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MÉTHODE D'ETUDE DE LA VARIABILITE GENIQUE ET
FONCTIONNELLE DU VIH ET KIT POUR SA'MISE EN ~UVRE.
La présente invention concerne le domaine
de l'analyse du virus de l'Immunodéficience Humaine de
type 1 (VIH-1). Plus particulièrement l'invention se
rapporte à une méthode et ses moyens de mise en aeuvre
pour l'investigation de la variabilité génique et
fonctionnelle du VIH.
Le Virus de l'Immunodéficience Humaine de
type 1 (VIH-1) est un rétrovirus enveloppé dont le
génome code notamment pour trois enzymes distinctes :
la Transcriptase Inverse qui transcrit l'ARN viral en
ADN double brin, l'intégrase qui permet l'intégration
de l'ADN"viral dans le génome de la cellule cible et la
protéase qui est nécessaire pour la maturation des
virions. Les enzymes virales, Transcriptase Inverse
(RT) et protéase (PR) vont être les principales cibles
des anti-rétroviraux.
Actuellement une quinzaine molécules anti-
rétrovirales inhibant la Transcriptase Inverse et la
protéase sont utilisées en pratique clinique.
L'utilisation combinée de ces inhibiteurs conduit à de
fortes diminutions de la réplication virale, mais ces
associations de drogues sont souvent compliquées par
d'importants effets secondaires, une faible compliance
et le développement de souches virales résistantes aux
anti-rétroviraux.
Une des causes majeures d'échec des
traitements du Virus de l'Immunodéficience Humaine
(VIH) est l'émergence de virus mutants résistants aux
traitements antiviraux qui apparaissent lbrsque la
suppression de la réplication virale est incomplète.
L'échappement à la pression exercée par les drogues
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entraîne l'apparition de mutations dans les enzymes et
protéines virales (RT et PR) qui jouent un rôle
important dans la réplication et l'infectivité virale
(Fitness). Les virus résistants peuvent présenter une
infectivité réduite en comparaison aux virus
sauvages . Cliniquement, il apparaît important de
disposer dans le même temps d'informations sur la
variabilité génique et fonctionnelle sur les 2
principales cibles puisque ces traitements sont
associés en pratique clinique. Aujourd'hui, un tel
outil n'est pas disponible. Les tests présents ne sont
pas suffisants, à partir du même échantillon viral de
patient, pour explorer dans le même temps les mutations
connues et inconnues et l'infectivité en présence ou en
absence de drogues ceci sur au moins 2 cibles géniques
d'intérêt.
Les différents tests diagnostics actuels
permettent de juger soit de la variabilité génique
(génotype) soit de la variabilité fonctionnelle
(phénotype et capacité réplicative) des virus de
patients infectés par le VIH aux antiviraux (Figure
1)
- Tests génotypiques de Résistance
- Tests Phénotypiques de Résistance
- Tests de réplication virale
- Tests associés
Les tests génotypiques de Résistance.
Dans les tests de résistance génotypiques,
l'ARN viral, dérivé du plasma est extrait puis les
régions codant pour la transcriptase inverse et la
protéase sont analysées.
Aujourd'hui, leur méthode d'analyse repose
sur la position de l'acide aminé muté précédé et suivi
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par une lettre indiquant l'acide aminé sauvage et
le mutant respectivement. Par exemple, pour la mutation
de résistance à la lamivudine M184V, la Valine remplace
la Méthionine en position 184 de la RT.
Les tests actuels utilisent majoritairement
des techniques de séquençage automatique des gènes
cibles. Ces tests détectent toutes les mutations
présentes dans la région séquencée mais ne peuvent pas
toutes les interpréter. En effet, seules les mutations
connues sont interprétées en fonction d'algorithmes qui
sont remis à jour régulièrement par des comités
d'experts internationaux. Ces algorithmes sont devenus
de plus en plus complexes avec les associations
thérapeutiques en croissance et plus de 15 drogues
disponibles sur le marché.
D'autres tests, comme le Line Probe
Assay (LiPA) ou les Gene Chips proposés par la
Société Affymetrix, sont basés sur des techniques
d'hybridation et utilisent des sondes spécifiques
limitées à l'identification de certaines mutations.
L'interprétation des résultats des tests
génotypiques est complexe en raison de la difficulté à
estimer les effets cumulatifs de mutations multiples
dont certaines peuvent avoir des effets additifs tandis
que d'autres vont restaurer la sensibilité.
Les tests Phénotypiques de Résistance.
Le principe des tests de résistance
phénotypique repose sur la mesure in vitro de la
croissance d'un virus de patient en présence de
drogues.
Dans les tests phénotypiques, l'ARN viral,
dérivé du plasma est extrait puis les régions codant
pour la transcriptase inverse et/ou la protéase sont
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amplifiées par PCR. Les amplicons sont recombinés in
vitro dans un vecteur défectif pour former une
particule virale. Cette particule virale est mise en
culture en présence de concentrations croissantes de
drogues. Les résultats sont exprimés en ratio fold
change de l'IC 50 (ou IC90) vis-à-vis d'un virus
contrôle, qui correspond à la concentration de la
drogue qui inhibe 50% (ou 90%) de la réplication virale
en comparaison au virus sauvage de référence. Le niveau
de résistance est défini en fonction de seuils de
sensibilité (cut off).
Trois principaux tests de, résistance
Phénotypique sont actuellement disponibles sur le
marché : PhenoSenseTM (Virologic, USA), AntivirogramT"
(Virco, Belgique) et PhenoscriptTM (VIRalliance,
France). Ces tests donnent des renseignements sur la
susceptibilité des drogues vis-à-vis de leur cible mais
ne préjugent pas de l'impact de mutations sentinelles
sur l'évolution de la résistance du virus.
Ces deux informations, génotype et
phénotype, ont pu être regroupées pour valider la
technique mais dans ce cas la méthodologie inclut une
étape comprenant la construction d'un vecteur de
recombinaison par ligation (Parkin et al 2004,
Antimicrob. Agents Chemother. 48 :437) ou nécessite de
multiples cycles d'infections pour le phénotypage
(demande de brevet PCT W00233638). Ces deux approches
techniques peuvent introduire un biais dans la
représentativité du virus du patient.
D'autre part, les tests de phénotypage
actuels ne sont pas conçus pour être compatibles avec
les tests de génotypage en usage sauf pour une
utilisation interne.
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Les tests de réplication virale.
Les mutations de résistance induites par
les inhibiteurs de protéase et de transcriptase inverse
sont connues pour modifier la capacité réplicative des
5 virus du VIH.
Les tests de détermination de la capacité
réplicative in vitro sont basés sur l'utilisation d'un
plasmide recombinant, transfecté puis amplifié en
culture cellulaire. Après normalisation de la quantité
de virus, le surnageant viral est utilisé pour infecter
de nouvelles cellules. La capacité réplicative est
alors évaluée sur une période donnée, correspondant à
un unique cycle ou plusieurs cycles de réplication
selon la méthodologie utilisée. La capacité réplicative
d'un variant muté s'exprime d'une façon générale
comparativement à celle d'un variant sauvage.
La qualification d'un virus de forte
infectivité est aujourd'hui déconnectée de sa
variabilité génique et fonctionnelle à partir du même
prélèvement de patient.
Les tests associés.
La demande de brevet PCT W00233638 décrit
la possibilité de réaliser un phénotype et un génotype
à partir d'un même produit d'amplification. Cependant,
la technique de phénotypage utilisée ne décrit pas un
cycle unique de réplication virale. Dans un premier
temps, elle nécessite une production virale dans des
cellules permissives permettant dans un deuxième temps
la réinfection de cellules indicatrices pour mesurer
les IC50 (demande de brevet PCT W09727480). Ces étapes
sont peu représentatives des populations virales
initiales du patient en raison de cycles multiples
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d'infection sans la pression de sélection des drogues
avec le risque d'évolution du virus initial.
La demande de brevet PCT W02004003513
propose une méthode de génotypage, phénotypage et par
ailleurs de capacité réplicative, centrées sur la
construction par ligation d'un vecteur de recombinaison
contenant un gène rapporteur et la séquence étudiée.
Cette méthode est aussi moins représentative de la
réalité du comportement du virus au cours de
l'infection du patient. Le clonage par ligation est
intéressant pour le rendement de recombinaison, mais
peut introduire des biais dans la sélection des
populations virales initiales du patient.
Les tests décrits dans la demande de brevet
PCT W00238792, permettent de mesurer l'infectivité
(capacité réplicative) et le phénotype à partir du même
vecteur de recombinaison. En particulier, le grand
fragment (>2800 pb) codant pour une partie du gène gag
et des régions du cadre de lecture du gène pol codant
pour la protéase et la transcriptase inverse, peut être
utilisé pour déterminer la capacité réplicative du
virus. Or, ce grand fragment, en pratique courante, ne
permet pas d'obtenir un taux de succès d'amplification
et un taux de réplication suffisant pour permettre la
mesure de l'infectivité. Les étapes suivantes ne sont
donc pas réalisables, ce qui limite l'usage de ce grand
fragment.
Les méthodes d'étude du virus VIH décrites
dans l'art antérieur sont limitées par la difficulté à
réaliser à la fois une bonne représentativité du
comportement du virus (recombinaison homologue), un
niveau d'amplification et de réplication suffisants y
compris pour des virus très mutés. La méthode de
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l'invention permet maintenant de renseigner et mieux
interpréter les données du virus et les données du
traitement du malade à partir du même prélèvement.
Il existe en effet aujourd'hui un besoin
important pour une stratégie permettant, à partir d'un
même échantillon biologique d'un patient atteint par le
VIH, d'obtenir une mesure de la résistance génotypique,
phénotypique et de la capacité réplicative du virus.
La présente invention a précisément pour
but d'offrir une nouvelle stratégie permettant, à
partir d'un même échantillon biologique d'un patient
infecté par le VIH, d'obtenir une mesure de la
résistance génotypique, phénotypique et de la capacité
réplicative du virus, de façon à disposer d'une
meilleure compréhension de la situation du patient et
donc de réaliser une meilleure orientation
thérapeutique.
Ce but est atteint selon l'invention grâce
à une méthode d'analyse d'un échantillon susceptible de
contenir un virus VIH, comprenant les étapes
suivantes :
a) l'extraction de l'ARN viral d'un
échantillon biologique susceptible de contenir un virus
VIH ;
b) la transcription inverse de l'ARN obtenu
à l'étape (a) et l'amplification avec une première
paire d'amorces permettant l'obtention d'un produit
amplifié de transcription inverse comprenant tout ou
partie d'au môins deux gènes successifs du génome d'un
virus VIH ;
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ladite méthode comprenant en outre
- l'étape (c), et/ou
- la suite d'étapes (d),(e), (f) et (g),
ci-après :
c) le séquençage du produit amplifié de
transcription inverse obtenu à l'étape (b) de façon à
établir un génotype du virus VIH présent dans ledit
échantillon et identifier les mutations éventuellement
présentes dans ledit produit amplifié de transcription
inverse ;
d) l'amplification du produit de
transcription inverse obtenu à l'étape (b) avec une
seconde paire d'amorces, complémentaire de la première
paire mise en aeuvre à l'étape b, et capable de générer
un produit d'amplification susceptible d'être inséré
par recombinaison homologue dans un vecteur rétroviral
défectif dans la région correspondant au produit
amplifié de transcription inverse préparé à l'étape
(b) ;
e) la recombinaison homologue dudit produit
d'amplification préparé à l'étape (d) avec ledit
vecteur défectif ;
f) l'analyse fonctionnelle des protéines
virales codées par tout ou partie desdits au moins deux
gènes successifs du produit de transcription
inverse recombiné dans un vecteur à l'étape (d) ;
g) la mesure de la capacité réplicative des
virus recombinants obtenus à l'étape (e) en présence ou
absence d'une ou plusieurs drogues.
La méthode de l'invention est remarquable
en ce qu'elle offre la possibilité de mesurer l'impact
des traitements anti-rétroviraux, jugé à la fois sur :
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- la variation génique enregistrant les
mutations connues, les mutations associées et les
mutations inconnues ;
- la variation fonctionnelle enregistrant
l'infectivité ou capacité réplicative du virus en
présence ou en absence d'anti-rétroviraux ;
Elle permet d'étudier à la fois sur le même
prélèvement biologique issu d'un malade l'impact d'un
agent antiviral sur la variabilité génique et
fonctionnelle sur sa cible initiale, par exemple
l'enzyme virale pour laquelle l'anti-rétroviral a été
conçu, mais également l'outil va renseigner en
parallèle sur les mêmes données, variabilité génique et
fonctionnelle, sur une ou plusieurs cibles d'intérêt.
La méthode de l'invention permet en outre
d'être très représentative du comportement du virus du
patient, elle est aussi représentative pour évaluer la
variabilité génique et fonctionnelle d'une ou plusieurs
cibles de virus VIH-1 appartenant aux sous types B et
non-B.
Chaque paramètre, génotype, phénotype,
capacité réplicative, pris individuellement apporte des
informations sur la résistance, et selon l'invention le
virus testé est le plus proche de son comportement
naturel. L'invention permet à partir du même
échantillon biologique de mesurer les 3 paramètres clés
de la résistance . génotype, phénotype et capacité
réplication . Elle assure une efficacité dans
l'isolement des populations virales, permet la
normalisation des virus reconstitués et une analyse
quantitative des résultats. Les 3 volets permettent une
meilleure interprétation clinique et un éclairage
réciproque de ces items pour en faire un outil combiné
d'utilité clinique.
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La méthode de l'invention concerne plus
particulièrement une méthode d'analyse d'échantillons
susceptible de contenir des virus VIH appartenant aux
5 sous-types B et non B. Ainsi, l'ARN est celui d'un
virus VIH appartenant aux sous-types B et non B.
Pour la réalisation de l'étape (a), la
méthode de l'invention s'intéresse plus
10 particulièrement à des échantillons dérivés d'un
prélèvement d'un patient. Il peut s'agir d'un
échantillon de sang ou de sérum, mais peut aussi
provenir d'un fluide biologique ou d'une biopsie ou de
tout autre préparation tissulaire. L'échantillon
biologique peut également provenir d'une culture
virale. De façon générale, un échantillon biologique
correspond à tous types d'échantillons contenant un ou
plusieurs variants de VIH, notamment de VIH-1. Par
virus VIH-1, on entend, comme indiqué ci-dessus, toute
souche virale appartenant aux sous type B et non B.
Pour la réalisation de l'étape (b), la
méthode de l'invention s'intéresse plus
particulièrement à une première paire d'amorces
permettant l'obtention d'un produit amplifié de
transcription inverse, aussi désigné ci-après amplicon,
comprenant tout ou partie d'au moins deux gènes utiles
dans l'étude de la résistance aux anti-rétroviraux.
Ainsi, l'étape (b) met en oeuvre une paire
d'amorces qui permet de préparer un amplicon
caractérisé par :
- La présence à chacune de ses extrémités
de zones conservées pour permettre l'amplification des
populations virales,
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- la présence potentielle de mutations
d'intérêt.
Une forme de réalisation préférée de
l'invention, comprend, à l'étape (b), la mise en aeuvre
d'une première paire d'amorces permettant l'obtention
d'un amplicon, comprenant tout ou partie du gène gag et
du gène pol codant pour la protéase et la transcriptase
inverse impliqués dans la capacité réplicative du
virus, et susceptible de conférer, au virus, une
résistance thérapeutique.
Il s'agit alors à l'étape (b) d'obtenir un
amplicon possédant outre les caractéristiques ci-
dessus :
- une partie de la séquence d'acides
nucléiques codant pour gag et incluant les sites de
clivage,
- la totalité de la séquence codant pour la
protéase,
- la séquence codant pour la transcriptase
inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
L'amplicon tel que défini ci-dessus
présente une taille inférieure à 2800pb, de préférence
comprise entre 2200 et 2700 pb et tout
préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
Ainsi, avantageusement, l'amplification de
l'étape (b) de la méthode de l'invention, met en aeuvre
une paire d'amorces encadrant une séquence nucléique,
complémentaire en 5' de la région phylogénétiquement
conservée du gène gag incluant les sites de clivage,
contenant la totalité de la séquence d'acides
nucléiques codant pour la protéase, complémentaire en
3' de la région phylogénétiquement conservée du gène
codant pour la transcriptase inverse.
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Plus particulièrement, la paire d'amorces
mise en aeuvre à l'étape (b) encadre une séquence
d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région
phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre
le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le
génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position
1415 sur le génome), et
- complémentaire en 3' de la région
phylogénétiquement conservée du gène codant pour la
transcriptase inverse, comprise entre le codon 325
(position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le
génome).
De façon toute préférée, la paire d'amorces
mise en aeuvre à l'étape (b) encadre une séquence
d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région
phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre
le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la
protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24
(position 1250 sur le génome), et
- complémentaire en 3' de la région
phylogénétiquement conservée du gène codant pour la
transcriptase inverse, comprise entre le codon 335
(position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position
3751 sur le génome).
L'amplification de l'étape (b) de la
méthode de l'invention est réalisée avec une paire
d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50
nucléotides, de préférence entre 20 et 30 nucléotides.
Avantageusement, l'amplification de l'étape
(b) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans
le groupe comprenant :
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- comme amorce sens, celle représentée par
l'une des séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 et SEQ
ID NO. 5 (Tableau 1)
- comme amorce antisens, celle représentée
par l'une des séquences SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4 et
SEQ ID NO. 6 (Tableau 1)
- des fragments ou analogues de ces
séquences.
On entend par analogues, soit des séquences
portant une ou plusieurs mutations sans que cela
n'altère ses capacités d'hybridation dans des
conditions de stringences généralement rencontrées lors
de la PCR, soit des séquences qui se situent de 1 à 10,
1 à 5 ou 1 à 3 nucléotides en amont ou en aval desdites
séquences d'amorces.
Tout spécialement, l'invention concerne la
mise en aeuvre à l'étape (b) d'une paire d'amorce
choisie dans le groupe comprenant :
- la paire d'amorces R1 de séquences SEQ ID
NO.1 et SEQ ID NO.2 du tableau 1
- la paire d'amorces R2 de séquences SEQ ID
NO.3 et SEQ ID NO.4 du tableau 1
- la paire d'amorces R3 de séquences SEQ ID
NO.5 et SEQ ID NO.6 du tableau 1.
L'étape (c) de séquençage de la méthode de
l'invention permet d'identifier les mutations connues,
inconnues et associées à partir des données disponibles
dans la littérature.
A l'étape (d), l'amplification du produit
amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b)
met aeuvre une paire d'amorces qui permet de préparer un
amplicon caractérisé par
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- la présence à chacune de ses extrémités
de zones conservées pour permettre la recombinaison
avec le vecteur rétroviral,
- la présence potentielle de mutations
d'intérêt.
A l'étape (d), l'amplification dù produit
amplifié de transcription inverse obtenu à l'étape (b)
comprenant tout ou partie du gène gag et du gène pol
codant pour la protéase et la transcriptase inverse est
avantageusement réalisé avec une seconde paire
d'amorces, complémentaire de la première paire mise en
aeuvre à l'étape (b), permettant d'obtenir un amplicon
comprenant en outre :
- une partie de la séquence d'acides
nucléiques codant pour gag et incluant les sites de
clivage,
- la totalité de la séquence codant pour la
protéase,
- la séquence codant pour la transcriptase
inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
L'amplicon tel que défini ci-dessus
présente une taille inférieure à 2800pb, de préférence
comprise entre 2200 et 2700 pb et tout
préférentiellement entre 2300 et 2600 pb.
Ainsi, avantageusement, l'amplification de
l'étape (d) de la méthode de l'invention, met en aeuvre
une paire d'amorces encadrant une séquence d'acides
nucléiques, complémentaire en 5' de la région
phylogénétiquement conservée du gène gag incluant les
sites de clivage, contenant la totalité de la séquence
d'acides nucléiques codant pour la protéase,
complémentaire en 3' de la région phylogénétiquement
conservée du gène codant pour la transcriptase inverse.
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Plus particulièrement, la paire d'amorces
mise en aeuvre à l'étape (d) encadre une séquence
d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de la région
5 phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre
le codon 102 de la protéine p17 (position 1093 sur le
génome) et le codon 76 de la protéine p24 (position
1415 sur le génome), et
- complémentaire en 3' de la région
10 phylogénétiquement conservée du gène codant pour la
transcriptase inverse, comprise entre le codon 325
(position 3520) et le codon 421 (position 3811 sur le
génome).
De façon toute préférée, la paire d'amorces
15 mise en oeuvre à l'étape (d) encadre une séquence
d'acides nucléiques :
- complémentaire en 5' de. la région
phylogénétiquement conservée du gène gag comprise entre
le codon 126 (position 1165 sur le génome) de la
protéine p17 et le codon 21 de la protéine p24
(position 1250 sur le génome), et
- complémentaire en 3' de la région
phylogénétiquement conservée du gène codant pour la
transcriptase inverse, comprise entre le codon 335
(position 3550 sur le génome) et le codon 395 (position
3751 sur le génome).
L'amplification de l'étape (d) de la
méthode de l'invention est réalisée avec une paire
d'amorces ayant une taille comprise entre 10 et 50
nucléotides, de préférence entre 20 et 30 nucléotides.
Avantageusement, l'amplification de l'étape
(d) est effectuée avec une paire d'amorces choisie dans
le groupe comprenant
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- comme amorce sens, celle représentée par
l'une des séquences SEQ ID NO. 7 et SEQ ID NO. 9
(Tableau 4)
- comme amorce antisens, celle représentée
par l'une des séquences SEQ ID NO. 8 et SEQ ID NO. 10
(Tableau 4)
- des fragments ou analogues de ces
séquences.
On entend par analogues, soit des séquences
portant une ou plusieurs mutations sans que cela
n'altère ses capacités d'hybridation dans des
conditions de stringences généralement rencontrées lors
de la PCR, soit des séquences qui se situent de 1 à 10,
1 à 5 ou 1 à 3 nucléotides en amont ou en aval desdites
séquences d'amorces.
Tout spécialement, l'invention concerne la
mise en aeuvre à l'étape (d) d'une paire d'amorces
choisie dans le groupe comprenant :
- la paire d'amorces N1 de séquences SEQ ID
NO.7 et SEQ ID NO.8 du tableau 4
- la paire d'amorces N2 de séquences SEQ ID
NO.9 et SEQ ID NO.10 du tableau 4.
L'analyse fonctionnelle de l'étape (f) de
la méthode de l'invention consiste plus
particulièrement à infecter des cellules cibles du VIH
avec les virus recombinants produits à l'étape (e) en
présence ou en absence d'une ou plusieurs drogues. A
titre d'exemple, on peut citer l'infection de cellules
cibles du VIH, en présence ou en absence d'une ou
plusieurs drogues, contenant un gène indicateur,
indépendant du vecteur rétroviral, dont l'expression
est liée à l'infection virale.
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La mesure de la capacité réplicative à
l'étape (g) de la méthode de l'invention consiste plus
particulièrement à mesurer l'expression d'un gène
indicateur en réponse à l'infection par le virus
recombinant produit à l'étape (e) en comparaison à un
virus de référence. A titre d'exemple, on peut citer
les procédés intégrant les valeurs de densités optiques
issues d'une réaction enzymatique liée à un gène
révélateur indépendant du vecteur et présent dans les
cellules infectées.
Selon une forme particulière de
réalisation, la méthode de l'invention comprend dans le
cas où les étapes (c) et (f) et (g) ont été
effectuées :
h) le traitement des données relatives
- à la présence éventuelle de mutations
déterminée à l'étape (c), et
- à l'analyse fonctionnelle des protéines
virales de l'étape (f), et
- à la capacité réplicative de l'étape (g),
pour obtenir les caractéristiques du virus
et/ou du traitement.
A titre d'exemple de tels traitements de
ces données, on peut citer les algorithmes
d'interprétation des mutations identifiées en (c), les
valeurs des concentrations de drogues inhibant 50%
(IC50) ou 90% (IC90) de la réplication virale obtenues
en (f), la comparaison de la capacité réplicative du
virus recombinant en (g) avec un virus de référence en
absence de drogues. Ceux-ci permettent une
interprétation réciproque des caractéristiques du virus
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et du traitement, de façon à disposer d'un nouvel outil
de suivi épidémiologique individuel et collectif.
L'invention concerne aussi des amorces et
combinaisons de celles-ci pour l'amplification de
séquences d'acides nucléiques du VIH comme définies
précédemment.
La méthode de l'invention permet de
disposer d'un nouveau test capable, à partir du même
échantillon biologique d'un patient VIH, d'obtenir une
mesure de la résistance génotypique, phénotypique et de
la capacité réplicative du virus c'est-à-dire la
variation génique enregistrant les mutations connues,
les mutations associées et les mutations inconnues et
la variation fonctionnelle enregistrant l'infectivité
ou capacité réplicative du virus en présence ou en
absence d'anti-rétroviraux (figure 2).
L'invention concerne donc encore un kit
pour la mise en aeuvre d'une méthode comme décrite
comprenant une ou plusieurs amorces définies
précédemment. Un tel kit comprend également une méthode
d'analyse des 3 données obtenues grâce à la méthode de
l'invention : génotype, phénotype et capacité
réplicative, etc...
D'autres avantages et caractéristiques de
l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent
où il sera fait référence aux dessins en annexe dans
lesquels :
La figure 1 représente les étapes
principales des analyses du génotype, du phénotype et
de la capacité réplicative.
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La figure 2 représente la compatibilité des
analyses du génotype, du phénotype et de la capacité
réplicative selon la méthode de l'invention.
La figure 3 montre.une meilleure efficacité
d'amplification des populations virales . Les ARN
provenant de 4 patients (A, B, C, D) ont été
rétrotrancrits et amplifiés dans les conditions
décrites dans la demande de brevet PCT WO 0238792
(test 1) ou dans les conditions définies par la
présente invention dans son exemple 1 (test 2).
La figure 4 représente la courbe DO/P24
obtenue dans un test de capacité réplicative pour un
virus de patient (virus 1) et un virus de référence.
La figure 5 représente la position des
paires d'amorces de l'invention sur le génome du VIH.
En outre, la figure montre l'organisation des gènes gag
et pol du VIH-1 :
- Gène gag
Matrice (matrix) : p17
. Capside (core) : p24
Nucléocapside (CA) : p2, p7, pl, p6
- Gène pol :
. Protéase (PR) : p10 Clivage et maturation
gag et pol
. Reverse transcriptase (RT) : p51
Transcription Inverse
= RNAse H : p15 : Activité RNAse H
= Intégrase (Int) : p31 : Intégration ADN
proviral
La Figure 6 montre les régions amplifiées
par les différents tests commerciaux de génotypage et
phénotypage décrits dans l'exemple 3.
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Exemple 1 Analyse génique et
fonctionnelle de la protéase et de la transcriptase
inverse.
La méthode selon la présente invention se
5 caractérise en premier lieu par la génération d'un
acide nucléique spécifique compatible à la fois avec
les techniques de génotypage et les techniques de
phénotypage.
Pour générer ce premier amplicon
10 spécifique, on procède de la façon suivante
1) On extrait l'ARN viral contenu dans un
échantillon biologique. L'échantillon biologique peut
être dérivé d'un prélèvement d'un patient. Il peut
15 s'agir d'un échantillon de sang ou de sérum, mais peut
aussi provenir d'un fluide biologique ou d'une biopsie
ou de tout autre préparation tissulaire. L'échantillon
biologique peut également provenir d'une culture
virale. De façon générale, un échantillon biologique
20 correspond à tous types d'échantillons contenant un ou
plusieurs variants VIH-1. Par virus VIH-1, on entend
toute souche virale appartenant aux sous types B et non
B.
2) On rétrotranscrit et amplifie l'ARN
obtenu en (1) avec une des paires d'amorces spécifiques
du tableau 1 ci-après pour obtenir un amplicon
caractérisé par :
- La présence, en 5' et en 3', de zones
conservées pour permettre l'amplification des
populations virales ;
- la présence de toutes les mutations
d'intérêt déjà décrites ;
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- la présence d'une partie de la séquence
d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les
sites de clivage ;
- la totalité de la séquence codant pour la
protéase
- la séquence codant pour la transcriptase
inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
Tableau 1
RT- Taille Nom séquence
PCR pb
Paire 2379 FIT ex+ CCTCCAggggCAAATggTACATCA
R1 (SEQ ID NO. 1)
FIT ex- CTTgATAAATTTgATATgTCCATTggCCTT
(SEQ ID NO. 2)
Paire 2358 GP A+ TCACCTAgAACTTTAAATgC
R2 (SEQ ID NO. 3)
RT A- TTAAATggCTCTTgATAAATTTgA
(SEQ ID NO. 4)
Paire 2586 GP B+ AgCCAggTCAgCCAAAATTA
R3 (SEQ ID NO. 5)
RT B- CATgCTTCCCATgTTTCCTT
(SEQ ID NO. 6)
La figure 3 montre que, sur 4 patients, la
méthode du brevet donne une meilleure amplification des
populations virales que dans les conditions du brevet
antérieur. D'autre part, sur une série de 26 patients,
la méthode du brevet permet l'amplification de la
totalité des échantillons alors que la méthode décrite
dans le brevet antérieur ne permet l'amplification
efficace que de 16 échantillons sur les 26 testés (4
sont négatifs et 6 sont trop faiblement amplifiés).
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Les tableaux 2 et 3 ci-après montrent deux
exemples d'échantillons de plasmas respectivement des
patients 1 et 2 pour lesquels les amplicons générés par
la méthode de l'invention ci-dessus ont permis la
réalisation du génotype selon les techniques Trugene et
Viroseq et du Phénotype selon la technique Phenoscript.
Tableau 2
Patient 1
Viroseq Trugene Phenoscript
Liste des Evidence Interpré- Contribution
mutations drogues de la tation des à la réponse
identifiées Résistance Résistances thérapeu-
tique
NRT I NRT I '''
D67N AZT Haute Résistance Improbable
K70R 3TC Haute Résistance Improbable
M184V ddC Haute nd nd
T215Y ddI Possible Résistance Probable
K219E d4T Haute Résistance Probable
Pas de
ABC Possible résistance Possible
Pas de
TDF nd résistance nd
NNRTI NNRTI ~., K103N DLV Haute Résistance nd
V1081 EFV Haute Résistance Improbable
P225H NVP Haute Résistance Improbable
IP IP
Pas de
L63P APV Nulle résistance Probable
Pas de
IDV Nulle résistance Probable
Pas de
SQV Nulle résistance Probable
Pas de
LPV Nulle résistance Probable
Pas de
RTV Nulle résistance nd
Pas de
NFV Nulle résistance Probable
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Tableau 3
Patient 2
Viroseq Trugene Phenoscript
Liste des Evidence Interprétat Contribution
mutations drogues de la ion des à la réponse
identifiées Résistance Résistances thérapeutiqu
e
NRTI NRTI
M41L AZT Haute Résistance Improbable
M184V 3TC Haute Résistance Improbable
T215Y ddC Haute nd nd
L210W ddI Possible Résistance Possible
d4T Possible Résistance Probable
Résistance
ABC Possible possible Possible
TDF nd Résistance nd
NNRTI NNRTI
Pas de
DLV Nulle résistance nd
Pas de
EFV Nulle résistance Probable
Pas de
NVP Nulle résistance Probable
Pas de
M36L APV Nulle résistance Probable
Pas de
L63P IDV Nulle résistance Probable
Pas de
SQV Nulle résistance Probable
Pas de
LPV Nulle résistance Probable
Pas de
RTV Nulle résistance nd
Pas de
NFV Possible résistance Probable
Exemple 2 Analyse de la capacité
réplicative de virus VIH provenant de patients
présentant des mutations dans la protéase et la
transcriptase inverse.
Dans cet exemple, la méthode de l'invention
comprend les étapes suivantes :
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1) On extrait l'ARN viral contenu dans un
échantillon biologique.
2) On Rétrotranscrit et amplifie l'ARN
obtenu en (1) avec une paire d'amorces spécifiques
permettant d'amplifier de façon régulière un amplicon
spécifique, comprenant au moins 2 gènes d'intérêt dans
l'étude de la résistance aux anti-rétroviraux, comme
décrit à l'exemple 1.
3) La préparation d'un nouvel amplicon à
partir de l'amplicon obtenu à l'étape (2) ci-dessus à
l'aide d'une nouvelle paire d'amorces décrite dans le
tableau 4 ci-après. Ce nouvel amplicon est caractérisé,
par :
- La présence, en 5' et en 3', de zones
conservées pour permettre la recombinaison avec le
vecteur rétroviral
- la présence de toutes les mutations
d'intérêt déjà décrites ;
- la présence d'une partie de la séquence
d'acides nucléiques codant pour gag et incluant les
sites de clivage ;
- la totalité de la séquence codant pour la
protéase ;
- la séquence codant pour la transcriptase
inverse allant au moins jusqu'au codon 340.
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Tableau 4
Neste taille Nom de séquence
d PCR l'amorce
Paire 2360 FIT in+ TggTACATCAggCCATATCACCTAgAACTT
N1 pb (SEQ ID NO. 7)
FIT in- TAAATTTgATATgTCCATTggCCTTgCC
(SEQ ID NO. 8)
Paire 2338 GP E+ AgAACTTTAAATgCATgggT
N2 pb (SEQ ID NO. 9)
RT E- TAAATTTgATATgTCCATTggCCTT
(SEQ ID NO. 10)
Les amorces de la méthode du brevet
décrites dans le tableau 4 permettent une meilleure
5 recombinaison sur des patients présentant de nombreuses
mutations avec un nouveau vecteur rétroviral délété
d'une partie du gène gag, de la région du cadre de
lecture pol codant pour la protéase et une partie de la
transcriptase inverse du VIH-1 que la recombinaison
10 décrite dans les conditions du brevet antérieur.
Dans les tableaux 5 et 6 ci-dessous, sont
listées les mutations identifiées dans le gène de la
protéase et de la transcriptase inverse pour une série
de 6 patients. Le tableau 7 donne les valeurs moyennes
15 de capacité réplicative obtenue pour ces 6 patients
dans deux tests indépendants avec la méthode de la
présente invention. Dans les conditions décrites dans
la demande de brevet PCT WO 0238792), sur cette série
de patients présentant de nombreuses mutations, la
20 recombinaison avec le vecteur rétroviral n'était pas
assez efficace pour produire un niveau suffisant de
virus recombinants et permettre une analyse de la
capacité réplicative.
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Tableau 5 : liste des principales mutations identifiées
pour les inhibiteurs de protéase (IP) sur les six
patients étudiés.
IP CR01 CR02 CR03 CR04 CR05 CR06
L10 I I I I/F I
K20 I
L24 I
M36 I
M46 I L L I L
G48 V
154 V V
L63 P P P P L/P P
A71 I V T
G73 T
V77 I I I
V82 A A A A
184 V V
L90 M M M M
Tableau 6: liste des principales mutations identifiées
pour les inhibiteurs de transcriptase inverse (RTI) sur
les six patients étudiés.
RTI CR01 CR02 CR03 CR04 CR05 CR06
M41 L L L L
E44 D A D
A62 V
D67 N N N N
T69 S+V+A D D
K70 R
L74 V
K103 N N
V118 V/I V/I I
Y181 C I
M184 V V V V
G190 S A
L210 W W W
T215 Y Y Y/C Y Y
K219 N K/Q E Q
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Tableau 7
Patients Moyenne du Ecartype CV%
% de la référence
CR 01 42,14 16,14 38,3
CR 02 5,78 0,09 1,5
CR 03 11,88 5,65 47,6
CR 04 8,76 0,31 3,6
CR 05 14,09 3,73 26,5
CR 06 20,70 2,90 14,0
Les amorces de la méthode du brevet
décrites dans le tableau 4 permettent, sur une autre
série de 4 patients en outre la production d'une
quantité de virus recombinants plus importante que la
recombinaison décrite dans les conditions du brevet
antérieur ainsi que la normalisation de l'infection des
cellules indicatrices en utilisant, par exemple, le
dosage de l'antigène p24. Le tableau 8 ci-dessous
décrit que la quantité de p24 produite par les virus
recombinants de 4 patients selon la méthode du
brevet (vecteur GRF) est supérieure à celle du brevet
antérieur (vecteur GPR).
Tableau 8
Patients Vecteur quantité de p24
ng/ml
BA 01 GPR 115
BA 01 GRF 261
BA 02 GPR 108
BA 02 GRF 132
BA 03 GPR 98
BA 03 GRF 280
BA 04 GPR 195
BA 04 GRF 430
Les amorces du tableau 4 permettent encore
de mesurer la capacité réplicative sur une gamme de
virus recombinants en comparaison à un virus de
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référence selon des méthodes quantitatives intégrant
les valeurs de densités optiques issues d'une réaction
enzymatique liée à un gène révélateur indépendant du
vecteur et présent dans les cellules infectées (Figure
4).
Les amorces du tableau 4 permettent enfin
d'obtenir une bonne reproductibilité de la mesure de la
capacité réplicative sur deux échantillons contrôles
dont l'un présentant des mutations connues pour
diminuer la capacité réplicative. Le tableau 9 ci-
dessous rapporte la reproductibilité de la valeur de
capacité réplicative sur 2 échantillons contrôles
présentant des mutations connués dans la protéase. 3
tests indépendants.
Tableau 9
Echantillons Mutations dans Moyenne
la protéase du
% de la Ecartype CV%
référence
GPCA L101, G48V, 17,3 2,1 12,3
V82A
GPCB 154V, A71V, 46,8 3,1 6,6
V82A
Exemple 3 : Compatibilité de l'amplicon des
exemples 1 et 2 avec les différents tests commerciaux.
1) Compatibilité avec les principaux tests
commerciaux de génotypage.
Les 4 principaux tests commerciaux sont
décrits dans un article de W. Cavert & H.H. Balfour
(Detection of antiretroviral resistance in HIV-1 Clin
Lab Med 2003 23 :915).
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1.1) TrugeneTM kit (Bayer Visible Genetics
Inc,) (Demande de brevet WO 02/070731 ; Grant et. al.
Accuracy of the Trugene HIV-1 Genotyping kit J Clin
Microbiol 2003 41:1586).
Le Kit de génotypage Trugene HIV-1 est
utilisé pour déterminer le génotype de virus de sous
types B et non B. L'ARN est extrait à partir des
plasmas de patients selon les techniques classiques,
l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par PCR avec
des amorces spécifiques du gène pol permettant
l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de
1300 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99
et comprenant pour la transcriptase inverse les codons
1 à 247. Le produit de RT-PCR ainsi obtenu est utilisé
dans chacune des 16 réactions de séquençage en
utilisant le principe de la réaction CLIPT", technique
de séquençage utilisant des amorces marquées (dye
primers). Quatre paires d'amorces différentes sont
utilisées pour cette méthode de séquençage, deux paires
pour le séquençage de la protéase et deux autres paires
pour le séquençage de la transcriptase inverse. Chaque
réaction de séquence est initiée par une amorce
spécifique marquée (CLIPTM) puis interrompue par le
nucléotide marqué correspondant. Tous les fragments
synthétisés sont ensuite séparés sur gel
d'électrophorèse et analysés par un séquenceur
automatique, indiquant spécifiquement les fragments se
terminant par chacun des quatre nucléotides marqués.
Les séquences, une fois reconstituées, sont comparées à
la séquence d'un virus de référence, à l'aide d'un
logiciel d'alignement.
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1.2) ViroSeqTM (Applied Biosystems) (Mracna
M et. al. J Clin Microbiol. 2001. 39:4323).
L'ARN est extrait à partir des plasmas de
patients selon une technique classique d'extraction
5 basée sur l' af f inité de l'ARN vis-à-vis de colonnes de
sicile, l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par
PCR avec des amorces spécifiques du gène pol permettant
l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de
1800 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99
10 et comprenant pour la transcriptase inverse les codons
1 à 335. L'ADN ainsi obtenu est ensuite séquencé avec 7
amorces différentes selon la technologie Big Dye"
Terminator, technique de séquençage utilisant des
nucléotides marqués (dye terminators). La réaction de
15 séquence est initiée par chaque amorce spécifique non
marquée puis interrompue par chacun des nucléotides
marqués. Tous les fragments synthétisés sont ensuite
séparés sur gel d'électrophorèse. La couleur du
fluorochrome sera alors enregistrée par un séquenceur
20 automatique (séquenceur ABI Prism 377 DNA), indiquant
spécifiquement les fragments se terminant par chacun
des quatre nucléotides marqués. Les séquences, une fois
reconstituées, sont comparées à la séquence d'un virus
de référence, à l'aide d'un logiciel d'alignement.
1.3) GeneSeqTM (ViroLogic) (Parkin NT et.
al., Antimicrob.Agents Chemother. 2004. 48 :437).
Cette technologie utilise les vecteurs de
résistance construits pour le test d'étude phénotypique
PhenoSense. La séquence d'acides nucléiques du vecteur
comprenant, pour la protéase les codons 1 à 99 et
comprenant, pour la transcriptase inverse les codons 1
à 305, est analysée par séquençage en utilisant
différentes combinaisons de sondes fluorescentes, les
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acides nucléiques sont ensuite déposés sur un gel
d'électrophorèse et analysés par un séquenceur
automatique. Les séquences obtenues sont comparées à
celles obtenues pour des virus de référence.
1.4) GenoSureT" (Virco) (Demande de brevet
PCT WO 01/81624).
L'ARN est extrait à partir des plasmas de
patients selon les techniques classiques d'extraction,
l'ARN viral est retrotranscrit et amplifié par PCR avec
des amorces spécifiques du gène pol permettant
l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques de
1800 pb comprenant pour la protéase les codons 1 à 99
et comprenant pour la transcriptase inverse les codons
1 à 415. L'ADN ainsi obtenu est ensuite séquencé selon
la technologie Big DyeT" Terminator, précédemment
décrite.
2) Compatibilité avec les principaux tests
commerciaux de phénotypage.
Une synthèse récente de M. Youle Clinical
Issues in HIV publiée en décembre 2003 sur le site
www.hivandhepatitis.com décrit les principaux tests de
résistance.
Trois tests sont actuellement disponibles
PhenoscriptTM (Viralliance) ; AntivirogramTM (Virco)
PhenoSenseTM (ViroLogic).
2.1) Le test développé par Virco,
AntivirogramTM, n'est pas compatible avec la méthode de
l'invention car le fragment d'acides nucléiques de 2200
pb amplifié à partir de l'ARN du patient comprend la
protéase du codon 10 au codon 99 et la totalité de la
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transcriptase inverse. (Hertogs et. al. 1998.
Antimicrob.Agents Chemother).
2.2) PhenoSenseT" (ViroLogic) (Parkin NT et.
al., Antimicrob.Agents Chemother. 2004. 48 :437 ;
Petropoulos et. al., Antimicrob.Agents Chemother. 2000.
44 :920).
Le test PhenoSense est réalisé à partir de
l'ARN viral extrait du plasma d'un patient VIH. Les
régions du gène pol codant pour la protéase et la
transcriptase inverse sont amplifiées par RT-PCR pour
obtenir une séquence d'acides nucléiques de 1500 pb
comprenant les sites de clivage de la protéine gag (p7-
pl-p6) la région entière codant pour la protéase et la
région de la transcriptase inverse allant du codon 1 au
codon 313. Cette séquence est ensuite insérée par
ligation dans un vecteur rétroviral VIH contenant un
gène rapporteur (Luciférase) et délété dans la protéine
d'enveloppe du VIH. Le vecteur retroviral est ensuite
co-transfecté dans des cellules 293T avec un vecteur
codant pour la protéine d'enveloppe MLV (Murine
Leukemia Virus). Les virus produits sont utilisés pour
infecter de nouvelles cellules en présence ou en
absence d'antirétroviraux. L'activité luciférase dans
les cellules infectées en présence de drogue est
comparée à l'activité luciférase en absence de drogue
ce qui permet le calcul des concentrations inhibant 50%
de la production virale (IC50).
Le tableau 10 ci-dessous résume les
caractéristiques des séquences d'acides nucléiques
amplifiées dans les principaux tests décrits
précédemment.
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Tableau 10
Test Taille du gag protéase Transcript
fragment ase
amplifié inverse
Trugene" 1300 pb nd Codons Codons 1-
1-99 247
ViroSeqT" 1800 pb nd Codons Codons 1-
1-99 335
GeneSeq" 1400 pb nd Codons Codons 1-
1-99 305
GenoSureTM 1800 pb nd Codons Codons 1-
1 1 415
PhenoSenseT" 1500 pb p7-pl-p6 Codons Codons 1-
1-99 313
La Figure 6 montre les régions amplifiées
par les différents tests commerciaux de génotypage et
phénotypage décrits dans l'exemple 3. L'amplicon selon
la présente invention, désigné nouvel amplicon dans
la figure 6 est compatible avec l'ensemble de ces
tests.
Exemple 4 : Détermination d'un score comme
outil d'aide à la décision thérapeutique.
A partir d'un échantillon biologique d'un
patient VIH, la méthode de l'invention permet de
prendre en compte dans un système de score les mesures
de variabilité génique et fonctionnelle d'un virus VIH
appartenant aux sous types B et non B.
La mesure de la variabilité génique est
réalisée à partir de la séquence d'acides nucléiques
spécifique amplifiée selon la méthode de l'invention,
puis analysée selon les techniques de séquençage
usuelles (Trugene, ViroSeq). Les mutations dans les
gènes de la protéase et de la transcriptase inverse
identifiées par ces tests sont interprétées selon des
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algorithmes remis à jour régulièrement par des comités
d'experts. Un premier score de 0 à 2 est attribué à
chacun des 3 niveaux de résistance déterminés par
l'interprétation. Le tableau 11 ci-dessous résume les
interprétations données par les tests Trugene et
ViroSeq en fonction des mutations identifiées et des
antirétroviraux (ARV) utilisés et attribue un score
génotypique correspondant à l'importance de la
résistance.
Tableau 11
ViroSeqTM TrugeneT" score
Evidence de la Interprétation de génotypique
Résistance la résistance
Haute Résistance 0
Possible Résistance 1
Possible
Nulle Pas de résistance 2
La mesure de la variabilité fonctionnelle
d'un virus VIH consiste en l'analyse de la capacité
réplicative du virus en présence (phénotype) ou en
absence d'antirétroviraux (Fitness).
Le principe des tests de résistance
phénotypique repose sur la mesure in vitro de la
croissance d'un virus de patient en présence de
drogues, comparée à un virus de référence (index de
résistance). Le niveau de résistance est défini en
fonction de seuils de sensibilité (cut off). Un second
score de 0 à 2 est attribué à chacun des 3 niveaux de
résistance déterminés par l'interprétation. Le tableau
12 résume les interprétations données par les
principaux tests Phénotypiques PhenoSense et
Phenoscript en fonction de leurs seuils de sensibilité
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et attribue un score phénotypique correspondant à
l'importance de la résistance.
Le tableau 12 ci-dessous rapporte
l'attribution d'un score phénotypique en fonction de
5 l'interprétation des seuils phénotypiques.
Tableau 12
PhenosenseT" Phenoscriptz" Score
Comparaison de la Contribution à la Phénotypique
sensibilité réponse
thérapeutique
Moins sensible Improbable 0
sensible possible 1
Plus sensible probable 2
La capacité réplicative d'un virus, ou
fitness, en l'absence d'antirétroviral est mesurée en
10 comparaison à un virus de référence. Elle renseigne sur
la capacité du virus à se répliquer et est exprimée en
% du virus de référence. A titre d'exemples, on peut
citer un virus ayant une fitness de 100% qui sera
considéré comme ayant une forte activité réplicative et
15 un virus ayant une fitness de 10% qui sera considéré
comme ayant une faible activité réplicative.
La combinaison des deux scores, génotype,
phénotype et du pourcentage de capacité réplicative à
partir d'un même échantillon biologique doit permettre
20 une meilleure interprétation des données cliniques et
fournir un outil d'aide à la décision thérapeutique. En
pratique, l'addition des scores génotypiques et
phénotypiques pour un antirétroviral donné, combinée à
la mesure de la capacité réplicative peut permettre
25 d'orienter le choix thérapeutique. Le score génotypique
+ phénotypique sera compris entre 0 et 4 pour chaque
ARV et sera accompagné d'un % de capacité réplicative.
Ainsi, pour un ARV en cours au moment du
prélèvement si le score génotypique + phénotypique est
CA 02563394 2006-10-13
WO 2005/108606 PCT/FR2005/000917
36
inférieur à 1 et que la capacité réplicative est élevée
(100% ou plus), il faut favoriser l'arrêt de la
molécule car, le virus est résistant et garde une forte
capacité à se répliquer en présence de cet ARV.
Pour un ARV en cours au moment du
prélèvement si le score génotypique + phénotypique est
inférieur à 1, et la capacité réplicative faible (10%),
la poursuite de la molécule peut être préférée à
l'arrêt du traitement par le clinicien en l'absence
d'alternative thérapeutique..
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PLUS D'UN TOME.
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