Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
DEMANDES OU BREVETS VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE I)E CETTE DEMANDE OU CE BREVETS
COMPRI~:ND PLUS D'UN TOME.
CECI EST ~.E TOME 1 DE 2
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Brevets.
JUMBO APPLICATIONS / PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION / PATENT CONTAINS MORE
THAN ONE VOLUME.
TRIS IS VOLUME 1 OF 2
NOTE: For additional vohxmes please contact the Canadian Patent Oi~ice.
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METHODE D'INDUCTION D'UNE ACTIVITE ARNi SPECIFIQUE DANS DES
CELLULES ET ACIDES NUCLEIQUES POUR SA MISE EN CEUVRE
L'invention concerne le domaine de la biologie et plus
particulièrement la préparation d'oligonucléotides, double brin, destinés à
être
utilisés dans un processus d'interférence ARN (RNAi ou ARNi) dans le but
d'induire la dégradation d'un ARN cible.
L'interférence ARN désignée aussi « RNAi » ou encore co-
suppression, a été mise en évidence dans les plantes, où il a été observé que
l'introduction d'un long ARN double brin, correspondant à un gène, induit la
répression spécifique et efficace de l'expression du gène ciblé. Le mécanisme
de cette interférence comporte la dégradation de l'ARN double brin en courts
duplex d'oligonucléotides d'environ 20 à 22 nucléotides appelés siRNAs.
L'interférence ARN a maintenant été appliquée aux mammifères
pour inhiber spécifiquement l'expression des gènes pour des applications en
génétique fonctionnelle. En effet, les siRNAs permettent d'identifier la
fonction
des gènes mis en évidence par le séquençage du génome humain, soit dans
des modèles de culture cellulaire, soit dans des modèles animaux en
particulier
chez la souris. L'interférence ARN est aussi utile dans le domaine
thérapeutique pour le traitement ou la prévention de cancers, de maladies
infectieuses et plus généralement de maladies mettant en jeu un gène
hétérologue ou homologue muté (Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W.,
Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001 a). Duplexes of 21-nucleotide RNAs
mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498 ;
Elbashir, S. M., Martinet, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W., and Tuschl, T.
(2001 b). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in
Drosophila .melanogaster embryo lysate. Embo J 20, 6877-6888).
Les siRNAs sont de courtes séquences d'ARN double brin, qui
peuvent être introduites dans les cellules sous forme d'oligonucléotides
synthétiques ou sous forme de vecteurs permettant l'expression de ces siRNAs.
Dans cette dernière approche, le siRNA est synthétisé sous la forme d'un
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précurseur qui est un shRNA (short hairpin RNA), formé d'une "tige boucle"
dans laquelle la tige représente le siRNA et la boucle une séquence
quelconque qui sera dégradée par les RNAases cellulaires, ce qui va donner
naissance au siRNA mature.
La mise en oeuvre de vecteurs d'expression de siRNAs présente de
nombreux avantages, en particulier pour les applications de génétique
fonctionnelle. Elle permet d'exprimer l'ARN double brin de manière stable dans
les cellules, et donc d'inhiber plus facilement l'expression des protéines à
longue demi-vie. En effet, les siRNAs synthétiques ont une durée de demi-vie
1o de 3 jours dans les cellules de mammifères. De plus, les siRNA sont dilués
au
cours des divisions cellulaires.
Elle permet aussi d'analyser des effets à long terme. Par contre, elle
nécessite d'établir des lignées exprimant la construction de manière stable,
ce
qui présente plusieurs inconvénients. En particulier, il faut comparer des
lignées
stables entre elles, ce qui est en général difficile d'interprétation parce
que les
lignées cellulaires dérivent. D'autre part, il est impossible d'étudier les
protéines
indispensables pour la cellule, puisque leur inhibition bloquera la
prolifération
des cellules et empêchera donc l'établissement de la lignée stable. II est
donc
indispensable de pouvoir induire l'activité du siRNA. On entend par induire
l'activité du siRNA pouvoir bloquer et débloquer son activité à volonté. On
entend par activité du siRNA sa capacité à reconnaïtre et à induire la
dégradation de son ARN cible.
II est décrit dans l'art antérieur un vecteur permettant l'expression
stable et inductible de siRNA. Ce système est basé sur l'inhibition de la
transcription du précurseur du siRNA. En effet, le vecteur, dérivé du vecteur
pSUPER (Brummellcamp T. R et al., www.sciencexpress.org/21 March
2002/page 1/10.1126/science.1068999 ), contient une séquence connue,
"l'opérateur tetracycline" ("opérateur TET"), positionnée entre le promoteur
dirigeant la transcription du siRNA et la séquence codant ledit siRNA. En
présence de la protéine "répresseur TET", celle-ci se fixe sur "l'opérateur
TET"
et bloque ainsi la transcription du siRNA. En présence de doxycycline, celle-
ci
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inhibe la fixation de la protéine "répresseur TET", sur "l'opérateur TET" et
permet donc la transcription du siRNA. Ce système d'expression engendre un
bruit de fond d'activité relativement élevé.
De plus, les systèmes inductibles basés sur les promoteurs
fonctionnent très mal dans les vecteurs viraux, parce que les promoteurs
viraux
prennent le pas sur les promoteurs inductibles et le bruit de fond est très
élevé.
L'invention vise précisément à palier ces inconvénients en offrant un
système permettant d'induire à volonté l'activité d'un siRNA.
Ce but est atteint par la présente invention grâce à l'emploi du couple
1o protéine TAT-séquence ARN TAR pour bloquer l'activité d'un siRNA dans des
cellules de mammifères.
Le principe de l'invention est basé sur l'interaction TAT/TAR. En
effet, le siRNA doit étre reconnu dans la cellule par un complexe protéique,
appelé complexe RISC (RNA-Induced Silencing Complex), qui va lui faire subir
une étape de maturation et l'utiliser comme guide pour reconnaitre et dégrader
le mRNA cible. La protéine TAT peut étre utlisée pour bloquer cette dernière
étape.
La protéine TAT du VIH joue un rôle crucial dans la réplication virale.
En effet, en tant que facteur de transcription, TAT régule la vitesse de
réplication du virus. TAT est une protéine sécrétée capable de diffuser dans
les
cellules non-infectées et de préparer un environnement propice à l'infection
virale. La protéine TAT existe sous deux formes (71 et 101 acides aminés)
codées par deux exons séparés par le gène env. TAT exerce sa fonction
d'activateur du promoteur du VIH en se liant à la séquence d'ARN TAR
présente en 5' de tous les ARN du VIH.
La liaison de TAT et de ses co-activateurs transcriptionnels
cellulaires à l'ARN TAR va stimuler l'élongation de la transcription en
augmentant la processivité de l'ARN polymérase II.
La présence d'ARNs double brins dans une cellule représente un
3o signal : il met en jeu une RNaselll nommée Dicer. Cette ribonucléase coupe
les
longs ARN double brin en petits fragments d'ARN double brin, les siRNAs, de
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taille et de structure précises, en général 21 à 23 nucléotides. Les siRNAs
duplexes s'associent ensuite avec des protéines pour former un complexe
nommé RISC (pour « RNA-Induced Silencing Complex »). RISC est donc un
complexe ribonucléoprotéique contenant une molécule de siRNA associée à
des protéines appartenant à la famille Argonaute. RISC guide, grâce à
l'extrémité 5'Phosphate d'un siRNA simple brin, les petits siRNAs pour la
reconnaissance spécifique de la séquence de l'ARN messager cible et catalyse
son clivage ; cette réaction a lieu dans le cytoplasme. Cela aboutit à
l'inhibition
de la traduction et ainsi à l'inhibition de l'expression du gène cible.
Selon l'invention, la boucle du précurseur du siRNA (shRNA),
normalement constituée de séquence quelconque, est remplacée par une
séquence nucléotidique codant pour au moins une séquence en nucléotides
contenue dans la séquence TAR, minimale et suffisante pour étre reconnue par
la protéine TAT.
Ladite séquence référencée dans la liste de séquences soumise en
annexe sous le numéro SEQ ID N° 1, est composée de 11 nucléotides et
présente l'enchaînement suivant : ATCTGAGCTCT (ou AUCUGAGCUCU sous
sa forme ARN).
II est également possible d'utiliser selon l'invention, une séquence
2o codant pour la totalité de la séquence TAR sauvage ou mutée ou tout
fragment
de celle-ci contenant ladite séquence en nucléotides, minimale non-mutée ci-
dessus décrite. Cette séquence (ADN ou ARN) est dénommée par ailleurs dans
le texte séquence séparatrice.
La séquence séparatrice utilisée selon l'invention peut ëtre naturelle
ou synthétique.
Ainsi, en présence de la protéine TAT, celle-ci interagit avec la
boucle TAR sur le shRNA, et l'interaction du siRNA avec le complexe protéique
de maturation (complexe RISC) ne peut se réaliser et le siRNA ne subit pas les
étapes de maturation induites par ledit complexe et reste donc inactif c'est-à-
3o dire sous la forme shRNA.
En l'absence de la protéine TAT, la boucle TAR du shRNA est
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dégradée et le siRNA résultant est accessible au complexe de maturation RISC
et le processus de dégradation de l'ARN cible par l'ARNi peut ainsi
s'effectuer.
L'invention a donc pour objet une méthode d'induction de l'activité
d'un ARNi dans des cellules dans laquelle
5 - on introduit dans des cellules eucaryotes la protéine TAT et un
acide nucléique codant pour les séquences sens et antisens d'un
ARNi d'intérêt, lesdites séquences sens et antisens étant
séparées par une séquence nucléotidique comprenant au moins
la séquence référencée sous le numéro SEQ ID N° 1 dans la
liste de séquences fournie en annexe, codant pour au moins une
séquence en nucléotides contenue dans la séquence TAR,
minimale et suffisante pour être reconnue par la protéine TAT,
dans des conditions où l'acide nucléique est transcrit en ARN,
ladite séquence séparatrice transcrite et la protéine TAT formant
un complexe inhibant l'activité de l'ARNi d'intérêt ;
- on induit l'activité de l'ARNi en retirant la protéine TAT.
La séquence séparatrice peut être constituée par toute séquence
nucléotidique pourvu qu'elle comprenne au moins la séquence SEQ ID N°1.
Avantageusement la séquence séparatrice est constituée d'une séquence
2o codant pour la séquence TAR complète, sauvage ou mutée, ou d'un fragment
de celle-ci comprenant une séquence codant pour la séquence SEQ ID N°1.
Selon une forme particulière de mise en ceuvre de la méthode de
l'invention, ledit acide nucléique codant pour les séquences comprenant les
séquences sens et antisens d'un ARNi d'intérêt séparées par la séquence
séparatrice ci-dessus décrite peut être introduite dans la cellule sous la
forme
d'un vecteur d'expression, particulièrement sous la forme d'un plasmide ou
d'un
vecteur viral.
Dans cette forme de réalisation, l'ARNi d'intérêt sera transcrit à partir
du vecteur codant pour le shRNA qui va donner naissance au siRNA après
clivage de la séquence séparatrice simple brin. Ainsi, le vecteur comprend au
moins une séquence en nucléotides codant pour les séquences sens et
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antisens du siRNA séparées par une séquence nucléotidique comprenant au
moins la séquence référencée sous le numéro SEQ ID N° 1, sous la
dépendance d'un promoteur de transcription.
Ledit acide nucléique décrit ci-dessus permet la mise en oeuvre de la
méthode d'induction de l'activité d'un ARNi dans des cellules eucaryotes.
Le vecteur peut en outre comprendre un gène de résistance à un
antibiotique. Avantageusement selon l'invention, le gène de résistance à un
antibiotique est un gène de résistance à la néomycine.
La présence d'un gène de résistance à un antibiotique, comme la
néomycine, permet de sélectionner les cellules transfectées.
Selon l'invention, lorsque les cellules sont des cellules en culture, la
protéine TAT peut être introduite dans lesdites cellules par simple culture
des
cellules dans un milieu comprenant la protéine TAT.
En effet, un avantage de la présente invention réside dans le fait que
la protéine TAT pénètre spontanément dans les cellules lorsque celles-ci sont
cultivées dans un milieu de culture contenant la protéine TAT. II est donc
facile
de bloquer l'action du siRNA, comprenant la séquence séparatrice TAR telle
que décrite précédemment, en cultivant les cellules contenant le siRNA dans un
milieu de culture contenant de la protéine TAT, et de stimuler l'activité de
l'ARNi
en cultivant lesdites cellules dans un milieu de culture sans protéine TAT, ce
qui
conduira à la dégradation de l'ARN cible par le l'ARNi.
Dans ces conditions le milieu de culture peut contenir la protéine
TAT en une concentration comprise entre 0,1 ~u g/ml et 5 ~,g/ml
préférentiellement 0,5 ~,g/ml et 1,5 ~,g/ml et très préférentiellement 1
~,g/ml.
La protéine TAT peut aussi étre introduite dans la cellule sous la
forme d'un vecteur d'expression inductible comprenant une séquence
nucléotidique codant pour la protéine TAT. Dans ce cas, l'expression de la
protéine pourra être induite ce qui aura comme conséquence d'inhiber
l'activité
de l'ARNi et donc de bloquer la dégradation de l'ARN cible par l'ARNi. La
3o dégradation de l'ARN cible par l'ARNi pourra alors être induite lorsque la
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synthèse de la protéine TAT sera elle-même bloquée.
Selon l'invention, les cellules transfectées avec l'acide nucléique
selon l'invention sont des cellules de mammifères. La méthode s'applique aussi
bien à la transfection de cellules en culture que directement chez l'animal.
L'invention permet d'analyser de manière fiable les gènes,
particulièrement les gènes humains d'un point de vue fonctionnel, dans des
cellules en culture ou dans des animaux, en particulier dans des souris.
L'invention se rapporte encore à une cellule ou une lignée de cellules
dans laquelle un acide nucléique selon l'invention, tel que décrit
précédemment
a été introduit.
L'invention se rapporte aussi aux animaux comprenant des cellules
dans lesquelles l'acide nucléique selon l'invention tel que décrit
précédemment
a été introduit.
L'invention a enfin pour objet des compositions, notamment
pharmaceutiques, comprenant comme substance active au moins un acide
nucléique selon l'invention tel que décrit précédemment ou des cellules
contenant ledit acide nucléique, telles que décrites précédemment,
éventuellement associées dans la composition à un excipient compatible.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des
2 o exemples qui suivent et dans lesquels il sera fait référence au dessin en
annexe
dans lequel la figure 1 représente l'inhibition du marqueur GFP par l'ARNi.
Exemple 1 : construction du plasmide pTATOF-siRNAGFP codant
pour un ARNi dont la cible est l'ARN messager codant pour la protéine
fluorescente verte (Green Fluorescent Protein : GFP)
Ce plasmide est construit à partir du plasmide pSUPER, permettant
l'expression constitutive de siRNA et décrit par Brummelkamp et al.
La séquence d'ADN (oligonucléotide ADN synthétique synthétisé à
façon), contenant dans l'ordre les séquences SEQ ID N°2 (codant pour le
siRNA sens)-SEQ ID N°1 (codant pour la séquence séparatrice)-SEQ ID
N°3
(codant pour le siRNA anti-sens) est introduite immédiatement en aval du
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promoteur H1 du plasmide pSuper aux sites Bgl II en 5', et Hind III en 3'. On
obtient ainsi le vecteur d'expression pTATOF-siRNAGFP.
(SEQ ID NO. 2) codant pour le siRNA sens
5' GCAAGCTGACCCTGAAGTTC 3'
3' CGTTCGACTGGGACTTCAAG 5'
séquence codant pour la séquence séparatrice (SEQ ID NO. 1 )
5' ATCTGAGCTCT 3'
3' TAGACTCGAGA 5'
(SEQ ID NO. 3) codant pour le siRNA anti-sens
5' GAACTTCAGGGTCAGCTTGC 3'
3' CTTGAAGTCCCAGTCGAACG 5'
Ainsi, les séquences codant pour les siRNA sens et anti-sens sont
séparées par une boucle TAR minimale, codée par la séquence séparatrice
nommée SEQ ID N0.1, codant pour la séquence minimale reconnue par la
protéine TAT (SEQ ID NO. 4).
Codant pour le SiRNA
5' 3'
GCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGAGCTCTGAACTTCAGGGTCAGCTTGC
CGTTCGACTGGGACTTCAAGTAGACTCGAGACTTGAAGTCCCAGTCGAACG
3' 5'
Codant pour le SiRNA complémentaire
Exemple 2 : inhibition de l'expression de la GFP par le siRNAGFP
exprimé par le vecteur de l'exemple 1
Des cellules de mammifères COS-7 sont transfectées avec du
polyfect (Qiagen) avec 4 pg de vecteurs d'expression des siRNA
(pTATOFsiRNAGFP, partie A, ou pSuper siRNAGFP sans boucle TAR, partie
2o B), ainsi qu'un vecteur d'expression de la Green Fluorescent Protein ou GFP
(500 ng). Soixante heures après la transfection, un western blot a été réalisé
à
partir des extraits totaux en utilisant un anticorps dirigé contre la GFP
(Santa
cruz) ou la tubuline cellulaire (Sigma) afin d'évaluer la quantité de
protéines
utilisée pour ce test.
Les cellules sont cultivées dans du milieu DMEM (Gibco) contenant
10% de sérum de veau foetal en présence (wt) ou en l'absence (-) d'un vecteur
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d'expression (0,5 pg) de la protéine TAT ou de ses mutants, co-transfectés
(Bres V, et al. Nat Cell Biol. 2003 Aug;S(8):754-61).
Un témoin est réalisé avec des cellules n'ayant pas reçu le vecteur
d'expression des sïRNA (pTATOF-siRNAGFP ou pSuper siRNAGFP), cultivées
en l'absence de protéine TAT. De même des témoins sont réalisés avec un
vecteur d'expression de la protéine TAT mutée (incapable de lier la séquence
TAR) en présence du vecteur d'expression des siRNA (pTATOF-siRNAGFP ou
pSuper siRNAGFP).
La Figure 1 montre les résultats de cette expérience
Partie A
En l'absence de protéine TAT et de vecteur pTATOF-siRNAGFP, la
GFP est présente dans les cellules (colonne 1 ).
En l'absence de protéine TAT et en présence du vecteur pTATOF-
siRNAGFP, la GFP est dégradée (colonne 2).
En présence de protéine TAT sauvage et du vecteur pTATOF-
siRNAGFP, la GFP est présente dans les cellules (colonne 3) en quantité
comparable à celle présente dans les cellules n'ayant pas reçu de protéine TAT
ni de vecteur pTATOF-siRNAGFP (colonne 1 ), et n'est donc pas dégradée.
En présence de protéine TAT mutée et du vecteur pTATOF-
2o siRNAGFP, la GFP est dégradée dans les cellules (colonne 4 et 5).
Partie B
En l'absence de protéine TAT et de vecteur pSupersiRNAGFP (sans
séquence TAR), la GFP est présente dans les cellules (colonne 1 ).
En l'absence de protéine TAT et en présence du vecteur
pSupersiRNAGFP, la GFP est dégradée (colonne 2).
En présence de protéine TAT sauvage ou mutée et du vecteur
pSupersiRNAGFP,) la GFP est dégradée dans les cellules (colonne 1, 4 et 5).
Ceci démontre que la protéine TAT sauvage reconnait la séquence
séparatrice intercalée entre les séquences sens et antisens de siRNA et bloque
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son activité alors qu'une protéine TAT mutée, incapable de reconnaître la
séquence séparatrice n'a pas d'effet sur le siRNA qui apparaît parfaitement
fonctionnel.
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