Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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WO 02/095015
PCT/FR02/01730
COMPOSES CAPABLES DE MODULER L'ACTIVITE ET DE STIMULER
LA PRODUCTION D'UN ANTICORPS CATALYTIQUE
L'invention a trait à des nouveaux composés capables de moduler l'activité
et de stimuler la production des anticorps catalytiques. L'invention porte en
'particulier sur un composé capable d'augmenter l'activité d'un anticorps
catalytique caractérisé en ce qu'il a une affinité spécifique pour le site
catalytique dudit anticorps, et en ce qu'il n'est pas immunogène. De tels
composés sont utiles en particulier pour le traitement thérapeutique ou la
prévention d'une pathologie liée à une déficience enzymatique, pour
stimuler in vivo l'hydrolyse de xénobiotiques, de drogues, de médicaments
ou toute autre molécule potentiellement toxique pour l'organisme ou encore
pour prévenir ou empêcher des réactions allergiques.
Anticorps et enzymes ont en commun la propriété de reconnaître
spécifiquement des molécules. A l'exception des cas pathologiques,
l'anticorps reconnaît un antigène ou une molécule qui est étrangère à
l'organisme produisant l'anticorps. La liaison de l'anticorps à l'antigène
conduit généralement à la neutralisation de la molécule étrangère à
l'organisme. Les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui se lient à
une molécule de telle sorte que l'énergie d'activation d'une réaction
impliquant la molécule est abaissée, augmentant ainsi la vitesse de la
réaction.
En 1946, Linus Pauling proposa le concept suivant: Les anticorps lieraient
de façon préférentielle les états stables des molécules tandis que les
enzymes lieraient de façon préférentielle l'état de transition d'état
énergétique plus élevé plutôt que la molécule de substrat dans son état de
basse énergie. Selon l'hypothèse de Pauling (Pauling, L., Nature (1948)
161 :707), l'enzyme stabiliserait l'état de transition des molécules,
réduisant
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l'énergie d'activation d'une réaction et augmentant ainsi la vitesse de cette
réaction.
En poursuivant cette hypothèse, il a été proposé une stratégie pour
l'obtention de nouvelles activités catalytiques, basée sur la production
d'anticorps dirigés contre un haptène qui mime l'état de transition d'une
réaction donnée, encore appelé Analogue d'Etat de Transition ou TSA
(Transition State Analogue). Ainsi, un anticorps dirigé, contre de tels
antigènes devrait acquérir des propriétés catalytiques similaires à celles
des enzymes.
Cette stratégie fut confirmée de nombreuses fois depuis 1986. Des
anticorps catalytiques peuvent en effet être induits par l'immunisation d'un
animal avec un analogue d'état de transition (TSA) rendu immunogène
(Pollack et al., J Am Chem Soc (1988) 110: 8713, Jackson et al., PNAS
(1988) 85 : 4953, Shokat et al., Chem Int Ed Engl (1988) 27 : 1172) et sont
capables de catalyser différents types de réaction chimique. Depuis les
premiers résultats démontrant la possibilité d'induire la production
d'anticorps catalysant des réactions d'hydrolyse d'esters et de carbonates,
plus de 70 réactions différentes ont pu être catalysées par des anticorps.
Ces réactions concernent aussi bien l'hydrolyse de liaisons chimiques
(esters, amides, additions de Diels-Alder,...) que des réactions
d'isomérisation, de décarboxylation, d'oxydo-réduction, etc...
En parallèle, des anticorps possédant une activité catalytique ont pu être
isolés à partir du sérum de malades atteints de différentes pathologies. Les
premières démonstrations ont été réalisées en purifiant les anticorps à
partir de sérums humains. Ces anticorps catalytiques naturels ont
notamment des activités DNAse ou protéase. En particulier, des anticorps
catalytiques présentant une activité protéase contre le peptide vasoactif
intestinal (VIP) furent ainsi isolés du sérum de patients atteints d'asthme.
Ces mêmes anticorps ont pu être obtenus par l'immunisation de souris
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avec le même peptide immunogène (Paul et al., J Neuroimmunol (1989)
23: 133-142). D'autres activités protéases ont été extraites, qui clivent la
thyroglobuline chez des patients atteints de la Thyroïdite d'Hashimoto ou le
facteur VIII chez des hémophiles traités par ce facteur de coagulation
(INSERM, Bayer Pharma, 1999, EP 1074842). Une activité catalytique
d'hydrolyse de l'ADN a été montrée dans le sérum de patients atteints de
lupus érythémateux ou d'arthrite rhumatoïde (Shuster A.M. et al., Science
(1992) 256 : 665-667). Il semble que cette activité DNAse soit corrélée aux
symptômes de ces pathologies.
Il a récemment été proposé une autre voie pour la production d'anticorps
catalytiques fondée sur la préparation d'anticorps anti-idiotypiques mimant
le site catalytique d'une enzyme. Par exemple, il a été montré qu'il est
possible d'induire in vivo la production d'anticorps catalytique anti-
idiotypique à activité 13-lactamase par immunisation avec un anticorps dirigé
contre le site actif de la p-lactamase (Avalle B. et al., Faseb J, (1998)
12 :1055-1060).
Les applications des anticorps catalytiques sont multiples. En particulier, de
tels anticorps catalytiques seraient utiles pour la catalyse de réactions
chimiques qui ne sont pas réalisées par les enzymes naturelles,
notamment pour agir in vivo sur le métabolisme (application médicale) ou
réaliser des réactions chimiques particulières (application industrielle).
Compte tenu du vaste répertoire de spécificité des anticorps et aussi de
leurs implications dans les processus d'immunité acquise, d'allergies et
d'auto-immunité, on comprend l'intérêt de produire in vivo des anticorps
catalytiques, notamment pour leurs applications thérapeutiques.
Une des applications qui a été développée concerne l'utilisation des
propriétés hydrolytiques des anticorps catalytiques pour activer des
composés non toxiques en composés cytotoxiques (Zeneca Ltd, 1998, US
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5,807,688). En ciblant cette activité au niveau de cellules cibles, des
molécules dont la cytotoxicité est masquée par un groupement chimique
pourraient être activées au contact de cellules tumorales pour des
traitements anti-cancéreux (méthode ADAPT, Antibody-directed Abzyme
Prodrug Therapy). Un autre exemple concerne la capacité de certains
anticorps à hydrolyser la cocaïne. Le développement d'un anticorps ayant
ces propriétés pourrait permettre son utilisation dans le traitement
d'overdoses et d'addiction à la cocaïne. Le brevet décrit une méthode
d'induction de la stimulation d'anticorps catalytique à l'aide de
l'immunisation d'un mammifère avec un haptène, analogue d'états de
transition ( Barber et al., 2000, US 6,017,541). Un troisième exemple est
développé par Advanced Biotech qui produit des anticorps catalytiques
pour le traitement des infections par des bactéries gram-négatives en
visant l'endotoxine (Genetic Engineering News (1999) vol. 19 n 20 page
15).
Théoriquement, les recherches visant à produire des anticorps capables
d'hydrolyser une molécule spécifique et en particulier un polypeptide
pourraient déboucher sur la conception de nouveaux traitements
thérapeutiques, notamment de traitements d'un déficit enzymatique
particulier, de traitements anti-viraux, de traitements des xénobiotiques
potentiellement toxiques pour l'organisme ou encore de méthodes de
prévention des allergies.
Cependant, pour être efficaces dans de telles applications, les activités
catalytiques de ces anticorps doivent être suffisamment significatives au
regard de l'effet recherché.
Des méthodes basées sur la conception des haptènes susceptibles
d'induire la production in vivo d'anticorps catalytiques (Igen International
Inc., 1989, EP 0 413 762), les stratégies d'immunisation (Boston
Biomedical Research lnstitute, 2000, US 6,140,091), la modification site-
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dirigée d'anticorps ou les méthodes de criblage (catELISA, Tawfik et al.,
PNAS (1993) 90: 373-377) et de sélection (phage-display) (Smith et al.,
1999, US 5,855,885) ont permis d'améliorer de façon significative les
propriétés catalytiques de certains anticorps et/ou leur production in vivo.
5 Cependant, ces méthodes s'appliquent au cas par cas et s'avèrent
insuffisantes dans de nombreux cas pour obtenir une efficacité compatible
avec une utilisation médicale ou industrielle. Il existe donc toujours un
besoin d'identifier de nouvelles méthodes permettant d'améliorer les
propriétés catalytiques des anticorps catalytiques ou d'induire de nouvelles
activités catalytiques.
Il a été montré récemment que les substrats des anticorps catalytiques
peuvent former in vitro un complexe d'interaction stéréospécifique différent
du complexe antigène-anticorps et induire une modification de la
conformation des anticorps, ladite modification augmentant l'affinité de
l'anticorps catalytique pour son substrat (Lindner et al., J Mol Biot (1999)
285: 421-430). En particulier, l'analyse des anticorps anti-idiotypiques a
permis de montrer que le site catalytique cohabite dans l'espace contenant
la zone de reconnaissance de l'immunogène sans se confondre avec elle. Il
a en outre été montré qu'il est possible de garder la fonction immunitaire et
perdre la fonction catalytique d'un anticorps (Kolesnikov et aL, PNAS
(2000) 97: 13526-13531), suggérant ainsi que la zone fonctionnelle de
l'anticorps catalytique réalise deux fonctions nettement différenciées
(réponse immunitaire spécifique ou catalyse) et qu'il existe au niveau de
cette zone, une compétition pour complexer des molécules potentiellement
différentes (antigène ou substrat).
L'invention résulte de la découverte qu'il est possible de moduler in vivo
l'activité d'un anticorps catalytique à l'aide d'un composé non immunogène
et présentant une affinité spécifique pour le site catalytique dudit
anticorps.
De tels composés ont un effet direct sur l'activité catalytique en induisant
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un changement conformationnel des anticorps déjà produits. De plus, de façon
particulièrement surprenante, les inventeurs ont constaté que, en dépit du
caractère non
immunogène de ces composés, ceux-ci pourraient augmenter indirectement la
production
des anticorps catalytiques, en déplaçant l'équilibre du système immunitaire
vers une
production d'anticorps à activité catalytique augmentée, ce déplacement étant
induit par
le changement conformationnel des anticorps pré-existants.
Ainsi, l'invention porte sur un composé capable de moduler l'activité d'un
anticorps
catalytique, ledit composé étant caractérisé en ce qu'il a une affinité
spécifique pour le
site catalytique dudit anticorps, et en ce qu'il n'est pas immunogène.
Elle porte également sur un procédé de modulation de l'activité d'un anticorps
catalytique comprenant la mise en contact dudit anticorps avec un composé non
immunogène et ayant une affinité spécifique pour le site catalytique dudit
anticorps.
Un aspect de cette invention est un composé, qui reconnaît spécifiquement le
site
catalytique d'un anticorps catalytique, et qui n'est pas immunogène, pour son
utilisation dans le traitement ou la prévention d'une pathologie liée à une
déficience
enzymatique, par stimulation de l'activité dudit anticorps catalytique.
Un autre aspect de cette invention est un procédé de sélection d'un composé
capable de
stimuler l'activité d'un anticorps catalytique, comprenant la sélection et
l'isolement d'un
anticorps catalytique naturel ou induit par l'injection répétée d'une molécule
immunogène,
caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) la synthèse et/ou l'extraction de composés dérivés d'une molécule
immunogène reconnue par l'anticorps catalytique isolé ;
b) le cas échéant, un premier criblage à l'aide d'un test biologique
et/ou biochimique des composés interagissant avec le site catalytique dudit
anticorps catalytique,
c) la sélection des composés non immunogènes reconnaissant
spécifiquement le site catalytique de l'anticorps parmi les composés
synthétisés
ou extraits à l'étape a) ou sélectionnés à l'étape b), à l'aide d'un test
permettant la mesure de ladite affinité.
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6a =
Un autre aspect de cette invention est un composé qui module l'activité d'un
anticorps
catalytique, dans lequel ledit composé a une affinité spécifique pour un site
catalytique
dudit anticorps, est non immunogène et est un ligand qui se lie à un
récepteur, ledit
composé étant un peptide constitué de la séquence d'acides aminés LNRRA (SEQ
ID
NO: 1).
Un autre aspect de cette invention est une composition pharmaceutique
comprenant
comme principe actif, le composé tel que décrit ci-dessus en combinaison avec
un
véhicule pharmaceutiquement acceptable,
Un anticorps catalytique est un anticorps capable de reconnaître de manière
spécifique
mais non exclusive, deux types de molécules:
l'antigène ou immunogène, c'est à dire une molécule susceptible d'induire une
réponse immunitaire directe par l'activation des lymphocytes B ou T
spécifiques selon la nature de l'antigène, et,
le substrat, qui reconnaît spécifiquement le site catalytique de l'anticorps
et,
comme son nom l'indique, est le substrat de la réaction chimique catalysée par
l'anticorps catalytique.
Par composé non immunogène , il faut comprendre un composé incapable
d'activer
directement des lymphocytes B ou T spécifiques (sélection clonale). Bien
entendu, il
faut garder à l'esprit que de tels composés non immunogènes sont cependant
capables
d'augmenter in vivo la production d'anticorps catalytiques de manière
indirecte
lorsqu'ils ont une
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affinité spécifique pour le site catalytique de l'anticorps, par le mécanisme
décrit ci-dessous :
Les anticorps catalytiques peuvent se présenter sous deux isoformes : une
isoforme dite non active ou peu active (ci-après nommé Ab), et une
isoforme dite active (ci-après nommé Ab*). L'isoforme active (Ab*)
présente une activité catalytique (ci-après nommé kcatl supérieure à celle
de l'isoforme non active (ci-après nommé kcat). En présençe d'un composé
(S) selon l'invention, la fixation dudit composé à l'anticorps catalytique
pour
former le complexe (Ab.S) déplace l'équilibre vers la formation du complexe
(Ab*.S), phénomène qui s'apparente au comportement allostérique illustré
à la figure 1. Le changement de conformation induit par le composé selon
l'invention conduit ainsi à la modulation in vivo de l'activité catalytique de
l'anticorps qui passe d'une valeur kt à une valeur Icce, la valeur kt* étant
différente de la valeur kcat=
Une modulation de l'activité catalytique peut ainsi être obtenue sur des
anticorps catalytiques présents dans le sérum de patients par l'injection
sous forme de pulse des composés selon l'invention, selon des méthodes
analogues à celles mises en oeuvre pour un vaccin.
De préférence, un composé selon l'invention est capable d'augmenter
l'activité d'un anticorps catalytique.
Le changement conformationnel de l'isoforme Ab vers l'isoforme Ab* peut
aussi conduire in vivo à une stimulation indirecte de la production de
nouveaux anticorps. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de
l'invention, un composé selon l'invention tel que défini plus haut est capable
de stimuler la production de l'anticorps catalytique dont il augmente
l'activité.
Par stimulation de la production, il faut bien comprendre qu'il ne s'agit pas
d'une production de novo de l'anticorps mais d'une augmentation de la
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production d'anticorps préexistant, par exemple suite à une première
immunisation avec un antigène.
Selon les applications recherchées d'un composé de l'invention, celui-ci est
avantageusement choisi dans un groupe comprenant :
- un substrat d'une enzyme ou l'un de ses analogues, inhibiteur ou
activateur ;
- un ligand se fixant sur un récepteur et notamment une hormone, une
drogue, un médicament ou l'un des ses fragments ou analogues ;
- un antibiotique ou l'un de ses analogues ;
- un polypeptide viral, bactérien ou parasitaire ;
- un xénobiotique récalcitrant et potentiellement toxique ; ou,
- un analogue d'allergène.
Par analogue de substrat d'enzyme, il faut comprendre les substrats non
immunogènes d'une enzyme et molécules dérivées, et en particulier les
analogues stables d'états de transition non immunogènes d'une enzyme ou
des inhibiteurs ou activateurs non immunogènes de cette enzyme. Les
analogues de substrat d'enzyme selon l'invention peuvent être notamment
des fragments d'anticorps reconnaissant spécifiquement le site catalytique
d'une enzyme.
De tels composés sont capables d'augmenter in vivo l'activité catalytique
et/ou la production. des anticorps catalytiques pour lesquels ils présentent
une affinité et peuvent ainsi compenser une activité enzymatique déficiente
ou réduite suite à une pathologie ou à un traitement thérapeutique, par
exemple.
Les activités enzymatiques déficientes ou réduites suite à une pathologie
ou à un traitement thérapeutique peuvent être par exemple des activités de
type hydrolase et en particulier des activités peptidase, protéase, des
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activités de type oxydoréductase (par exemple déshydrogénase, oxydase
ou oxygénase), des activités isomérases, des activités lyases et en
particulier décarboxylase, des activités transférase et en particulier des
activités kinase, ou encore des activités ligase.
A titre d'exemples de pathologies, on peut citer :
= l'anémie hémolytique chronique qui est la conséquence d'un déficit en
triose phosphage isomérase,
= la leucémiose qui est la conséquence d'un déficit en céto-acide
décarboxylase,
= le syndrome de Lesch-Nyhan qui est la conséquence d'un déficit en
hypoxanthine guanine phosphorisbosyl-transférase,
= l'acidurée glutarique type Il qui est la conséquence d'un déficit en
acétyl-CoA déshydrogénase, ou encore
= l'hyperglycérolémie qui est la conséquence d'un déficit en glycérol
kinase.
Il est important de souligner à ce stade que, de manière surprenante, un
composé selon l'invention, inhibiteur d'une enzyme est capable
d'augmenter l'activité catalytique d'un anticorps catalytique mimant
l'activité
de cette enzyme, via ses propriétés spécifiques vis-à-vis des anticorps
catalytiques, décrites ci-dessus, en dépit de ses propriétés inhibitrices.
Un substrat d'enzyme ou analogue entrant dans la définition des composés
selon l'invention peut donc être par exemple, selon la nature de l'enzyme
dont il est le substrat, un peptide, mais aussi un sucre ou l'un des ses
dérivés, un lipide ou l'un de ses dérivés, un nucléotide ou l'un de ses
dérivés ou encore un stéroïde ou l'un de ses dérivés.
Un exemple d'un tel analogue de substrat d'enzyme est un inhibiteur non
immunogène de l'activité p-lactamase, dont l'injection sous forme orale
peut induire la production d'anticorps hydrolysant les antibiotiques à noyau
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p-lactame. Ainsi un composé selon l'invention est en particulier un peptide
ayant une affinité pour le site actif de la 13-lactamase, et de manière encore
préférée, caractérisé en ce qu'il inhibe spécifiquement l'activité [3-
lactamase.
5 L'invention a trait aussi à un composé apte à augmenter in vivo le niveau
physiologique d'une activité enzymatique, caractérisé en ce qu'il comprend
un substrat non immunogène d'un anticorps catalytique ayant ladite activité
enzymatique ou l'un de ses analogues activateurs ou inhibiteurs et en ce
qu'il a une affinité spécifique pour le site catalytique dudit anticorps.
10 Dans une autre forme de réalisation préférée de l'invention, un composé
selon l'invention est un ligand se fixant sur un récepteur et notamment une
hormone, une drogue, un médicament, ou un de leurs fragments ou
analogues.
Selon les modes de réalisation, les composés décrits ci-dessus sont
capables d'augmenter l'activité catalytique d'anticorps catalytiques
dégradant les drogues, hormones ou médicaments dont ils dérivent ou dont
ils sont analogues.
Ainsi, l'invention porte également sur un composé apte à stimuler in vivo la
dégradation de médicaments ou de drogues par des anticorps catalytiques
spécifiques, caractérisé en ce qu'il est non immunogène, qu'il comprend
une drogue ou un médicament ou l'un de leurs fragments ou analogues et
en ce qu'il a une affinité spécifique pour le site catalytique dudit
anticorps.
Les fragments d'un ligand entrant dans la définition d'un composé selon
l'invention sont choisis parmi les fragments ayant retenu les propriétés de
fixation au récepteur. Lorsque le ligand est un polypeptide, des fragments
du ligand sont des peptides gardant les propriétés de fixation au récepteur.
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Un analogue d'un ligand est une molécule capable de se fixer au même
récepteur que le ligand. En particulier, il s'agit d'un agoniste ou d'un
antagoniste du récepteur sur lequel se fixe le ligand. Un tel analogue peut
être une molécule naturelle ou artificielle isolée à l'aide d'un criblage de
molécules se fixant sur un récepteur. Un exemple d'un tel ligand est un
fragment du TNF entrant dans la définition des composés selon l'invention
et capable de se fixer aux récepteurs cellulaires p55 et p75.
En particulier, un composé préféré est caractérisé en ce qu'il comprend un
peptide dérivé de la cytokine TNFa, ledit composé étant non immunogène
et présentant une affinité spécifique pour le site catalytique d'un anticorps
catalytique et ledit peptide contenant l'une des séquences d'acides aminés
suivantes :
LNRRA, IASVY ou LFA.
Un autre exemple de composé préféré est caractérisé en ce qu'il comprend
un peptide dérivé de la thyroglobuline.
Un autre exemple de composé préféré est la codéine, analogue de la
cocaïne et capable de stimuler par injection répétée, la production
d'anticorps catalytiques dégradant la cocaïne.
Dans une autre forme de réalisation préférée de l'invention, un composé
selon l'invention est choisi parmi les antibiotiques ou leurs analogues. Par
analogue d'antibiotique, il faut comprendre une molécule de structure
différente de la molécule antibiotique dont elle est l'analogue mais capable
de reproduire une fonction antibiotique similaire.
Dans une autre forme de réalisation préférée de l'invention, un composé
selon l'invention est choisi parmi un peptide viral, bactérien ou parasitaire.
De tels composés sont ainsi capables de stimuler la production catalytique
dégradant les protéines virales bactériennes ou parasitaires et permettent
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ainsi de lutter contre les infections virales, bactériennes ou parasitaires
correspondantes.
Des exemples de peptides particulièrement préférés sont les peptides non
immunogènes dérivés d'épitopes de surface ou de protéines de virulence
d'organismes pathogènes tels que les virus HIV, HSV ou HBV, de bactéries
pathogènes telles que Legionelia, Listeria, Staphylococcus, ou de parasites
tels que P. faciparum, Echinococcus, Leishmania ouTrypanosoma.
En particulier, un exemple d'un tel composé selon l'invention est un
composé caractérisé en ce qu'il comprend un peptide non immunogène
dérivé d'un épitope d'un virus Herpès.
Dans une autre forme de réalisation préférée de l'invention, un composé
selon l'invention est un xénobiotique récalcitrant et potentiellement toxique
ou l'un de ses fragments. On entend par xénobiotique récalcitrant toute
molécule étrangère à l'organisme susceptible de s'accumuler dans les
tissus ou le milieu intérieur d'un homme ou d'un animal. Certaines de ces
molécules, et notamment les pesticides (composés organophosphorés), la
dioxine ou les organochlorés (PCB, DDT...), sont potentiellement toxiques
pour l'organisme, en particulier sur le long terme.
L'accumulation dans l'organisme de certains xénobiotiques est en
particulier cancérigène ou neurotoxique.
L'invention vise par conséquent un composé apte à stimuler in vivo
l'hydrolyse de xénobiotiques potentiellement toxiques par des anticorps
catalytiques spécifiques, ledit composé étant caractérisé en ce qu'il est non
immunogène, qu'il comprend un xénobiotique récalcitrant et potentiellement
toxique, ou l'un de ses fragments et en ce qu'il a une affinité spécifique
pour le site catalytique dudit anticorps.
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Elle vise également l'utilisation d'un xénobiotique récalcitrant non
immunogène ou l'un de ses fragments ayant une affinité spécifique pour le
site catalytique d'un anticorps pour stimuler l'hydrolyse dudit xénobiotique
par lesdits anticorps catalytiques.
Selon encore une autre forme de réalisation de l'invention, un composé
selon l'invention est un analogue d'allergène.
On entend par allergène tout produit susceptible de 'déclencher une
réaction allergique. Un analogue d'allergène est une molécule dont la
structure mime l'allergène mais n'est pas immunogène. De tels analogues
d'allergènes selon l'invention, en augmentant l'activité catalytique
d'anticorps capables de dégrader, en particulier par hydrolyse, les
allergènes et en stimulant indirectement la production d'anticorps sériques
et sécrétoires, sont ainsi susceptibles de désensibiliser partiellement ou
totalement un sujet allergique.
Par conséquent, l'invention porte également sur un composé apte à
prévenir ou à diminuer une réaction allergique liée à un allergène
caractérisé en ce qu'il comprend un analogue non immunogène dudit
allergène et en ce qu'il a une affinité spécifique pour le site catalytique
dudit
anticorps.
Elle vise également l'utilisation d'un analogue non immunogène d'un
allergène ayant une affinité spécifique pour le site catalytique d'un
anticorps
pour prévenir ou diminuer une réaction allergique liée audit allergène.
Toute composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un
quelconque composé décrit ci-dessus fait également partie de l'invention.
Par composition pharmaceutique, on entend toute composition apte à être
administrée à l'homme ou à l'animal. Le principe actif peut être, le cas
échéant, associé à une autre molécule active dont la fonction est de
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moduler ou stimuler l'activité biologique du composé selon l'invention, ou
encore d'en diminuer les effets secondaires éventuels.
La composition comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement
acceptable.
Les véhicules utilisés dans la préparation des compositions
pharmaceutiques sont choisis de préférence parmi ceux généralement
utilisés dans les préparations vaccinales. Ils sont bien entendu choisis en
fonction du mode d'administration de la composition et de son utilisation.
L'invention porte également sur une utilisation d'un composé selon
l'invention dans la préparation d'une composition pharmaceutique pour le
traitement ou la prévention d'une pathologie liée à une déficience
enzymatique.
Elle vise aussi une utilisation d'un composé selon l'invention dans la
préparation d'une composition pour la stimulation de l'hydrolyse de
xénobiotiques, de drogues, de médicaments ou de toute autre molécule
potentiellement toxique pour l'organisme.
Elle vise en outre une utilisation d'un composé selon l'invention dans la
préparation d'une composition pour la prévention ou la désensibilisation
aux réactions allergiques.
Les anticorps catalytiques, outre leur propriétés catalytiques, reconnaissent
par leur région Fc, les récepteurs cellulaires, et en particulier les
récepteurs
présents sur les cellules présentatrices d'antigènes, les cellules
cytotoxiques et les macrophages, et plus généralement les différentes
cellules du système immunitaire. Il est donc important de souligner qu'en
stimulant la production d'anticorps catalytiques par les composés selon
l'invention, il est possible de cibler une activité catalytique donnée au
niveau d'une cellule reconnaissant l'anticorps catalytique.
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Lorsqu'il s'agit d'une reconnaissance de type non spécifique, c'est-à-dire
par exemple par les régions Fc des anticorps, l'activité catalytique peut être
ciblée sur les cellules du système immunitaire de type cellulaire, celle-ci
s'ajoutant alors à l'action sur le système humoral (synthèse des anticorps
5 recherchés par les lymphocytes B).
Lorsqu'il s'agit d'une reconnaissance spécifique d'un épitope donné, c'est-
à-dire par les régions paratopiques du Fab'2, l'un des épitopes reconnus
n'étant pas le substrat enzymatique de l'anticorps catalytique, les
composés selon l'invention permettent alors de cibler l'activité catalytique
10 sur une cible choisie, ladite cible comprenant ledit épitope. Il s'agit
ici
d'anticorps présentant une double-spécificité à la fois pour un épitope
spécifique et pour le substrat enzymatique. Ainsi, les composés selon
l'invention permettent de cibler une activité catalytique à des effecteurs du
système immunitaire et/ou inflammatoire.
15 L'invention porte enfin sur un procédé de sélection d'un composé selon
l'invention comprenant la sélection et l'isolement d'un anticorps catalytique
naturel ou induit par l'injection répétée d'une molécule immunogène,
caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes :
a) la synthèse et/ou l'extraction de composés dérivés d'une molécule
immunogène reconnue par l'anticorps catalytique isolé ;
b) le cas échéant, un premier criblage à l'aide d'un test biologique et/ou
biochimique des composés interagissant avec le site catalytique dudit
anticorps catalytique,
c) la sélection des composés non immunogènes présentant une affinité
spécifique pour le site catalytique de l'anticorps parmi les composés
synthétisés ou extraits à l'étape a) ou sélectionnés à l'étape b), à l'aide
d'un test permettant la mesure de ladite affinité.
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De nombreuses méthodes de sélection et d'isolement d'un anticorps
catalytique naturel ou induit par l'injection répétée d'une molécule
immunogène ont été décrites dans l'état de la technique et peuvent être
utilisées. L'homme du métier pourra en particulier se reporter aux
publications scientifiques décrivant l'isolement d'anticorps catalytiques
naturels ou induits et notamment : Blackburn G.M. et Garçon A. (2000) in
Biotechnology Vol. 8b, 2"d edition Wiley VCH pp 404-490, ainsi qu'aux
technologies d'isolement des anticorps monoclonaux connus de l'homme
du métier, et en particulier la technique des cultures d'hybridomes
développées par Kohler et Milstein (1975).
A l'étape (a) du procédé de l'invention, il s'agit d'obtenir des composés
dérivés d'une molécule immunogène reconnue par l'anticorps catalytique
sélectionné et isolé préalablement. Les composés peuvent être synthétisés
en particulier par chimie combinatoire, par biosynthèse ou par
bioconversion. La structure chimique des composés synthétisés en (a) peut
aussi être prédite à l'aide de méthodes bio-informatiques de prédiction de
structure chimique.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier, les composés sont dérivés
d'un peptide immunogène et sont synthétisés par mutagenèse d'un ADN
codant ledit peptide immunogène et par l'expression de l'ADN muté dans
une cellule hôte selon les méthodes de biologie moléculaire connues de
.
l'homme du métier telles que celles décrites par Sambrook et al. (Molecular
Cloning : a laboratory manuel, 3rd Ed. Cold Spring Harbor, Laboratory
press, New York, 2001).
Le cas échéant, en particulier lorsque les composés susceptibles d'interagir
avec le site catalytique sont mal connus, le procédé peut comporter une
première étape de criblage (étape (b) du procédé) à l'aide d'un test
biologique et/ou biochimique des composés interagissant avec le site
catalytique dudit anticorps. Cette étape consiste, après avoir généré un
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grand nombre de composés dérivés du composé immunogène, à
sélectionner dans un premier temps les composés ayant gardé la propriété
de se fixer à l'anticorps catalytique afin de réduire le nombre de composés
à cribler à l'étape (c). Tout test permettant d'identifier parmi un ensemble
de composés le ou les composés interagissant spécifiquement avec un
anticorps catalytique donné peut être utilisé dans le procédé de l'invention.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier du procédé, les composés
synthétisés ou extraits à l'étape (b) sont des peptides et sont sélectionnés à
l'aide d'un criblage biochimique de type test catELISA (Tawfik et aL 1993,
supra), un criblage sur puce à protéines ou un criblage par mesure de la
surface plasmonique de résonance.
Une puce à protéine est constituée d'un support sur lequel sont fixés à des
positions déterminées les différents peptides à cribler. Le marquage de
l'anticorps catalytique et la mise en contact avec la puce à protéine dans
des conditions permettant les interactions protéines-protéines permettent la
sélection des peptides interagissant spécifiquement avec l'anticorps
catalytique.
Les techniques de mesure de la surface plasmonique de résonance sont
connues de l'homme du métier et permettent d'en déduire les constantes
d'affinité entre deux molécules. De telles techniques peuvent être mises en
oeuvre aisément, notamment à l'aide du dispositif BlAcore (Silin V. et Plant
A (1997) Trends Biotechol. 15 :353-359).
De manière générale, toute méthode biochimique permettant de tester
l'interaction d'un peptide avec un anticorps, et en particulier les méthodes
dérivées du Western blot, peuvent être utilisées= dans le procédé de
l'invention pour procéder au criblage biochimique des composés
interagissant avec l'anticorps.
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On choisira de préférence des méthodes utilisables en routine et
permettant un criblage à haut débit des molécules.
On peut aussi utiliser les différents tests biologiques développés pour
détecter des interactions moléculaires et en particulier les interactions
entre
deux peptides ou deux polypeptides.
Dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, les
composés peptidiques sont sélectionnés par la technique du phage display
ou par la technique du double-hybride. Ces méthodes sont bien connues
de l'homme du métier et sont décrites dans Sambrook et al. (2001, supra).
Parmi l'ensemble des composés synthétisés et éventuellement
sélectionnés par le premier criblage, les composés selon l'invention sont
ensuite sélectionnés à l'étape (c) du procédé, à l'aide d'un test permettant
la mesure de l'affinité pour le site catalytique de l'anticorps.
Par exemple, un composé selon l'invention peut être sélectionné par
mesure de la vitesse de la réaction catalysée par l'anticorps catalytique en
présence soit du composé à tester, soit du composé immunogène de
référence. Lorsque la vitesse de la réaction catalysée par l'anticorps,
mesurée en présence du composé testé, est significativement supérieure à
celle mesurée en présence du composé immunogène de référence, le
composé testé est sélectionné.
Par conséquent, tout type de tests permettant de mesurer la constante
d'affinité des complexes composés-anticorps peut être utilisé pour
sélectionner les composés non immunogènes selon l'invention.
Un autre aspect de l'invention concerne des nouvelles méthodes de
traitement thérapeutique.
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En particulier, l'invention porte sur une méthode :
- de traitement thérapeutique ou de prévention d'une pathologie liée à
une déficience enzymatique,
- de stimulation de l'hydrolyse de xénobiotiques, de drogues, de
médicaments ou de toute autre molécule potentiellement toxique pour
l'organisme, ou
- de prévention ou de désensibilisation aux réactions allergiques.
Dans tous les cas, les méthodes comprennent l'administration à un
organisme, d'une composition pharmaceutique comprenant à titre
de principe actif un composé selon l'invention, seul ou en association avec
une autre substance pharmacologiquement active capable d'augmenter in
vivo l'activité d'un anticorps catalytique, en combinaison avec un véhicule
pharmaceutique approprié.
Les modes d'administration, la composition du véhicule et le dosage des
composés administrés pour le traitement seront choisis en fonction de
l'effet thérapeutique ou préventif recherché. Selon les cas, les formes
d'administrations peuvent être locales ou systémiques et en particulier
orale, sublinguale, intraveineuse, nasale, aérosol, intramusculaire, sous-
cutané ou alimentaire.
On remarquera que les méthodes de traitements de l'invention
s'apparenteront en général aux méthodes vaccinales, l'homme du métier
pourra se reporter notamment aux véhicules classiquement utilisés dans ce
domaine.
Les exemples qui suivent permettent d'illustrer certains modes de
réalisation de l'invention sans être toutefois limitatifs.
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LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : La figure 1 illustre le mécanisme d'adaptation induite (induced
fit)
permettant à un composé non immunogène de déplacer l'équilibre des
états conformationnels d'un anticorps catalytique des formes catalytiques
5 peu
actives ou non actives vers des formes des isomères actives. Le
déplacement de l'équilibre conduit in vivo à une augmentation de l'activité
catalytique de l'anticorps catalytique et indirectement à Lire stimulation de
sa production.
EXEMPLES
10 EXEMPLE
1 : Composé capable d'augmenter l'activité catalytique des IgA
sécrétées dirigées contre des épitopes du virus Herpes pour lutter contre
les infections au virus Herpès.
Les IgA sécrétées sont les principaux effecteurs du système immunitaire
des muqueuses. Elles sont notamment impliquées dans la reconnaissance
15 des
antigènes bactériens, viraux ou des protozoaires. Il a été montré en
particulier que des IgA extraites du lait maternel sain peuvent posséder des
activités catalytiques de type protéine kinase, DNase ou RNase (Buneva
V.N. et aL (1998) Appl. Biochem. Biotechnol. 75: 63-76, Nevinsky G.A. et
aL (1998) Appl. Biochem. Biotechnol. 75: 77-91).
20 Parmi
les IgA sécrétées, la production d'un anticorps catalytique dirigé
contre des épitopes du virus Herpes simplex virus type 1 pourrait être
stimulée par l'application cutanée de peptides non immunogènes sous
formes de patches. Les peptides non immunogènes choisis représentent
les séquences spécifiques des épitopes connus de l'HSV1.
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Une approche similaire peut être mise en uvre pour stimuler la production
d'anticorps catalytiques hydrolysant des peptides de HSV2, responsable de
l'herpes génital, ou de l'herpes Zoster, responsable du zona.
EXEMPLE 2: Composé capable d'augmenter l'activité catalytique d'un
anticorps hydrolysant certaines séquences peptidiques du TNFa pour le
traitement de l'arthrite rhumatoïde.
Le TNFa (tumor necrosis factor) est une cytokine qui joue un rôle central
dans les phénomènes inflammatoires rencontrés dans les maladies auto-
immunes comme l'arthrite rhumatoïde ou la myocardie auto-immune. Il joue
aussi un rôle en tant que régulateur d'autres cytokines pro-inflammatoires.
L'action inflammatoire du TNFa est liée à sa fixation à deux récepteurs
cellulaires, p55 et p75. Cette fixation met en jeu des boucles du TNFa
formées par les résidus 29-34, 84-91 et 143-148.
Des peptides non immunogènes et ayant une affinité spécifique avec un
anticorps catalytique capable d'hydrolyser le TNFa sont sélectionnés parmi
des peptides contenant les séquences LNRRA (29-33), IASVY (83-87) et
LFA (143-145). L'injection répétée de ces peptides chez un patient
souffrant d'arthrite rhumatoïde devrait permettre de stimuler in vivo la
production d'anticorps catalytiques hydrolysant le TNFa au niveau des
séquences de reconnaissance des récepteurs cellulaires, réduisant ainsi
les mécanismes inflammatoires liés à l'arthrite rhumatoïde.
EXEMPLE 3: Composé capable d'augmenter l'activité catalytique d'un
anticorps hydrolysant la cocaïne pour traiter les phénomènes
d'accoutumance aux drogues.
La consommation de drogues chez un sujet provoque un phénomène
d'accoutumance. La quantité de drogue circulant dans le sang après
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administration est directement reliée à l'effet stupéfiant et à l'accoutumance
qui s'en suit. L'immunisation d'un sujet à l'aide de peptides immunogènes
stimulant directement la production d'anticorps catalytiques hydrolysant la
cocaïne permet de diminuer, voire éliminer, la quantité de cocaïne
circulante. Afin d'augmenter l'activité catalytique de ces anticorps et de
stimuler indirectement leur production, il pourrait être injecté, de manière
répétée, par voie intraveineuse, de faibles concentrations de codéine, un
composé non immunogène proche de la cocaïne.
EXEMPLE 4: Composé capable d'augmenter l'activité catalytique d'un
anticorps à activité f3-lacta mase.
Le développement d'anticorps catalytiques à partir de sites actifs
enzymatiques par utilisation du réseau idiotypique a été démontré (Avalle
B. et al., Faseb J (1998) 12 :1055-1060). En particulier, à partir du site
actif
de la 8-lactamase, il a été obtenu un anticorps (Ab1) spécifique, inhibiteur
de l'activité 8-lactamase (Kosnikov et al., PNAS (2000) 97 13526-13531).
Cet anticorps permet la production d'une seconde génération d'anticorps
Ab2, anti-idiotypiques, et porteurs d'une activité proche de celle de la f3-
lactamase.
Ainsi, la létalité liée à l'injection répétée de pénicilline devrait être
diminuée,
en stimulant la production d'anticorps anti-idiotypique à activité 8-lactamase
par l'administration de peptides non immunogènes mimant le paratope de
l'anticorps induit en présence du site actif de la 13-lactamase.
EXEMPLE 5: Composé capable d'augmenter l'activité catalytique
d'anticorps hydrolysant un allergène pour diminuer ou prévenir une réaction
allergique.
Une désensibilisation spécifique induit à la fois l'augmentation des
anticorps bloquants sériques et sécrétoires, la diminution de la production
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d'IgE spécifiques et la modification de la réponse des mastocytes, des
basophiles ainsi que des lymphocytes.
L'administration à un sujet sensible d'un allergène d'une molécule non
immunogène dérivée de l'allergène devrait permettre de modifier la
réponse immunologique vers l'augmentation de la production d'anticorps
catalytiques dirigés contre cet allergène, une augmentation indirecte de la
production d'anticorps bloquant sériques et sécrétoires et, la diminution de
la production d'IgE spécifiques, compte tenu de l'hydrolyse de l'allergène.
L'ensemble de ces réponses permet de diminuer ou de prévenir la réaction
allergique.
Les trois exemples ci-après illustrent cette application :
A. Peptides non immunogènes pour prévenir ou diminuer les allergies
aux médicaments anti-infectieux.
Les antibiotiques sont les molécules les plus souvent incriminées dans les
réactions d'allergies aux médicaments anti-infectieux (50% des cas). On
sait notamment que l'allergénicité est dans la grande majorité des cas
portée par le cycle 13-lactame. En étant clivé au cours du métabolisme, le
cycle p-lactame donne l'haptène pénicilloyl qui est capable d'induire la
production d'IgE.
Il serait donc possible à l'aide de peptides non immunogènes inhibiteurs de
l'activité 13-lactamase, injectés sous forme orale, d'induire la production
d'anticorps non IgE capables d'hydrolyser les antibiotiques à noyau 13-
lactame, empêchant alors la production d'anticorps IgE.
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B. Peptides non immunogènes stimulant la production d'anticorps
catalytique hydrolysant la sérotonine pour prévenir ou diminuer les
allergies alimentaires.
Depuis plusieurs années, on assiste à une augmentation alarmante des
allergies alimentaires. Ce phénomène est apparu de façon concomitante
avec une modification de nos habitudes alimentaires : on assiste à une
augmentation importante de la quantité de certains médiateurs histamino-
libérateurs dans divers aliments frais : l'histamine, la sérotonine, la
tyramine
etc... Ces produits peuvent circuler dans le sang, d'autant plus facilement
que la paroi intestinale est immature (cas du jeune enfant) et induire des
phénomènes d'allergie par médiation cellulaire. La sérotonine (5-
hydroxytryptamine) par exemple est dérivée du tryptophane et dégradée en
5-hydroxyindole acétique.
Il serait donc possible de sélectionner des peptides non immunogènes
dérivés de la sérotonine et ayant une affinité spécifique pour un anticorps
catalytique hydrolysant la sérotonine. L'injection par voie orale de tels
peptides stimulant la production d'anticorps catalytique dégradant l'excès
de sérotonine devrait permettre de réduire les phénomènes allergiques liés
à l'alimentation.
C. Peptides non immunogènes stimulant la production d'anticorps
catalytiques hydrolysant les protéines d'arachide.
L'allergie à l'arachide affecte un nombre de plus en plus important
d'individus. La gravité des chocs auxquels elle donne lieu ainsi que sa
fréquence sont en augmentation. Parmi les nombreux allergènes détectés
sinon caractérisés, une protéine de 17 kD, l'Ara h Il a été identifiée comme
allergène majeur et caractérisé. Des comparaisons de séquences ont
permis d'identifier des homologies de séquences avec des protéines de
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différents aliments de la famille des légumineuses qui pourraient provoquer
des sensibilisations croisées.
L'absorption par voie orale de tels peptides non immunogènes stimulant la
production d'anticorps catalytiques dégradant les protéines des
5 légumineuses responsables de ces allergies devrait permettre de réduire
ces phénomènes allergiques.
