Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
DEMANDES OU BREVETS VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE I)E CETTE DEMANDE OU CE BREVETS
COMPREND PLUS D'UN TOME.
CECI EST LE TOME DE _2
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Brevets.
JUMBO APPLICATIONS / PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION / PATENT CONTAINS MORE
THAN ONE VOLUME.
THIS IS VOLUME 1 OF 2
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NOUVELLES SÉQUENCES PHOSPHORYLÉES DE LA PHOSPHATASE
CDC25B, ANTICORPS DIRIGÉS CONTRE CES SÉQUENCES AINSI QUE
,5 LEURS UTILISATIONS
La présente invention a pour objet de nouvelles séquences phosphorylées de la
phosphatase CDC25CB ainsi que des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés
contre ces séquences. La présente invention a également pour objet
l'utilisation de ces
nouvelles séquences phosphorylées notamment pour la mise en ceuvre d'un
procédé de
criblage in vitro de composés inhibiteurs de la mitose cellulaire, à savoir
des composés
inhibiteurs de l'entrée en mitose des cellules ou de la progression de la
mitose.
Les mécanismes qui contrôlent la division des cellules mettent en j eu de
nombreux acteurs dont les activités sont régulées par des réactions de
phosphorylation
et de déphosphorylation, impliquant des kinases et des phosphatases. Des
dérégulations
de ces mécanismes ont été identifiées dans de nombreux cancers. Leur
identification et
leur caractérisation ouvrent aujourd'hui de nouvelles perspectives pour le
diagnostic et
le traitement de la maladie cancéreuse.
CDC25B est une phosphatase régulatrice du cycle cellulaire essentielle pour le
contrôle de l'entrée en mitose et de la progression de la mitose. Elle
appartient à une
famille qui compte trois membres codés par des gènes différents (CDC25A, B et
C)
chez les mammifères. La protéine CDC25B est exprimée et active en fin de phase
G2
du cycle cellulaire (Baldin et al., 1997 ; Gabrielli et al., 1996). Sa
localisation
intracellulaire est régulée par des séquences NES et NLS (Davezac et al.,
2000) et par
son interaction avec les protéines 14-3-3 (Mils et al., 2000 ; Forrest et al.,
2001). Il a été
suggéré que CDC25B puisse agir comme un "starter" des évènements mitotiques
précoces (Nilsson et al., 2000). Elle pourrait jouer un rôle dans
l'activatiori initiale d'une
population de CDC2/cycline B au niveau du centrosome avant sa translocation
nucléaire
(Kumagai et al., 1992 ; Hoffinann et al., 1993). CDC25B active les complexes
CDK/cycline pour permettre les remaniements architecturaux et biochimiques qui
sont
nécessaires pour permettre le processus de division cellulaire. Son activité
est régulée
par les variations de son expression, par son association à des partenaires
régulateurs et
par des évènements de phosphorylation. Ainsi, une cascade de signalisation
cônduit à la
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modulation de l'activité catalytique de CDC25B participant à la régulation de
l'entrée
en mitose.
Un des buts de l'invention consiste à fournir une nouvelle séquence
phosphorylée
de la phosphatase CDC25B, ainsi qu'un nouvel anticorps dirigé contre l'épitope
phosphorylé de la phosphatase CDC25B phosphorylée.
Un des buts de la présente invention consiste à fournir un procédé de criblage
in
vitro de composés inhibiteurs de la mitose des cellules, notamment de l'entrée
en
mitose, lesdits composés inhibiteurs pouvant être notamment utilisés dans le
cadre
d'une thérapie anticancéreuse.
La présente invention concerne une séquence peptidique caractérisée en ce
qu'elle
comprend ou est constituée par un fragment d'au moins environ 10 acides aminés
issus
de la séquence SEQ ID NO : 1 suivante : 1
DRKMEVEELSpPLALGRFSL SEQ ID NO : 1
dans laquelle le résidu sérine en position 10 est phosphorylé,
ledit fragment susmentionné contenant ledit résidu sérine phosphorylé.
L'expression "résidu phosphorylé" désigne un acide aminé porteur d'un
groupement phosphate.
Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne une
séquence peptidique telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle
comprend ou
est constituée par la séquence SEQ ID NO : 2 suivante :
MEVEELSpPLALGR SEQ ID NO : 2
dans laquelle le résidu sérine en position 7 est phosphorylé.
La séquence SEQ ID NO : 2 correspond à un fragment de la séquence
SEQ ID NO : 1 susmentionnée. Plus exactement, elle correspond au fragment de
SEQ ID NO : 1 délimité de l'acide aminé en position 4 à l'acide aminé en
position 16.
La présente invention concerne également une séquence peptidique telle que
définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par
l'une des
séquences suivantes :
- la séquence SEQ ID NO : 3, représentant le variant d'épissage CDC25B1 de la
protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu sérine en
position
235 est phosphorylé,
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3
- la séquence SEQ ID NO : 4, représentant un variant d'épissage CDC25B2 de la
protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu sérine en
position
208 est phosphorylé,
- la séquence SEQ ID NO : 5, représentant un variant d'épissage CDC25B3 de la
.5 protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu sérine
en position
249 est phosphorylé,
- la séquence SEQ ID NO : 6, représentant un variant d'épissage CDC25B4 de la
protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu sérine en
position
259 est phosphorylé,
- la séquence SEQ ID NO : 7, représentant un variant d'épissage CDC25B5 de la
protéine d'origine humaine de la phosphatase CDC25B, dont le résidu sérine en
position
284 est phosphorylé.
La présente invention concerne également un anticorps polyclonal ou monoclonal
susceptible de reconnaître une séquence peptidique telle que définie ci-
dessus, sous
l5 réserve que ledit anticorps ne reconnaisse pas la séquence SEQ ID NO : 8
dans laquelle
le résidu sérine en position 249 n'est pas phosphorylé.
La séquence SEQ ID NO : 8 correspond à la séquence protéique de CDC25B non
phosphorylée.
Un anticorps polyclonal avantageux de l'invention est caractérisé en ce qu'il
est
zo susceptible de reconnaître la séquence SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-
dessus, sous
réserve que ledit anticorps ne reconnaisse pas la séquence SEQ ID NO : 8 dans
laquelle
le résidu sérine en position 249 n'est pas phosphorylé.
Un tel anticorps dirigé contre l'épitope phosphorylé de séquence SEQ ID NO : 2
est généré en immunisant des lapins avec ledit épitope.
25 Plus précisément, ledit épitope est couplé de façon covalente avec une
protéine
porteuse telle que l'hémocyanine, la BSA ou l'ovalbumine. Les lapins sont
alors
immunisés pendant 3 mois (4 injections au total) et la saignée finale permet
la
récupération d'environ 50 ml de sérum. Le sérum est ensuite doublement purifié
par
affinité sur une colonne de peptide phosphorylé puis sur une colonne de
peptide non
30 phosphorylé.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un
anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, notamment dirigé contre la
séquence
peptidique SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'il
résulte de
la sélection d'un hybridome sécrétant un anticorps dirigé contre la séquence
peptidique"
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telle que définie ci-dessus ou de la sélection dans une banque d'expression
d'un ADN
compléinentaire codant pour toute ou partie d'un anticorps.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un
anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, notamment dirigé contre la
séquence
peptidique SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il
comprend
les étapes suivantes :
- la fusion entre des myélomes d'un animal immunisé, notamment d'un animal
non humain préalablement immunisé, par injection de la séquence peptidique
telle que
définie ci-dessus et des splénocytes d'un animal, notamment d'un aniinal non
humain,
afin d'obtenir des hybridomes,
- la mise en culture des hybridomes ainsi obtenus,
- la récupération et purification par clonage d'un hybridome, choisi parmi
ceux
obtenus à l'étape précédente et sécrétant un anticorps dirigé contre la
séquence
peptidique telle que définie ci-dessus.
L'animal utilisé pour 1'étape d'immunisation est notamment une souris.
Les myébmes utilisés pour la fusion proviennent notamment d'une souris.
Les splénocytes utilisés pour la fusion proviennent d'un animal de la même
espèce que celle dont provient les myélomes, à savoir notamment d'une souris.
On choisit les hybridomes qui sécrètent les anticorps contre la séquence
peptidique SEQ ID NO : 2 sur la base de la production d'anticorps capables de
reconnaître dans un test ELISA le peptide phosphorylé utilisé pour
l'immunisation mais
pas le peptide non phosphorylé.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un
anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus, notamment dirigé contre la
séquence
peptidique SEQ ID NO : 2 telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il
comprend
une étape de sélection dans une banque d'expression d'un ADNc codant pour
toute ou
partie d'un anticorps.
Les anticorps sont sélectionnés contre la séquence peptidique SEQ ID NO : 2
sur
la base de leur capacité à reconnaître dans un test ELISA, par transfert de
protéines
(western blot) ou par toute autre méthode appropriée, le peptide phosphorylé
utilisé
pour l'immunisation, mais pas le peptide non phosphorylé.
La présente invention concerne également une composition phannaceutique
caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active une séquence
peptidique
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telle que définie ci-dessus ou un anticorps tel que défini ci-dessus, en
association avec
un vecteur pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également l'utilisation de la séquence
peptidique
telle que définie ci-dessus, ou d'Lm anticorps tel que défini ci-dessus, pour
la préparation
5 d'un médicament destiné au traitement de maladies hyperprolifératives telles
que les
cancers.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un anticorps tel que
défini ci-dessus, pour la mise en oruvre d'un procédé de détection in vitro de
cellules
mitotiques, exprimant une séquence protéique telle que définie ci-dessus,
parmi des
cellules en culture ou des coupes de tissus sains ou tumoraux.
Les cellules en culture sont fixées, perméabilisées puis incubées en présence
de
l'anticorps. La révélation de l'anticorps est effectuée par utilisation d'un
anticorps
secondaire porteur d'un fluorochrome (l'observation est alors effectuée avec
un
microscope à fluorescence) ou d'une molécule permettant l'hydrolyse d'un
substrat et la
production d'une réaction colorée observable en lumière visible. Une stratégie
expérimentale similaire peut être appliquée sur des coupes de tissus.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un anticorps tel que
défini ci-dessus, pour la mise en Ceuvre d'un procédé de détection in vitro de
la
surexpression d'une séquence protéique telle que définie ci-dessus, dans des
cellules en
'20 culture ou des coupes de tissus sains ou tumoraux, notamment dans des
coupes de
tumeurs du sein, des poumons ou du pancréas.
La mise en évidence de la surexpression de CDC25B repose sur la même stratégie
expérimentale que décrite ci-dessus pour le procédé de détection de cellules
mitotiques.
Elle peut également être effectuée par transfert de protéines (western blot)
ou par toute
autre méthode capable de quantifier une protéine d'intérêt sur des extraits
protéiques
totaux préparés à partir des cellules saines ou tumorales.
La présente invention concerne également un procédé de criblage in vitro de
composés inhibiteurs de la mitose, à savoir de l'entrée en mitose des cellules
ou de la
progression de la mitose, lesdits composés inhibiteurs pouvant être notamment
utilisés
dans le cadre-d'une thérapie anticancéreuse, caractérisé en ce qu'il comprend
:
- la mise en présence dudit composé avec des cellules, et
- la sélection des composés inhibiteurs par détection de l'absence de liaison
de
l'anticorps tel que défini ci-dessus, ledit anticorps étant suscëptible de
reconnaître une
séquence peptidique telle que définie ci-dessus, par une méthode appropriée,
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notamment en utilisant les techniques ELISA, de transfert de protéines
(Western Blot)
ou d'immunofluorescence indirecte.
DESCRIPTION DES FIGURES
Les Figures lA, 1B, 1C, 1D et lE représentent la détection de la forme
phosphorylée de CDC25B sur la sérine 249 par immunofluorescence à différents
stades
cellulaires. La Figure lA correspond à l'interphase ; la Figure 1B correspond
à la
prophase ; la Figure 1 C correspond à la métaphase ; la Figure 1D correspond à
l'anaphase/télophase ; et la Figure lE correspond à la phase Gl.
La Figure 2 représente la détection de la forme phosphorylée de CDC25B sur la
sérine 249 par transfert de protéines (western blot).
La colonne 1 correspond à la protéine CDC25B purifiée seule ; la colonne 2
correspond à la protéine CDC25B purifiée avec le peptide phosphorylé ; la
colonne 3
correspond à la protéine CDC25B purifiée avec le peptide non phosphorylé ; et
la
colonne 4 correspond au traitement de CDC25B avec la phosphatase lambda.
METHODES ET RESULTATS
La phosphatase CDC25B est phosphorylée sur la sérine 249
L'analyse par spectroinétrie de masse réalisée sur CDC25B a permis de détecter
la
phosphorylation du résidu sérine en positiôn 249.
La protéine CDC25B a été purifiée puis digérée par la trypsine. L'analyse par
spectrométrie de masse MS/MS a révélé la présence d'un peptide
monophosphorylé. La
fragmentation de ce peptide a permis l'identification du groupement phosphate
sur la
sérine 249.
Production d'anticorps contre la protéine CDC25B phosphorylée sur l'acide
aminé sérine 249
Le peptide de séquence MEVEELS(p)PLALGR (SEQ ID NO : 2), où (p) désigne
la sérine phosphorylée, a été utilisé pour l'immunisation de lapins. Après
sacrifice des
animaux, le sérum a été purifié par chromatographie en deux étapes : la
première sur
une colonne de peptide phosphorylé pour retenir les anticorps spécifiques,
puis la
deuxième sur une colonne du même peptide non phosphorylé de séquence
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MEVEELSPLALGR (SEQ ID NO : 9), de manière à purifier dans l'éluat les
anticorps
spécifiques de la forme phosphorylée. La reconnaissance du peptide phosphorylé
par les
anticorps a été validée dans un test ELISA. Par la suite, ces anticorps sont
désignés sous
le nom de anti-S249P.
Les anticorps anti-S249P reconnaissent la protéine CDC25B dans des cellules
en mitose.
A) Des cellules HeLa ont été fixées et utilisées pour effectuer une analyse
par
immunofluorescence avec ces anticorps. Les cellules ont également été colorées
avec le
4'-6-diamino-2-phénylindole (DAPI) pour localiser le noyau. Les images
présentées à la
figure 1 sont représentatives d'observations sur un grand noinbre de cellules.
Elles
indiquent que la protéine CDC25B phosphorylée sur la sérine 249 (SEQ ID NO :
2) est
accumulée de façon très abondante dans les cellules en mitose, en particulier
au niveau
des pôles du fuseau. Ce marquage est aboli lorsqu'une compétition est réalisée
avec le
test avec le peptide phosphorylé ayant servi à l'immunisation mais pas avec le
peptide
non phosphorylé (MEVEELSPLALGR) ni avec un peptide phosphorylé sans rapport.
B) La protéine CDC25B a été purifiée à partir de cellules en culture puis
analysée par transfert de protéines (western blot) avec les anticorps contre
la
phosphatase CDC25B phosphorylée au niveau de la sérine 249. Comme le montre la
figure 2, la protéine CDC25B est phosphorylée in vivo sur ce site. Le
traitement par la
phosphatase lambda abolit cette phosphorylation. La détection est éliminée par
compétition avec le peptide pliosphorylé ayant servi à l'immunisation.
Ces observations valident l'utilisation de ces anticorps pour la détection de
la
protéine CDC25B phosphorylée dans les cellules mitotiques.
DOMAINES D'APPLICATION
A - Marqueur de cellules mitotiques
La détection de la phosphorylation de la forme phosphorylée de CDC25B permet
de détecter la présence de cellules mitotiques sur des cellules en culture ou
sur des
coupes de tumeurs.
La forme phosphorylée de CDC25B sur la sérine 249 est présente dans la cellule
en mitose. Sa localisation est nucléaire en prophase, puis elle est concentrée
en
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métaphase sur les deux hémi-fuseaux mitotiques avant d'envahir le plan
équatorial en
télophase, puis disparaître en fin de mitose.
Les anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre cette forme
phosphorylée de CDC25B permettent par conséquent la détection de toute cellule
mitotique exprimant la phosphatase CDC25B.
Cette détection des cellules mitotiques peut être réalisée sur des cellules en
cultüre
fixées ou sur des coupes de tissus sains ou tumoraux, en utilisant les
techniques
d'immunofluorescence indirecte ou d'immunocytochimie.
La détection des cellules mitotiques par cette méthode est ainsi un outil
nouveau à
-10 la disposition des cytologistes et des anatomo-pathologistes.
B - Aide à la décision thêrapeutique :
La prise en compte des niveaux d'expression de CDC25B dans les tumeurs a u.n
intérêt majeur dans le choix de la décision thérapeutique (utilisation ou non
de drogues
ciblant la protéine CDC25B). La détection de la forme phosphorylée de CDC25B
sur la
sérine 249 a un intérêt majeur dans cette application.
L'expression de CDC25B est variable en fonction des tissus. Il a été montré
que
des tumeurs (sein, poumon, pancréas, ...) surexpriment cette protéine. Dans le
cas des
tumeurs du pancréas, la croissance tumorale est dépendante de l'expression et
de la
fonction de CDC25B (Guo et al., 2004).
De nouveaux agents pharmacologiques capables de cibler CDC25B sont
actuellement développés par l'industrie (Prevost et al., 2003). Il est donc
essentiel de
prendre en compte le niveau d'expression de la phosphatase CDC25B afin de
déterminer la pertinence de l'utilisation d'un tel traitement.
L'utilisation d'anticorps dirigés contre la forme phosphorylée de CDC25B sur
la
sérine 249 permet de révéler la forme mitotique (et probablement active) de
cette
phosphatase. Sa détection (par iinmunocytochimie) dans des biopsies ou sur les
pièces
opératoires après exérèse chirurgicale apporte des éléments d'information de
nature à
orienter le choix thérapeutique en posant éventuelleinent, si CDC25B est
surexprimée,
l'indication d'une utilisation d'inhibiteurs des phosphatases CDC25.
C - Mise en place de criblage à haut débit :
La recherche de molécules interférant avec le cycle cellulaire peut utiliser
les
anticorps selon l'invention pour évaluer l'inhibition de l'entrée en mitose.
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Une recherche active de molécules inhibitrices de la progression dans le cycle
cellulaire est actuellement menée par de nombreux groupes phannaceutiques.
La mise en évidence d'un marqueur de cellules mitotiques représente un outil
de
choix pour explorer de façon simple et dans des cribles à haut débit la
capacité de
molécules à inhiber l'entrée et la progression en mitose.
Les anticorps contre la forme phosphorylée de CDC25B peuvent répondre à ce
besoin. Ils peuvent ainsi être utilisés en immunocytochimie, en cytométrie de
flux ou
par toute autre méthode adaptée permettant de détecter la protéine CDC25B
phosphorylée.
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RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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- Gabrielli, B. G. et al. (1996) Cytoplasmic accumulation of CDC25B
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- Guo et al. (2004) Expression and functional significance of CDC25B in human
pancreatic ductal adenocarcinoma, Oncogene, 23, 71-81,
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Phosphorylation and activation of human cdc25-C by cdc2-cyclin B and its
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- Mils, V. et al. (2000) Specific interaction between 14.3.3 isoforms and the
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- Nilsson, I. & Hoffmann, I. (2000) Cell cycle regulation by the Cdc25
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z5 - Prevost, G. et al. (2003) Inhibitors of the CDC25 phosphatases in
"Progress in
cell cycle research" Ed. Meijer, L., Jézéquel, A., Roberge, M., vol. 5, 225-
234.
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