la détection
et/ou le dosage de la protéine OZF selon l'invention dans un échantillon
biologique,
caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants
a) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention ;
b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la
réaction
immunologique ;
c) les réacüfs permettant la détection des complexes antigène-anticorps
produits par
la réaction immunologique.
Sous un dernier aspect, l'invention a pour objet une méthode pour évaluer
l'affinité d'un composé à tester pour la protéine OZF, caractérisée en ce
qu'elle
comprend
a) la mise en contact d'un échantillon contenant ladite protéine OZF avec
i) un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention ; et
ü) ledit composé à tester ; et
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b) la mesure de la quantité dudit anticorps monoGonal ou l'un de ses
fragments,
ladite quantité étant inversement proportionnelle à la quantité de composés à
tester fixés sur ladite protéine OZF.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent être
utilisés également dans des méthodes in vitro pour la sélection de composés
susceptibles de se fixer à la protéine OZF avec l'affinité recherchée. Ainsi,
la présente
invention comprend également des méthodes de sélection par compétition de
composés pharmaceutiques dans lesquelles les anticorps monoclonaux de
l'invention
ou leurs fragments entrent en compétition avec le composé à tester susceptible
de se
1o fixer à la protéine OZF. De cette manière, (anticorps monoclonal ou ses
fragments est
utilisé pour détecter la présence de tout composé tel qu'un polypeptide ou
tout autre
composé organique qui peuvent présenter un ou plusieurs sites de
reconnaissance de
fépitope de la protéine OZF reconnu par les anticorps selon l'invention. Ainsi
ces
composés, identifiés par la méthode selon l'invention pourront être utilisés
pour
occuper ces sites de fixation sur la protéine OZF et agir en tant qu'agent
modulateur ou
antagoniste de l'activité biologique de la protéine OZF.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la
suite
de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont
représentées
ci-après.
LEGENDES DES FIGURES
FIGURES 1A et 1B. Analyse par Southem blot de lignées cellulaires
pancréatiques et
de tumeurs primaires.
Figure 1A : Hybridation par Southem blot des ADN totaux génomiques de placenta
et
de douze lignées cellulaires d'adénocarcinomes pancréatiques digérés par
Bglll. Trois
lignées cellulaires, AtCPC-1, BxPC-3, Su.86.86 présentent une co-amplification
d'OZF
avec RAC. PANG1 présente une amplification de RAC uniquement.
Figure 1 B : Hybridation par Southem blot de i'ADN total génomique de AICPC-1
(figure
1A), de placenta (P) et de douze tumeurs primaires d'adénocarcinomes
pancréatiques
3o digérées par Bglll. La comparaison des intensités des signaux d'hybridation
d'OZF
avec ceux obtenus après réhybridation avec une sonde N-myc montre une
augmentation du nombre de copies du gène dans les échantillons tumoraux T6 et
T9.
FIGURE 2. Expression de fARNm d'OZF dans les lignées cellulaires
pancréatiques.
L'ARN, des douze lignées cellulaires d'adénocarcinomes pancréatiques analysées
par
Southem blot dans les figures 1A et 1 B, était analysé par Northern blot avec
une sonde
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d'ADNc contenant la phase ouverte de lecture d'OZF. AICPC-1, BxPC-3, Su.86.86
ayant OZF amplifié, présentent un haut niveau d'expression. De hauts niveaux
d'expression d'OZF sont observés en absence d'amplification dans Capan-1, -2,
MlA
PaCa-2 et PANC-1. L'absence ou une très faible expression a été observée dans
un
échantillon de pancréas normal adulte (Clontech). Le gel correspondant, coloré
avant
transfert au bromure d'éthidium, est montré en dessous, avec les bandes d'ARN
ribosomiques 28S et 18S.
FIGURES 3A, 3B et 3C. Analyse par Western blot de lignées cellulaires
pancréatiques
et de tumeurs primaires. Des quantités identiques de protéine (10 Ng),
déterminées par
lo coloration des extraits après électrophorèse sur gel SDS (non montré) ont
été
transférées sur nitrocellulose. La nitrocellulose a été alors bloquée et
hybridée avec un
anticorps polyclonal anti-OZF.
Figure 3A : Lignées cellulaires pancréatiques précédemment analysées par
Southern
et Northem blot (figure 1A et figure 2).
Figure 3B : Immunotransfert d'OZF d'échantillons de tumeurs primaires
d'adénocarcinomes pancréatiques.
Figure 3C : Immunotransfert d'OZF de pancréas normal humain. Les protéines ont
été
extraites dans les mêmes conditions pour les quatre échantillons indépendants
de
pancréas normaux (P1-P4), la lignée MIA PaCa-1 (MP) et pour un carcinome
pancréatique (T6) exprimant OZF. La nitroceHulose a été hybridée avec des
anticorps
polyclonaux anti-OZF et anti-pag afin de vérifier l'intégrité des protéines.
Les anticorps
anti-pag sont des anticorps de poule purifiés dans les mémes conditions que
les anti-
OZF.
FIGURES 4A, 4B et 4C. Détection par immunohistochimie d'OZF dans les
carcinomes
2s pancréatiques humains. La coloration à la péroxydase a été obtenue avec un
anticorps
anti-OZF purifié par affinité. Les anticorps anti-OZF montrent une coloration
granulaire
nucléaire dans les cellules AICPC-1 greffées chez la souris athymique (figure
4A),
dans un adénocarcinome exprimant OZF (figure 4B), et l'absence de coloration
dans
du pancréas sain n'exprimant pas OZF (figure 4C) (grossissement : 1000X).
3o FIGURE 5. Analyse par Western blot d'extraits bruts de cellules humaines
293 non
transfectées et transfectées par un vecteur d'expression OZF. Détection de la
protéine
OZF endogène (à gauche) et après détection transitoire par un vecteur
d'expression du
gène OZF (à droite) en triplicata, avec un anticorps monoclonal anti-OZF et un
anticorps secondaire anti-souris couplé à la péroxydase, par chimio-
luminescence.
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FIGURE 6. Marquage immunocytochimique de la protéine OZF dans les cellules de
la
lignée AICPC-1 issue d'un adénocarcinome pancréatique surexprimant la protéine
OZF. Les cellules sont cultivées sur lamelle, fixées par 4 % de
paraformaldéhyde dans
du PBS, puis perméabilisées par 0,1 % de triton X100. Les sites non
spécifiques sont
saturés par 2 % de BSA. Les cellules sont incubées 1 h avec l'anticorps
monoclonal
anti-OZF (1/200), lavées puis mises en contact 30 mn avec le second anticorps
anti-
souris couplé à un fluorochrome, lavées et incubées 4 mn au DAPI (0,2 Ng/ml)
qui
marque spécifiquement les noyaux (photos de gauche). Un marquage nucléaire
spécifique d'OZF est observé (photos de droite). A faible grossissement en
haut et à
1o fort grossissement en bas.
FIGURE 7. Expression du gène OZF dans les cancers du côlon. Analyse par
Western
blot.
A l'aide des anticorps monoclonaux, nous avons examiné l'expression de la
protéine
OZF dans les cancers du côlon. L'étude a porté sur 16 échantillons coliques.
Sur les
16 échantillons, 10 proviennent d'une tumeur colique (T1 - T3 - T5 - T6 - T7 -
T8 - T9 -
T10 - T11 - T12), et 6 de muqueuses coliques saines (C2 - C4 - C5 - C6 - C8 -
C12).
Les échantillons T5 et C5 proviennent d'un même patient, de méme que T6 - C6,
T8 -
C8, et T12 - C12. Nous avons déposé dans les puits d'électrophorèse des
quantités
équivalentes de protéine pour chaque échantillon colique, les échantillons
sont séparés
2o par migration sur gel de polyacrylamide, puis transférés sur une membrane
de PVDF.
La protéine OZF est révélée par l'anticorps monoclonal anti-OZF et un anti-
anticorps
de souris couplé à la péroxydase.
Dans les quatre cas où nous avions un échantillon colique sain et un
échantillon
colique cancéreux prélevés chez une mëme personne, nous avons constaté une
accumulation plus importante de la protéine OZF dans le tissu tumoral que dans
le
tissu normal.
En comparant la quantité de protéine OZF accumulée, nous constatons que les
tissus
tumoraux T1 - T3 - T5 - T7 - T8 - T9 - T10 - T12 présentent une quantité
supérieure de
protéine OZF par rapport aux tissus sains.
3o FIGURE 8. Comparaison des séquences d'acides aminés N-terminales des
protéines
OZF suivant leur origine et leur réactivité avec les anticorps monoclonaux.
Comparaison de la région N-terminale de deux allèles de la protéine OZF
humaine (hu-
OZF) qui diffèrent par un polymorphisme à la position 8 (KIR) avec la protéine
OZF
d'origine mucine (mu-OZF) et bovine (bo-OZF). La séquence du peptide
synthétique
utilisé dans les expériences d'inhibition compétitive est indiquée au-dessus
(PEPTIDE).
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Le résidu tyrosine en position 10 est souligné. La séquence de la protéine
porteuse
MBP est indiquée en petites lettres majuscules pour la protéine MBP-OZF. Le
chaînon
consensus HIC {"H/C link") précédent le premier doigt de zinc correspond à la
position
11-17.
s * indique les positions parfaitement conservées ;
° indique le polymorphisme K/R.
La réactivité avec l'anticorps monoGonal 5B8 selon l'invention est indiquée
dans la
colonne de droite (+ : positive ; - : négative).
lo EXEMPLES
Matériels et méthodes
Echantillons tumoraux et lignées cellulaires. Onze lignées de cellules
d'adénocarcinomes de pancréas ont été obtenues de fAmerican Type Culture
Collection (Rockville, USA) et cultivées comme prescrit par le fournisseur.
Une lignée
ls cellulaire additionnelle (AICPC-1) a été établie au laboratoire à partir de
la tumeur
primitive d'une patiente agée de soixante ans atteint d'un adénocarcinome du
pancréas. Les cellules ont été cultivées dans du milieu Dubelcco modifié
supplémenté
avec 20 % (vol/vol) de sérum de veau foetal. Des tissus tumoraux ont aussi été
obtenus de patients atteints de carcinome primaire du pancréas exocrine (n =
13 ; 6
2o hommes et 7 femmes).
Analyse par Southem et par Northern blot. L'extraction d'ADN a été effectuée
suivant les méthodes standards pour les lignées cellulaires et pour les
tumeurs
congelées (Sambrook et al., 1989). Les fragments obtenus après digestion de
l'ADN
génomique (5 Ng) avec fendonucléase Bgll ont été séparés par électrophorèse
sur gel
2s d'agarose à 0,7 %, transférés sur nitrocellulose (BA85, Schleicher et
Schuell) et
hybridés avec des sondes marquées au P32 (Le Chalony et al., 1996). Les
lignées de
cellules tumorales ont été hybridées avec une sonde OZF obtenue après
amplification
par PCR à l'aide d'amorces internes pour générer un fragment de 1 kb contenant
toute
la phase ouverte de lecture (847-1840). Les carcinomes pancréatiques primaires
ont
3o été hybridés avec un fragment cloné Xbal/Scal (652-1852) (Le Chalony et
al., 1994).
La sonde RAC (2,2 kb) a été préparée à partir d'un clone pUC-RAC à l'aide
d'amorces
universelles situées de part et d'autre du site multiple de clonage (Cheng et
al., 1992).
L'évaluation quantitative des signaux d'hybridation a été faite au
phosphorimager
(BioRad). Les ARN totaux ont été extraits à l'aide du kit Rneasy {Qiagen).
Pour les
35 analyses en Northem blot, 10 Ng d'ARN ont été déposés sur gel d'agarose 1 %
I 2,2 M
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formaldéhyde, transférés après migration sur membrane de nitrocellulose (BA85,
Schleicher et Schuell) et hybridés avec la sonde Xbal/Scal.
Production des anticorps polyclonaux. Les antisérums ont été développés chez
la
poule en utilisant la protéine OZF purifiée comme immunogène (Ferbus et al.,
1996).
s Les immunoglobulines IgY de jaune d'oeuf de poule ont été préparés comme
décrit
(Akita et al., 1992). Les anticorps spécifiques ont été obtenus à partir des
IgY anti-OZF
après purification par affinité sur une colonne de MBP-OZF couplé au sépharose
4B
(Pharmacia) (Ferbus et al., 1996). La spécificité des anticorps anti-OZF a été
vérifiée
par immunoélectrophorèse. Une bande unique de 33 kDa a été observée dans les
1o extraits nucléaires des cellules exprimant OZF.
Méthode de préparation de l'anticorps monoclonal. La protéine recombinante de
fusion MBP-OZF produite chez E. soli a été purifiée sur colonne d'amylose par
affinité
pour le MBP (Ferbus et al., 1996). Des souris ont été immunisées avec la
protéine
MBP-OZF purifiée. L'immunisation de souris Balblc est réalisée par trois
injections
15 sous-cutanées à deux semaines d'intervalle de 50 Ng de protéine MBP-OZF
purifiée.
La réponse immune anti-OZF est contr8lée par ELISA et immunoblot en utilisant
la
protéine MBP-OZF. Trois jours avant la fusion, 100 pg de protéine MBP-OZF sont
injectés par voie intraveineuse aux souris ayant les plus hauts titres d'anti-
sérum.
Après le test de criblage en ELISA, nous avons sélectionné pour l'étape de
fusion la
2o souris qui présentait la meilleure réponse. Les leucocytes spléniques ont
été fusionnés
avec les cellules de la lignée myélomateuse P3X63/8.653 en présence de
polyéthylèneglycol à 50 %. Après "HAT' sélection dans la culture bn.ite, les
hybridomes
sont encapsulés individuellement dans des gouttelettes d'agarose biotinylé et
marqués
par la protéine MBP-OZF conjuguée à fisothiocyanate de fluorescine (+) et par
la
25 protéine MBP-PAG conjuguée à la phycoérythrine (-). La suspension de
gouttelettes
est ensuite analysée par cytométrie de flux et seuls les hybridomes réagissant
avec le
conjugué MBP-OZF sont isolés et Gonés suivant la technique de "sécrétion
capture
report web" (SCRW) (Kenney et al., 1995).
Les anticorps monoclonaux sont purifiés à partir du surnageant de culture des
3o hybridomes par chromatographie d'affinité sur colonne protéine G Sépharose
(Pharmacia).
Les immunoglobulines produites sont en majorité des IgG1.
L'anticorps monoclonal spécifique de la protéine OZF humaine reconnaït celle-
ci à (état natif ou dénaturé (en ELISA, en Western, en immunohistochimie, par
35 immuno-précipitation).
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Technique EL-ISA pour ia sélection et la caractérisation des anticorps
monoclonaux.
- Incubation de microplaques 96 puits pour ELISA en présence de 50 NI par
puits d'une
solution de MBP-OZF ou MBP-PAG (témoin) à 10 Ng/ml en tampon carbonate-
s bircarbonate 0,05 M, pH 9,6, une nuit à 4°C.
- Saturation avec une solution d'albumine bovine sérique à 2 % en tampon
phosphate
salin pH 7,3 (PBS).
- Addition de 25 Irl de surnageant brut de culture de fhybridome avec 25 ul
d'une
solution de Tween à 0,1 % en tampon PBS et incubation 2 heures à 37°C.
- Après lavage, addition de 50 NI d'une solution au 1/10 000 d'anticorps de
chèvre anti-
souris conjugués à la phosphatase alcaline (Sigma, St Louis, MO) et incubation
1
heure à 37°C.
- Détection avec une solution de p-nitrophényl phosphate à 1 mg/ml en tampon
diéthanolamine, pH 9,8, MgCl2 0,5 mM.
- Mesure de fabsorbance à 405 nm avec un lecteur microplaque (Titertek
Multiscan de
chez Labsystem, les Ulis, France).
Les isotypes des anticorps monoclonaux sont déterminés par ELISA en utilisant
un kit pour le sous-typage d'hybridome murin (Boehringer-Mannheim, Allemagne).
L'épitope de reconnaissance se situe au niveau de son extrémité NH2
2o terminale. II reconnaît en effet la protéine OZF recombinante tronquée, ne
possédant
que les deux premiers doigts à zinc, et ne reconnaît pas la protéine murine
homologue
qui diffère de la protéine humaine au niveau de ses quinze premiers acides
aminés.
Extraction des protéines et analyse par Western blot avec anticorps
polyclonaux.
Les échantillons tumoraux congelés et les extraits cellulaires ont été
solubilisés dans
du tampon SDS en présence de ø-mercaptoéthanol et chauffés à ébullition 5
minutes.
Des quantités égales de protéines (10 Ng) ont été chargées sur gel SDS
polyacrylamide 12 % et transférées après migration sur membrane de PDVF
(Amersham). Les membranes ont été hybridées avec les anticorps anti-OZF puis
avec
des anti-poules de lapin conjugués à la phosphatase alcaline (Sigma), dilués
3o respectivement 200 et 15 000 fois. La chimioluminescence a été produite par
incubation de la membrane avec du CDP star (Dupont) et la protéine a été
révélée par
autoradiographie sur un fitm X-OMAT ARS.
Extraction des protéines et analyse par Western blot avec anticorps
monoclonaux. Les cellules sont cultivées à confluence, trypsinées, concentrées
par
centrifugation et lysées avec du tampon (65 mM Tris-HCI, pH 6,8, 0,01 % bleu
de
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bromophénol, 5 % ~i-mercaptoéthanol, 10 % glycérol, 2 % SDS) en présence
d'inhibiteurs de protéase, chauffées à ébullition puis soniquées. 50 Ng
d'extrait
cellulaire ou 0,05 Ng de protéine recombinante sont chargés dans chaque puits.
Les
protéines sont séparées par électrophorèse sur un gel polyacrylamide à 12 % en
SDS
s et transférées sur membrane PDVF (immobilon-P, Millipore). L'efficacité du
transfert de
protéine est contr8lée par coloration Ponceau S. L'analyse par Western blot
est
réalisée selon la technique décrite dans Ferbus et al., 1996. Les blots sont
hybridés
pendant 2 heures avec des anticorps anti-OZF dilués au 1/500 puis avec des IgG
anti-
souris de chèvre conjugués à la phosphatase alcaline dilués au 1/10 000. Les
mêmes
lo conditions sont utilisées pour le témoin positif avec des anticorps anti-
OZF de poulet
dilués au 1/200 et des anticorps anti-poulet IgY de lapin au 1/10 000. La
phosphatase
alcaline est détectée par chimioluminescence avec le réactif CDP-star (NEN
Live
Science Products) et visualisée par autoradiographie (X-OMAT AR, Kodak,
Rochester,
NY).
15 Immunofluorescence. Les cellules sont cultivées dans des lames Lab-Teck à
chambre (Nunc Inc., Naperville, IL) pendant 24 heures. Les lames Lab-Teck sont
lavées deux fois en PBS et fixées avec une solution à 4 % de paraformaldéhyde
en
PBS (p/v) pendant 15 minutes à température ambiante. Les cellules sont ensuite
rincées en PBS et incubées deux fois pendant 30 minutes dans une solution à
0,1 M
2o glycine, 0,2 M Tris-HCI pH 7,5 puis perméabilisées dans une solution de
triton X100 à
0,1 % (v/v) dans du PBS pendant 5 minutes. Les anticorps anti-OZF purifiés
sont
incubés pendant une heure à 37°C (dilution au 1/100) en tampon PBS à
0,5
d'albumine bovine sérique (p/v). Après lavage, les cellules sont incubées
pendant 30
minutes à 37°C avec des anticorps IgG (H+L) anti-souris de chèvre
conjugués à la
25 FITC (isothiocyanate de fiuoréscéine) dilués au 1/80 (Biosys S.A., France).
Les lames
sont colorées par contraste avec du DAPI (4'6-diamidino-2-phénylindole) pour
la
coloration de l'ADN de la chromatine, fixées par une solution (Vectashield,
Vector
Laboratoires, Inc., Burlingame, CA) et observées sous un microscope à
fluorescence.
Marquage immunohistochimique d'OZF. La coloration a été obtenue par un anti-
3o poule couplé à la péroxydase après incubation avec un antisérum anti-OZF de
poule
purifié, sur des coupes de tissu congelé (5 Nm) comme décrit (Terris et al.,
1995).
Transfection des cellules N1H3T3. La surexpression d'OZF est réalisée par
transfection d'une lignée cellulaire murine NIH3T3 avec un vecteur plasmidique
exprimant la protéine OZF dans des cellules eucaryotes. Le milieu de culture
est
35 ensemencé avec une densité cellulaire de 0,8 x 106 cellules dans des boïtes
de pétri
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de diamètre 60 mm puis les cellules sont transfectées 24 h plus tard avec 2 Ng
de
plasmide en utilisant la technique de calcium-phosphate. 5 à 6 h après la
transfection
les précipités sont éliminés et les cellules sont remises en milieu de
culture. Le jour
suivant, les cellules sont transférées dans des lames Lab-Tek à chambre et
fixées
avant l'analyse par immunofluorescence.
EXEMPLE 1 : Amplification du gène OZF dans les lignées d'adénocarcinomes
pancréatiques
Pour évaluer le nombre de copies du gène OZF dans les cellules des lignées
1o tumorales et déterminer s'il appartient à famplicon portant le gène RAC,
les ADN
génomiques totaux, de 12 lignées cellulaires et d'un placenta, ont été digérés
avec
l'enzyme de restriction Bglll, séparés sur gel d'agarose et hybridés par
Southem blot
avec des sondes ADN OZF et RAC. Comme montré dans la figure 1A, trois lignées,
AICPC-1, BxPC-3, SU.86.86 présentent un signal d'amplification dans un
fragment
génomique Bglll de taille de 5,3 kb. La quantification des niveaux
d'amplificaüon révèle
que le gène OZF est approximativement de 60 copies, 6 copies et 30 copies dans
AICPG1, BxPC-3, SU.86.86 respectivement. La co-amplification avec RAC est
observée dans ces trois lignées, cependant PANC-1 montre une ampl~cation de
RAC
seule. Le nombre de copies des gènes RAC et OZF est similaire dans BxPC-3.
2o L'intensité relative du signal d'amplification est supérieure pour le gène
OZF que pour
RAC dans AICPC-1 et inférieure dans SU.86.86. Ces expériences montrent que le
gène OZF est co-amplifié avec RAC dans trois des quatre lignées cellulaires.
Contrairement à ce qui avait été reporté, l'amplification de RAC dans la
lignée AsPG1
n'est pas détectée (Cheng et al., 1996 ; Miwa et al., 1996). Les analyses
caryotypiques
des lignées cellulaires ont confirmé la ploïdie et la spé~cité du marquage
chromosomique de chaque lignée incluant AsPG1 (Curtis et al., à para?tre).
L'amplification précédemment décrite dans AsPC-1 peut être due à un sous clone
ou
avoir été perdue pendant la propagation en culture.
L'état d'amplification d'OZF a été examiné dans des échantillons tumoraux.
3o Douze adénocarcinomes primaires pancréatiques, pris au hasard, ont été
analysés par
Southem blot avec une sonde OZF (figure 1 B). Deux tumeurs (T6 et T9)
présentent
une augmentation du signal d'hybridation (de 3 à 5 fois) par rapport à l'ADN
placentaire, après normalisation avec le signal obtenu après réhybridation
avec une
copie unique du gène N-myc. Ce signal est considéré comme significatif pour
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l'amplification étant donné la forte proportion de cellules non tumorales dans
les tissus
tumoraux.
EXEMPLE 2 : Expression d'OZF dans les lignées pancréatiques et dans les
échantillons tumoraux
5 L'expression d'OZF a été examinée en premier dans les lignées tumorales par
Northem blot (figure 2). Différents niveaux d'expression ont été détectés dans
toutes
les lignées. Les lignées AICPC-1 et SU.86.86 qui présentent les plus hauts
niveaux
d'ampt~cation expriment les plus hauts niveaux de mRNA OZF. Une expression
modérée est observée dans BxPC-3, Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2 et PANC-1, et
1o une plus faible expression est trouvée dans les quatre lignées restantes.
L'expression d'OZF a été aussi recherchée au niveau protéique par Western
blot en utilisant un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine OZF
recombinante
exprimée chez E.ooli (Ferbus et al., 1996). La protéine OZF a été détectée
dans toutes
les lignées cellulaires (figure 3A). Le plus haut niveau de la protéine est
trouvé dans les
15 lignées cellulaires qui présentent une amplification du gène OZF {AICPC-1,
BxPC-3 et
SU.86.86). Comme le tissu pancréatique présente des ARN souvent dégradés,
l'expression d'OZF a été étudiée dans les tumeurs et le pancréas normal par la
détermination de l'accumulation de sa protéine. Afin de comparer le taux de la
protéine
OZF dans le pancréas normal adulte avec ceux trouvés dans les tumeurs, les
2o protéines de quatre échantillons pancréatiques différents ont été extraites
selon le
protocole standard et analysées par Western blot (figure 3C). L'intégrité des
extraits a
été contra" lée par l'utilisation d'un anticorps polyclonal dirigé contre la
protéine
ubiquitaire PAG de 22 kDa qui est exprimée dans les cellules en prolifération
(Prospéri
et al., 1993). Parmi les huit échantillons d'adénomes pancréatiques primaires
étudiés,
trois présentent un faible niveau de la protéine OZF comme dans les
échantillons de
pancréas sains. Cinq tumeurs (T6-T9, T12) présentent les plus hauts niveaux
d'OZF
(figures 3B et 3C). Par conséquent le gène OZF est exprimé à hauts niveaux
dans plus
de la moitié des adénocarcinomes analysés.
EXEMPLE 3 : Restriction de l'expression d'OZF aux cellules tumorales dans les
3o tumeurs pancréatiques
L'utilisation possible d'anticorps anti-OZF dans des études immuno-
histochimiques a été déterminée. L'expression d'OZF a été détectée (figure 4A)
dans
une tumeur obtenue après greffe des cellules AICPC-1 chez la souris athymique.
L'immunohistochimie a été effectuée sur des coupes de carcinomes pancréatiques
congelés afin de détem3iner si d'autres types cellulaires en plus des cellules
tumorales,
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contribuent à l'expression d'OZF. Un exemple de carcinome pancréatique
montrant
une expression d'OZF est montré en figure 48. Les anticorps anti-OZF révèlent
par
coloration une granulation nucléaire qui prédomine dans les cellules
tumorales. Les
autres types cellulaires comme les fibroblastes et les cellules endothéliates
présentent
s une très faible ou une absence de coloration. Ainsi dans les tumeurs
pancréatiques
l'expression d'OZF est restreinte principalement aux cellules tumorales et les
anticorps
anti-OZF peuvent être utilisés pour détecter les cellules tumorales dans des
tumeurs
pancréatiques hétérogènes.
EXEMPLE 4 : Expression du gène OZF dans les cancers du c8lon
1o A l'aide des anticorps monoclonaux, (expression de la protéine OZF a été
examinée dans les cancers du côlon. L'étude a porté sur 16 échantillons
coliques. Sur
les 16 échantillons, 10 proviennent d'une tumeur colique (T1 - T3 - T5 - T6 -
T7 - T8
T9 - T10 - T11 - T12), et 6 de muqueuses coliques saines (C2 - C4 - C5 - C6 -
C8
C12). Les échantillons T5 et C5 proviennent d'un méme patient, de même que T6 -
C6,
15 T8-CB,etT12-C12.
Analyse par Western blot
Des quantités équivalentes de protéine pour chaque échantillon colique sont
déposées dans les puits d'électrophorèse. Les échantillons sont séparés par
migration
sur gel de polyacrylamide, puis transférés sur une membrane de PVDF. La
protéine
2o OZF est révélée par l'anticorps monoclonal anti-OZF et un anti-anticorps de
souris
couplé à la péroxydase. Le résultat est présenté figure 7.
Dans les quatre cas où l'échantillon colique sain et (échantillon colique
cancéreux sont prélevés chez une mëme personne, une accumulation plus
importante
de ia protéine OZF est constatée dans le tissu tumoral que dans le tissu
normal.
2s En comparant la quantité de protéine OZF accumulée, on constate que tes
tissus tumoraux T1 - T3 - T5 - T7 - T8 - T9 - T10 - T12 présentent une
quantité
supérieure de protéine OZF par rapport aux tissus sains.
D'après les résultats, 50 % des tissus cancéreux analysés présentent une forte
surexpression d'OZF et 80 % des échantillons tumoraux analysés ont un niveau
3o d'expression de la protéine OZF supérieur à celui observé dans les tissus
normaux.
Ces observations montrent que le gène OZF est surexprimé dans fes cancers du
côlon.
Les résultats obtenus dans les exemples précédents montrent que
s5 l'amplification du gène OZF a été observée dans 3 des 12 lignées
d'adénocarcinomes
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du pancréas (AICPC-1, BxPC-3 et SU.86.86). L'augmentation du nombre de copies
du
gène a été aussi trouvée dans 2 des 12 échantillons de tumeurs primaires (T6
et T9),
quoiqu'à des niveaux plus faibles que ceux observés dans les lignées. Parce
que les
tumeurs primaires pancréatiques contiennent généralement un large excès de
cellules
s normales, l'hybridation du signal en Southem blot peut avoir été atténuée
dans les
tumeurs T6 et T9. De plus, les échantillons contenant peu de cellules
tumorales,
présentant un signa! d'amplification modéré, échappent à la détection. Les
xénogreffes
sur souris athymiques devraient nous permettre une meilleure estimation de
l'amplification du gène OZF dans les tumeurs pancréatiques primaires. En
addition à
io ces résultats, l'amplification d'OZF a été ident~ée par hybridation in situ
en
fluorescence dans la tumeur utilisée pour générer la lignée AICPC-1 (Curtis et
al., à
paraître). Ainsi, l'amplification d'OZF a lieu dans les tumeurs pancréatiques
primaires
et dans les lignée cellulaires.
Toutes les lignées d'adénocarcinomes pancréatiques expriment fARNm et la
15 protéine OZF mais à des niveaux différents. Les plus hauts niveaux d'ARNm
d'OZF ont
été trouvés dans les lignées ayant ampl~é le gène OZF (AICPG1, BxPG3 et
SU.86.86). Quoique (estimation de la protéine peut ëtre moins précise, le taux
de la
protéine OZF a été comparé dans les deux tumeurs primaires présentant une
amplification du nombre de copies (T6 et T9), à la lignée cellulaire MIAPaCa-
2. Les
2o deux tumeurs expriment de hauts niveaux de protéines OZF. Ainsi, le gène
OZF qui
est hautement exprimé dans toutes les tumeurs pancréatiques présentant une
amplification, n'est pas inactivé dans famplicon 19q13.1.
L'amplification génique est un mécanisme important pour l'augmentation de
l'expression de gènes impliqués dans la cancérogenèse même si la surexpression
est
25 souvent observée en absence d'amplification. Les études d'expression de
quatre
échantillons indépendants de pancréas normaux et de trois échantillons de
tumeurs
primaires montrent des niveaux de protéines OZF très faibles ou indécelables.
Au
contraire, toutes les lignées expriment OZF et quatre d'entre elles montrent
de hauts
niveaux d'ARNm OZF en absence d'amplification. Le cas le plus significatif est
celui de
30 la lignée PANC-1 qui possède deux copies du gène OZF et exprime un haut
niveau
d'ARNm de 2 à 4 fois plus bas que celui de la lignée SU.86.86 qui possède 30
copies
du gène OZF. De hauts niveaux de protéine OZF sont aussi observés dans des
tumeurs primaires sans amplfication du gène OZF, et fimmunohistochimie montre
que
la protéine OZF est détectée essentiellement dans les cellules tumorales. En
dehors
ss du statut d'amplification génique, OZF est surexprimé dans 7 des 12 lignées
tumorales
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et dans 5 des 8 tumeurs primaires. Les plus hauts niveaux d'expression d'OZF
dans un
large échantillon de tumeurs comparé au pancréas normal suggèrent que ce gène
est
impliqué dans le processus oncogénique. De plus il pourrait être utilisé comme
un
marqueur pour détecter de rares cellules tumorales dans le pancréas.
En dehors du gène OZF, la région q13.1 du chromosome 19 comprend
plusieurs gènes candidats. Le mieux caractérisé est le gène RAC, localisé à
proximité
d'OZF, qui code pour une sérine-thréonine kinase (The Human Gene Map, 1997).
Les
deux gènes sont coamplifiés dans les lignées cellulaires, cependant seul le
gène RAC
a été trouvé amplifié dans PANC-1. Cependant, dans la lignée PANC-1, dans
laquelle
le gène RAC est amplifié, les niveaux d'ARNm sont seulement légèrement plus
bas
que ceux observés dans les lignées cellulaires qui présentent une
amplification du
gène OZF. Cette lignée cellulaire contient aussi une protéine OZF abondante.
Ainsi, la
surexpression d'OZF dans PANC-1 peut être due à un mécanisme autre que
l'amplification génique comme dans le cas d'autres gènes connus. Par exemple
dans
1s les cancers du sein et de l'ovaire, la prévalence de la surexpression
HER2/neu
intervient plus fréquemment que l'amplification et a été utilisée pour prédire
le taux de
survie (Slamon et al., 1989).
EXEMPLE 5 : Sélection des hybridomes et caractérisation des anticorps
monoclonaux
A. Sélection des hvbridomes
Après immunisation puis fusion cellulaire les anticorps sécrétés par un seul
hybridome sont examinés en utilisant la technique SCRW et sélectionnés une à
une
par cytométrie de flux. 22 surnageants réagissant par FACS (trieur automatique
de
cellules par cytométrie de flux par fluorescence) avec la protéine OZF
recombinante et
ne réagissant pas avec la protéine porteuse MBP sont testés pour leur activité
avec la
protéine recombinante MBP-OZF. La moitié des lignées cellulaires sont
positives par
ELISA et immunoblot (cf. tableau 1 ). Aucune réactivité n'est observée après
ELISA sur
la protéine MBP-PAG indiquant que ces surnageants sont spécifiques du
polypeptide
3o OZF (Prospéri M-T et al., 1993). Dans la mesure où certains anticorps
monoclonaux
peuvent réagir avec des épitoges résultant de la fusion avec la protéine
porteuse MBP
la réactivité des surnageants a été examinée avec la protéine OZF produite par
des
cellules eucaryotes. Après analyse par immunoblot et immunofluorescence en
présence de protéines OZF endogènes issues de cellules mammaires humaines HBL
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100, six anticorps monoclonaux ont été sélectionnés sur la base de leur forte
réactivité
avec la protéine OZF humaine (cf. tableau 1 ci-dessous).
TABLEAU 1 : Criblage et sélection des anticorps monoclonaux anti-OZF.
LIGNES ELISA ELISA IMMUNOBLOT IMMUNOBLOT IFA
CELLULAIREMBP-OZF MBP-PAG MBP-OZF HBL100 HBL100
CELLULES CELLULES
4A5 + - + _ _
5B1 - ' - - _
5B8 +++ - +++ +++ ++
5B9 + - + _ +
4C3 _ - _ _
_
4C8 + - + _
5C10 +++ - +++ +++ +++
5C11 +++ _ _ - +
5D9 +++ _ +++ _ ++
5D10 + _ - _
5D11 + _ _ _ _
5E9 ++ - ++ + +
5E10 +++ _ _ _ +
5F1 + _ _ _ _
5F4 + - _ _ _
5F8 + - - _ -
5G10 +++ - -+++ +++ +
5H2 _ - - _ - _
5H4 +++ _ +++ _ _
5H7 +++ - +++ +++ +++
5H8 +++ _ ++ _ +
4H10 +++ _ +++ +++ +++
Légende du Tableau 1 : Les surnageants bruts de culture de 22 clones
d'hybridomes
sélectionnés par la technique SCRW ont été testés successivement par ELISA
contre
les protéines recombinantes MBP-OZF et MBP-PAG, puis ensuite par immunoblot et
1o immunofluorescence {IFA) contre la protéine MBP-OZF et la protéine OZF
endogène
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issue de cellules HBL 100 humaines. La protéine recombinante MBP-PAG a été
utilisée comme témoin négatif.
B. Caractérisation des anticorps monoclonaux
s Après purification sur colonne protéine G Sépharose les sous-types
d'immunoglobuline des six anticorps monoclonaux sélectionnés ont été
déterminés.
Cinq anticorps (5B8, 5C10, 5610, 5H7, 4H10) appartiennent au sous-type tgG1 et
un
anticorps au sous-type IgG3 (5D9). Les anticorps monoGonaux ont également été
testés par immunoblot et immunofluorescence avec différents extraits de
cellules de
1o mammifères. L'analyse par Western blot sur des extraits humains (cellules
de sein, de
rein, de côlon et de pancréas) détectent une bande unique de 33 kDA
caractéristique
de la protéine OZF. De manière inattendue, les anticorps monoclonaux ne
reconnaissent pas les protéines OZF bovine et mucine en dépit de leur forte
identité
(95 %) avec la protéine OZF humaine (Le Chalony, C. et al., 1996 ; Blottière
L. et al.,
1s 1999). L'absence de réactivité ne résulte pas du processus de traduction
dans la
mesure où les protéines OZF mucine traduites in vitro ne sont pas non plus
détectées.
Les mêmes résultats sont observés par immunofluorescenoe (cf. tableau 2 ci-
dessous), une forte expression nucléaire d'OZF est observée après transfection
des
cellules mucines NIH3T3 avec le vecteur d'expression. Aucune fluorescence
n'est
2o visible sur les cellules mucines NIH3T3 non transfectées. Par conséquent,
les six
anticorps monoclonaux ainsi produits et caractérisés selon (invention sont
hautement
spécifiques de la protéine humaine OZF.
EXEMPLE 6 : Détermination de l'épitoge
2s Puisque les anticorps monoclonaux réagissent seulement avec la protéine OZF
humaine, les séquences OZF humaines, bovine et mucine ont été comparées afin
de
déterminer dans une première étape la localisation de (épitoge.
La plupart des domaines variables sont situés dans les trois premiers doigts
de
zinc et dans la séquence du peptide leader (PL) de 10 acides aminés précédent
le
3o domaine doigt de zinc (Le Chalony et al., 1996 ; Blottière et al., 1999).
Cette première étape suggère que la localisation de (épitoge est située de
manière plausible dans la partie N-terminale de la protéine OZF. Compte tenu
du fait
que la protéine MBP-OZF pour laquelle les cinq premiers acides aminés de la
protéine
OZF sont manquants, réagit avec les anticorps monoclonaux selon l'invention,
il est
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fort probable que fépitope contre lequel sont dirigés ces anticorps
monoclonaux est
situé à la jonction entre le peptide leader et le premier doigt de zinc (cf.
figure 8).
Afin de confirmer cette hypothèse, une technique ELISA oar inhibition
compétitive est réalisée en présence d'un pep#ide dont la séquence correspond
au
fragment aa4-aa17 de la protéine OZF humaine. Ce peptide se révèle être un
puissant
inhibiteur compétitif vis-à-vis des anticorps monoclonaux selon l'invention
(cf. tableau 2
ci-après).
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Légende du tableau 2 : Six anticorps monoclonaux anti-OZF ont été testés par
ELISA,
immunoblot et immunofluorescence. Les anticorps monoclonaux et (anticorps
polyclonal de poulet anti-OZF ont été dilués respectivement au 1/500 et au
1/100. La
compétition est réalisée en présence de 0,05 mg/ml du peptide synthétique aa4-
aa17
(cf. figure 8).
Pour fimmunoblot, les extraits suivants ont été utilisés
- origine humaine : cellules HBL100 du sein, cellules 293 de rein, cellules
SU86-86 de
pancréas, cellules RC8 et TC7 de côlon ;
- origine mutine : fibroblastes NIH3T3 ;
lo - origine bovine : cellules FBHE d'endothélium et lymphocytes LB9THY.
L'immunofluorescence a été réalisée sur des lignées cellulaires HBL100 et
NIH3T3.
L'anticorps polyclonal de poulet anti-OZF a été utilisé comme témoin positif
(Y-OZF).
(+) : détection d'OZF ; (-) : pas de détection d'OZF ; nf : non fait.
Ces résultats démontrent que les six anticorps monoclonaux selon (invention
testés reconnaissent un épitoge commun de la protéine OZF humaine situé à la
jonction entre le peptide leader et le premier doigt de zinc. Dans cette
région, la
comparaison des séquences humaines et bovine de la protéine OZF met en
évidence
deux substitutions
- une première substitution conservatrice en position 8 résultant d'un
polymorphisme
lysine/arginine chez (homme qui ne modifie pas la réactivité des anticorps
monoclonaux ; et
- la substitution d'un résidu tyrosine par un résidu leucine en position 10
dans la
séquence bovine.
Dans la séquence de la protéine OZF mutine, un résidu cystéine est trouvé en
position 10 et deux substitutions en positions 13 et 14.
Par conséquent, ces résultats montrent que ia présence d'un résidu tyrosine en
position 10 est critique pour la reconnaissance des anticorps monoclonaux et
influence
de manière probable la conformation de cette région épitopique.
3o La comparaison de ta séquence de cet épitoge avec des séquences de
protéines issues de banques de données n'a pas permis d'identifier d'autres
protéines
portant cet épitoge.
Ainsi, six anticorps monoclonaux efficaces pour la détection de la protéine
OZF
recombinante et native par ELISA, western blot ou immunofluorescence ont ainsi
été
purgés et caractérisés. Cinq anticorps sont de type IgG1 et un de type IgG3.
Au
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contraire, des anticorps polyclonaux qui détectent de nombreuses protéines à
doigt de
zinc autres que la protéine OZF humaine, ces anticorps monoclonaux selon
(invention
reconnaissent un épitope unique de la protéine OZF humaine. La séquence de cet
épitoge unique situé à la jonction entre les dix premiers acides aminés et le
domaine
s doigt de zinc n'est pas présent dans les autres protéines de Kruppel,
incluant les
protéines OZF d'origine mucine et bovine. Ces anticorps monoclonaux selon
(invention
sont hautement spécifiques de la protéine endogène OZF humaine, à la fois sous
sa
forme dénaturée et native.
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