Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
1
Analogues de la temporine-SHa et leurs utilisations
La présente invention se rapporte à de nouveaux peptides antimicrobiens, aux
compositions pharmaceutiques comprenant ces peptides et à leurs utilisations,
notamment en tant que médicament ou désinfectant. La présente invention se
rapporte
en outre à une plante transgénique exprimant ces nouveaux peptides.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
L'évolution et la progression de la résistance bactérienne aux antibiotiques
apparaît aujourd'hui comme un problème majeur de santé publique, notamment en
milieu hospitalier avec l'apparition de souches multi-résistantes.
D'importants efforts de
recherche ont permis de développer de nouveaux antibiotiques efficaces sur ces
souches
résistantes. Néanmoins, à force d'utilisation, des mécanismes de résistance
vis-à-vis de
ces molécules apparaissent et diminuent leur efficacité.
Face à ce phénomène, les peptides antimicrobiens (PAM) sont apparus comme
très prometteurs pour concevoir de nouveaux agents thérapeutiques. Les
peptides
antimicrobiens cationiques sont considérés comme l'un des éléments clefs du
système
immunitaire inné qui assure la première ligne de défense des organismes
multicellulaires contre les pathogènes. L'intérêt de ces peptides vient d'une
part de leur
très large spectre d'activité permettant notamment leur utilisation dans le
cadre de
traitement d'infections par des souches multi-résistantes. D'autre part, leur
mode
d'action repose sur une perméabilisation ou une fragmentation rapide des
membranes
des microorganismes et est donc peu susceptible de générer l'apparition de
mécanismes
de résistance.
Des peptides antimicrobiens ont été identifiés aussi bien chez les plantes,
les
insectes, les batraciens ou les mammifères. La peau des batraciens est une
source
importante de peptides antimicrobiens et chaque espèce de grenouille dispose
de son
propre répertoire peptidique constitué généralement de 10 à 15 PAM.
Les grenouilles de la famille des Ranidae sont très nombreuses et cette
famille
comporte à l'heure actuelle 16 genres et 338 espèces. Ces grenouilles
synthétisent et
sécrètent une remarquable diversité de PAM qui ont été classés en 13 familles
(Conlon
et al., 2008 et 2009). L'une de ces familles, les temporines, comprend des PAM
de
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
2
petite taille (généralement entre 10 et 14 résidus) dont les séquences sont
très variables
suivant les espèces. Plus de 60 membres appartenant à la famille des
temporines ont été
identifiés. Ces temporines ont été isolées à partir de plusieurs espèces de
Rana comme
par exemple, Rana temporaria (Simmaco et al., 1996), Rana esculenta (Simmaco
et al.,
1990), Rana japonica (Isaacson et al., 2002), Rana ornativentris (Kim et al.,
2001) et
Pelophylax (Rana) saharica (Abbassi et al., 2008).
Contrairement aux 12 autres familles de peptides de Ranidae, les temporines
sont dépourvues, du motif Rafla box , un motif heptapeptidique cyclisé par un
pont
disulfure en C-terminal (Mangoni, 2006). De plus, la plupart des temporines
contiennent un seul résidu basique qui leur confère une charge nette de +2 à
pH
physiologique.
Les temporines sont en général particulièrement actives contre les bactéries
Gram-positif et les levures mais elles possèdent également des propriétés
antifongiques
(Rollins-Smith et al., 2003) et pour certaines des propriétés antivirales
(Chinchar et al.,
2004).
Des études récentes menées sur les temporines A, B (Mangoni et al., 2006) et
SHa (Abbassi et al., 2008), ont indiqué que ces peptides possèdent une action
antiparasitaire sur des protozoaires du genre Leishmania, agents responsables
des
leishmanioses. En dehors de ces temporines, très peu de PAM possèdent une
activité
antiparasitaire : les dermaseptines et le polypeptide YY (également isolés de
la peau de
grenouille) ; l'indolicidine (isolée de granules de neutrophiles bovins) ; la
gomésine
(isolée de l'araignée Acanthoscurria gomesiana) ; les hybrides cécropine-
mélittine
(obtenus à partir de molécules d'insectes).
Les leishmanioses sont des affections extrêmement répandues dans le monde,
essentiellement en Inde, en Amérique du sud, en Afrique et sur le pourtour
méditerranéen. Plusieurs millions de personnes sont infectées chaque année par
ce
parasite. Selon l'espèce de Leishmania, les leishmanioses peuvent être des
affections
cutanées, muco-cutanées ou viscérales. Par exemple, la forme viscérale, la
plus grave et
potentiellement mortelle en absence de traitement, est due à deux espèces de
Leishmania : Leishmania infantum et Leishmania donovani. Les Leishmania
présentent
au cours de leur cycle de développement deux stades morphologiques successifs
: le
stade promastigote (forme libre dans le tube digestif de l'insecte vecteur, le
phlébotome)
CA 02755472 2016-06-21
=
3
et le stade amastigote (forme intracellulaire infectant les phagocytes
mononuclés de l'hôte
mammifère).
Le traitement de première intention des leishmanioses consiste en
l'utilisation des
dérivés de l'antimoine, tels que l'antimoniate de méglumine (Glucantime ) ou
le
stibogluconate de sodium (Pentostame). Cependant, l'efficacité de l'antimoine
diminue avec
l'émergence d'une importante résistance pouvant aller jusqu'à 60% selon la
localisation
géographique. Malgré la disponibilité de médicaments alternatifs comme
l'amphotéricine B
(Ambisome ) ou la miltéfosine (Impavide), il y a un réel besoin de trouver de
nouvelles
molécules permettant de lutter contre cette maladie.
RESUME DE L'INVENTION
L'objectif de la présente invention est de fournir de nouveaux peptides
antimicrobiens,
analogues de la temporine-SHa et présentant une activité antimicrobienne
accrue, notamment
vis-à-vis des bactéries et du parasite Leishmania. De préférence, ces nouveaux
peptides ont
également une activité hémolytique diminuée par rapport à la temporine-SHa.
Selon un aspect, la présente invention concerne un peptide d'une taille
comprise entre
13 et 100 acides aminés, doté d'une activité antimicrobienne et comprenant la
séquence F-L-
X1-X2-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F, où Xi est un acide aminé sélectionné dans le groupe
constitué
de S, R, H et K, et X2, X3 et X4, identiques ou différents, sont des acides
aminés sélectionnés
dans le groupe constitué de G, R, H et K, et où, lorsque Xi est S, au moins
l'un des résidus X2,
X3 et X4 est sélectionné dans le groupe constitué de R, H et K, et les dérivés
fonctionnels et
les sels pharmaceutiquement acceptables dudit peptide. De préférence, Xi est
un acide aminé
sélectionné dans le groupe constitué de R, H et K, et X2, X3 et X4 sont G. De
préférence, Xi est
K, et X2, X3 et X4 sont G.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne un acide nucléique codant
pour un
peptide selon l'invention.
La présente invention concerne en outre une cassette d'expression comprenant
un acide
nucléique selon l'invention.
La présente invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un
acide nucléique codant pour un peptide selon l'invention.
CA 02755472 2016-06-21
3a
Selon un aspect, la présente invention concerne un peptide d'une taille
comprise entre
13 et 100 acides aminés, doté d'une activité antibactérienne, antifongique ou
antiparasitaire
vis-à-vis d'un parasite appartenant au genre Leishmania, et comprenant la
séquence F-L-X1-G-
I-V-G-M-L-G-K-L-F, où X1 est un acide aminé sélectionné dans le groupe
constitué de R, H
et K, et dérivés fonctionnels et sels pharmaceutiquement acceptables dudit
peptide, lesdits
dérivés fonctionnels étant des rétro peptides, des rétro-inverso peptides ou
des peptides
comprenant la séquence F-L-X1-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F raccourcie de 1 ou 2 acides
aminés
en son extrémité C-terminale et/ou N-terminale.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
4
Dans un autre aspect, la présente invention concerne une cellule hôte
comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon
l'invention.
La présente invention concerne également un anticorps se liant spécifiquement
à
un peptide selon l'invention.
Dans encore un autre aspect, la présente invention concerne une composition
pharmaceutique comprenant au moins un peptide selon l'invention, et un support
et/ou
excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également un peptide selon l'invention, en tant
que médicament. De préférence, le médicament est destiné au traitement d'une
infection
par une bactérie, un virus, un champignon ou un parasite. De préférence, le
parasite
appartient au genre Leishmania.
Dans encore un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un
peptide selon l'invention en tant que désinfectant, conservateur ou pesticide.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne un appareillage médical
ou
un implant comprenant un corps présentant au moins une surface couverte ou
incluant
un peptide selon l'invention.
Dans un dernier aspect, la présente invention concerne une plante transgénique
comprenant un acide nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon
l'invention, et susceptible d'exprimer ou exprimant un peptide selon
l'invention.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 représente une projection de Schiffer-Edmunson de l'hélice a de la
temporine-SHa. Les résidus 4, 11, 7, 3 et 10 constituent la face polaire de
l'hélice. Les
résidus 8, 1, 12, 5, 9, 2, 13 et 6 constituent la face apolaire de l'hélice.
La figure 2 présente un graphe représentant l'activité de la temporine-SHa ( a
) et
de l'analogue [KItemporine-SHa (#) sur les amastigotes axéniques (A) et les
promastigotes (B) de Leishmania infantum. Le pourcentage de croissance des
amastigotes et des promastigotes est représenté en fonction de la
concentration en
peptide.
La figure 3 présente un graphe représentant l'activité cytotoxique de la
temporine-SHa ( a ) et de l'analogue [KItemporine-SHa (#) sur les monocytes.
Le
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
pourcentage de croissance des monocytes est représenté en fonction de la
concentration
en peptide.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La temporine-SHa, anciennement appelée temporine-lSa, a été isolée à partir de
5 la peau
de la grenouille nord-africaine Pelophylax saharica (Abbassi et al., 2008).
Cette
temporine est obtenue par la maturation post-traductionnelle d'un précurseur
de 50
résidus (numéro d'entrée dans la base de données GenBank : CA077282). Ce
précurseur présente un domaine N-terminal très conservé contenant le peptide
signal et
une région riche en résidus acides, ainsi qu'un domaine C-terminal
hypervariable
contenant la séquence progénitrice de la temporine-SHa. In vivo, la forme
mature de la
temporine est obtenue après i) clivage protéolytique au niveau du doublet KR
qui
précède la séquence progénitrice, ii) élimination du résidu K en C-terminal de
la
séquence progénitrice par une carboxypeptidase et iii) amidation du résidu C-
terminal
de la temporine grâce au résidu G en C-terminal de la séquence progénitrice
qui sert de
donneur de la fonction amide (substrat de la peptidyl-glycine a-amidating
monooxygenase). La protéine mature est un peptide d'une longueur de 13 résidus
d'acide aminé et présentant la séquence suivante F-L-S-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F
(SEQ
ID No.1). Les temporines ne sont pas structurées en solution aqueuse mais se
structurent
en hélice a dans des environnements membrano-mimétiques.
Ce peptide possède une activité antimicrobienne vis-à-vis des bactéries Gram-
positif et Gram-négatif, des levures et du parasite Leishmania infantum
(Abbassi et al.,
2008). L'action antiparasitaire de la temporine-SHa s'exerce aussi bien sur
les formes
promastigotes que sur les formes amastigotes axéniques du parasite avec
respectivement
une CI50 de 18,1 ILLM et de 22,8 ILLM.
L'activité antimicrobienne des peptides antimicrobiens (PAM), ainsi que leurs
activités cytolytiques vis-à-vis des cellules de mammifères, sont le reflet
d'un subtil
équilibre entre plusieurs paramètres, comme la charge nette, l'hydrophobie,
l'hélicité et
l'amphipathie (Giangaspero et al., 2001 ; Yeaman et al., 2003 ; Dennison et
al., 2005).
Ces paramètres sont très étroitement liés et la simple substitution d'un
résidu d'acide
aminé peut induire la modification simultanée de plusieurs propriétés physico-
chimiques du peptide.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
6
Les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la substitution d'un ou
plusieurs acides aminés de la face polaire de l'hélice a de la temporine-SHa
par un acide
aminé basique permettait d'obtenir un analogue de cette temporine présentant
une
activité antimicrobienne accrue ainsi qu'une toxicité diminuée.
Dans le présent document, les termes peptide , oligopeptide ,
polypeptide ou protéine sont utilisés indifféremment et se réfèrent à
une chaîne
d'acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, quel que soit le nombre
de résidus
d'acide aminé constituant cette chaîne.
Dans les séquences peptidiques décrites dans ce document, les acides aminés
sont
représentés par leur code à une lettre selon la nomenclature suivante : C :
cystéine; D :
acide aspartique; E : acide glutamique; F : phénylalanine; G : glycine; H :
histidine; I :
isoleucine; K: lysine; L : leucine ; M : méthionine ; N : asparagine ; P :
proline ; Q :
glutamine ; R: arginine ; S : sérine ; T : thréonine ; V: valine ; W:
tryptophane et Y:
tyrosine.
Le terme microbe ou microbien tel qu'utilisé dans ce document se réfère
à
des bactéries, des champignons, des levures, des virus et/ou des parasites.
Le terme infection microbienne tel qu'utilisé dans ce document se réfère à
une
infection causée par des bactéries, des champignons, des levures, des virus
et/ou des
parasites.
Le terme activité antimicrobienne tel qu'utilisé dans ce document se réfère
à
une activité antibactérienne, antivirale, antifongique et/ou antiparasitaire.
Cette activité
peut être évaluée au travers de la mesure de différents paramètres tels que la
CI50, la
CMI ou encore la CMB. La CI50 ou concentration inhibitrice 50 correspond
à la
concentration nécessaire d'un composé pour réduire de 50% la croissance in
vitro d'une
population de microorganismes. La CMI ou concentration minimale
inhibitrice
correspond à la concentration minimale de composé permettant d'inhiber
totalement la
croissance microbienne, après 18 heures d'incubation, en général à 37 C, en
présence
dudit composé. La CMB ou concentration minimale bactéricide est la
concentration minimale de composé permettant de détruire 99,9% des
microorganismes
après 18 à 24 heures de contact avec ledit composé.
Le terme concentration létale 50 ou CL50 tel qu'utilisé dans ce
document,
se réfère à la concentration de composé causant la mort de 50 % d'une
population
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
7
cellulaire. La CL50 est un indicateur quantitatif de la toxicité d'un composé.
La CL50 est
notamment utilisée dans ce document pour évaluer l'activité hémolytique des
PAM et
correspond dans ce cas à la concentration de peptide induisant l'hémolyse de
50% des
globules rouges.
La présente invention concerne tout d'abord un peptide analogue de la
temporine-SHa dans lequel un ou plusieurs acides aminés de la face polaire de
l'hélice a
sont substitués par des acides aminés basiques. Selon la projection de
Schiffer-
Edmunson de l'hélice a de la temporine-SHa représentée sur la figure 1, les
acides
aminés constituant la face polaire de cette hélice sont les résidus 4, 11, 7,
3 et 10 de la
temporine-SHa, notamment telle que présentée dans la SEQ ID No.1 .
La présente invention concerne donc un peptide analogue de la temporine-SHa,
doté d'une activité antimicrobienne et comprenant la séquence F-L-X1-X2-I-V-X3-
M-L-
X4-K-L-F (SEQ ID No.18), où X1 est un acide aminé sélectionné dans le groupe
constitué de S, R, H et K, et X2, X3 et X4, identiques ou différents, sont des
acides
aminés sélectionnés dans le groupe constitué de G, R, H et K, et où lorsque X1
est S au
moins l'un des résidus X2, X3 et X4 est sélectionné dans le groupe constitué
de R, H et
K.
Selon un mode de réalisation, le peptide de la présente invention comprend une
séquence sélectionnée parmi le groupe consistant en
F-L-X1-G-I-V-G-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No.2) ;
F-L-S-X2-I-V-G-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No .3);
F-L-S-G-I-V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No .4);
F-L-S-G-I-V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No .5);
F-L-X1-X2-I-V-G-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No .6);
F-L-X1-G-I-V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No .7);
F-L-X1-G-I-V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No .8);
F-L-S-X2-I-V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No .9);
F-L-S-X2-I-V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.10);
F-L-S-G-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.11);
F-L-X1-X2-I-V-X3-M-L-G-K-L-F (SEQ ID No.12);
F-L-X1-X2-I-V-G-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.13);
F-L-X1-G-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.14);
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
8
F-L-S-X2-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.15); et
F-L-X1-X2-I-V-X3-M-L-X4-K-L-F (SEQ ID No.16),
dans lesquels Xi, X2, X3 et/ou X4 sont des acides aminé basiques sélectionnés
dans
le groupe constitué de R, H et K. De préférence, X1, X2, X3 et/ou X4 sont K.
Dans un
mode de réalisation particulier, Xi est K dans les SEQ ID Nos.2 à 16.
Selon un mode de réalisation, le peptide a une taille comprise entre 13 et 100
acides aminés, de préférence entre 13 et 30, 35, 40, 45 ou 50 acides aminés.
Selon un
autre mode de réalisation, le peptide a une taille comprise entre 13 et 15, 20
ou 25
acides aminés. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide a une
taille de 13
acides aminés.
Le peptide selon l'invention peut être un précurseur d'un peptide
antimicrobien
mature. Ce précurseur subit alors des modifications post-traductionnelles
permettant
d'obtenir la forme mature du PAM. Il peut ainsi comprendre une séquence signal
de
translocation et des sites de reconnaissance et/ou de clivage lui permettant
de subir ces
modifications post-traductionnelles. Selon un mode de réalisation particulier,
le peptide
est un précurseur d'un peptide antimicrobien mature et comprend la séquence F-
L-G-T-
I-N-L-S-L-C-E-Q-E-R-D-A-D-E-E-E-R-R-D-E-P-N-E-S-N-V-E-V-E-K-R-F-L-X1-X2-
I-V-X3-M-L-X4-K-L-F-G-K (SEQ ID No.17), où X1 est un acide aminé sélectionné
dans le groupe constitué de S, R, H et K, et X2, X3 et X4, identiques ou
différents, sont
des acides aminés sélectionnés dans le groupe constitué de G, R, H et K, et où
lorsque
X1 est S au moins l'un des résidus X2, X3 et X4 est sélectionné dans le groupe
constitué
de R, H et K.
Les acides aminés constituant le peptide selon l'invention peuvent être de
configuration L ou D, de préférence de configuration L.
Le peptide selon l'invention peut présenter une modification post-
traductionnelle
et/ou une modification chimique en particulier une glycosylation, une
amidation, une
acylation, une acétylation ou une méthylation.
Afin d'augmenter la biodisponibilité du peptide en améliorant sa résistance
aux
peptidases, des groupements protecteurs peuvent être ajoutés aux extrémités C-
et/ou N-
terminale. Par exemple, le groupement protecteur à l'extrémité N-terminale
peut être
une acylation ou une acétylation et le groupement protecteur à l'extrémité C-
terminale
peut être une amidation ou une estérification. L'action des protéases peut
également être
contrecarrée par l'utilisation d'acides aminés de configuration D, la
cyclisation du
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
9
peptide par formation de ponts disulfures, d'anneaux lactames ou de liaisons
entre les
extrémités N- et C-terminales. Le peptide de l'invention peut également
comprendre des
liaisons pseudo-peptidiques remplaçant les liaisons peptidiques classiques
CONH et
conférant une résistance accrue aux peptidases, telles que CHOH-CH2, NHCO, CH2-
0,
CH2CH2, CO-CH2, N-N, CH=CH, CH2NH, et CH2-S. De préférence, le peptide selon
l'invention présente une amidation de son extrémité C-terminale.
Le peptide selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs acides aminés qui
sont des acides aminés rares notamment l'hydroxypro line, l'hydroxylysine,
l'allohydroxylysine, la 6-N-méthylysine, la N-éthylglycine, la N-
méthylglycine, la N-
éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline,
la
pyroglutamine, l'acide aminobutyrique ; ou des acides aminés synthétiques
notamment
l'ornithine, la norleucine, la norvaline et la cyclohexyl-alanine.
L'invention couvre également les dérivés fonctionnels d'un peptide selon
l'invention tel que décrit ci-dessus. Le terme dérivé fonctionnel tel
qu'utilisé dans ce
document, se réfère à des peptides ayant substantiellement la même séquence
d'acides
aminés, substantiellement la même structure hélicoïdale et substantiellement
la même
activité antimicrobienne. Ces dérivés fonctionnels peuvent être, par exemple,
des rétro
peptides, des rétro-inverso peptides, des peptides présentant des
substitutions
conservatives et les peptides dont la chaîne latérale d'un ou plusieurs des
acides aminés
est substituée par des groupements qui ne modifient pas l'activité
antimicrobienne du
peptide de l'invention. Le terme substitution conservative tel qu'utilisé
dans ce
document, se réfère à une substitution d'un résidu d'acide aminé par un autre
qui
présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou
polarité). A
titre d'exemple, l'isoleucine, la leucine, l'alanine, la valine, la
phénylalanine, la proline
et la glycine peuvent être substitués mutuellement de façon conservative, de
même que
la lysine, l'histidine et l'arginine ou la sérine, la tyrosine et la thréonine
ou la cystéine et
la méthionine ou l'asparagine, la glutamine et le tryptophane ou l'acide
aspartique et
l'acide glutamique. Le terme de dérivé fonctionnel se réfère également à un
peptide
selon l'invention dont la séquence est raccourcie de 1, 2, 3 ou 4 acides
aminés en son
extrémité C-terminale et/ou N-terminale.
L'invention couvre également les sels pharmaceutiquement acceptables d'un
peptide selon l'invention. Les sels pharmaceutiquement acceptables peuvent
être, par
exemple, les sels avec des acides minéraux pharmaceutiquement acceptables tels
que
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique et l'acide
phosphorique ;
les sels avec des acides organiques pharmaceutiquement acceptables tels que
l'acide
acétique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide
succinique, l'acide
ascorbique et l'acide tartrique ; les sels avec des bases minérales
pharmaceutiquement
5
acceptables tels que les sels de sodium, de potassium, de calcium, de
magnésium ou
d'ammonium ; ou les sels avec des bases organiques qui ont un azote
salifiable,
couramment utilisés dans la technique pharmaceutique. Les méthodes de
préparation de
ces sels sont bien connues de l'homme du métier.
Le peptide selon l'invention peut être obtenu par synthèse chimique classique
(en
10 phase
solide ou en phase homogène liquide) ou par synthèse enzymatique (Kullman et
al., 1987). Il peut également être obtenu par la méthode consistant à cultiver
une cellule
hôte, telle que décrite ci-après, comprenant un transgène codant pour le
peptide et
exprimant ledit peptide, et à extraire ledit peptide à partir de ces cellules
hôtes ou du
milieu de culture dans lequel le peptide a été sécrété.
Le peptide selon l'invention est doté d'une activité antimicrobienne.
Avantageusement, cette activité est supérieure à celle de la temporine-SHa vis-
à-vis
d'au moins une souche bactérienne, virale, fongique ou parasitaire. Selon un
mode de
réalisation, le peptide selon l'invention a une activité antimicrobienne
supérieure à la
temporine-SHa vis-à-vis des bactéries et plus particulièrement vis-à-vis des
bactéries
Gram-négatif telles qu'Escherichia cou i ou Pseudomonas aeruginosa. Selon un
mode de
réalisation particulier, le peptide selon l'invention a une CMI vis-à-vis de
Pseudomonas
aeruginosa inférieure à 10 uM. Selon un mode de réalisation préférée, le
peptide selon
l'invention a une activité antimicrobienne supérieure à la temporine-SHa vis-à-
vis des
parasites, notamment vis-à-vis des parasites Leishmania infantum, Leishmania
donovani, Leishmania amazonensis, Leishmania major, Leishmania mexicana,
Leishmania panamensis, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Leishmania
guyanensis et/ou Leishmania peruviana, plus particulièrement vis-à-vis des
parasites
Leishmania infantum, Leishmania major, Leishmania tropica et/ou Leishmania
braziliensis, et de manière tout particulièrement préférée vis-à-vis du
parasite
Leishmania infantum. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide
selon
l'invention a une CI50 inférieure à 15 ILLM vis-à-vis de la forme promastigote
du parasite
Leishmania infantum.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
11
Selon un mode de réalisation préférée, le peptide selon l'invention a une
activité
hémolytique inférieure à celle de la temporine-SHa. Selon un mode de
réalisation
particulier, le peptide selon l'invention a une CL50 vis-à-vis des
érythrocytes supérieure
à 30 itM.
La présente invention concerne également un acide nucléique codant pour un
peptide selon l'invention.
Au sens de l'invention, on entend par acide nucléique toute molécule à
base
d'ADN ou d'ARN. Il peut s'agir de molécules synthétiques ou semi-synthétiques,
recombinantes, éventuellement amplifiées ou clonées dans des vecteurs,
modifiées
chimiquement, comprenant des bases non-naturelles ou des nucléotides modifiés
comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique
modifiée, ou un sucre modifié.
L'acide nucléique selon l'invention peut être sous la forme d'ADN et/ou d'ARN,
simple brin ou double brin. Selon un mode de réalisation préférée, l'acide
nucléique est
une molécule d'ADN isolée, synthétisée par des techniques recombinantes bien
connues
de l'homme du métier.
L'acide nucléique selon l'invention peut être déduit de la séquence du peptide
selon l'invention et l'usage des codons peut être adapté selon la cellule hôte
dans
laquelle l'acide nucléique doit être transcrit. Ces étapes peuvent être
réalisées selon des
méthodes bien connues de l'homme du métier et dont certaines sont décrites
dans le
manuel de référence Sambrook et al. (Sambrook et al., 2001).
La présente invention concerne en outre une cassette d'expression comprenant
un acide nucléique selon l'invention lié de manière opérationnelle aux
séquences
nécessaires à son expression. Notamment, l'acide nucléique peut être sous le
contrôle
d'un promoteur permettant son expression dans une cellule hôte. De manière
générale,
une cassette d'expression est constituée de ou comprend un promoteur
permettant
d'initier la transcription, un acide nucléique selon l'invention, et un
terminateur de
transcription. Le terme cassette d'expression désigne une construction
d'acide
nucléique comprenant une région codante et une région régulatrice, liées de
manière
opérationnelle. L'expression "lié de manière opérationnelle" indique que les
éléments
sont combinés de manière à ce que l'expression de la séquence codante (le gène
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
12
d'intérêt) et/ou le ciblage du peptide codé soient sous contrôle du promoteur
transcriptionnel et/ou du peptide de transit. Typiquement, la séquence du
promoteur est
placée en amont du gène d'intérêt, à une distance de celui-ci compatible avec
le contrôle
de l'expression. De même, la séquence du peptide de transit est généralement
fusionnée
en amont de la séquence du gène d'intérêt, et en phase avec celui-ci, et en
aval de tout
promoteur. Des séquences d'espacement peuvent être présentes, entre les
éléments
régulateurs et le gène, dès lors qu'elles n'empêchent pas l'expression et/ou
le ciblage.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cassette d'expression comprend au
moins
une séquence activatrice enhancer liée de manière opérationnelle au
promoteur.
La présente invention concerne en outre un vecteur d'expression comprenant un
acide nucléique ou une cassette d'expression selon l'invention. Ce vecteur
d'expression
peut être utilisé pour transformer une cellule hôte et permettre l'expression
de l'acide
nucléique selon l'invention dans ladite cellule.
Le vecteur peut être un ADN ou un ARN, circulaire ou non, simple- ou double-
brin. Il est avantageusement choisi parmi un plasmide, un phage, un phagemide,
un
virus, un cosmide et un chromosome artificiel.
Avantageusement, le vecteur d'expression comprend des éléments régulateurs
permettant l'expression de l'acide nucléique selon l'invention. Ces éléments
peuvent
comporter par exemple des promoteurs de transcription, des activateurs de
transcription,
des séquences terminatrices, des codons d'initiation et de terminaison. Les
méthodes
pour sélectionner ces éléments en fonction de la cellule hôte dans laquelle
l'expression
est souhaitée, sont bien connues de l'homme du métier.
Le vecteur peut comporter en outre des éléments permettant sa sélection dans
la
cellule hôte comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou un
gène de
sélection assurant la complémentation du gène respectif délété dans le génome
de la
cellule hôte. De tels éléments sont bien connus de l'homme du métier et
largement
décrits dans la littérature.
Lorsque la cellule hôte à transformer est une cellule végétale, le vecteur
d'expression est de préférence un vecteur de plante. Des exemples de vecteurs
de
plantes sont décrits dans la littérature, parmi lesquels on peut citer
notamment les
plasmides T-DNA de A. tumefaciens pBIN19 (Bevan, 1984), pPZP100 (Hajdukewicz
et
al., 1994), la série pCAMBIA (R. Jefferson, CAMBIA, Australie). Les vecteurs
de
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
13
l'invention peuvent comprendre, en outre, une origine de réplication et/ou un
gène de
sélection et/ou une séquence de recombinaison végétale.
Les vecteurs peuvent être construits par des techniques classiques de biologie
moléculaire, bien connues de l'homme du métier.
La présente invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique, d'une
cassette
d'expression ou d'un vecteur d'expression selon l'invention pour transformer
ou
transfecter une cellule. La cellule hôte peut être transformée/transfectée de
manière
transitoire ou stable et l'acide nucléique, la cassette ou le vecteur peut
être contenu dans
la cellule sous forme d'épisome ou sous forme chromosomique.
La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique,
une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, la cellule hôte est un microorganisme, de
préférence une bactérie ou une levure.
Selon un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule animale,
par
exemple une cellule de mammifère telle que les cellules COS ou CHO (US
4,889,803 ;
US 5,047,335). Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-
humaine et
non-embryonnaire.
Selon encore un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule
végétale. Le terme cellule végétale tel qu'utilisé dans ce document, se
réfère à toute
cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés
tels que des
cals, et des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plante,
des plantes
ou des semences.
La présente invention concerne également une méthode de production d'un
peptide antimicrobien selon l'invention comprenant la transformation ou
transfection
d'une cellule par un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur
d'expression selon l'invention ; la mise en culture de la cellule
transfectée/transformée ;
et la récolte du peptide produit par ladite cellule. Les méthodes de
production de
peptides recombinants sont bien connues de l'homme du métier. Par exemple, on
peut
citer les modes spécifiques décrits dans WO 01/70968 pour une production dans
une
lignée cellulaire immortalisée humaine, WO 2005/123928 pour une production
dans une
plante et US 2005-229261 pour une production dans le lait d'un animal
transgénique.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
14
La présente invention concerne également une méthode de production d'un
peptide antimicrobien selon l'invention comprenant l'insertion d'un acide
nucléique,
d'une cassette ou d'un vecteur d'expression selon l'invention dans un système
d'expression in vitro également appelé acellulaire et la récolte du peptide
produit par
ledit système. De nombreux systèmes d'expression in vitro ou acellulaires sont
disponibles dans le commerce et l'utilisation de ces systèmes est bien connue
de
l'homme du métier.
La présente invention concerne en outre un peptide selon l'invention en tant
que
médicament, en particulier en tant que médicament destiné au traitement d'une
infection
microbienne, à savoir une infection par une bactérie, un virus, un champignon
ou un
parasite. Elle concerne également un acide nucléique, une cassette ou un
vecteur selon
l'invention en tant que médicament. Le médicament peut être destiné à un usage
pharmaceutique ou vétérinaire.
Selon un mode de réalisation particulier, l'infection est une infection par un
parasite, de préférence du genre Leishmania. L'infection par un parasite peut
être une
leishmaniose cutanée, une leishmaniose muco-cutanée ou une leishmaniose
viscérale.
Le parasite peut être choisi parmi le groupe constitué de Leishmania
aethiopica,
Leishmania amazonensis, Leishmania arabica, Leishmania aristedes, Leishmania
braziliensis, Leishmania infantum, Leishmania colombiensis, Leishmania deanei,
Leishmania donovani, Leishmania enriettii, Leishmania equatorensis, Leishmania
forattinii, Leishmania garnhami, Leishmania gerbili, Leishmania guyanensis,
Leishmania herreri, Leishmania hertigi, Leishmania lainsoni, Leishmania major,
Leishmania mexicana, Leishmania naiffi, Leishmania panamensis, Leishmania
peruviana, Leishmania pifanoi, Leishmania shawi, Leishmania turanica,
Leishmania
tropica et Leishmania venezuelensis. De préférence, le parasite est choisi
parmi le
groupe constitué de Leishmania infantum, Leishmania donovani, Leishmania
mexicana,
Leishmania amazonensis, Leishmania major, Leishmania tropica, Leishmania
braziliensis, Leishmania guyanensis, Leishmania panamensis et Leishmania
peruviana.
De manière particulièrement préférée, le parasite est choisi parmi le groupe
constitué de
Leishmania infantum, Leishmania major, Leishmania tropica et Leishmania
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
braziliensis. De manière tout particulièrement préférée, l'infection est une
infection par
le parasite Leishmania infantum.
L'infection peut également être une infection par un parasite du genre
Trypanosoma. Le parasite peut être choisi parmi le groupe constitué de
Trypanosoma
5 avium,
Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma con golense,
Trypanosoma equinum, Trypanosoma equiperdum, Trypanosoma evansi, Trypanosoma
lewisi, Trypanosoma melophagium, Trypanosoma percae, Trypanosoma rangeli,
Trypanosoma rotatorium, Trypanosoma simiae, Trypanosoma suis, Trypanosoma
theileri, Trypanosoma triglae et Trypanosoma vivax. De préférence, le parasite
est
10 choisi
parmi le groupe constitué de Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi et
Trypanosoma con golense.
La présente invention concerne un peptide selon l'invention en tant qu'agent
antimicrobien. La présente invention concerne également un acide nucléique,
une
15 cassette ou un vecteur selon l'invention en tant qu'agent antimicrobien.
La présente invention concerne un peptide selon l'invention en tant qu'agent
stimulateur du système immunitaire, notamment lors d'une infection
microbienne. La
présente invention concerne également un acide nucléique, une cassette ou un
vecteur
selon l'invention en tant qu'agent stimulateur du système immunitaire. Selon
un mode
particulier de l'invention, le peptide selon l'invention possède des
propriétés
chimiotactiques. Le peptide induit le recrutement de cellules immunitaires sur
le lieu de
l'infection et augmente l'efficacité de la réponse immunitaire aux infections.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique
comprenant au moins un peptide selon l'invention et un support et/ou excipient
pharmaceutiquement acceptable. La présente invention concerne également une
composition pharmaceutique comprenant au moins un acide nucléique, cassette ou
vecteur selon l'invention et un support et/ou excipient pharmaceutiquement
acceptable.
Les excipients et supports pharmaceutiquement acceptables susceptibles d'être
utilisés dans la composition selon la présente invention sont bien connus de
l'homme du
métier (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed.,
Mack
Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides
and
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
16
Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and
Handbook of
Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical
Press[2000]) et
comprennent notamment les solutions physiologiques salées et les tampons
phosphates.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être appropriée pour une
administration orale, sublinguale, cutanée, sous-cutanée, intramusculaire,
intraveineuse,
topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale,
intraoculaire ou intra-
auriculaire. De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention
est
appropriée pour une administration cutanée, orale, intramusculaire,
intraveineuse,
transdermique ou sous-cutanée. Selon un mode de réalisation particulier, la
composition
pharmaceutique selon l'invention est appropriée pour une administration
topique. La
composition pharmaceutique selon l'invention peut être sous forme de
comprimés,
capsules, gélules, granulats, suspensions, émulsions, solutions, gels, pates,
onguents,
crèmes, emplâtres, potions, suppositoires, lavements, injectables, implants,
patches,
sprays ou aérosols.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend de 1 à
2000 mg de peptide selon l'invention. De préférence, la composition selon
l'invention
comprend de 50 à 100, 150, 200, 250, 500, 750, 1000 ou 1500 mg de peptide
selon
l'invention.
La composition selon l'invention peut comprendre en outre des substances
actives additionnelles, telles que d'autres agents antimicrobiens, notamment
des
peptides antimicrobiens ou des antibiotiques. La composition peut également
comprendre en outre des substances susceptibles de potentialiser l'activité du
peptide
selon l'invention.
La présente invention concerne l'utilisation d'un peptide selon l'invention
pour
la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une infection
microbienne. La
présente invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique,
d'une cassette
ou d'un vecteur selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné
au
traitement d'une infection microbienne.
La présente invention concerne un peptide selon l'invention pour une
utilisation
dans le traitement d'une infection microbienne. La présente invention concerne
également un acide nucléique, une cassette ou un vecteur selon l'invention
pour une
utilisation dans le traitement d'une infection microbienne.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
17
Le traitement peut être curatif ou préventif.
Le sujet à traiter est un animal, de préférence un mammifère. Selon un mode de
réalisation particulier, le sujet à traiter est un humain.
La présente invention concerne également une méthode de traitement d'une
infection microbienne comprenant l'administration d'une dose thérapeutiquement
efficace d'un peptide, d'un acide nucléique, d'une cassette ou d'un vecteur
selon
l'invention.
Le terme dose thérapeutiquement efficace tel qu'utilisé ici se réfère à la
quantité de peptide, d'acide nucléique, de cassette ou de vecteur selon
l'invention
nécessaire pour observer une activité antimicrobienne sur la bactérie, le
virus, le
champignon ou le parasite responsable de l'infection. La quantité de peptide,
d'acide
nucléique, de cassette ou de vecteur selon l'invention à administrer ainsi que
la durée du
traitement sont évalués par l'homme du métier selon l'état physiologique du
sujet à
traiter, l'agent pathogène et l'activité antimicrobienne du peptide vis-à-vis
dudit agent
pathogène.
Dans un mode de réalisation particulier, l'infection microbienne à traiter est
une
leishmanio se.
Une dose efficace de peptide selon la présente invention peut comprendre, sans
y
être limitée, entre environ 1 et 40 mg/kg de poids corporel. La fréquence
d'administration peut être par exemple toutes les 4 à 24 heures, de préférence
toutes les
8 à 12 heures. La durée du traitement peut être par exemple de 1 à 30 jours,
de
préférence de 10 à 20 jours, et de manière tout particulièrement préférée de 5
à 10 jours.
La présente invention concerne également l'utilisation du peptide selon
l'invention en tant que conservateur, désinfectant ou pesticide.
Les produits alimentaires peuvent être traités par un peptide selon
l'invention
afin d'éliminer ou de prévenir le risque d'infection par des micro-organismes
et ainsi
améliorer leur conservation. Le peptide est utilisé dans ce cas comme
conservateur.
Le peptide selon l'invention peut être utilisé en tant que pesticide. Le
peptide est
alors utilisé afin de prévenir ou de traiter les infections des plantes par
des
phytopathogènes.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
18
Le peptide selon l'invention peut également être utilisé en tant que
désinfectant.
Le terme désinfectant se réfère à une activité antimicrobienne du peptide
sur une
surface (par exemple, murs, portes, matériel médical), un liquide (par
exemple, de l'eau)
ou un gaz (par exemple, un gaz anesthésiant).
Les biofilms sont responsables de près de 60% des infections nososomiales. Ils
sont essentiellement dus à la colonisation microbienne de biomatériaux
implantés.
L'éradication d'un biofilm bactérien est un problème clinique majeur étant
donné que
l'antibiothérapie habituellement active sur les bactéries à l'état
planctonique, se révèle
souvent bien moins efficace sur des structures organisées en biofilm. L'effet
des
peptides antimicrobiens sur ce type de biofilm a été démontré dans de
précédentes
études réalisées sur la temporine-A (Cirioni et al., 2003).
Selon un mode de réalisation, le peptide selon l'invention est utilisé pour
l'élimination de biofilms bactériens. Selon un mode de réalisation préférée,
le peptide
selon l'invention est notamment utilisé pour la désinfection du matériel
chirurgical ou
prothétique.
La présente invention concerne également un appareillage médical ou implant
comprenant un corps présentant au moins une surface couverte ou incluant un
peptide
selon l'invention. Notamment, la surface peut être couverte d'un peptide à une
densité
de 0,4 à 300 mg/cm2. Le peptide peut être combiné à une autre molécule active,
de
préférence un antibiotique. L'implant peut être un implant vasculaire.
La présente invention concerne également une méthode de préparation d'un
appareil médical ou implant comprenant l'application d'une couche de peptide
selon
l'invention, ou la mise en contact avec celui-ci, sur au moins une surface de
l'appareil
ou implant. Ce type d'appareil médical ou implant ainsi que ses utilisations
et méthodes
de préparation sont par exemple décrite dans la demande de brevet WO
2005/006938.
La présente invention concerne une composition alimentaire comprenant au
moins un peptide selon l'invention.
La présente invention concerne également une composition agrochimique
comprenant au moins un peptide selon l'invention.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
19
La présente invention concerne une plante transgénique comprenant un acide
nucléique, une cassette ou un vecteur d'expression selon l'invention, et
susceptible
d'exprimer ou exprimant un peptide selon l'invention.
L'introduction des acides nucléiques, des cassettes ou des vecteurs
d'expression
de l'invention dans une cellule ou un tissu végétal, y compris une graine ou
plante, peut
être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier. Les techniques
de
transgenèse végétale sont bien connues dans le domaine, et comprennent par
exemple
l'utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens (Hooykaa and
Schilperoort,
1992), l'électroporation, le transfert conjugatif, des techniques biolistiques
(Russel et
al., 1992) ou la microinjection dans des embryons ou protoplastes végétaux.
D'autres
techniques de transgenèse végétale sont bien connues, ou d'autres protocoles
mettant en
oeuvre les techniques ci-dessus sont décrits dans l'art antérieur (Siemens and
Schieder,
1996) et peuvent être appliqués à la présente invention. La plante
transgénique selon
l'invention peut notamment être obtenue selon la méthode décrite dans la
demande de
brevet WO 00/055337.
La plante transgénique peut appartenir à toute espèce végétale. Elle peut être
monocotylédone ou dicotylédone. Plus particulièrement, la plante transgénique
de
l'invention est une plante de culture destinée ou non à l'alimentation animale
ou
humaine ou sur laquelle les phlébotomes, les insectes vecteurs des
leishmanies, viennent
se nourrir tels que le maïs, le blé, le colza, le soja, la luzerne, le lin, le
riz, la canne à
sucre, la betterave, le tabac, le coton, le tournesol, la tomate, le chou, la
carotte, la
pomme de terre, ou des arbres fruitiers tels que le citronnier, le pommier,
l'abricotier, le
pêcher ou le noisetier, ou les plantes identifiées, à ce jour, comme sources
de repas
sucré pour les phlébotomes tels Ricinus comm unis, Capparis spinosa, Solanum
jasminoides, Solanum luteum ou Bougainvillea glabra.
Selon un mode de réalisation, l'expression du peptide selon l'invention permet
à
la plante transgénique de présenter une résistance accrue aux pathogènes, et
plus
particulièrement aux phytopathogènes. L'utilisation d'une telle plante
transgénique
permet de réduire de manière considérable la pulvérisation ou l'application de
pesticides
sur les cultures, et ainsi de limiter les effets néfastes de ces produits sur
l'environnement.
Selon un autre mode de réalisation, la plante transgénique exprime un peptide
selon l'invention qui est administré à un animal y compris les phlébotomes ou
un
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
humain par ingestion de ladite plante ou de ses sucs. Dans ce cas, le peptide
n'a pas
nécessairement un effet sur les phytopathogènes mais présente une activité
antimicrobienne vis-à-vis d'un ou plusieurs pathogènes de l'animal y compris
les
leishmanies présentes dans le tractus digestif des phlébotomes vecteurs des
5
leishmanioses humaines et animales ou l'humain auquel il est administré. Les
plantes
transgéniques sur lesquelles les phlébotomes prennent leur repas sucré,
délivrent
directement dans le tractus digestif de l'insecte vecteur, un peptide
antimicrobien de
l'invention qui tue directement le parasite éventuellement présent chez
l'insecte vecteur
ou en bloquant son développement en tuant les bactéries de la flore
intestinale de
10
l'insecte vecteur, nécessaires à la différenciation et à la multiplication
parasitaire. Les
plantes transgéniques constituent de fait un moyen efficace de contrôle
indirect de la
transmission des leishmanioses.
La présente invention concerne un anticorps spécifique du peptide selon
15
l'invention. Le terme anticorps tel qu'utilisé dans la présente invention
se réfère
notamment à des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, des fragments de ceux-ci
(par
exemple les fragments F (ab) '2, F (ab)), des anticorps simple-chaîne ou
minibody ou
encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial
reconnaissant le
peptide selon l'invention, notamment les CDR (régions déterminant la
20
complémentarité). On peut citer par exemple les anticorps chimériques,
humanisés ou
humains. Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes
selon
des méthodes bien connues de l'homme du métier. Les différentes techniques de
préparation des anticorps sont bien connues de l'homme du métier.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un anticorps selon
l'invention pour détecter un peptide selon l'invention. Elle concerne
également
l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour effectuer des mesures
quantitatives
d'un peptide selon l'invention, notamment par des dosages immunologiques. Ces
mesures peuvent notamment permettre d'évaluer l'expression du peptide selon
l'invention dans une cellule hôte ou une plante transgénique selon
l'invention.
Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par
référence
dans la présente demande. D'autres caractéristiques et avantages de
l'invention
apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés à titre
illustratif et non
limitatif.
cA 02755472 2016-06-21
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
21
EXEMPLES
Matériel et méthodes
Synthèse peptidique en phase solide
La synthèse peptidique en phase solide a été réalisée à l'aide d'un
synthétiseur
de peptides automatique (Applied Biosystems 433A) selon le protocole décrit
dans
Vanhoye et al. (Vanhoye et al., 2004), et en utilisant des acides aminés
protégés par
Fmoc (Novabiochem, Suisse) et une résine Rink amide MBHA (Serin Chemicals,
Suisse).
La purification des peptides synthétisés a été réalisée par RP-HPLC sur une
colonne semipréparative C18 (Waters RCM compact preparative Cartridge module,
300
Å, 25 x 100 mm), en utilisant un gradient 0-60% acétonitrile (1%/min) à un
débit de 8
mi/min. L'homogénéité et l'identité des peptides synthétiques ont été évaluées
par RP-
HPLC analytique (colonne Syrnmetry.C18, 5 jun, 4,6 x 250 mm, Waters ¨ débit :
0,75
ml/min) et spectrométrie de masse MALDI-TOF (Voyager DE-PRO, Applied
Biosystems).
Tests d'activité antibactérienne
Les souches suivantes ont été utilisées pour les testa antibactériens : Esche
richia
colt (ATCC 25922 et ATCC 35218), Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Bacillus megaterium et Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 27853).
Pour chaque souche, un inoculum standard de 103 à 106 bactéries/tnL (phase
exponentielle de croissance) a été préparé. Pour cela, une colonie isolée sur
une gélose
LB préalablement ensemencée par une des souches, a été mise en culture dans 10
mL de
milieu LB. Les cultures en milieu liquide ont ensuite été incubées pendant 2 à
3 h sous
agitation à 37 C pour que les bactéries soient en phase exponentielle de
croissance.
Chaque suspension bactérienne a été diluée dans du milieu LB de manière à
obtenir une
DO à 630 mn de 0,01 qui correspond à une concentration de 105-106 cfu/mL (cfu
: unité
formant une colonie).
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
22
La concentration minimale inhibitrice (CMI) de chaque peptide a été déterminée
par un test d'inhibition de croissance en milieu liquide. La CMI est définie
comme étant
la plus faible concentration de peptide capable d'inhiber la croissance de la
souche
bactérienne testée, après une incubation de 18 h à 37 C. Le test a été
effectué dans une
plaque de microtitration stérile contenant 96 puits. Une gamme de
concentrations
croissantes de chaque peptide (1 à 400 nM) a été préalablement préparée dans
de l'eau
milliQ stérile contenant 5% de diméthyl sulfoxide (DMSO). Le DMSO facilite la
solubilisation des peptides et ne présente aucune activité antimicrobienne à
la
concentration utilisée. Dans chaque puits, 50 nt, de peptide ont été incubés
avec 50 nt,
de suspension bactérienne (105-106 cfu/mL). La microplaque a ensuite été
incubée à
37 C pendant 18 h, sous agitation. La croissance bactérienne a été déterminée
par
mesure de la DO à 630 nm (turbidité) à l'aide d'un lecteur de plaques. Les
tests ont été
réalisés en triplets pour chaque concentration de peptide.
Le témoin négatif d'inhibition de croissance a été obtenu en remplaçant la
solution contenant le peptide par 50 nI_, d'eau milliQ stérile contenant 5% de
DMSO. Le
témoin positif permettant d'inhiber totalement la croissance des souches
bactériennes a
été obtenu en remplaçant la solution contenant le peptide par 50 nI_, de
formaldéhyde à
0,7%.
Tests d'activité antifongique
Les trois souches de levures suivantes ont été utilisées : Saccharomyces
cerevisiae, Candida albicans (ATCC 90028), Candida parapsilosis (ATCC 22019).
Ces
souches ont été préalablement cultivées sur gélose YPD pendant 48 h minimum.
Des
suspensions de levures ont ensuite été préparées, exactement comme pour les
bactéries,
et ajustées à 105-106 cfu/mL dans du milieu YPD liquide.
Le test antifongique correspond au test d'inhibition de croissance en milieu
liquide utilisé pour les bactéries (cf ci-dessus) dans lequel le milieu LB a
été remplacé
par un milieu de culture YPD. Les souches fongiques ont été incubées à 30 C.
Tests hémolytiques
L'activité hémolytique des peptides antimicrobiens a été mise en évidence en
utilisant des globules rouges humains de donneurs sains. L'hémolyse des
globules
CA 02755472 2016-06-21
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
23
rouges se traduit par la libération d'hémoglobine dans le milieu réactionnel
dont la
concentration est déterminée par spectrophotométrie à 450 nm.
Les globules rouges ont été séparés du plasma et des globules blancs par
centrifugation du sang humain (900 g, 10 min). Le culot contenant les globules
rouges a
été lavé 3 fois avec du tampon PBS, pH 7,4. Après comptage à l'aide d'une
cellule de
Malassez, une solution mère de 2.107 hématie,s/mL a été préparée dans le même
tampon, ainsi qu'une gamme de concentrations des peptides à tester (1 à 200
M).
Le test a été effectué de la manière suivante : 100 kiL des différentes
concentrations de peptide ont été ajoutés à 100 1.1 de la suspension de
globules rouges.
Après 1 h d'incubation à 37 C, puis centrifugation (12 000g, 15 sec),
l'absorbance du
surnageant a été mesurée à 450 nm. Le témoin négatif pour ce test (0%
d'hémolyse)
contenait 100 ILL de tampon PBS à la place de la solution contenant le peptide
et le
témoin positif (100% d'hémolyse) contenait 100 L de Tritone0,1% à la place de
la
même solution.
La valeur LC50 obtenue résulte de la moyenne de trois expériences réalisées en
triplets et correspond à la concentration de peptide induisant 50% d'hémolyse.
Tests d'activité anti-Leishmania
L'activité antiparasitaire des peptides a été évaluée sur les deux formes du
parasite
Leishmania infantum, la forme promastigote et la forme amastigote.
Les tests d'activité anti-Leishmania ont été réalisés avec une lignée aNEO-
aLUC
de Leishmania infantum. Cette lignée a été obtenue en transformant la souche
MHOM/MA/67/1114AP-263 de Leishmania infantum avec le vecteur pGM aNEO-
aLUC contenant le gène rapporteur de la luciférase (LUC) et le gène de
résistance à la
néomycine (NEO) tel que décrit dans Roy et a/. (2000). Elle est maintenue en
culture
sous ses deux formes, promastigotes et amastigotes.
Culture des parasites :
Les promastigotes de Leishmania infantum ont été maintenus à 26 C par un à
deux passages hebdomadaires selon le nombre de parasites dans l'inoculum, dans
du
milieu SDM 79, supplémenté avec 10% à 20% de sérum de veau foetal
décomplérnenté
et de 5 mg/mL d'hêmine de porc et en présence de 100 UhnL de pénicilline et
100
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
24
iag/mL de streptomycine (Brun & Shonenberger, 1979). A partir d'un inoculum de
105
cellules/mL en phase de croissance logarithmique, les promastigotes ont
atteint une
densité cellulaire de 2 à 3x108 parasites/mL en phase stationnaire, après 7
jours de
culture dans des flacons de culture de 25 cm2. Les densités cellulaires ont
été
déterminées par comptage en cytométrie de flux, en présence d'iodure de
propidium sur
un compteur Facscan (Excalibur, Becton-Dickinson, Ivry, France).
Les amastigotes axéniques ont été obtenus par différenciation des
promastigotes
à 37 C 0,1 C (saturation en H20, 5% CO2), en culture dans le milieu MAA,
supplémenté avec 20% de sérum de veau foetal décomplémenté et de 12,5 mg/mL
d'hêmine de porc, en présence de 100 U/mL de pénicilline et 100 iag/mL de
streptomycine (Sereno et Lemesre, 1997). A partir d'un inoculum de 5x105
cellules/mL
en phase de croissance logarithmique, les amastigotes ont atteint une densité
cellulaire
de 2 à 3x108 parasites/mL en phase stationnaire, après 7 jours de culture dans
des
flacons de culture de 25 cm2. L'observation microscopique des amastigotes
axéniques
montre des formes homogènes (rondes à ovoïdes) sans flagelle apparent et
immobiles.
Les amastigotes axéniques des diverses espèces de Leishmania présentent les
mêmes
propriétés ultrastructurales, biologiques, biochimiques et immunologiques que
les
amastigotes intracellulaires. Les densités cellulaires ont aussi été
déterminées par
comptage en cytométrie de flux selon la même procédure et les mêmes paramètres
utilisés pour les promastigotes.
Tests d'activité anti-Leishmania sur les amastigotes axéniques :
Une suspension d'amastigotes axéniques de la lignée de Leishmania infantum
transfectée par la cassette aNEO-aLUC en phase exponentielle de croissance et
avec un
pourcentage de viabilité supérieur à 90%, a été ajustée à une densité de
1,25x106
parasites/mL dans du milieu MAA/20. Des solutions de peptides antimicrobiens
cinq
fois concentrées ont également été préparées dans ce milieu (300 à 4,7 tM).
Pour le test, la suspension d'amastigotes axéniques est répartie dans une
microplaque de culture sous un volume de 80 iaL par puits (soit 105
parasites/puits) dans
lesquels sont ajoutés 20 iaL de chaque solution de peptide (60 à 0,94 iaM
final) (soit une
densité parasitaire finale de 106 parasites/mL). La plaque est ensuite incubée
à 37 C
pendant 72 h. Pour le contrôle négatif, la solution de peptide a été remplacée
par 20 iaL
de milieu MAA/20. Le contrôle positif a été réalisé avec 20 iaL de la solution
contenant
CA 02755472 2016-06-21
WO 2010/106293 PCT/PR2010/050487
la plus forte concentration de peptide. Les expériences sont effectuées en
triplets pour
chaque concentration de peptide. Après 72 heures, 50 4 de tampon de lyse
(Steady
GL0e, Promega) ont été ajoutés dans chaque puits. Après incubation durant 5
min à
température ambiante, la lyse cellulaire a été vérifiée au microscope.
5 La luminescence émise a
été mesurée par un lecteur de luminescence (Victor,
PerkinElmer). Elle est proportionnelle au nombre de parasites vivants dans le
milieu.
Le pourcentage de croissance a été calculé selon la formule suivante :
% croissance [(L moy ¨ bc1f)peptide x 100] / (L moy ¨ beccensie
avec L moy: Luminescence moyenne et bdf : bruit de fond.
10 La concentration
inhibant de 50% la croissance des amastigotes (CI50) a été
déterminée.
Tests d'activité anti-Leishmania sur les promastigotes
Comme pour les tests sur amastigotes, 804 de suspension de promastigotes (105
15 parasites/puits) ont
été mélangés à 20 4 de solution de peptide (60 à 0,94 itM final)
dans chaque puits d'une plaque de microtitration. Les contrôles négatifs et
positifs ont
été réalisés selon le même protocole que pour les tests d'activité anti-
Leishmania sur les
amastigotes. Les expériences sont effectuées en triplets pour chaque
concentration de
peptide.
20 Après 72 heures
d'incubation à 26 C, 50 L par puits de tampon de lyse Steady
Glo (Pmmega) ont été ajoutés et, après incubation durant 5 min à température
ambiante,
la lyse cellulaire a été vérifiée au microscope. La luminescence émise a été
mesurée et
le pourcentage de croissance a été calculé selon la méthode décrite ci-dessus.
La
concentration inhibant de 50% la croissance des promastigotes (C150) a été
déterminée.
Tests de cytotoxicité sur les monocytes :
L'activité cytotoxique des peptides antimicrobiens a été déterminée vis-à-vis
d'une lignée de monocytes humains THP-1. Les cellules ont été maintenues en
culture
dans du milieu RPMI (10% SVF, 100 U/mL pénicilline, 100 p.g/mL streptomycine)
jusqu'à obtenir une phase exponentielle de croissance. Après comptage sur
cellule de
Thoma, la densité cellulaire a été ajustée à 6,25x105 cellules/mL dans du
milieu RPMI
1640. Des solutions peptidiques 5 fois concentrées ont été préparées dans du
milieu
RPMI (300 à 4,7 M).
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
26
Les monocytes sont répartis sous un volume de 80 iaL de suspension cellulaire
par
puits (soit 5x104 monocytes/puits ou 5x105 cellules/mL final) et mélangés à 20
iaL de
solution de peptide (60 à 0,94 1.M final). Les contrôles négatifs et positifs
ont été
réalisés selon le même protocole que pour les tests d'activité anti-
Leishmania. Les
expériences sont effectuées en triplets pour chaque concentration de peptide.
Les
cellules sont incubées à 37 C, sous 5% de CO2, pendant 72h.
Après 72 heures, le nombre de cellules THP-1 viables a été indirectement
évalué
par le test MTT (Mosmann, 1983). Le MTT (ou 3-(4,5-diméthylthiazol-2-y1)-2,5-
diphényl-tétrazolium bromide), de couleur jaune, est réduit en bleu formazan
sous
l'action de la succinate-tétrazolium réductase qui est présente dans la chaîne
respiratoire
mitochondriale des cellules métaboliquement actives. Ce bleu formazan est
détectable
par spectrophotométrie (570 nm).
Une solution de MTT dissous dans le tampon PBS (pH 7,4) à la concentration
de 10 mg/mL, filtrée sur 0,45 iam, est ainsi répartie à raison de 10 iaL par
puits. Les
plaques sont ensuite incubées pendant 4 h à 37 C. La réaction enzymatique est
stoppée
par l'addition de 100 iaL d'un mélange isopropanol 50% / SDS 10% et les
microplaques
sont ensuite incubées à température ambiante durant 30 min, sous agitation. La
DO à
570 nm de chaque puits a ensuite été mesurée (lecteur Victor, PerkinElmer)
afin de
déterminer la CI50.
Résultats
Activités antibactérienne, antifongique et hémolytique de la temporine-SHa et
de
l'analogue [K3]temporine-SHa
L'activité antimicrobienne de la temporine-SHa (SEQ ID No.1) et de l'analogue
[KItemporine-SHa (SEQ ID No.19) a été évaluée sur différentes souches
bactériennes
de référence Gram-positif et Gram-négatif, ainsi que sur des souches
fongiques.
L'activité hémolytique de ces deux peptides a également été évaluée. Les
valeurs
des concentrations minimales inhibitrices (CMI) et des concentrations létales
50 (CL50)
sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293
PCT/FR2010/050487
27
Tableau 1 : Activités antimicrobiennes et hémolytiques de la temporine-SHa et
de
l'analogue [10temporine-SHa
CMI ( 1\1)
Temp-SHa [K3]
Temp-SHa
Gram-négatif
Escherichia cou i (ATCC 25922) 10 3
Escherichia coli (ATCC 35218) 10 3
Escherichia cou i ML-35p 6,25 3
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) 31,25 3
Gram-positif
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) 3 3
Enterococcus faecalis (ATCC 29212) 10 10
Bacillus megaterium 2,5 1,5
Levures
Candida albicans (ATCC 90028) 15 12,5
Candida parapsilosis (ATCC 22019) 31,25 12,5-6,25
Saccharomyces cerevisiae 7,9 6,25
CL50 érythrocytes ( 1\1) 25 50
Ces résultats démontrent que l'activité antimicrobienne de l'analogue
[10temporine-SHa est remarquablement plus importante que celle de la temporine-
SHa, notamment à l'encontre des souches Gram-négatif (CMI de 3 iuM pour toutes
les
souches testées) et des levures.
A noter que l'activité antibactérienne de l'analogue [10temporine-SHa est 10
fois
plus importante à l'encontre de Pseudomonas aeruginosa que celle de la
temporine-
SHa. Ce résultat est particulièrement intéressant étant donné que cette souche
est
résistante à la plupart des temporines.
De plus, l'augmentation du pouvoir antimicrobien de l'analogue [10temporine-
SHa s'accompagne d'une diminution d'un facteur 2 de l'activité hémolytique par
rapport à celle de la temporine-SHa.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
28
Activité anti-Leishmania de la temporine-SHa et de l'analogue [K3]temporine-
SHa
L'activité anti-Leishmania des deux temporines a été évaluée sur le parasite
Leishmania infantum, agent responsable essentiellement de la leishmaniose
viscérale
humaine dans le pourtour du bassin méditerranéen et en Amérique latine.
Des cultures des formes promastigotes et amastigotes axéniques de Leishmania
infantum (MHOM/MA/67/ITMAP-236) exprimant le gène de la luciférase ont été
utilisées. L'évaluation de l'activité métabolique des parasites est basée sur
l'oxydation
de la luciférine par la luciférase en présence d'ATP. Ce processus aboutit à
l'émission
de photons qui est proportionnelle à la concentration des parasites non lysés.
Les résultats de ces tests anti-Leishmania ont démontré que la temporine-SHa
et
l'analogue [KItemporine-SHa sont actifs contre les deux formes du parasite
Leishmania infantum (Figure 2 A et B). Cependant, l'analogue [KItemporine-SHa
présente une meilleure activité antiparasitaire vis-à-vis des promastigotes
par rapport à
la temporine-SHa. L'analogue [KItemporine-SHa agit sur la forme promastigote
du
parasite avec une CI50 de l'ordre de 10 uM, alors que la temporine-SHa a une
CI50 de
l'ordre de 20 uM (figure 2 B).
Les effets cytotoxiques de la temporine-SHa et de l'analogue [KItemporine-SHa
ont été évalués sur la lignée de monocytes humains THP-1. Les monocytes
représentent
la forme non différenciée des macrophages qui sont les cellules hôtes des
parasites
Leishmania. Les résultats obtenus (Figure 3) démontrent que la temporine-SHa
et
l'analogue [KItemporine-SHa ne sont pas cytotoxiques aux doses
antimicrobiennes.
Conclusion
La substitution de la sérine sur la face polaire de l'hélice a de la temporine-
SHa par une
lysine a permis de générer un analogue [KItemporine-SHa présentant une
activité
antimicrobienne plus importante que celle de la temporine-SHa, notamment à
l'encontre
des souches Gram-négatif et des levures. Cet analogue présente en outre une
meilleure
activité antiparasitaire vis-à-vis du parasite Leishmania infantum, notamment
vis-à-vis
des promastigotes.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
29
De plus, il a été démontré que cette augmentation du pouvoir antimicrobien
s'accompagne d'une diminution d'un facteur 2 de l'activité hémolytique et que
cet
analogue n'était pas cytotoxique vis-à-vis des monocytes, cellules cibles du
parasite de
l'hôte vertébré, aux doses antimicrobiennes.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Abbassi F, Oury B, Blasco T, Sereno D, Bolbach G, Nicolas P, Hani K, Amiche
M, Ladram A (2008) Isolation, characterization and molecular cloning of new
temporins from the skin of the North African ranid Pelophylax saharica.
Peptides 29:
1526-33.
Brun R, Schônenberger M (1979) Cultivation and in vitro cloning or procyclic
culture forms of Trypanosoma brucei in a semi-defined medium. Acta Trop. 36:
289-
92.
Bevan M (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation.
Nucleic Acids Res. 12: 8711-21.
Chinchar VG, Bryan L, Silphadaung U, Noga E, Wade D, Rollins-Smith L
(2004) Inactivation of viruses infecting ectothermic animals by amphibian and
piscine
antimicrobial peptides. Virology 323: 268-75.
Cirioni 0, Giacometti A, Ghiselli R, Dell'Acqua G, Goy Y, Kamysz W,
Lukasiak J, Mocchegiani F, Orlando F, D'Amato G, Balaban N, Saba V, Scalise G
(2003) Prophylactic efficacy of topical temporin A and RNAIII inhibiting
peptide in a
subcutaneous rat Pouch model of graft infection attributable to staphylococci
with
intermediate resistance to glycopeptides. Circulation 108: 767-71.
Conlon JM (2008) Reflections on a systematic nomenclature for antimicrobial
peptides from the skins of frogs of the family Ranidae. Peptides 29: 1815-9.
Conlon JM, Kolodziejek J, Nowotny N (2009) Antimicrobial peptides from the
skins of North American frogs. Biochim. Biophys. Acta, 1788: 1556-63.
Dennison SR, Wallace J, Harris F, Phoenix DA (2005) Amphiphilic a-helical
antimicrobial peptides and their structure/function relationships. Protein
Pept. Lett. 12:
31-9.
CA 02755472 2011-09-13
WO 2010/106293 PCT/FR2010/050487
Giangaspero A, Sandri L, Tossi A (2001) Amphipathic a helical antimicrobial
peptides: A systematic study of the effects of structural and physical
properties on
biological activity. Eur. J. Biochem. 268: 5589-600.
Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P (1994) The small, versatile pPZP family of
5 Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol. Biol.
25: 989-94.
Hooykaas PJJ, Schilperoort RA (1992) Agrobacterium and plant genetic
engineering. Plant Mol. Biol. 19: 15-38.
Isaacson T, Soto A, Iwamuro S, Knoop FC, Conlon JM (2002) Antimicrobial
peptides with atypical structural features from the skin of the Japanese brown
frog Rana
10 japonica. Peptides 23: 419-25.
Kim JB, Iwamuro S, Knoop FC, Conlon JM (2001) Antimicrobial peptides from
the skin of the Japanese mountain brown frog, Rana ornativentris. J. Pept.
Res. 58: 349-
56.
Kullmann W (1987) Enzymatic peptide synthesis, CRC Press, Florida.
15 Mangoni ML (2006) Temporins, anti-infective peptides with expanding
properties. Cell. Mol. Life Sci. 63: 1060-9.
Mosmann T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65:
55-63.
Rollins-Smith LA, Carey C, Conlon JM, Reinert LK, Doersam JK, Bergman T
20 et al (2003) Activities of temporin family peptides against the chytrid
fungus
(Batrachochytrium dendrobatidis) associated with global amphibian declines.
Antimicrob. Agents Chemother. 47: 1157-60.
Roy G, Dumas C, Sereno D, Wu Y, Singh AK, Tremblay MJ, Ouellette M,
Olivier M, Papadopoulou B (2000) Episomal and stable expression of the
luciferase
25 reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages
and in animal
models. Mol. Biochem. Parasitol. 110: 195-206.
Russell JA, Roy MK, Sanford JC (1992) Major improvements in biolistic
transformation of suspension-cultured tobacco cells. In Vitro Cell. Dey.
Biol., 28P, p.
97-105.
30 Sambrook J, Russell D (2001) Molecular cloning: a laboratory manual,
Third
Edition Cold Spring Harbor.
CA 02755472 2011-09-13
11756-85 31
Sereno D, Lemesre JL (1997) Axenically cultured amastigote forms as an in
vitro model for investigation of antileishmanial agents. Antimicrob. Agents
Chemother.
41: 972-6.
Siemens, J, Schieder 0 (1996) Transgenic plants: genetic transformation -
recent
developments and the state of the art. Plant Tissue Cult. Biotechnol. 2: 66-
75.
Simmaco M, De Biase G, Severini C, Aita M, Falconieri G, Erspamer, Barra D,
Bossa F (1990) Purification and characterization of bioactive peptides from
skin extract
of Rana esculenta. Biochem. Biophys. Acta 1033: 318- 23.
Simmaco M, Mignogna G, Canofeni S, Miele R, Mangoni ML, Barra D (1996)
Temporins, antimicrobial peptides from the European red frog Rana temporaria.
Eur. J.
Biochem. 242: 788-92.
Vanhoye D, Bruston F, El Amri S, Ladram A, Amiche M, Nicolas P (2004)
Membrane association, electrostatic sequestration and cytotoxicity of Gly-Leu-
rich
peptide orthologs with differing functions. Biochemistry 43: 8391-409.
Yeaman MR, Yount NY (2003) Mechanisms of antimicrobial peptide action
and resistance. Pharmacol. Rev. 55: 27-55.
LISTAGE DES SÉQUENCES EN FORMAT ÉLECTRONIQUE
En vertu de l'article 111(1) des Règles sur les brevets, la présente
description
contient une version électronique du listage des séquences en format texte
ASCII
(fichier 11756-85 Seq 07-SEP-11 v 1 .txt).
Une copie du listage des séquences en format électronique est disponible au
Bureau des brevets du Canada.
Les séquences comprises dans le listage des séquences en format électronique
sont reproduites dans le tableau des séquences qui suit.
PAGE AMENDÉE
CA 02755472 2011-09-13
11756-85 32
TABLEAU DES SÉQUENCES
<110> Université Pierre et Marie Curie (Paris 6)
Institut de Recherche pour le développement
Centre National de la Recherche Scientifique
<120> Analogues de la temporine-SHa et leurs utilisations
<130> 11756-85
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Pelophylax saharica
<400> 1
Phe Leu Ser Gly Ile Val Gly Met Leu Gly Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3).7(3)
<223> R, H ou K
<400> 2
Phe Leu Xaa Gly Ile Val Gly Met Leu Gly Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
CA 02755472 2011-09-13
11756-85 33
<222> (4)..(4)
<223> R, H ou K
<400> 3
Phe Leu Ser Xaa Ile Val Gly Met Leu Gly Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> R, H ou K
<400> 4
Phe Leu Ser Gly Ile Val Xaa Met Leu Gly Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)7.(10)
<223> R, H ou K
<400> 5
Phe Leu Ser Gly Ile Val Gly Met Leu Xaa Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> R, H ou K
CA 02755472 2011-09-13
=
11756-85 34
<400> 6
Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Gly Met Leu Gly Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> R, H ou K
<400> 7
Phe Leu Xaa Gly Ile Val Xaa Met Leu Gly Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> R, H ou K
<400> 8
Phe Leu Xaa Gly Ile Val Gly Met Leu Xaa Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
CA 02755472 2011-09-13
11756-85 35
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> R, H ou K
<400> 9
Phe Leu Ser Xaa Ile Val Xaa Met Leu Gly Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> R, H ou K
<400> 10
Phe Leu Ser Xaa Ile Val Gly Met Leu Xaa Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
CA 02755472 2011-09-13
11756-85 36
<222> (10)..(10)
<223> R, H ou K
<400> 11
Phe Leu Ser Gly Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> R, H ou K
<400> 12
Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Xaa Met Leu Gly Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> R, H ou K
<400> 13
Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Gly Met Leu Xaa Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 14
<211> 13
CA 02755472 2011-09-13
..
11756-85 37
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
_
<222> (3)..(3)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
_
<222> (7)..(7)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
_
<222> (10)..(10)
<223> R, H ou K
<400> 14
Phe Leu Xaa Gly Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
_
<222> (7)..(7)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)7.(10)
<223> R, H ou K
<400> 15
Phe Leu Ser Xaa Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 16
<211> 13
CA 02755472 2011-09-13
11756-85 38
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> R, H ou K
<400> 16
Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Précurseur d'un peptide antimicrobien mature
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> S, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> G, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> G, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> G, R, H ou K
CA 02755472 2011-09-13
11756-85 39
<400> 17
Phe Leu Gly Thr Ile Asn Leu Ser Leu Cys Glu Gin Glu Arg Asp Ala
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Arg Arg Asp Glu Pro Asn Glu Ser Asn Val Glu Val
20 25 30
Glu Lys Arg Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe
35 40 45
Gly Lys
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide analogue de la temporine-SHa
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> S, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (4).7(4)
<223> G, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (7).7(7)
<223> G, R, H ou K
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (10)7.(10)
<223> G, R, H ou K
<400> 18
Phe Leu Xaa Xaa Ile Val Xaa Met Leu Xaa Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Analogue [K3]temporine-SHa
CA 02755472 2011-09-13
11756-85 40
<400> 19
Phe Leu Lys Gly Ile Val Gly Met Leu Gly Lys Leu Phe
1 5 10
