Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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PROCEDE D'IMMUNISATION GENETIQUE PAR
ELECTROTRANSFERT CONTRE UNE TOXINE ET ANTISERUM
SUSCEPTIBLE D'ETRE OBTENU PAR LEDIT PROCEDE
L'invention a pour objet un procédé d'obtention d'un antisérum dirigé contre
une
toxine protéique par administration chez un animal d'une solution comprenant
une
construction génétique codant un fragment immunogène de toxine, suivie de
l'application d'un champ électrique dans la zone d'administration, et
isolement du
sérum. L'antisérum susceptible d'être obtenu par le procédé ainsi que
l'utilisation
de la solution pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à
traiter
un effet toxique lié à l'absorption chez un mammifère d'une toxine,
caractérisée
en ce que ledit médicament est formulé en vue d'une administration par
électrotransfert chez le patient, sont également compris dans l'invention.
Le moyen le plus utilisé à l'heure actuelle qui permet d'obtenir des
antisérums
contre un antigène protéique, par exemple une toxine ou un poison, est
d'effectuer des injections répétitives de protéines recombinantes ou natives
purifiées afin d'induire une réponse immunitaire chez l'animal.
Alternativement,
on peut aussi faire exprimer la protéine sur une capside ou enveloppe virale,
ou
dans une particule de type virosome. Pour la toxine botulinique ou d'autres
toxines létales, on ne peut pas immuniser avec la toxine entière.
Classiquement,
il faut produire de la toxine à partir de la bactérie, la purifier, puis
modifier cette
protéine de façon à inactiver sa létalité, tout en gardant son pouvoir
antigénique.
Ceci s'obtient, par exemple, en purifiant une sous-unité de la toxine, qui
n'est
donc pas entièrement fonctionnelle. Alternativement, on peut produire une
telle
sous-unité recombinante, par exemple chez E.coli. Ceci peut se révéler
indispensable en l'absence de procédé fiable d'inactivation de la toxine. Dans
les
deux cas, production de protéine native inactivée ou de fragments
recombinants,
les techniques sont lourdes et coûteuses. Ceci explique par exemple, qu'un
seul
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stock de sérum multivalent contre les divers sérotypes de toxines botuliniques
aient été produits à ce jour.
Une voie alternative pour l'obtention d'un antisérum est l'immunisation
génétique, dans laquelle un ADN codant la toxine est administré chez l'animal
à
immuniser. L'ADN codant, dans lequel le gène codant est précédé d'un
promoteur adéquat et comporte une séquence de polyadénylation, peut être
porté,
soit par un vecteur viral (adénovirus, AAV, rétrovirus, lentivirus, etc...),
soit par
un plasmide bactérien. Il peut être aussi produit par synthèse acellulaire in
vitro,
par exemple par PCR.
La possibilité d'obtenir une immunisation par injection d'un ADN plasmidique a
été démontrée pour la première fois il y a une dizaine d'années (Tang et al.,
Nature. 1992 Mar 12 ; 356(6365):152-4; Ulmer et al., Science. 1993 Mar
19;259(5102):1745-9). L'immunisation génétique consiste à injecter directement
dans le muscle squelettique ou la peau, ou encore dans d'autres tissus, les
gènes
codant les protéines antigéniques et insérés sur un fragment circulaire d'ADN
bactérien (plasmide). L'organisme lui-même produit les antigènes qui vont
induire la réaction immunitaire. Il est maintenant bien établi que
l'immunisation
par ADN induit une réponse durable à la fois cellulaire et humorale
(Gurunathan
et al., Annu Rev Immunol. 2000;18:927-74. Review; Quinn et al., Vaccine. 2002
Aug 19;20(25-26):3187-92).
De nombreuses publications récentes font état de cette réponse humorale, dont
on peut citer quelques exemples :
- Une injection intramusculaire unique de plasmide codant une protéine
de l'enveloppe du virus HBV (hépatite B) provoque la production d'anticorps
pendant au moins 74 semaines (Davis et al., Gene Ther. 1997 Mar;4(3):181-8), à
un titre compatible avec une protection efficace.
- Lorsqu'un plasmide codant un génome muté du virus de Kunjin est
injecté intramusculairement chez la souris, des anticorps sont produits avec
un
titre variant de 10 à 40. Si ces souris sont soumises au virus sauvage de
Kunjin,
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ou au très ressemblant virus West Nile, elles sont protégées (0 à 20% de
mortalité) (Hall et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Sep 2;100(18):10460-4.
Epub 2003 Aug 13).
- L'injection intramusculaire chez la souris de plasmide codant la partie
membranaire de la protéine humaine PSMA (prostate specific membrane antigen)
conduit à la production d'anticorps contre cette protéine (Kuratsukuri et al.,
Eur
Urol. 2002 Ju1;42(1):67-73).
Ces quelques exemples montrent qu'il est possible d'obtenir des anticorps
neutralisants avec des titres satisfaisants chez l'animal par immunisation par
l'ADN. Ceci est surtout vrai chez la souris, et la méthode est un peu moins
efficace chez les animaux plus gros (Babiuk et al., Vaccine. 2003 Jan 30;21(7-
8):649-58. Review; Dupuis et al., J Immunol. 2000 Sep 1;165(5):2850-8).
Une bien meilleure efficacité de transfert de gène peut être obtenue en
utilisant la
technique physique. Par exemple, la méthode balistique de "gene gun" utilisant
des particules d'or recouvertes d'ADN, qui sont projetées à très grande
vitesse sur
la peau ou les muqueuses de l'animal conduisant à l'administration d'ADN aux
noyaux des cellules de ces tissus. Une autre technique utilise les ultrasons.
Une
autre technique, appelée méthode "hydrodynamique ou hydrostatique"
d'injection d'ADN, utilise l'injection rapide intraveineuse ou intraartérielle
d'un
grand volume de liquide contenant l'ADN codant, ce qui permet la pénétration
de
l'ADN dans les cellules, par exemple les hépatocytes, les cellules
endothéliales,
ou les cellules musculaires. Une dernière méthode physique très efficace
d'administration d'ADN est l'électrotransfert, que les inventeurs ont
développée
au laboratoire. L'électrotransfert est une technique simple et efficace de
transfert
de gènes, consistant en une injection intramusculaire d'une solution d'ADN
suivie de l'application d'une série d'impulsions électriques, au moyen
d'électrodes
reliées à un générateur (Aihara et al., Nat Biotechnol. 1998 Sep;16(9):867-
70.;
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Mir et al., C R Acad Sci III. 1998 Nov;321(11):893-9.; Mir et al., Proc Natl
Acad
Sci U S A. 1999 Apr 13;96(8):4262-7.). Ceci permet d'améliorer l'expression
des
protéines de plusieurs ordres de grandeur (Lee et al., Mol Cells. 1997 Aug
31;7(4):495-501; Kirman et al., Curr Opin Immunol. 2003 Aug;15(4):471-6.
Review).
Plusieurs études récentes montrent l'intérêt de la technique
d'électrotransfert lors
de l'immunisation par ADN: par exemple, le titre en anticorps produit augmente
d'un facteur 100 chez la souris après électrotransfert d'un plasmide codant un
antigène de surface du virus HBV (Widera et al., J Immunol. 2000 May
1;164(9):4635-40). Ce facteur d'augmentation est de l'ordre de 10 dans le cas
de
lapins ou de cochons d'Inde. Des titres élevés en anticorps ont également été
obtenus chez la souris et le lapin après électrotransfert intramusculaire d'un
plasmide codant une glycoprotéine de l'enveloppe du virus de l'hépatite C
(Zucchelli et al., J Virol. 2000 Dec;74(24):11598-607), et chez la souris
après
électrotransfert d'un plasmide codant une protéine du bacille de la
tuberculose
(Tollefsen et al., Vaccine. 2002 Sep 10;20(27-28):3370-8). Cette technique est
également applicable à des animaux plus gros tels que la chèvre ou les bovins,
(Tollefsen et al., Scand J Immunol. 2003 Mar;57(3):229-38). Les inventeurs ont
eux-même montré au laboratoire que l'électrotransfert d'un plasmide codant
l'hémagglutinine de la grippe induisait une meilleure réponse immune chez la
souris qu'une simple injection intramusculaire (Bachy et al., Vaccine. 2001
Feb
8;19(13-14):1688-93). Enfm, on peut noter qu'il a été possible de générer des
anticorps monoclonaux contre des allergènes de mites après immunisation de
souris par électrotransfert (Yang et al., Clin Exp Allergy. 2003 May;33(5):663-
8).
La technique d'électrotransfert est simple, facile à mettre en oeuvre, et ne
requiert
pas la purification de protéines recombinantes, étape généralement longue,
fastidieuse et de coût élevé nécessaire lors de l'immunisation classique. Elle
permet donc de tester rapidement plusieurs épitopes.
Les techniques d'immunisation génétiques citées plus haut (méthodes
balistiques,
ultrasoniques, hydrodynamiques, hydrostatiques ou électriques) peuvent être
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combinées avec des méthodes d'immunisation classique par protéine. Par
exemple, on pourra pratiquer une première immunisation génétique, suivie après
plusieurs semaines de 1 à 2 immunisations génétiques, suivies enfin après
plusieurs semaines ou plusieurs mois de plusieurs immunisations protéiques
5 contre le même antigène. On pourra aussi, alternativement, vacciner d'abord
contre la protéine puis effectuer une immunisation génétique.
Les neurotoxines botuliques (Clostridium botulinum) et tétaniques (Clostridium
tetani) présentent une organisation commune. Elles sont synthétisées sous
forme
d'une seule chaîne protéique (- 150 kDa), qui est ensuite activée par un
clivage
protéolytique déterminant deux chaînes protéiques : la chaîne légère en N-
terminal ou L (- 50 kDa) et la chaîne lourde en C-terminal ou H(- 100 kDa),
qui
restent réunies par un pont disulfure. Trois domaines fonctionnels ont été
définis
sur ces neurotoxines. La moitié C-terminale de la chaîne H(dénommée Hc) est
le domaine de reconnaissance d'un récepteur spécifique à la surface des
neurones.
La moitié N-terminale de la chaîne H(H-N) est impliquée dans l'internalisation
dans le neurone de la chaîne L. Cette dernière contient le site enzymatique de
protéolyse vis-à-vis des protéines SNAREs et est responsable de l'activité
intraneuronale des neurotoxines qui se traduit par un blocage de la neuro-
exocytose. Chacun de ces trois domaines fonctionnels est associé à une
structure
tridimensionnelle particulière. Le domaine Hc contient deux structures riches
en
feuillets bêta, le domaine H-N est formé de deux très longues hélices alpha,
et la
chaîne L forme une structure compacte riche en feuillets bêta (Kozaki et al.,
Infect Immun. 1986 Jun;52(3):786-91; Kozaki et al., Infect Immun. 1987
Dec;55(12):3051-6).
L'ensemble des gènes des neurotoxines botuliques et tétaniques a été séquencé
et
la structure cristallographique a été déterminée pour les neurotoxines
botuliques
A et B et la neurotoxine tétanique.
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Divers travaux ont été réalisés pour déterminer le fragment immunogène de ces
neurotoxines. Il a d'abord été montré que le fragment Hc de la toxine
tétanique,
obtenu par protéolyse par la papaïne et purifié par chromatographie, est non
toxique et protège par immunisation anti-Hc les souris contre une dose
d'épreuve
de toxine (Kozaki et al., Infect Immun. 1989 Sep;57(9):2634-9.). Puis, ce
fragment a été produit en tant que protéine recombinante chez Escherichia coli
et
s'est également révélé un excellent immunogène (Halpern et al., Infect Immun.
1989 Jan;57(1):18-22.).
Parmi tous les fragments recombinants de neurotoxine botulique A testés, le
seul
qui induise une protection complète des souris est le domaine C-terminal de la
chaîne lourde, qui correspond au domaine Hc de la neurotoxine tétanique
(Clayton et al., Infect Immun. 1995 Jul;63(7):2738-42; Dertzbaugh et West,
Vaccine. 1996 Nov;14(16):1538-44; Kubota et al., Appl Environ Microbiol.
1997 Apr;63(4):1214-8; LaPenotiere et al., Toxicon. 1995 Oct;33(10):1383-6.
Review). Les anticorps monoclonaux neutralisants obtenus avec la neurotoxine
botulique A entière comme immunogène étaient tous dirigés contre le fragment
Hc. L'analyse des anticorps générés par vaccination avec la neurotoxine
botulique entière formolée chez l'homme a montré que la plupart étaient
dirigés
contre la chaîne légère et peu contre le fragment Hc. Cette étude a conclu
qu'un
vaccin basé sur le fragment Hc est plus protecteur qu'un vaccin préparé avec
la
toxine entière (Brown et al., Hybridoma. 1997 Oct;16(5):447-56). De ce fait,
la
deuxième génération de vaccin antibotulique développée par 1'USAMRIID
consiste en des fragments Hc recombinants et purifiés des sept toxinotypes de
neurotoxines botuliques A, B, C, D, E, F et G.
Il a été noté que le fragment recombinant Hc serait plus efficace que
l'anatoxine
correspondante préparée de façon classique. La protection à l'aide d'anticorps
neutralisants de neurotoxine consiste essentiellement dans le blocage de la
reconnaissance du récepteur cellulaire par le fragment Hc (Brown et al.,
1997).
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Par ailleurs, de nombreux travaux ont été réalisés pour obtenir des anticorps
monoclonaux neutralisants contre les neurotoxines botuliques. Les essais
réalisés
avec la neurotoxine botulique A entière se sont fréquemment révélés
infructueux
alors que ceux produits en immunisant des souris avec la protéine recombinante
Hc ont permis d'obtenir un nombre significatif d'anticorps monoclonaux
neutralisants (Amersdorfer et al., Infect Immun. 1997 Sep;65(9):3743-52;
Middlebrook, Adv Exp Med Biol. 1995;383:93-8). Ainsi, le fragment Hc se
révèle être un meilleur immunogène que la neurotoxine entière et détoxifiée
pour
induire des anticorps neutralisants.
La méthode actuellement utilisée implique la production de protéines natives
ou
recombinantes, ce qui est un processus long et côuteux. De plus, si la
proteine
native ou recombinante est toxique, elle doit être dénaturée avant l'injection
chez
des animaux. Il peut en résulter des antisérums à faible pouvoir neutralisant,
puisque seul des anticorps d'épitopes peuvent être obtenus.
Ainsi, il existe aujourd'hui un réel besoin de posséder des antisérums
protecteurs
contre des toxines botuliques (ou autres), notamment en cas de bioterrorisme.
Les inventeurs ont mis au point une nouvelle méthode d'obtention d'antisérum
dirigé contre une toxine protéique, l'antisérum obtenu avec cette méthode
possédant un titre élevé en anticorps neutralisants contre les toxines
botuliques.
La nouvelle méthode présente en outre l'avantage d'être facile à mettre en
oeuvre
et d'être peu coûteuse.
Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé
d'obtention d'un antisérum dirigé contre au moins une toxine protéique
comprenant les étapes suivantes :
a) obtention d'une solution comprenant au moins une construction
génétique, ladite construction comprenant un acide nucléique codant au moins
un
fragment immunogène de ladite toxine,
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b) administration par injection chez un animal de la solution obtenue à
l'étape a),
c) application d'un champ électrique dans la zone d'injection, et
d) prélèvement ultérieur de sang total et isolement du sérum.
Par toxine protéique on entend désigner toute substance d'origine animale,
végétale ou bactérienne qui produit des effets toxiques et qui est
généralement
antigénique. Par fragment immunogène de toxine protéique on entend
désigner tout fragment de ladite toxine qui possède la capacité d'induire une
réaction ou une réponse immunitaire.
Les termes protéine, polypeptide ou peptide sont utilisés indifféremment dans
la
présente description pour désigner une séquence d'acides aminés ou, pour leurs
dérivés, contenant une séquence d'acides aminés.
Par prélèvement ultérieur (étape (d)) au sens de la présente demande on
entend
un prélèvement qui est effectué dans un laps de temps minimum après létape (c)
(application d'un champ électrique) nécessaire pour obtenir une immunisation.
De
manière générale, ce laps de temps est d'au moins 15 jours après l'application
du
champ électrique.
Pour la mise en pratique de la présente invention, on utilise de nombreuses
techniques classiques en biologie moléculaire, en microbiologie et en génie
génétique. Ces techniques sont bien connues et sont expliquées, par exemple,
dans
Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II et III, 1997 (F. M.
Ausubel,
éd.) ; Sambrook et coll., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2è'
édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ; DNA
Cloning : A Practical Approach, Volumes I et II, 1985 (D.N. Glover, éd.) ;
Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M.L. Gait, éd.) ; Nucleic Acid Hybridization,
1985 (Hames et Higgins) ; Transcription and Translation, 1984 (Hames et
Higgins, éd.) ; Animal Cell Culture, 1986 (R.I. Freshney, éd.) ; Immobilized
Cells
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and Enzymes, 1986 (IRL Press) ; Perbal, 1984, A Pratical Guide to Molecular
Cloning ; la série, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) ; Gene
Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J.H. Miller et M.P. Calos, éds.,
Cold
Spring Harbor Laboratory) ; et Methods in Enzymology Vol. 154 et Col. 155 (Wu
et Grossmann, et Wu, éd. respectivement).
Les conditions d'application d'un champ électrique dans la zone d'injection
selon
l'étape (c) sont maintenant bien connues de l'homme l'art, et sont notamment
décrites dans les demandes de brevet internationales publiées le 14 janvier
1999
sous les numéros WO 99/01157 et WO 99/01158. L'homme de l'art saura adapter
ces conditions selon chaque cas.
De préférence, le champ électrique possède une intensité comprise entre 1 et
800
V/cm sous la forme de 1 à 100 000 impulsions carrées d'une durée supérieure à
100 microsecondes et d'une fréquence comprise entre 0,1 et 1000 Hertz. De
manière encore préférée, le champ électrique possède une intensité comprise
entre
80 et 250 V/cm sous la forme de 1 à 20 impulsions à ondes carrées d'une durée
comprise entre 1 et 50 millisecondes et d'une fréquence de 1 à 10 Hertz.
Avantageusement, l'injection est une injection intradermique ou
intramusculaire.
Selon un mode de réalisation préféré, l'étape b) d'administration de la
solution est
précédée d'une étape d'injection d'une solution contenant une enzyme dégradant
la matrice extracellulaire, telle que la hyaluronidase. En effet, cette enzyme
est
responsable de la dégradation de l'acide hyaluronique, constituant majeur de
la
matrice extracellulaire du muscle. La hyaluronidase permet donc d'augmenter
l'accessibilité des plasmides aux cellules musculaires. De préférence, on
injecte
entre 5 et 200 1 d'une solution contenant entre 0,1 à 2 U/ l de
hyaluronidase. De
manière encore plus préférée, on injecte environ 25 1 d'une solution à 0.4U/ l
de
hyaluronidase dans du NaC1.
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De manière avantageuse, la toxine est choisie dans le groupe constitué par une
toxine de Clostridium botulinum, de Clostridium tetani, de Bacillus anthracis,
la
ricine, la toxine diphtérique et la toxine du choléra.
5 De manière encore plus avantageuse, le fragment immunogène de ladite toxine
est
le fragment C-terminal (Hc) choisi dans le groupe constitué par le fragment Hc
de
la toxine de sérotype A de Clostridium botulinum de séquence SED ID N 1, le
fragment Hc de la toxine de sérotype B de Clostridium botulinum de séquence
SED ID N 2, le fragment Hc de la toxine de sérotype C de Clostridium
botulinum
10 de séquence SED ID N 3, le fragment Hc de la toxine de sérotype D de
Clostridium botulinum de séquence SED ID N 4, le fragment Hc de la toxine de
sérotype E de Clostridium botulinum de séquence SED ID N 5, le fragment Hc
de la toxine de sérotype F de Clostridium botulinum de séquence SED ID N 6,
le
fragment Hc de la toxine de sérotype G de Clostridium botulinum de séquence
SED ID N 7, et le fragment Hc de la toxine de Clostridium tetani de séquence
SED ID N 8, ainsi que leurs variants.
De préférence, l'acide nucléique codant le fragment Hc de la toxine A de
Clostridium botulinum est de séquence SED ID N 17, ou l'un de ses variants.
Dans son sens le plus large, le terme "variant" d'une séquence protéique
désigne
une séquence ne présentant de modifications qu'au niveau d'aminoacides ou de
nucléotides n'ayant pas d'influence sur sa fonction en ne diminuant pas son
immunogénicité. De même, on entend désigner par variant quand elle est
utilisée ici en référence à une séquence nucléotidique, une séquence de
nucléotides correspondant à une séquence de nucléotides de référence, la
séquence correspondante codant un polypeptide ayant sensiblement la même
structure et la même fonction que le polypeptide codé par la séquence
nucléotidique de référence. Il est souhaitable que la séquence nucléotidique
sensiblement similaire code le polypeptide codé par la séquence nucléotidique
de
référence. Il est souhaitable que le pourcentage d'identité entre la séquence
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nucléotidique sensiblement similaire et la séquence nucléotidique de référence
soit d'au moins 90 %, plus préférablement d'au moins 95 %, encore plus
préférablement d'au moins 99 %. Les comparaisons de séquences sont réalisées
en utilisant l'algorithme d'alignement des séquences de Smith-Waterman (se
reporter par exemple à Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology :
Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. Londres :1995. ISBN 0412-99391-0
ou à http://www-hto.usc.edu/ software/seqaln/index.html). Le programme localS
version 1.16 est utilisé avec les paramètres suivants : "match" : 1, "mismatch
penalty" : 0,33, "open-gap penalty" : 2, "extended-gap penalty" : 2. Une
séquence
nucléotidique "sensiblement similaire" à la séquence nucléotidique de
référence
s'hybride avec la séquence nucléotidique de référence dans dodécylsulfate de
sodium (SDS) à 7 %, NaPO4 0,5M, EDTA 1mM à 50 C avec lavage dans 2 x
SSC, SDS à 0,1 % à 50 C, de façon plus souhaitable dans dodécylsulfate de
sodium (SDS) à 7 %, NaPO4 0,5M, EDTA 1mM à 50 C avec lavage dans 1 x
SSC, SDS à 0,1 % à 50 C, de façon encore plus désirable dans dodécylsulfate de
sodium (SDS) à 7 %, NaPO4 0,5M, EDTA 1mM à 50 C avec lavage dans 0,5 x
SSC, SDS à 0,1 % à 50 C, de préférence dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7
%, NaPO4 0,5M, EDTA 1mM à 50 C avec lavage dans 0,1 x SSC, SDS à 0,1 % à
50 C, plus préférablement dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7 %, NaPO4
0,5M, EDTA 1mM à 50 C avec lavage dans 0,lx SSC, SDS à 0,1 % à 65 C, et
code encore pour un produit de gène fonctionnellement équivalent.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la construction génétique comprend
en
5' de l'acide nucléique codant au moins un fragment de ladite toxine, le
promoteur du cytomégalovirus (CMV).
La structure du promoteur du CMV est notamment décrite dans Hennighausen et
al. (EMBO J. 5 (6), 1367-1371, 1986).
Selon un autre mode de réalisation préféré, la construction génétique comprend
une séquence codant un signal de sécrétion extracellulaire.
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Ces signaux de sécrétion extracellulaires, qui sont bien connus de l'homme de
l'art, permettent d'obtenir des titres en anticorps plus élevés.
De préférence, la séquence codant le signal de sécrétion extracellulaire est
choisie
parmi les séquences SEQ ID N 9, qui code le signal de sécrétion
extracellulaire
de l'érythropoïétine de souris, et SEQ ID N 10, qui code le signal de
sécrétion
extracellulaire de la phosphatase alcaline humaine, et l'un de leur variants.
Selon encore un autre mode de réalisation préféré, la construction génétique
comprend en 5' du promoteur une séquence nucléique de site d'initiation de la
traduction, dite séquence KOZAK, de séquence SEQ ID N 11.
Selon encore un nouveau mode de réalisation préféré, au moins un codon initial
de la séquence d'acide nucléique qui code au moins un fragment de ladite
toxine,
est remplacé par un codon différent codant le même acide aminé et dont la
fréquence dans les cellules eucaryotes est plus élevée que la fréquence dans
Clostridium botulinum, comme défmi dans le tableau 1.
Tableau 1 :
Fréquence des codons (%o)
UUU 15,5 4~54 UCU 10,7 . a,~, UAU 12,6 . UGU 10,0
Génome: UUC 23,8 61 1 UCC 14,2 UAC 17,8 UGC 12,0 1,7
Mus musculus UUA 6,5 5375 UCA 15,1 . UAA 0,7 11 UGA 1,1 77
UUG 9,0 8< ACG 4,2 UAG 1,t UGG 15,8
CUU 11,8 4 CCU 14,3 CAU 11,4 ,' CGU 3,3
CUC 18,4 CCC 16,5 ~.:= CAC 22,2 ;,SCGC 7,0
CUA 13,0 8: CCA 18,8 ., ' CAA 16,5 .. ? CGA 5,3
CUG 30,3 7 CCG 5,8 11~ CAG 49,8 42 CGG 6,9 0,2
AUU 15,9 4= ACU 13,0 .?: AAU 18,7 AGU 8,9 .
AUC 25,4 3 ACC 15,2 2;; AAC 26,4 AGC 15,9
AUA 18,1 ACA 23,3 .? AAA 46,8 2AGA 20,1 :,:='
AUG 22,7 ACG 4,4 2~ 211.AAG 30,1 AGG 14,0
GUU 5,8 210 GCU 12,4 GAU 18,2 ;3. GGU 9,1 1
GUC 10,0 i GCC 19,4 1" GAC 28,9 ,. GGC 17,5
GUA 8,3 .+ GCA 17,8 GAA 31,7 GGA 15,7 .i:=
GUG 17,6 : GCG 6,2 : GAG 30,4 1M GGG 10,8
Les toxines botuliques étant produites naturellement par l'organisme
Clostridium,
le code génétique utilisé par cet organisme n'est pas nécessairement adapté à
une
bonne expression de la protéine chez les mammifères. Les inventeurs ont donc
utilisé un gène synthétique conçu selon la technique d'optimisation de codons,
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c'est-à-dire l'utilisation de codons synonymes correspondant aux ARNt (ARN de
transfert) les plus fréquents dans les cellules eucaryotes.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la construction génétique comprend
en
outre un acide nucléique codant au moins une cytokine.
Avantageusement, la solution de l'étape (a) comprend une autre construction
génétique qui contient un acide nucléique codant une cytokine, lesdites deux
constructions génétiques étant co-administrées à l'étape (b).
De préférence, la séquence de l'acide nucléique codant la cytokine est choisie
dans le groupe constitué par SEQ ID N 12, qui code le facteur de croissance
hématopoïétique (GM-CSF), SEQ ID N 13, qui code la sous-unité p35 de
l'interleukine 12 de souris, SEQ ID N 14, qui code la sous-unité p40 de
l'interleukine 12 de souris, SEQ ID N 15, qui code l'interleukine 4 de
souris, et
SEQ ID N 16, qui code l'interleukine 10 humaine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la construction génétique
comprend en outre une séquence d'immunostimulation non méthylée riche en
bases guanine et cytosine, d'une taille comprise entre 10 et 10000
nucléotides.
Une telle séquence, dite séquence CpG, est bien connue de l'homme de l'art. Il
doit être entendu que dans la présente invention la séquence
d'immunostimulation
peut aussi être un oligonucléotide particulier qui sera co-administré avec le
plasmide codant le fragment de toxine. (Mutwiri et al., Veterinary Immunology
and immunopathology, 2003, 91, 89-103 ; R. Rankin, et al., Vaccine 2002, 20,
3014-3022).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'antisérum est
dirigé
contre au moins deux toxines protéiques et en ce que la solution de l'étape a)
comprend un mélange d'au moins deux constructions génétiques, chacune
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desdites constructions comprenant un acide nucléique codant au moins un
fragment immunogène desdites toxines.
De préférence, l'animal est choisi parmi la souris, le lapin, le cheval et le
porc.
Selon un mode de réalisation tout particulièrement préféré, les étapes b) et
c) sont
répétées au moins une fois avant l'étape d). De manière générale, ces étapes
sont
répétées à un intervalle d'au moins 15 jours, de préférence d'au moins 3
semaines,
et de manière particulièrement préférée, d'au moins un mois.
De manière encore plus préférée, l'étape c) est suivie d'une administration
chez
l'animal du fragment immunogène recombinant de ladite toxine. De manière
générale cette administration est effectuée au moins 15 jours après l'étape
c). On
isole ensuite le sérum à l'étape d).
L'isolement du sérum peut être réalisé par toute méthode connue de l'homme du
métier. De préférence, le sérum est isolé à l'étape d) par centrifugation.
Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un antisérum
dirigé
contre une toxine protéique susceptible d'être obtenu par le procédé selon
l'une
quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce son titre en
anticorps
anti-toxine est supérieur ou égal à 100, et en ce que son pouvoir neutralisant
est
supérieur ou égal à 100.
Le titre en anticorps peut être déterminé en effectuant des dilutions, par
exemple
des dilutions de deux en deux des sérums à partir de la dilution 1/100e puis,
on
effectue un dosage ELISA, et on obtient une courbe donnant la densité optique
à
une longueur d'onde donnée, par exemple à 492 nm lorsqu'on utilise le système
peroxydase/orthophénylènediamine en fonction de la dilution. Le titre en
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anticorps correspond à la réciproque du facteur de dilution qui donne une
densité
optique d'au moins 0,2 au dessus des sérums naïfs.
Pour la détermination du pouvoir neutralisant, ou titre neutralisant, la
présence
5 d'anticorps neutralisants est déterminée par un test de létalité chez la
souris : par
exemple, la neurotoxine botulique de type A est produite et calibrée à 10
Doses
Létales Souris par ml. Des dilutions de sérum sont ensuite incubées avec une
préparation de toxine, et injectées à des souris. La survie des souris est
ensuite
observée pendant quelques jours. Les résultats sont exprimés par unités
10 neutralisantes par ml (une unité neutralisante correspondant au volume de
sérum
neutralisant 10 Doses Létales Souris).
L'invention a également pour objet l'antisérum selon la présente invention,
pour
son utilisation comme sérum préventif ou comme antidote destiné à neutraliser
15 chez un mammifère les effets toxiques liés à l'absorption de la toxine chez
ledit
mammifère.
Dans la présente demande, l'absorption de la toxine peut résulter de la
contamination par bactéries chez ledit mammifère.
La présente invention a encore pour objet l'utilisation d'un antisérum selon
la
présente invention, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou
à
traiter un effet toxique lié à l'absorption chez un mammifère d'une toxine
choisie
dans le groupe constitué par une toxine de Clostridium botulinum, une toxine
de
Clostridium tetani, une toxine de Bacillus anthracis, la ricine, la toxine
diphtérique et la toxine du choléra.
L'invention a encore pour objet l'antisérum selon la présente invention, pour
son
utilisation comme réactif dans un test immunologique, tel que par exemple,
sans
toutefois s'y limiter, un titrage immuno-enzymatique ELISA, un
immunotransfert,
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un titrage immunoluminescent, etc.. L'homme du métier connaît bien ces
différents tests immunologiques et saura y appliquer l'antisérum selon
l'invention.
Selon un dernier aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'une solution
contenant au moins une construction génétique selon la présente invention,
pour la
fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter un effet toxique
lié à
l'absorption chez un mammifere d'une toxine choisie dans le groupe constitué
par
une toxine de Clostridium botulinum, une toxine de Clostridium tetani, une
toxine
de Bacillus anthracis, la ricine, la toxine diphtérique et la toxine du
choléra,
caractérisée en ce que ledit médicament est formulé en vue d'une
administration
par électrotransfert.
Les conditions d'électroporation applicables pour l'administration par
électrotransfert, le mode et le nombre d'injections sont tels que définis
précédemment.
Le médicament, préparé à partir de la solution contenant ladite au moins une
construction génétique, doit être formulé en l'absence de lipides cationiques
pour
permettre l'électrotransfert. Il peut être formulé en présence de tout
excipient
pharmaceutique acceptable connu de l'homme de l'art, tel qu'une solution
saline,
un tampon phosphate, un tampon glucosé, etc...
De préférence, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que la
solution
contient en outre un adjuvant immunostimulant. On pourra citer comme exemples
d'adjuvants immunostimulants, sans toutefois s'y limiter, l'adjuvant de Freund
et
l'alun.
Les exemples et figures qui suivent servent à illustrer la présente invention,
sans
toutefois en limiter la portée.
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LEGENDES DES FIGURES
Le signe * dans certaines figures correspond à un titre en anticorps
inférieur à 100.
Figure 1: Dosage ELISA des sérums 3 semaines après électrotransfert.
Dilutions de 2 en 2 des sérums à partir de la dilution 1/100e.
Figure 2: Dosage ELISA des sérums 70 jours après électrotransfert.
Dilutions de 2 en 2 des sérums à partir de la dilution 1/100e.
Figure 3 : Titres en anticorps obtenus à partir des dosages ELISA de 21 à
70 jours après électrotransfert (titre en anticorps = réciproque du facteur de
dilution qui donne une DO490 de 0.3 au dessus des sérums naïfs).
Figure 4: Comparaison injection seule/injection + électrotransfert avec
les plasmides pVaxFcBoNTA et pVaxFc*BoNTA
Figure 5: Apport de l'optimisation des codons au niveau de la séquence
FcBoNTA (FcBoNTA/Fc*BoNTA).
Figure 6: Effet de la hyaluronidase sur le titre en anticorps (plasmide
pVaxFcBoNTA et pVaxFc*BoNTA)
Figure 7: Effet de la hyaluronidase sur le titre en anticorps (plasmide
pVaxFc*BoNTA-Master)
Figure 8: Titres en anticorps anti-FcBoNTB avec les plasmides
pVaxFc*BoNTA et pVaxFc*BoNTA-Master (injection+électrotransfert)
Figure 9: Titres en anticorps anti FcBoNTE avec les plasmides
pVaxFcBoNTE, pVaxFc*BoNTE, pVaxFc*BoNTE-Master et pVaxFc*BoNTE-
Variant
Figure 10: Titres en anticorps anti-FcBoNTA, antiFcBoNTB et anti-
FcBoNTE dans ABE (avec les plasmides pVaxFc*BoNTA-Master,
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pVaxFc*BoNTB-Master et pVaxFc*BoNTE-Master co-injectés et
électrotransférés : sérum multivalent ABE)
Figure 11: Titres en anticorps anti-FcBoNTA chez le lapin
Figure 12 : Titres en anticorps anti-FcBoNTA avec ou sans réinjection du
plasmide pVaxFc*BoNTA-Master chez la souris ( id. pour intradermique et
im. pour intramusculaire)
Figure 13 : Titres en anticorps anti-FcBoNTA avec ou sans réinjection du
plasmide pVaxFc*BoNTA chez la souris.
Figure 14 : Intérêt de l'optimisation de codon pour l'obtention de titres
plus élevés en antisérum : en utilisant pVaxFcNoNTA (foncé) ou la séquence
optimisée en codons du fragment Hc de la toxine botulinique de sérotype A
(plasmide A pVaxFc*BoNTA, quadrillé).
Figure 15 : Obtention d'antisérums par le procédé de l'invention, dosée à
trois temps après électrotransfert, en utilisant une séquence génétique
optimisée
codant pour un fragment de la toxine botulinique A, non associée ( Fc*BoNTA)
ou associée (Fc*BoNTA sécrétée, colonne quadrillée) à une séquence de
sécrétion
protéique.
Figure 16 : Obtention d'antisérums par le procédé de l'invention, dosée à
trois temps après électrotransfert, en utilisant une séquence génétique
optimisée
codant pour un fragment de la toxine botulinique B , non associée ( Fc*BoNTB)
ou associée (Fc*BoNTB sécrétée) à une séquence de sécrétion protéique
Figure 17 : Obtention d'antisérums par le procédé de l'invention, dosée à
trois temps après électrotransfert, en utilisant une séquence génétique
optimisée
codant pour un fragment de la toxine botulinique E:
- non codon-optimisé (FcBoNTE),
codon-optimisé non associée ou associée à une séquence de
sécrétion protéique (Fc*BoNTE),
- codon-optimisé et associé ou associée à une séquence de
sécrétion protéique (Fc*BoNTE sécrétée)
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
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EXEMPLES
I- Materiels et méthodes
- Matériel génétique
Les inventeurs ont injecté et électrotransféré différentes constructions
plasmidiques codant le fragment C-terminal de la toxine botulique A, noté
FcBoNTA dans la suite, fragment connu comme étant la partie la plus
immunogène de la toxine. Les différentes constructions testées sont :
- pVaxFcBoNTA : ce plasmide contient le fragment FcBoNTA
sous contrôle d'un promoteur CMV.
- pVaxFc*BoNTA : ce plasmide contient le fragment FcBoNTA
dont la séquence a été optimisée pour que l'expression de la protéine soit
optimale chez la souris (notée Fc*BoNTA). En effet, la fréquence des codons
chez Clostridium Botulinum et chez la souris est très différente : ce qui
signifie
que le pool des ARN de transfert chez ces deux espèces est différent et
pourrait
être un facteur limitant. La séquence a entièrement été modifiée pour donner
au
final la même protéine, en utilisant les codons les plus fréquents chez la
souris.
Le fragment Fc* est sous contrôle d'un promoteur CMV.
- pVaxFc*BoNTA-Master: ce plasmide contient le fragment
Fc*BoNTA fusionné au signal de sécrétion de l'érythropoïétine murine, et
précédé d'une séquence Kozak qui améliore la traduction.
- pVaxFc*BoNTA-Variant: ce plasmide contient le fragment
Fc*BoNTA fusionné au signal de sécrétion de la phosphatase alcaline sécrétée
humaine, et précédé d'une séquence Kozak qui améliore la traduction.
- Mode opératoire
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Ces différentes constructions ont été injectées et électrotransférées sur des
souris SWISS à raison de 40 g par injection
- dans 30 1 de NaC1 150mM dans le muscle tibial cranial
- dans 100 1 de NaC1 150mM dans la peau en intradermique
5 Dans tous les cas, le mode opératoire est le suivant : les souris sont
anesthésiées (injection intrapéritonéale d'un mélange Ketamine/Xylazine),
leurs
pattes postérieures sont rasées puis la solution de plasmide est injectée dans
le
muscle tibial cranial ou dans la peau. Les muscles ou la peau sont ensuite
soumis
à un champ électrique de 200V/cro sous la forme de 8 impulsions carrées de
10 20 ms d'une fréquence de 2 Hz à l'aide de deux électrodes plaques reliées à
un
générateur électrique Genetronics EC 830. Si nécessaire, une solution de
hyaluronidase (25 1 à 0.4U/ L dans NaC1 150mM) est injectée dans le muscle
tibial cranial deux heures avant injection et électrotransfert.
Des prélèvements de sang (environ 150 l) sont réalisés par
15 ponction rétro-orbitale sur souris anesthésiées. Pour le dosage dans le
sérum les
prélèvements sont centrifugés 10 minutes à 4 C à 3000 rpm. Le plasma est
retiré
et les sérums sont conservés à-80 C.
- Dosage des anticorps anti-FcBoNTA, anti-FcBoNTB et anti-
FcBoNTE (dosage Elisa)
20 Pour doser les anticorps anti-FcBoNTA (ou anti-FcBoNTB ou anti-
FcBoNTE) dans le sérum des souris on réalise un test ELISA. Concrètement la
protéine recombinante FcBoNTA, FcBoNTB ou FcBoNTE est déposée au fond
d'une plaque 96 puits, les sérums sont ensuite incubés avec la plaque : si des
anticorps sont présents dans le sérum, ils se fixeront à la protéine. Des
lavages
permettent de retirer tout ce qui ne s'est pas fixé à la protéine recombinante
et la
présence d'anticorps anti-Fc est ensuite détectée par la combinaison d'un
anticorps secondaire anti-Ig de souris biotinylé et de streptavidine couplée à
la
peroxydase. Il suffit ensuite de révéler avec un substrat de la peroxydase et
de
lire la plaque à 492 nm.
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Pour déterminer le titre en anticorps, on effectue des dilutions de deux en
deux des sérums à partir de la dilution 1/100e. La courbe donnant la densité
optique à 492 nm en fonction de la dilution permet de déterminer le titre en
anticorps qui correspond à la réciproque du facteur de dilution qui donne une
D0490 de 0.3 au dessus des sérums naïfs.
- Dosage des anticorps neutralisants (test de létalité)
La présence d'anticorps neutralisants est déterminée par un test de létalité
chez la souris : la neurotoxine botulique de type A est produite et calibrée à
10
Doses Létales Souris par ml. Des dilutions de sérum sont ensuite incubées avec
2
ml de préparation de toxine 30 minutes à 37 , et injectées à des souris par
voie
intrapéritonéale (2 souris par dilution, 1m1 par souris). La survie des souris
est
ensuite observée pendant quatre jours. Les résultats sont exprimés par unités
neutralisantes par ml (une unité neutralisante correspondant au volume de
sérum
neutralisant 10 Doses Létales Souris).
II- Expériences complémentaires :
1) Comparaison iniection seule/iniection+électrotransfert
Les inventeurs ont effectué une expérience pour valider l'intérêt de
l'électrotransfert. Les inventeurs ont pour cela comparé les titres en
anticorps
obtenus sur des lots de souris injectés avec le même plasmide (pVaxFcBoNTA
ou pVaxFc*BoNTA) mais avec ou sans électrotransfert suite à l'injection.
Les titres en anticorps obtenus 30 jours après traitement sont donnés à la
figure 4.
Suite à cette expérience, les inventeurs ont testé le pouvoir neutralisant de
ces anticorps obtenus par injection seule ou injection+électrotransfert : Les
inventeurs ont donc effectué un test de neutralisation ou test de létalité
chez la
souris. Les sérums ont été testés à 45 jours et les sérums d'une même
condition
ont été poolés pour limiter le nombre de souris.
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Les résultats présentés dans le tableau 2 donnent le nombre de souris
vivantes sur le nombre de souris totales pour chaque dilution de sérum et pour
chaque condition. On en déduit le titre neutralisant comme la réciproque de la
dilution la plus forte pour laquelle les souris sont vivantes :
Tableau 2:
Dilutions Titre neutralisant
Fc*BoNTA 10" 10" 10 10 *10MDL
Injection seule 0/2 0/2 0/2 0/2 <100
Injection + électrotransfert 2/2 1/2 0/2 0/2 1000
On constate donc que les anticorps obtenus avec une injection seule ne
sont pas neutralisants alors qu'avec électrotransfert on retrouve des
résultats
comparables aux précédents.
1) Diverses comparaisons
a) apport de l'optimisation :
Les inventeurs ont comparé l'apport de l'optimisation des codons au
niveau de la séquence administrée par électrotransfert (Figure 5) ou sans
électrotransfert (Figure 4) .
On observe bien que l'optimisation au niveau des codons de la séquence
FcBoNTA augmente très fortement le titre en anticorps (grisé par rapport à
hachuré).
b) apport de la hyaluronidase dans le procédé utilisant l'électrotransfert
Les inventeurs ont étudié l'effet de la hyaluronidase sur le titre en
anticorps :
Les résultats obtenus avec le plasmide pVaxFcBoNTA sont donnés à la
figure 6.
Les résultats obtenus avec le plasmide pVaxFc*BoNTA sont donnés à la
figure 6.
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Les résultats obtenus avec le plasmide pVAxFc*BoNTA-Master sont
donnés figure 7.
2) Toxines B et E=
Les inventeurs ont suivi exactement le même protocole qu'avec la toxine
A.
Injection + électrotransfert de 40 g de plasmide pVaxFc*BoNTB et
pVaxFc*BoNTB-Master (fragment C-terminal de BoNTB + signal de sécrétion de
l'Epo+ séquence Kozak).
Des prélèvements ont été effectués à 15 jours, 30 jours et 45 jours après
injection et électrotransfert.
Les résultats obtenus pour les titres en anticorps anti-FcBoNTB sont
donnés à la figure 8.
Il est donc possible d'obtenir des anticorps anti-FcBoNTB par
électrotransfert de plasmide.
Titre en anticorps anti-FcBoNTE
Même protocole avec la toxine E(40 g de plasmide).
Les inventeurs ont comparé
- pVaxFcBoNTE : fragment C-terminal non sécrété, non optimisé
- pVaxFc*BoNTE : fragment C-terminal optimisé (codons)
- pVaxFc*BoNTE-Master : fragment C-terminal optimisé + signal
de sécrétion mEpo+ séquence Kozak
- pVaxFc*BoNTE-Variant : fragment C-terminal optimisé+ signal
de sécrétion hSeAP + séquence Kozak
Des prélèvements ont été effectués à 15 , 28 et 42 jours. Les résultats sont
donnés à la figure 9.
3) Sérums multivalents :
Les inventeurs ont testé la co-injection + électrotransfert de plusieurs
plasmides codant plusieurs fragments C-terminaux : FcBoNTA, FcBoNTB, et
FcBoNTE.
Les trois plasmides codent les fragments C-terminaux précédés du signal
de sécrétion de l'Epo de souris et d'une séquence Kozak.
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On a injecté 40 g de chaque plasmide soit 20 g de chaque dans chaque
patte de la souris pour faire un total de 60 g d'ADN par patte.
Les titres en anticorps anti-FcBoNTA sont donnés à la figure 10 (A).
Les titres en anticorps anti-FcBoNTB sont donnés à la figure 10 (B).
Les titres en anticorps anti-FcBoNTE sont donnés à la figure 10 (E).
4) Chez le lapin :
Les inventeurs ont testé l'injection ou injection + électrotransfert de 500 g
de
plasmide pVaxFc*BoNTA-Master chez le lapin. Les conditions d'électrotransfert
sont : 8 impulsions de 125V/cm; de 20ms ; d'une fréquence de 2Hz avec des
électrodes aiguilles.
Les résultats sont présentés figure 11.
5) Effet de réiniections :
Les inventeurs ont testé chez la souris l'effet d'un second réinjection +
électrotransfert :
- deux injections + électrotransfert dans chaque muscle à JO avec le
plasmide pVaxFc*BoNTA-Master (notation im. 80 g) (figure 12)
- deux injections + électrotransfert à 3 semaines d'intervalle en
intramusculaire chaque fois avec le plasmide pVaxFc*BoNTA-Master
(notation im. + im. 40 g) (figure 12)
- deux injections + électrotransfert à 3 semaines d'intervalle, le 1'
traitement en intradermique, le 2è' en intramusculaire, avec le plasmide
pVaxFc*BoNTA-Master (notation id. + im. 40 g) (figure 12)
- deux injections + électrotransfert à 1 mois d'intervalle en intramusculaire
à
chaque fois avec le pVaxFc*BoNTA (figure 13)
III- RESULTATS
Les inventeurs ont comparé différentes constructions et différents modes
opératoires (4 souris par condition) :
- injection seule (injection + Electrotransfert)
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- injection + électrotransfert en intramusculaire de 40 g de
pVaxFcBoNTA
- injection + électrotransfert en intramusculaire de 40 g de
pVaxFc* BoNTA(séquence optimisée)
5 - injection + électrotransfert en intramusculaire de 40 g de
pVaxFc*BoNTA-Master (séquence optimisée +signal de sécrétion de
l'érythropoïetine murine +séquence Kozak)
- injection + électrotransfert en intramusculaire de 40 g de
pVaxFc*BoNTA-Variant (séquence optimisée +signal de sécrétion de la
10 phosphatase alcaline humaine sécrétée +séquence Kozak)
- injection + électrotransfert en intradermique de 40 g de
pVaxFc*BoNTA (séquence optimisée)
- traitement à la hyaluronidase + injection + électrotransfert en
intramusculaire de 40 g de pVaxFc*BoNTA (séquence optimisée)
15 - aucun traitement
Les résultats obtenus avec le dosage ELISA des sérums 3 semaines après
l'électrotransfert sont donnés à la figure 1.
Les inventeurs détectent donc dès trois semaines des anticorps anti-
FcBoNTA dans l'ensemble des sérums des souris traitées dans les différentes
20 conditions décrites, et pas dans les sérums des souris naïves. On peut
cependant
remarquer que le titre en anticorps varie selon les conditions : les souris
traitées à
la hyaluronidase ont un titre en anticorps supérieur aux autres. Cette enzyme
est
responsable de la dégradation de l'acide hyaluronique, constituant majeur de
la
matrice extracellulaire du muscle. La hyaluronidase permet donc d'augmenter
25 l'accessibilité des plasmides aux cellules musculaires. L'électrotransfert
en
intradermique permet aussi d'obtenir des anticorps.
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Des prélèvements ont ensuite été effectués tous les 15 jours, et les
résultats obtenus avec le dosage ELISA à 70 jours après injection sont donnés
à
la figure 2.
L'allure du dosage ELISA à 70 jours ressemble à celle obtenue à 21 jours.
On peut cependant remarquer que les titres en anticorps ont augmenté dans
toutes les conditions sauf la condition intradermique. Ceci peut s'expliquer
par le
fait que les inventeurs ont montré que l'expression d'une protéine après
électrotransfert intradermique ne dure qu'une quinzaine de jours, comparée à
des
cinétiques d'expression dans le muscle qui perdurent jusqu'à un an.
Pour avoir une vue plus globale des titres en anticorps au cours de la
cinétique, la figure 3 présente l'ensemble des titres obtenus par condition au
cours du temps.
Ces résultats nous donnent une information sur le titre en anticorps dans
le sérum des souris de chaque condition mais ne donnent pas d'information
quand au pouvoir neutralisant de ces anticorps. Les inventeurs ont donc
effectué
un test de neutralisation ou test de létalité chez la souris. Les sérums
prélevés à
40 jour sont été testés et les sérums d'une même condition ont été regroupés
pour
limiter le nombre de souris à utliser.
Les résultats présentés dans le Tableau 3 donnent le nombre de souris
vivantes sur le nombre de souris traitées pour chaque dilution de sérum et
pour
chaque condition. On en déduit le titre neutralisant comme l'inverse de la
dilution
la plus forte pour laquelle les souris sont vivantes :
Tableau 3: souris survivantes après un challenge létal (10 doses létales)
de toxine BoNTA
dilutions titre neutral.
10 10 10 10 *10MLD
pVaxFe Fc 2/2 0/2 0/2 0/2 100
pVaxFc* Fc* 2/2 0/2 0/2 0/2 100
pVaxFc*Master M 2/2 2/2 2/2 0/2 10000
pVaxFc*Variant V 2/2 1/2 0/2 0/2 100-1000
pVaxFc*+hyalu H 2/2 2/2 0/2 0/2 1000
CA 02617082 2008-01-28
WO 2007/012671 PCT/EP2006/064798
27
pVaxFc*intradermig ue ID 0/2 0/2 0/2 0/2 0
La première conclusion de ce test est que les anticorps obtenus par
électrotransfert de plasmide sont neutralisants.
La deuxième conclusion est que certaines conditions donnent un titre
neutralisant très convainquant, la condition pVAxFc*BoNTA-Master en
particulier donne un titre neutralisant de 10000 au moins.
Les inventeurs ont ensuite effectué une expérience pour valider l'intérêt
de l'électrotransfert. Ils ont pour cela comparé les titres en anticorps
obtenus sur
des lots de souris injectés avec le même plasmide (pVaxFcBoNTA ou
pVaxFc*BoNTA) mais avec ou sans électrotransfert suite à l'injection.
Les titres en anticorps obtenus 30 jours après traitement sont donnés à la
figure 4.
Dans les deux cas on observe une forte augmentation du titre en anticorps
dans les lots injectés ET électrotransférés comparés aux lots injectés
seulement.
IV- CONCLUSION
Les inventeurs ont obtenu après une simple injection et électrotransfert de
plasmide codant le fragment C-terminal FcBoNTA de la toxine botulique A, de
forts titres en anticorps neutralisants. Ce résultat permet de penser qu'il
est
possible d'obtenir par cette méthode simple des antisérums antitoxine
botulique
mono ou multivalents à usage thérapeutique. En effet, un antisérum multivalent
peut être obtenu par immunisation génétique à plusieurs plasmides, car il a
été
démontré que la cotransfection conduisait avec la technique d'électrotransfert
à
une coexpression. Alternativement, un antisérum multivalent peut être obtenu
par
simple mélange d'antisérums univalents.
