Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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MÉTHODE ET TROUSSES DE DÉTECTION DE MUTATIONS ASSOCIÉES
A DES MALADIES GÉNÉTIQUES RÉCESSIVES
DOMAINE DE L'INVENTION
100011 La présente invention concerne une méthode de détection d'une pluralité
de
mutations dans au moins une région d'ADN ciblée du génome humain, les
mutations étant
associées à des maladies génétiques récessives. L'invention permet ainsi
d'identifier des
porteurs de mutations associées à des maladies génétiques récessives.
DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR
[0002] La région du Saguenay-Lac-St-Jean (SLSJ) au Canada présente un taux de
porteurs de maladies génétiques à caractère récessif plus élevé que dans la
majorité des autres
régions canadiennes. Cette situation est attribuable à certains phénomènes
historiques et
démographiques, incluant l'effet fondateur (c.-à-d. la création d'une nouvelle
population à
partir d'un nombre relativement restreint d'individus provenant d'une
population mère) et une
certaine homogénéité de la population.
[0003] Les maladies récessives les plus répandues dans cette région incluent
l'acidose
lactique, connue également sous le nom de variante canadienne française du
syndrome de
Leigh (LSFC), la tyrosinémie de type 1, la neuropathie sensitivomotrice
héréditaire, avec ou
sans agénésie du corps calleux (ACCPN) et l'ataxie spastique de Charlevoix-
Saguenay
(ARSACS).
[0004] Puisque ces maladies génétiques ont un caractère récessif (c.-à-dire
que pour être
atteint, un individu doit avoir deux allèles inopérants ou être homozygote
muté) et que la
majorité des individus porteurs de ces mutations sont hétérozygotes et ne
développent pas de
symptômes associés à ces maladies, l'identification des individus porteurs de
telles mutations
est difficile. Une telle identification des individus porteurs est toutefois
souhaitable, voir
essentielle, particulièrement lors de la planification des naissances. En
effet, les enfants issus
de la procréation entre deux individus hétérozygotes porteurs développent,
dans
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approximativement 25% des cas, la maladie génétique à caractère récessif.
Considérant que
le taux de porteurs hétérozygotes de mutations associées à l'une de ces
maladies s'élève à
environ 1 individu sur 20 dans certaines populations (dont celle du SLSJ), le
nombre de
descendants atteints de l'une de ces maladies est important.
[0005] Au cours des dernières années, les percées en matière de génie
génétique humaine
ont permis d'identifier différentes variations génétiques récessives associées
à chacune de ces
maladies. Plus spécifiquement, une substitution de la cytosine en position
1119 par une
thymidine (1119C/T) sur le gène LRPPRC (ou Leucine-rich PPR motif-containing
protein)
est associée avec l'acidose lactique (Mootha VK, et al. Identification of a
gene causing
human cytochrome c oxidase deficiency by integrative genomics . Proc Natl Acad
Sci U S
A. 2003 Jan 21,100(2):605-10). Par ailleurs, la mutation IVS12+5G/A sur le
gène FAH (ou
Fumarylacetoacetate hydrolase) est associée à la tyrosinémie de type 1 (Grompe
M, et al.,
A single mutation of the fumarylacetoacetate hydrolase gene in French
Canadians with
hereditary tyrosinemia type I . N. Engl. J. Med. 1994 Aug 11;331(6):353-7)
alors que la
mutation 2436de1G sur le gène SLC12A6 (ou Solute carrier family 12 potassium
chloride
transporters member 6) est associée à la polyneuropathie (Howard HC, et. al.,
The K-Cl
cotransporter KCC3 is mutant in a severe peripheral neuropathy associated with
agenesis of
the corpus callosum . Nat. Genet. 2002 Nov;32(3):384-92.) Enfin, une
association a été
établie entre les mutations 6594delT et 5254C/T sur le gène de SACS (ou
Spastic ataxia of
Charlevoix-Saguenay) et l'ataxie spastique de Charlevoix-Saguenay (Engert JC,
et. al.,
ARSACS, a spastic ataxia common in Northeastern Quebec, is caused by mutations
in a
new gene encoding an 11.5-kb ORF . Nat. Genet. 2000, Feb;24(2):120-5).
[0006] L'identification de telles mutations a permis la mise au point de
certains tests de
dépistage génétique. Les tests existants reposent en grande partie sur
l'amplification de
fragments d'ADN génomique d'intérêt des individus soumis au dépistage et par
le
séquençage desdits fragments, lesquels test ont été décrits dans l'art. Bien
qu'elles suscitent
un certain intérêt, les méthodes de dépistage génétique actuelles présentent
également
certains inconvénients. Par exemple, le dépistage des cinq mutations ci-haut
identifiées chez
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un individu requiert le prélèvement d'échantillons d'acides nucléiques
multiples, lesquels
échantillons doivent ensuite être acheminés dans des laboratoires accrédités
distincts pour
des fins d'analyse.
[0007] De façon usuelle, les échantillons font l'objet de cinq analyses
distinctes par
séquençage directe, soit une analyse pour chacune des mutations identifiées en
lien avec les
maladies génétiques récessives décrites ci-haut et les laboratoires dans
lesquels sont
effectuées les analyses sont généralement situés à l'extérieur de la région du
SLSJ. Cette
approche nécessite donc un transport d'échantillons et un grand nombre de
manipulations
techniques, telle l'extraction d'ADN, rendant cette méthodologie onéreuse et
contribuant à
accroître les délais nécessaires à l'obtention des résultats. En cas
d'urgence, comme par
exemple lorsqu'une grossesse est en cours, des coûts supplémentaires sont
engendrés pour
obtenir les résultats de manière expéditive, rendant les méthodologies
actuelles peu flexibles.
Finalement, le volume de tests à effectuer est variable et le nombre
d'échantillons à tester
lors de chaque envoi aux laboratoires accrédités est généralement petit, ce
qui contribue
également à maintenir élevés les coûts associés à de tels tests génétiques.
[0008] Puisque les tests de dépistage actuels sont peu économiques, les
programmes de
dépistage à grande échelle représentent un défi (p. ex. dans le cadre d'un
programme
populationnel de dépistage). Ainsi, le processus de dépistage actuellement en
usage dans la
région du SLSJ pour le dépistage des maladies récessives ne vise que certains
groupes
d'individus et repose sur la couverture en cascades familiales. Sommairement,
lorsqu'un
individu d'une cascade familiale se présente au service de conseil génétique
de son
établissement pour le dépistage d'une maladie génétique récessive, le
dépistage des autres
maladies génétiques récessives d'intérêt lui est proposé. Ainsi, les individus
n'appartenant
pas à de telles cascades familiales, mais néanmoins à risque d'être porteurs
de certaines
mutations génétiques ont un accès plus restreint au dépistage génétique.
[0009] Il serait donc souhaiTableau de pouvoir bénéficier d'une technologie
simple,
flexible et économique permettant de déterminer chez un grand nombre
d'individus la
présence de mutations génétiques récessives. Une telle technologie pourrait
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avantageusement permettre de déterminer, de manière simultanée et au sein d'un
même
laboratoire, la présence ou l'absence de mutations associées à plusieurs
maladies génétiques
récessives.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
[0010] Selon un mode de réalisation de la présente invention, une méthode pour
détecter
la présence ou l'absence de mutations dans le génome d'un individu est
fournie. La méthode
comprend (a) amplifier simultanément une pluralité de fragments d'acides
nucléiques de
l'individu pour obtenir un produit d'amplification, chacun desdits fragments
chevauchant la
position de l'une des mutations; (b) hybrider le produit d'amplification avec
un premier jeu
de sondes incluant un nombre de sondes correspondant à ladite pluralité de
fragments; et (c)
détecter la présence des marqueurs spécifiques.
[0011] Selon un aspect de l'invention, chacune des sondes du premier jeu est
adaptée
pour s'hybrider spécifiquement à un des fragments amplifiés lorsqu'il comporte
une des
mutations. Chacune des sondes est couplée à un marqueur spécifique. La
détection d'un
marqueur spécifique à une sonde du premier jeu indique la présence d'une
mutation
correspondante dans le génome de l'individu. Le premier jeu de sondes inclut
préférablement au moins une sonde ayant une séquence correspondant à l'une des
SEQ. ID.
NO 12, SEQ. ID. NO 14, SEQ. ID. NO 16, SEQ. ID. NO 18 et SEQ. ID. NO 20.
[0012] Selon un autre aspect de l'invention, la méthode comprend également
l'hybridation du produit d'amplification avec un second jeu de sondes,
laquelle hybridation a
lieu avant de détecter la présence des marqueurs spécifiques. Le second jeu de
sondes
comprend un nombre de sondes correspondant à la pluralité de fragments et
chacune des
sondes du second jeu est adaptée pour s'hybrider spécifiquement à un des
fragments
amplifiés lorsqu'il correspond à un génotype sauvage. Chacune des sondes est
couplée à un
marqueur spécifique, et la détection d'un marqueur spécifique à une sonde du
second jeu
indique l'absence d'une mutation correspondante dans le génome de l'individu.
Le second
jeu de sondes inclut préférablement au moins une sonde ayant une séquence
correspondant à
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l'une des SEQ. ID. NO 11, SEQ. ID. NO 13, SEQ. ID. NO 15, SEQ. ID. NO 17 et
SEQ. ID.
NO 19.
[0013] Selon un aspect additionnel, les fragments d'acides nucléiques sont des
fragments
d'ADN génomique, et préférablement des fragments de gènes et de façon
préférentielle des
gènes sont choisis parmi LRPPRC, FAH, SLC12A6 et SACS.
[0014] Selon un autre aspect de la présente invention, l'une des mutations est
associée à
l'acidose lactique et est préférablement une substitution 1119C/T sur le gène
LRPPRC.
[0015] Selon un autre aspect additionnel, l'une des mutations est associée à
la
tyrosinémie et est préférablement une mutation IVS 12+5G/A sur le gène FAH.
[0016] Selon un aspect supplémentaire de la présente invention, l'une des
mutations est
associée à la neuropathie sensitivomotrice héréditaire, avec ou sans agénésie
du corps calleux
et préférablement une mutation 2436de1G sur le gène SLC12A6.
[0017] Selon un autre aspect supplémentaire, l'une des mutations est associée
à l'ataxie
spastique de Charlevoix-Saguenay et est préférablement une mutation 6594delT
ou une
mutation 5254C/T sur le gène SACS.
[0018] Selon un aspect additionnel de la présente invention, l'amplification
des
fragments est réalisée à l'aide d'une des paires d'amorces choisies parmi les
SEQ. ID NO. 1
et SEQ. ID. NO. 2; SEQ. ID NO. 3 et SEQ. ID. NO. 4; SEQ. ID NO. 5 et SEQ. ID.
NO. 6;
SEQ. ID NO. 7 et SEQ. ID. NO. 8; et SEQ. ID NO. 9 et SEQ. ID. NO. 10.
100191 Toujours selon un autre mode de réalisation de l'invention, une trousse
pour
déterminer simultanément la présence ou l'absence d'une pluralité de mutations
dans le
génome d'un individu est fournie. La trousse comprend un jeu d'amorces
perrnettant
d'amplifier simultanément une pluralité de fragments d'acides nucléiques de
l'individu pour
obtenir un produit d'amplification. Le jeu d'amorces inclut préférablement au
moins une
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amorce correspondant à l'une des séquences choisie parmi les SEQ. ID. NO. 1 à
SEQ. ID.
NO. 10.
100201 Selon un aspect additionnel, la trousse comprend également un premier
jeu de
sondes incluant un nombre de sondes correspondant à la pluralité de fragments.
Chacune des
sondes du premier jeu est adaptée pour s'hybrider spécifiquement à un des
fragments
lorsqu'il comporte une des mutations. De manière préférable, le premier jeu de
sondes inclut
au moins une sonde ayant une séquence correspondant à l'une des SEQ. ID. NO
12, SEQ.
ID. NO 14, SEQ. ID. NO 16, SEQ. ID. NO 18 et SEQ. ID. NO 20.
[0021] Selon un autre aspect additionnel, la trousse comprend également un
second jeu
de sondes incluant un nombre de sondes correspondant à la pluralité de
fragments. Chacune
des sondes du second jeu est adaptée pour s'hybrider spécifiquement à un des
fragments
lorsqu'il correspond à un génotype sauvage. Le second jeu de sondes inclut
préférablement
au moins une sonde ayant une séquence correspondant à l'une des SEQ. ID. NO
11, SEQ.
ID. NO 13, SEQ. ID. NO 15, SEQ. ID. NO 17 et SEQ. ID. NO 19.
[0022] Selon un autre mode de réalisation de l'invention, une trousse pour
déterminer
simultanément la présence ou l'absence d'une pluralité de mutations dans une
pluralité de
fragments d'acide nucléiques d'un individu est fournie. La trousse comprend un
premier jeu
de sondes, chacune des sondes du premier jeu étant adaptée pour s'hybrider
spécifiquement à
l'un des fragments d'acide nucléique lorsqu'il comporte une des mutations. Le
premier jeu
de sondes inclut préférablement au moins une sonde ayant une séquence
correspondant à
l'une des SEQ. ID. NO 12, SEQ. ID. NO 14, SEQ. ID. NO 16, SEQ. ID. NO 18 et
SEQ. ID.
NO 20.
100231 Selon un aspect additionnel, chacune des sondes du second jeu est
adaptée pour
s'hybrider spécifiquement à un des fragments lorsqu'il correspond à un
génotype sauvage.
Le second jeu de sondes inclut préférablement au moins une sonde ayant une
séquence
correspondant à l'une des SEQ. ID. NO 11, SEQ. ID. NO 13, SEQ. ID. NO 15, SEQ.
ID. NO
17 et SEQ. ID. NO 19.
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100241 Enfin, selon un dernier aspect de la présente invention, la trousse
comprend
également un jeu d'amorces permettant d'amplifier simultanément la pluralité
de fragments
d'acides nucléiques de l'individu. L'amplification permet d'obtenir un produit
d'amplification. Le jeu d'amorces inclut préférablement au moins une amorce
correspondant
à l'une des séquences choisie parmi les SEQ. ID. NO. 1 à SEQ. ID. NO. 10.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
[0025] Les modes de réalisation de la présente invention devraient être
compris de façon
plus claire en se référant à la description détaillée des modes de réalisation
de l'invention en
conjonction avec les dessins l'accompagnant, dans laquelle:
[0026] FIG. 1 est un graphique illustrant la valeur médiane de la fluorescence
obtenue à
partir de différents échantillons en utilisant les sondes spécifiques ALSASS
et ALSASM-2;
[0027] FIG. 2 est un graphique illustrant la valeur médiane de la fluorescence
obtenue à
partir de différents échantillons en utilisant les sondes spécifiques TYRSSS-3
et TYRSSM-3;
[0028] FIG. 3 est un graphique illustrant la valeur médiane de la fluorescence
obtenue à
partir de différents échantillons en utilisant les sondes spécifiques PNPSSS
et PNPSSM-3;
[0029] FIG. 4 est un graphique illustrant la valeur médiane de la fluorescence
obtenue à
partir de différents échantillons en utilisant les sondes spécifiques AS 1 SSS-
3 et AS 1 SSM-3;
et
[0030] FIG. 5 est un graphique illustrant la valeur médiane de la fluorescence
obtenue à
partir de différents échantillons en utilisant les sondes spécifiques AS2SSS
et AS2SSM-2.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
[0031] La description qui suit et les modes de réalisation qui y sont décrits,
sont fournis
par l'illustration d'un ou plusieurs exemple(s) de modes de réalisation de
principes et
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d'aspects de la présente invention. Ces exemples sont fournis dans un but
d'explication et
non de limitation des principes de l'invention.
[0032] Dans un premier mode de réalisation de la présente invention, une
méthode de
détection de la présence ou de l'absence de mutations dans le génome d'un
individu est
fournie. La méthode de la présente invention est rapide, fiable, relativement
abordable et
permet de limiter les manipulations expérimentales requises pour la
détermination de
mutations associées à plusieurs maladies génétiques. Plus particulièrement, la
méthode de la
présente invention repose sur l'utilisation des outils présentement
disponibles dans les
domaines de la biologie moléculaire et des nanotechnologies afin de
centraliser les analyses,
minimiser les frais afférents au transport et aux consommables et limiter les
délais requis
pour l'obtention des résultats. Ainsi, la présente méthode peut trouver une
utilité dans le
cadre d'un programme populationnel de dépistage où le volume d'échantillons à
traiter par
période de temps est important et planifiable.
[0033] De manière générale, la méthode de la présente invention permet
l'amplification
simultanée de plusieurs fragments d'acides nucléiques d'intérêt et
l'hybridation subséquente
de ces fragments d'acides nucléiques avec des sondes spécifiques à chacune des
mutations,
l'hybridation des différents fragments étant réalisée simultanément, à partir
d'un seul produit
d'amplification et dans les mêmes conditions d'hybridation. La méthode permet
également la
détection simultanée d'un grand nombre de sondes spécifiques à chacune des
mutations,
lesquelles sondes sont chacune marquée à l'aide d'un marqueur spécifique et
indiquent la
présence ou l'absence de mutations associées à des maladies génétiques
récessives, tel qu'il
sera décrit en détails ci-après. Cette approche est libellée multiplexe
pour signifier
l'application de la méthode pour la détection simultanée, dans un même et
unique test, d'au
moins deux mutations.
[0034] Les maladies génétiques récessives envisagées par la présente invention
incluent
les maladies génétiques récessives retrouvées plus communément dans la région
du SLSJ,
soit l'acidose lactique ou variante canadienne française du syndrome de Leigh
(LSFC), la
tyrosinémie de type 1, la neuropathie sensitivomotrice héréditaire, avec ou
sans agénésie du
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corps calleux (ACCPN) et l'ataxie spastique de Charlevoix-Saguenay (ARSACS),
lesquelles
maladies sont décrites plus en détails dans le Tableau 1 ci-dessous. Une
personne versée
dans l'art appréciera toutefois que la méthode de la présente invention peut
aussi trouver une
utilité dans la détection de mutations associées à d'autres maladies
récessives issues, par
exemple, d'un effet fondateur commun, telles la fibrose kystique et la
mucolipidose de type
2. Cette même personne versée dans l'art comprendra que l'invention ne se
limite pas
seulement à la détection des mutations associées à des maladies génétiques
récessives, mais
qu'elle s'étend également à la détection d'autres mutations associées à
d'autres maladies
génétiques, soit à toute maladie associée à au moins une mutation dans au
moins une région
d'ADN génomique d'un individu.
TABLEAU 1
Liste des maladies récessives à incidence élevée dans la région du Saguenay-
Lac-St-Jean
Maladies OMIM4 GENE OMIM Chromosome Mutation Références
(Maladie) (Gène)
LSFC' 220110 LRPPR 607544 2p2l 1119C/T Mootha VK et al., (2003)
C
Tyrosinémie 276700 FAH 276700 15q25.1 IVS12+5G/A Grompe M et al., (1994)
(Type 1)
ACCPNZ 218000 SLC12 694878 15q13-q15 2436de1G Howard HC et al.,(2002)
A
ARSACS3 270550 SACS 604490 13q12.12 6594de1T Engert JC et al., (2000)
5254C/T
LSFC : acidose lactique ou variante canadienne française du syndrome de Leigh.
2ACCPN : Neuropathie sensitivomotrice héréditaire avec ou sans agénésie du
corps calleux.
3ARSACS : Ataxie spastique de Charlevoix-Saguenay.
40MIM : numéro dans la base de données Online Mendelian Inheritance in Man.
[0035] Selon un mode de réalisation préféré, la méthode de la présente
invention inclut
l'étape d'amplifier simultanément une pluralité de fragments d'acides
nucléiques de
l'individu pour obtenir un produit d'amplification. Dans ce mode de
réalisation chacun des
fragments amplifiés chevauche la position d'une mutation associée à l'une des
maladies
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génétiques récessives. Les mutations associées aux maladies récessives sont
préférablement
choisies parmi la mutation 11 19C/T sur le gène LRPPRC associée à l'acidose
lactique (Leigh
syndrome, LSFC), la mutation IVS12+5G/A sur le gène FAH associée à la
tyrosinémie de
type 1, la mutation 2436de1G sur le gène SLC12A6 associée à la
polyneuropathie, la mutation
6594delT sur le gène de SACS associée à l'ataxie spastique de Charlevoix-
Saguenay et la
mutation 5254C/T sur le gène de SACS, également associée à l'ataxie spastique
de
Ch arl evo i x- S aguenay.
[0036] L'étape d'amplification est préférablement réalisée par la technique de
réaction en
chaîne de la polymérase ou PCR, à l'aide d'un jeu d'amorces sélectionné pour
permettre
d'amplifier simultanément, dans un même essai et suivant les mêmes conditions
d'amplification, cinq (5) fragments d'acides nucléiques, chacun des fragments
amplifiés
chevauchant l'une des mutations décrites précédemment. Une personne versée
dans l'art
reconnaîtra que l'amplification peut s'appliquer à un nombre inférieur ou
supérieur de
fragments d'acides nucléiques, dans la mesure où les amorces sont adaptées
pour permettre
une telle amplification simultanée des fragments.
[0037] Les fragments d'acides nucléiques sont préférablement des fragments
d'ADN
génomique, et plus préférablement des régions géniques où un polymorphisme
pour une
maladie récessive visée existe. Ainsi, pour chaque maladie récessive visée, la
région du gène
propre à chacune des maladies considérées, où le polymorphisme pour la maladie
récessive
ciblée se retrouve, sera la région amplifiée par PCR. Par conséquent, chacune
des séquences
des amorces utilisées dans la réaction PCR correspond à une région du génome
humain
contenant le gène associé à la maladie récessive. L'étape d'amplification est
donc réalisée à
l'aide d'amorces spécifiques aux régions ciblées du génome.
[0038] Ainsi, puisque chacune des séquences des amorces utilisées dans la
réaction PCR
correspond à une région du gène associé à une maladie récessive (voir Tableau
2), lors de la
réaction PCR, les amorces spécifiques aux régions déterminées contribuent à
l'amplification
de cette région du gène, et ce, dans des conditions d'amplification favorisant
la production de
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grandes quantités de fragments d'ADN afin d'obtenir des produits du PCR. Ces
derniers
peuvent être d'une longueur d'environ 200 nucléotides.
[0039] Dans un mode de réalisation de l'invention, le jeu d'amorces comprend
cinq
paires d'amorces, soit les amorces comprenant les séquences SEQ. ID. NO. 1 et
SEQ. ID.
NO. 2; SEQ. ID. NO. 3 et SEQ. ID. NO. 4; SEQ. ID. NO. 5 et SEQ. ID. NO. 6;
SEQ. ID.
NO. 7 et SEQ. ID. NO. 8; et SEQ. ID. NO. 9 et SEQ. ID. NO. 10, lesquelles
séquences sont
décrites plus en détails dans le Tableau 2 ci-dessous.
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~ Q ~ =-, N M d ~ l~ 00 01
11b
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C7 â w vdi
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[0040] Dans un autre mode de réalisation préférentiel, au moins une des
amorces
utilisées dans la réaction de PCR a été modifiée préalablement à la réaction
de PCR afin de
comprendre une modification terminale à l'extrémité 5'. Selon ce mode de
réalisation,
l'extrémité 5' de l'amorce est liée à une molécule terminale, préférablement
la biotine. Dans
ce mode de réalisation préféré, la biotine est ultérieurement couplée à la
streptavidine afin de
permettre la liaison éventuelle d'un chromophore à l'extrémité 5' de chacun
des fragments
amplifiés par PCR. Le chromophore couplé à la streptavidine est préférablement
la
R-phycoérythine (aussi connu sous le nom d"'Alexa 532" ou "Cy3"), laquelle est
excitée à
une longueur d'onde de 532 nm-13 mW par un laser yttrium aluminium garnet
(YAG) de
couleur verte. Tel qu'il sera décrit en détails ci-après, l'accouplement d'un
chromophore aux
fragments amplifiés par PCR permettra de détecter la fluorescence des brins
d'acide
nucléiques ayant une séquence complémentaire aux sondes d'hybridation
utilisées et par le
fait même, d'évaluer indirectement la liaison de ces brins d'acides nucléiques
aux sondes
spécifiques fixées à des microsphères.
100411 Bien que la molécule terminale soit préférablement la biotine, une
personne
versée dans l'art comprendra que la molécule terminale est choisie parmi des
molécules
ayant des affinités particulières et connues pour d'autres molécules et que
d'autres
modifications terminales peuvent être apportées aux amorces de la réaction de
PCR afin de
coupler, à leur extrémité 5', une molécule permettant un accouplement avec
d'autres
molécules.
[00421 Il est entendu que l'étape d'amplification est réalisée à partir d'un
échantillon
d'acides nucléiques de l'individu, et préférablement à partir d'un échantillon
d'ADN
génomique. Ainsi, l'étape d'amplification peut inclure les étapes consistant à
obtenir un
échantillon d'ADN de l'individu et à préparer l'échantillon afin de le rendre
utilisable pour la
réaction de PCR. Un tel échantillon peut inclure tout type d'échantillon
d'ADN, incluant un
échantillon de sang, de salive ou de tissus. L'échantillon obtenu est
préférentiellement traité
afin d'isoler l'ADN génomique, de préférence par lyse cellulaire à l'aide
d'une solution à
base de détergents. Une personne versée dans l'art connaîtra d'autres méthodes
d'isolement et
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de purification d'ADN, lesquelles peuvent également être utilisées pour la
réalisation de la
méthode de la présente invention.
[0043] La méthode de la présente invention inclut également l'étape consistant
à hybrider
le produit d'amplification de la réaction de PCR avec un premier jeu de
sondes. Le premier
jeu de sondes inclut un nombre de sondes correspondant au nombre de fragments
amplifiés,
et préférablement cinq (5) sondes. Chacune des sondes du premier jeu est
adaptée pour
s'hybrider spécifiquement à un des fragments amplifiés lorsque ce fragment
comporte une
des mutations ciblées. Dans ce mode de réalisation, les sondes du premier jeu
sont
préférablement les sondes ALSASM-2 (SEQ. ID. NO. 12), TYRSSM-3 (SEQ. ID. NO.
14),
PNPSSM (SEQ. ID. NO. 16), ASISSM-3 (SEQ. ID. NO. 18) et AS2SSM-2 (SEQ. ID. NO.
20) décrites dans le Tableau 3 ci-dessous.
[0044] Dans un mode de réalisation alternatif, la méthode de la présente
invention
comprend également l'hybridation des fragments amplif és par la réaction de
PCR avec un
second jeu de sondes. Une telle hybridation du second jeu est préférablement
effectuée
simultanément à l'hybridation du premier jeu de sondes.
[0045] Le second jeu de sondes inclut préférablement cinq (5) sondes, soit un
nombre de
sondes correspondant au nombre de fragments amplifiés. Chacune des sondes du
second jeu
est adaptée pour s'hybrider spécifiquement à un desdits fragments lorsqu'il
correspond au
génotype sauvage, ou en d'autres mots, lorsque la mutation est absente. Dans
ce mode de
réalisation, les sondes du second jeu sont préférablement les sondes ALSASS
(SEQ. ID. NO.
11), TYRSSS-3 (SEQ. ID. NO. 13), PNPSSS (SEQ. ID. NO. 15), AS1SSS-3 (SEQ. ID.
NO.
17) et AS2SSS (SEQ. ID. NO. 19) décrites dans le Tableau 3 ci-dessous.
[0046] Une personne versée dans l'art appréciera que le nombre, la séquence et
la
combinaison des sondes peuvent varier en fonction du nombre de mutations à
détecter.
Ainsi, une seule sonde ayant une séquence correspondant à l'une des SEQ. ID.
NO. 11 à
SEQ. ID. NO. 20 ci-haut décrites pourrait être utilisée en combinaison avec
des sondes ayant
des séquences autres.
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-16-
[0047] Selon un aspect de la présente invention, chacune des sondes est
couplée à un
marqueur spécifique permettant de déterminer simultanément la présence de
chacune des
sondes dans l'échantillon. Ainsi, l'étape de l'hybridation des produits du PCR
peut être
précédée par la liaison de chacune des sondes à des marqueurs spécifiques,
telles des
microsphères. De préférence, une modification à l'extrémité 5' est apportée à
chacune des
sondes. Cette modification est préférablement de type "5'Uni-link amino" afin
de permettre
aux sondes de se lier aux groupements hydroxyles à la surface des microsphères
spécifiques.
[0048] Plus particulièrement, chacune des microsphères peut se définir
généralement
comme étant un excipient sous forme de petite sphère dont le diamètre est
compris entre
quelques microns et un millimètre, solide et pleine, ayant à sa surface une
substance
adhésive, de préférence le polystyrène. Des principes actifs, de préférence au
nombre de
deux, sont dissous ou dispersés dans les microsphères, lesquels sont
généralement ajoutés
selon une quantité prédéfinie, selon la technique de marquage de la
microsphère qui
s'ensuivra. De telles microsphères sont disponibles chez de nombreux
fournisseurs et sont
choisies parmi 100 microsphères disponibles. Le choix des microsphères couplé
à chacune
des sondes est généralement déterminé de façon aléatoire puisque ces dernières
sont très
similaires et donc généralement interchangeables. De plus, il est à noter
qu'une personne
versée dans l'art saura que la substance adhésive à la surface de la
microsphère peut être d'un
autre type de molécule, comme par exemple un ligand, un anticorps ou une
protéine.
100491 Selon un mode préféré de l'invention, les principes actifs qui sont
dissous ou
dispersés dans chacune des microsphères sont des chromophores. Les
chromophores sont
généralement des molécules colorées, pouvant faire partie de la famille des
nitrés, des
monoazoiques, des diazoiques, des triphenylméthanes, des quinoneimines, des
xanthènes et
des anthraquinones. La liste de ces familles de chromophores n'est pas
exhaustive. Par
exemple, les principes actifs, de préférence des chromophores rouge et orange
sont mélangés
dans la microsphère et excités à l'aide d'un laser diode à 635 nM-IOmW, de
couleur rouge,
lors de l'étape de la détection par l'appareil cytofluorométrique, tel qu'il
sera décrit en détails
ci-après. La couleur qui sera observée lors de l'étape de la détection et de
la quantification
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des microsphères est due à un phénomène de résonance entre une double liaison
chimique et
la lumière d'excitation du chromophore choisi et est spécifique à chacune des
sondes utilisée.
Dans un mode de réalisation préféré, les sondes ALSAS, ALSASM-2, TYRSSS-3,
TYRSSM-3, PNPSSS, PNPSSM, ASISSS-3, ASISSM-3, AS2SSS et AS2SSM-2 sont
couplées aux microsphères commercialisées par LUMINEX sous les numéros 033,
034,
035, 036, 037, 038, 042, 043, 044 et 045, respectivement. Ainsi, une fois
qu'elles seront liées
aux microsphères, les sondes spécifiques auront pour tâche de se lier, par
hybridation, aux
produits du PCR obtenus lors de l'étape de l'amplification et de permettre la
détermination de
la présence ou l'absence de mutations sur les fragments.
[0050] L'utilisation d'un chromophore pour la liaison à la microsphère n'est
pas l'unique
moyen de marquer ces microsphères. Effectivement, si un appareil de détection
le permet, un
autre type de principe actif pourra être utilisé. Par exemple, une personne
versée dans l'art
reconnaîtra qu'un principe actif de nature radioactive, thermique ou autre,
par exemple, peut
être utilisé afin de détecter un produit PCR/sonde. Une personne versée dans
l'art
comprendra également que d'autres types de modifications sur les sondes
utilisées peuvent
réaliser le même objectif.
[0051] Les techniques relatives à l'hybridation de sondes sont généralement
connues
dans l'art et ne nécessitent pas de description exhaustive. L'étape de
l'hybridation des
produits du PCR aux sondes couplées à des microsphères peut ensuite être
complétée afin de
produire des complexes comprenant les produits du PCR liés aux sondes couplées
à des
microsphères. Après l'hybridation, ces complexes sont récupérés par
centrifugation et re-
suspendus dans une solution contenant un agent combiné. A des fins de
précision donc, il est
entendu que l'étape d'hybridation inclut une étape de purification visant à
éliminer les sondes
n'ayant pas hybridé avec un fragment complémentaire d'acide nucléique amplifié
et que lors
de la détection, seules les sondes ayant hybridé avec de tels fragments
complémentaires
seront détectées. Une personne versée dans l'art comprendra que le terme
hybridation
spécifique ou tout autre terme similaire indique une hybridation
généralement spécifique
suivant les conditions d'expérimentation et qu'une telle hybridation peut
néanmoins
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impliquer un certain nombre d'hybridations non spécifiques définissant un
certain bruit de
fond lors de l'expérimentation.
[0052] La méthode de la présente invention comporte enfin une étape de
détection de la
présence des marqueurs spécifiques à chacune des sondes du premier jeu et, le
cas échant,
des marqueurs spécifiques à chacune des sondes du second jeu. Il sera compris
que la
détection d'un marqueur spécifique à une sonde du premier jeu indique la
présence d'une
mutation correspondante dans le génome dudit individu, alors que la détection
d'un marqueur
spécifique à une sonde du second jeu indique l'absence de mutation
correspondante.
[0053] Selon un mode préféré de l'invention, la détection des complexes
produits du
PCR/sonde s'effectue dans un appareil permettant la détection simultanée par
laser d'un
complexe lié à un agent combiné. Cet appareil est de préférence un
cytofluoromètre. Ainsi,
l'étape de la détection permet d'identifier, de préférence par mesure de la
fluorescence des
chromophores, la présence simultanée des différentes microsphères et des
produits de PCR
(c.-à-d. le produit d'amplification par PCR comprenant une molécule de
biotine, de
streptavidine et un chromophore). Ainsi, la détection simultanée d'une
microsphère liée à
une sonde spécifique (laquelle sonde peut être hybridée ou non avec un
fragment
complémentaire d'ADN) et du fragment complémentaire d'ADN est indicatif de
l'hybridation du brin d'ADN concerné à la sonde. précisément.
[0054] Une personne dans le domaine comprendra que l'étape de détection de la
présente
méthode implique une étape de quantification des complexes produits de
PCR/sondes,
laquelle peut être calculée, par exemple, par une valeur médiane de la
fluorescence des
chromophores. Dans le cas où l'invention est réalisée à l'aide d'un
cytofluoromètre de marque
LUMINEX , la réalisation simultanée, dans une seule réaction, de 100 tests sur
96
échantillons différents, sera permise, ce qui en fait un calibre idéal pour
les besoins de
dépistage populationnel d'un nombre restreint de gènes ou régions géniques.
Une personne
versée dans l'art comprendra qu'un autre type d'appareil peut réaliser le même
objectif et que
le type d'appareil utilisé dépendra de la nature de la modification terminale
à l'extrémité 5'
effectuée sur les amorces et sur le premier élément de l'agent combiné.
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[0055] Selon un mode préféré de l'invention, la quantification des complexes
produit
PCR/sonde permet d'établir un rapport de la fluorescence entre les complexes
formés avec le
produit de PCR comportant une mutation (ou complexe muté ) et les complexes
formés
avec le produit de PCR comportant le génotype sauvage (ou complexe sauvage
. De
préférence, les valeurs de ces rapports permettent, à leur tour d'établir un
diagnostique
clinique de la présence de la mutation récessive dans un spécimen et ainsi
d'identifier les
porteurs de cette mutation. Par exemple, une valeur de rapport complexe
muté/complexe
sauvage variant entre 0.4 et 0.6 tend à indiquer que l'individu diagnostiqué
est homozygote
pour les allèles sauvage (c.-à-d. qu'il n'est pas porteur de la mutation
concernée), alors
qu'une valeur du rapport s'approchant de 1.0 (p. ex. variant de 0.9 à 1.0)
indique la présence
de la mutation sur un des allèles de l'individu diagnostiqué. Enfin, un valeur
du rapport
complexe muté/complexe sauvage s'approchant de 2 tend à indiquer un génotype
homozygote muté chez l'individu. Une personne versée dans l'art appréciera que
la valeur de
ces rapports est arbitraire et qu'elle peut être modifiée sans s'éloigner de
l'esprit de
l'invention. Cette même personne versée dans l'art appréciera que
l'établissement de cette
valeur de rapport peut prendre en considération certains facteurs, dont
notamment le bruit de
fond et la valeurs des contrôles positifs et négatifs.
[0056] Ainsi, selon un mode de réalisation, chacun des puits contient les
réactifs
nécessaires au dépistage d'au moins une des mutations concernées. Chaque
plaque inclut les
échantillons de 40 personnes en duplicata, des contrôles positifs représentés
par au moins un
porteur de chacune des mutations ciblées, un homozygote sauvage connu en plus
d'un
contrôle négatif composé d'une réaction de PCR en absence d'ADN génomique.
L'invention
s'étend à la méthode exécutée dans des plaques de différentes grandeurs et ne
se limite pas à
son exécution sur une plaque de 96 puits.
[0057] Dans un autre mode de réalisation préféré, une trousse pour déterminer
simultanément la présence ou l'absence d'une pluralité de mutations dans le
génome d'un
individu est fournie. La trousse comprend préférablement un jeu d'amorces
permettant
d'amplifier simultanément une pluralité de fragments d'acides nucléiques de
l'individu. Tel
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que décrit précédemment, les fragments d'acides nucléiques concernés sont
préférablement
des fragments d'DDN génomique de l'individu. Ainsi, la trousse permet
l'obtention de
plusieurs fragments amplifiés distincts en effectuant une seule réaction de
PCR, dans un
même tube réactionnel. Le jeu d'amorces auquel il est fait référence peut
inclure, par
exemple, une ou plusieurs amorces correspondant aux SEQ. ID. NO. 1 à SEQ. ID.
NO. 10.
Une personne versée dans l'art appréciera que la nature, le nombre et la
combinaison
d'amorces est adaptée en fonction des mutations devant être identifiés.
100581 La trousse peut également inclure un jeu de sondes capables de
s'hybrider aux
produits de PCR. Le jeu de sondes inclut un nombre de sondes correspondant à
au nombres
de fragments amplifiés et chacune des sondes est adaptée pour se lier de
manière
relativement spécifique aux fragments amplifiés lorsqu'ils comporte une des
mutations
d'intérêt. Ainsi, le jeu de sonde peut inclure une ou plusieurs sondes ayant
une séquence
correspondant à l'une des SEQ. ID. NO 12, SEQ. ID. NO 14, SEQ. ID. NO 16, SEQ.
ID. NO
18 et SEQ. ID. NO 20.
[0059] Similairement, la trousse peut comprendre un second jeu de sondes.
Contrairement au premier jeu de sondes, le second jeu inclut des sondes
adaptées pour
s'hybrider aux fragments amplifiés lorsque ceux-ci présente le génotype
sauvage ou, en
d'autres mots, lorsque les fragments sont exempts de mutations. Le second jeu
de sondes
inclut préférablement une ou plusieurs sondes ayant une séquence correspondant
à l'une des
SEQ. ID. NO 11, SEQ. ID. NO 13, SEQ. ID. NO 15, SEQ. ID. NO 17 et SEQ. ID. NO
19.
[0060] Alternativement, une trousse pourrait n'inclure que l'un ou l'autre des
premier et
second jeux de sondes décrits ci-haut. Une telle trousse pourrait trouver une
utilité, par
exemple, lorsque les fragments d'acides nucléiques sont amplifiés à l'aide
d'amorces autres
que celles décrites ci-haut. Également, une personne versée dans l'art
appréciera que
l'établissement d'un rapport complexe muté/complexe sauvage peut ne pas être
désirée dans
toutes les situations. Ainsi, il peut être utile, dans certaines
circonstances, de n'utiliser qu'un
seul des jeux de sondes. Cette même personne versée dans l'art comprendra que
la trousse
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peut donc inclure un ou plusieurs des (1) jeux d'amorces, (2) premier jeu de
sonde et (3)
second jeu de sonde ou encore certains uniquement certaines de leurs
composantes (p. ex. 2
[0061] Ayant décrit les principes généraux de l'invention, une méthode pour
déterminer
la présence ou l'absence de mutations dans le génome d'un individu va
maintenant être
décrite à l'aide d'un exemple.
EXEMPLE 1:
MÉTHODE DE DÉPISTAGE OU DE DÉTECTION DE PORTEURS DE MALADIES RÉCESSIVES A
L'AIDE DE SONDES COUPLÉES A DES MICROSPHERES
Matériels et méthodes:
Extraction de l'ADNgénomique (ADNg)
[0062] Selon un mode préférentiel de l'invention, l'extraction de l'ADN
génomique
(ADNg) a été effectuée selon une modification de la méthode standard à partir
de papier
FTA (Whatman(ï). La méthode utilisée est celle décrite par Caggana et ses
collaborateurs
en 1998 (Caggana M. Conroy J.M., Pass K.A. Rapid efficient method for
multiplex
amplification from filterpaper . Human mutation 11: [M. Conroy] 404-409
(1998)).
Plusieurs méthodes d'extraction d'ADN génomique sont accessibles. Les
échantillons de
sang prélevé sur papier FTA permettent d'obtenir à partir d'un cercle de 2 mm
une quantité
accepTableau d'ADNg. Les cercles ou punches sont mis en présence de méthanol
et laissés à
l'air libre pendant toute la nuit auxquels 25 L d'eau stérile sont ajoutés.
Les échantillons
sont chauffés à 95 C pendant 10 minutes, puis centrifugés et le surnageant
contenant l'ADN
est transféré dans un tube stérile. Une fraction de cet échantillon est
utilisée dans la réaction
PCR, exécutée en multiplex.
Préparation du mastermix
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[0063] Selon un mode préféré de l'invention, la préparation du mastermix pour
la
réaction PCR pour l'amplification des régions du génome visées par la présente
invention se
détaille ainsi:
a. Dégeler les réactifs (tampon, dNTPs, amorces, ADNg) et conserver à 4 C;
b. Diluer et combiner les amorces pour obtenir une concentration finale de 10
M pour chacune des amorces (voir Tableau 2). Les amorces sont conçues
pour amplifier la région mutée du génome où un polymorphisme pour
chacune des maladies récessives ciblées est déjà identifié;
c. Calculer le volume requis selon le nombre de réactions à effectuer en
utilisant
une valeur de 25 L par réaction de PCR;
d. Mélanger les réactifs dans l'ordre suivant :
Réactifs volume conc. finale
Tampon 10X 10 L 1 X
mM dNTPs 1 L 250 M
10 M Amorces 3 L 0.3 M
H20* 75 L
Taq polymérase 1 uL 5 unités
20 Volume final 90 L
e. Mettre 18 L de mastermix par puits
f. Ajouter 2 L d'ADN génomique
g. Sceller la plaque et la déposer dans l'appareil de PCR lorsque la
température
25 atteint 94 C
Programmation de l'appareil de PCR.
[0064] La programmation de l'appareil de PCR utilisé pour l'amplification des
fragments
d'acides nucléiques est résumée ci-après:
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étape température temps
1. 94 C 10 min
2. 94 C 30 sec
3. 54 C 60 sec
4. 72 C 60 sec
5. Répéter 35 fois étapes 2 à 4 90 min
6. 72 C 10 min
7. conserver 4 C
Hybridation
[0065] Selon un mode préféré de l'invention, l'hybridation des fragments
amplifiés aux
sondes qui ont été préalablement couplées à une microsphère spécifique
sélectionnée parmi
100 microsphères différentes est effectuée. Ces sondes correspondent aux
séquences
conservées ou mutées des régions où l'on retrouve les polymorphismes
responsables de l'une
des 4 maladies récessives à l'étude (voir Tableau 3). L'appareil Luminex
possède un laser
qui a pour fonction de détecter les chromophores et donc d'identifier avec
précision une des
100 sphères disponibles.
a. Re-suspendre les microsphères par vortex pendant 20 secondes et par
sonication pendant 20 secondes.
b. Diluer les microsphères à une concentration de 50 microsphères par L de
solution TMAC à 1.5X (3M TMAC, 50 mM Tris-HCI, pH8.0, 4 mM EDTA,
pH8.0, 0.1% sarkosyl);
c. Mettre 10 L de tampon TE par puits.
d. Ajouter 25 gL de la solution diluée de microsphères.
e. Ajouter 2.5 L de la réaction de PCR et mélanger à l'aide d'un pipeteur
multipuits
f. Sceller la plaque.
g. Incuber à 95 C pendant 5 min et à 52 C +/- 5 C pendant 15 min.
h. Centrifuger la plaque à 3000 x g pendant 5 min à 22 C.
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-24-
i. Enlever le surnageant par inversion.
Marquage d'une protéine, la biotine, à un chromophore, la phycoérythrine.
[0066] Une fois l'hybridation complétée, les complexes comprenant les
microsphères
couplées aux sondes avec les produits PCR, sont récupérés par centrifugation
et re-suspendus
dans une solution contenant une protéine, de préférence la biotine, liée à un
chromophore, de
préférence la phycoérythine. Cette étape de l'invention se détaille comme
suit:
a. Ajouter 75 ,uL d'une solution de TMAC 1X contenant de la streptavidine-
phycoérythrine à 4 g par mL.
b. Re-suspendre les culots à l'aide d'une pipette multipuits.
c. Incuber 10 minutes à la température ambiante dans l'obscurité.
Analyse
a. Préparer le fichier d'exécution de l'appareil LUMINEX en utilisant, par
exemple un volume de 50 L analysé pendant 45 secondes à la température
ambiante afin de détecter un minimum de 100 microsphères pour chacune des
sondes utilisées.
b. Déposer la plaque dans l'appareil.
c. Démarrer l'analyse.
[0067] L'appareil cytofluorométrique de marque LUMINEX possède un laser qui a
pour fonction de détecter les chromophores et donc d'identifier avec précision
une des 100
microsphères disponibles. Le plateau d'échantillonnage propre à l'appareil
LUMINEX a été
retenu parce qu'il permet simultanément la réalisation dans une seule réaction
de 100 tests
sur 96 échantillons différents, ce qui en fait un calibre idéal pour les
besoins de dépistage. De
plus, les coûts d'acquisition de l'appareil et celui des réactions sont
inférieurs à ceux déjà
utilisés. Les conditions expérimentales sont uniques, rapides et spécifiques à
un coût
nettement inférieur à ce qui existe présentement. Cet appareil permet de
mesurer la présence
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-25-
de deux éléments fluorescents simultanément. Ainsi, la présence des principes
actifs dissous
dans la microsphère d'une part, et le chromophore constituant le deuxième
élément de l'agent
combiné d'autre part, signalera la présence des régions d'ADN ciblées,
correspondant à la
séquence d'ADN des première et deuxième sous-régions.
Rapport (Étape optionnelle mais préférable pour l'analyse des résultats)
a. Transférer et enregistrer les résultats dans un fichier Excel ou autre.
b. Utiliser les valeurs de fluorescence médiane d'intensité afin de générer un
histogramme.
c. Interprétation automatisée du résultat;
a. Validation du résultat par personne accréditée.
[0068] L'appareil de détection produit donc les données brutes qu'il faut
ensuite
analyser. Le transfert et l'enregistrement des données peuvent se faire dans
un fichier de type
ExcelTM. Un tel transfert est illustré dans les FIG. 1 à FIG. 5, lesquelles
figures démontrent
les résultats de la méthode effectuée dans le cadre de la détermination du
génotype d'un
grand nombre d'individus pour les mutations 1119C/T sur le gène LRPPRC,
IVS12+5G/A
sur le gène FAH, 2436de1G sur le gène SLC12A6, 6594delT sur le gène SACS et
5254C/T et
sur le gène SACS, respectivement.
[0069] La compilation des données générées permet l'établissement d'un rapport
complexe muté/complexe sauvage, tel que décrit précédemment. Dans cet exemple,
une
valeur de rapport complexe muté/complexe sauvage variant entre 0.4 et 0.6 tend
à indiquer
que l'individu diagnostiqué est homozygote pour les allèles sauvages (c.-à-d.
qu'il n'est pas
porteur de la mutation concernée), alors qu'une valeur du rapport s'approchant
de 1.0 (p. ex.
variant de 0.9 à 1.0) indique la présence de la mutation sur un des allèles de
l'individu
diagnostiqué. L'interprétation des rapports complexe muté/complexe sauvage
permet
d'établir le diagnostique clinique.
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-26-
[0070J Ainsi, une valeur d'intensité médiane de fluorescence supérieure ou
égale à 100
est considérée comme étant une valeur positive et indicative que l'origine du
spécimen
d'ADN prélevé est porteur de la mutation d'une maladie récessive ciblée.
[0071J L'invention permet aussi de dépister ou de détecter au moins une
mutation dans au
moins une région d'ADN ciblée du génome humain, ladite mutation étant associée
à une
maladie récessive, caractérisée en ce que la méthode est exercée afin de
dépister ou de
détecter au moins deux mutations simultanément, c'est-à-dire, dans un même et
unique test.
Ainsi, l'invention permet de mettre au point un test de détection de porteurs
de maladies
récessives qui est aussi rapide et efficace et ce, à un coût nettement
inférieur à ce qui existe
présentement sur le marché.
[00721 Même si un mode de réalisation préférentiel de la présente invention a
été décrit
en détail ci-dessus et illustré dans les dessins accompagnant la demande, il
doit être compris
que l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation particulier et que
plusieurs
changements et modifications peuvent y être effectués sans s'éloigner de la
portée ou l'esprit
de la présente invention.
