Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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Anticorps biomarqueur et dispositif de diagnostic pour la détection de
certaines maladies auto-immunes
Domaine technique de l'invention
L'invention concerne le domaine de l'immunologie, à savoir le domaine de
l'interaction
entre un antigène et un anticorps. Plus particulièrement, l'invention concerne
l'utilisation d'un antigène de synthèse (TCSP), dérivé d'une protéine du
parasite
unicellulaire Trypanosoma Cruzi, qui est la cause de la maladie de Chagas,
pour la
détection d'anticorps non reliés à la maladie de Chagas, qui permettent de
diagnostiquer certaines maladies auto-immunes dans un patient humain.
Etat de la technique
On sait que les agents infectieux peuvent échapper au système immunitaire d'un
hôte
en interférant avec la maturation normale d'une réponse immunitaire humorale
effective, et en dirigeant des anticorps induits contre des autoantigènes. De
plus, dû à
des similitudes structurelles entre certains antigènes infectieux et antigènes
du soi
( self antigens en anglais), on pense que certains agents infectieux sont
capables
de déclencher une réponse auto-immunitaire dans des hôtes qui présentent une
prédisposition génétique.
La maladie de Chagas est endémique en Amérique Latine et Amérique du Sud, et
représente une cause importante de morbidité et mortalité dans les pays où
elle sévit.
Elle est pratiquement absente sur les autres continents. Environ 16 à 18
millions de
personnes sont infectées, et environ 50 000 patients en meurent chaque année.
C'est
l'infection par le parasite unicellulaire Trypanosoma Cruzi (T. cruzi), membre
de l'ordre
des Kinetoplastida et de la famille des Trypanosomatidae, qui induit la
maladie de
Chagas chez l'être humain ; ce parasite protozoaire est transmis par plusieurs
espèces
d'insectes hématophages, et notamment par les Triatominae (punaises hémato-
phages). La transmission a lieu lorsque les formes infectieuses du parasite
sont
déposées lors de la piqûre de l'insecte, lorsque des déjections de l'insecte
vecteur
entrent en contact avec le sang ou les muqueuses de l'hôte. L'insecte vecteur
libère
ainsi les formes trypomastigotes métacycliques infectieuses qui, par la voie
de la
circulation sanguine, vont coloniser de nombreux types cellulaires. Le cycle
de vie
complexe du parasite lui permet d'échapper à la réponse immunitaire de l'hôte,
sans
conduire à la mort de l'hôte. Le parasite passe par une étape épimastigote
dans
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l'insecte vecteur, une étape trypomastigote dans le sang du mammifère hôte, et
une
étape amastigote intracellulaire : pendant cette dernière étape, le parasite
se multiplie
par division binaire. Une autre voie de contamination est la transfusion
sanguine avec
du sang contaminé ; plusieurs procédés de dépistage ont été développés (voir
par
exemple les brevets EP 0 976 763 et US 6,458,922).
On sait que T. cruzi infecte les cellules musculaires cardiaques et
squelettiques, les
cellules gliales et les cellules du système phagocytaire mononucléé. Après
pénétration
passive dans la cellule hôte, la forme trimastogite du parasite se différencie
en forme
amastigote ; elle se divise activement, puis les formes trypomastigotes sont
libérées,
provoquant ainsi une nouvelle invasion cellulaire. Environ 30% des patients
atteints par
cette maladie développent de sévères symptômes cliniques cardiaques de type
cardiomyopathies (voir l'article de K. Karratolios et al., "Inflammatory
Cardiomyopathy",
paru en 2006 dans la revue Hellenic Journal of Cardiology, vol. 47, P. 54-65,
et l'article
de J. Burian et al., Myocarditis : the immunologist's view on pathogenesis
and
treatment , paru en 2005 dans la revue Swiss Medical Weakly, vol. 135, p. 359-
364) ;
ces cardiomyopathies peuvent être aiguës ou chroniques.
Des atteintes cardiaques comparables peuvent être observées chez des patients
infectés par le virus d'immunodéficience humaine (VIH) ou d'autres agents
infectieux
en dehors de tout contexte de la maladie de Chagas. Des atteintes cardiaques
comparables peuvent également exister avec moins de fréquence chez des sujets
apparemment sains ; on sait (voir l'article de F. Kierszenbaum, Views on the
autoimmunity hypothesis for Chagas disease pathogenesis , paru en 2003 dans
la
revue "FEMS Immunology and Medical Microbiology, vol. 1545, p. 1 - 11, et
l'article de
R. Jahns et al., Pathological autoantibodies in cardiomyopathy , paru en
septembre
2008 dans la revue Autoimmunity, vol 41(6), p. 454 - 461) que ces atteintes
résultent
de mécanismes auto-immunitaires d'origine indéterminée. En effet, des
réactions auto-
immunes peuvent être observées chez les patients atteints de cardiomyopathies
sans
que l'on ne connaisse précisément l'origine, ni la spécificité des anticorps
impliqués, ni
à fortiori celle des immunogènes. Aucun document ne fait état d'une structure
antigénique définie, responsable de cette auto-immunité et plus
particulièrement d'un
antigène de T. cruzi (TCSP). Des anticorps ont été décrits contre des
récepteurs
(adrénergiques ou cholinergiques) sans pour autant définir leur spécificité
vis-à-vis du
peptide TCSP et d'aucune façon l'implication d'un antigène du parasite T.
cruzi en
dehors de son contexte naturel de la maladie de Chagas.
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On sait que chaque étape du cycle de vie du parasite T. cruzi exprime des
protéines
antigènes spécifiques, comme décrit par exemple dans l'article de Hoft et al.
( Trypanosama cruzi Expresses Diverse Repetitive Protein Antigens ), paru en
juillet
1989 dans la revue Infection and Immunity, vol. 57 (7), p. 1959-1967). Dans
les études
décrites dans cette publication, les auteurs ont criblé une banque
d'expression de T.
cruzi avec des anti-sérums humains et ont trouvé des cDNA qui codent des
polypeptides contenant des unités répétitives comprenant de 6 à 34 acides
aminés. La
séquence d'acides aminés de TCR70 (qui est identique à TCR 69) a été fortement
conservée, avec seulement quelques substitutions occasionnelles. Leur
apparition
fréquente dans toutes les fractions isolées et la diversité de ces unités
répétitives
suggère qu'ils sont impliqués dans le contournement du rôle destructif du
système
immunitaire. Puisque ces unités répétitives sont des modulateurs efficaces du
système
immunitaire, on peut penser que d'autres agents infectieux utilisent des
stratégies
similaires, voire même les mêmes unités répétitives.
Les méthodes de dépistage des anticorps ,dirigés contre T. cruzi, qui sont
utilisées
dans les banques de sang (notamment au . Brésil où ce dépistage est
obligatoire),
comprennent l'immunofluorescence indirecte (IFA), l'hémagglutination indirecte
(IHA),
et le dosage par des techniques immunoenzymatiques (ELISA). La plupart de ces
kits
de dosage, qui sont commercialement disponibles, utilisent des extraits bruts
de
parasites ou des fractions subcellulaires comme préparations d'antigènes. Il a
été
trouvé que les extraits de parasites réagissent, avec des sérums de patients
qui
présentent d'autres maladies, telles que la leishmaniose, l'infection
Trypanosoma
rangeli, la syphilis ou la fièvre rhumatoïde. Par conséquent, l'utilisation
d'unités
répétitives similaires par différents organismes pathogènes complique le
diagnostic et
le traitement. D'autre part, une réponse faussement positive lors du dépistage
de la
maladie de Chagas peut conduire à un diagnostic erroné qui sera suivi d'un
traitement
superflu et / ou inefficace.
Par conséquent, il y a un besoin urgent de pouvoir détecter des unités
répétitives qui
peuvent être utilisés par différents organismes pathogènes. Cependant, dans
l'état de
la technique, il n'existe pas de document qui montre ou suggère que les motifs
polypeptidiques TCR 70 qui sont identifiés chez T. cruzi existent dans
d'autres
maladies sans rapport avec la maladie de Chagas, ou entraînent des désordres
auto-
immunitaires. Il n'a pas non plus été démontré ou suggéré dans l'état de la
technique
que ces unités répétitives peuvent permettre le développement d'outils fiables
pour le
diagnostic et le traitement ou la prévention efficace de pathologies
cardiaques ou de
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désordres auto-immunitaires liées ou non à la maladie de Chagas. Il y a donc
également un besoin de disposer de méthodes immunodiagnostiques, de préférence
rapides ou utilisables sous la forme de kits, pour détecter des anticorps
pathogènes
capables de se lier de manière spécifique aux antigènes exprimés par T. cruzi.
Et
finalement, on manque de méthodes pour pouvoir réduire le taux de ces
anticorps
pathogènes dans le sang.
Objets de l'invention
Selon l'invention, les problèmes posés sont résolus par l'utilisation
d'anticorps qui se
lient de manière spécifique à un peptide comportant la séquence
Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-Vai
(SEQ ID N 1),
et qui ne sont pas induits dans un hôte suite à son infection par T. cruzi.
Ces anticorps en tant que tels représentent le premier objet de la présente
invention.
Un deuxième objet de l'invention est un antigène qui se lie de manière
spécifique à
l'anticorps selon le premier objet, à l'exception des antigènes qui se lient
aussi à des
anticorps induits par T. cruzi et qui sont codés génétiquement par le parasite
T. cruzi,
c'est-à-dire à l'exception des antigènes comportant la séquence SEQ ID N 1.
Un troisième objet est l'utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant
la
séquence
Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N 2),
et de préférence la séquence
Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N 3),
et encore plus préférentiellement la séquence SEQ ID N 1, pour la détection
et/ou la
précipitation des anticorps selon le premier objet, pour autant que ledit
peptide ou
ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps. En
particulier,
ledit peptide ou ladite protéine peut être un peptide TCSP ou un variant du
peptide
TCSP, pour autant que ledit variant présente une activité spécifique vis-à-vis
des
anticorps selon le premier objet de ('invention.
Lesdits anticorps peuvent se lier à des antigènes d'un agent infectieux, d'un
allergène
et/ou d'un auto-antigène ; ledit agent infectieux peut être un agent
pathogène, et la
présence desdits anticorps est alors lié à une maladie infectieuse ou auto-
immune.
Ledit agent pathogène peut aussi être sélectionné dans le groupe formé par les
prions,
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les virus, les procaryotes, des eucaryotes unicellulaires ou multicellulaires.
Ladite
maladie infectieuse ou auto-immune peut être sélectionnée dans le groupe formé
par
la cardiomyopathie, la myocardite, le lupus érythémateux systémique.
5 Un autre objet de l'invention est un procédé pour la détection d'anticorps
selon le
premier objet dans un échantillon liquide, ce procédé comprenant les étapes
suivantes :
(a) Mettre un échantillon biologique, de préférence un échantillon de fluide
corporel et/ou de liquide surnageant d'une culture cellulaire ( échantillon
liquide ), en contact avec un peptide ou une protéine comportant la
séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, ou avec un peptide TCSP
ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite
protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon la
revendication 1 ;
(b) Déterminer la liaison dudit anticorps selon la revendication 1 dans ledit
échantillon liquide avec ledit peptide ou ladite protéine à l'aide d'un ou
plusieurs marqueurs appropriés, aptes à déterminer le complexe formé
entre ledit peptide ou protéine et l'anticorps selon la revendication 1.
Ledit marqueur peut être sélectionné dans le groupe constitué par les
marqueurs de
chemoluminescence, les marqueurs d'agglutination, les marqueurs de membranes,
les
marqueurs immunoenzymatiques, les marqueurs radioactifs.
Encore un autre objet de l'invention est un kit ou dispositif pour mettre en
oeuvre le
procédé selon l'objet précédent, comprenant :
(a) une quantité déterminée d'un ou plusieurs peptides et/ou protéines
comportant la séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, et/ou d'un
peptide TCSP ou d'un variant du peptide TCSP, pour autant que lesdits
peptides ou lesdites protéines présentent une activité spécifique vis-à-vis
des
anticorps selon le premier objet de l'invention ;
(b) un ou plusieurs marqueurs appropriés, aptes à déterminer le complexe formé
entre ledit peptide ou protéine et l'anticorps selon le premier objet de
l'invention ;
(c) optionnellement, un support solide, de préférence imprégné par ledit
peptide
ou ladite protéine.
Ledit marqueur peut être sélectionné dans le groupe constitué par les
marqueurs de
chemoluminescence, les marqueurs d'agglutination, les marqueurs de membranes,
les
marqueurs immunoenzymatique, les marqueurs radioactifs.
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Encore un autre objet est une méthode d'immunodiagnostic comportant une étape
de
détection qualitative ou quantitative des anticorps selon le premier objet par
l'utilisation
d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 2,
SEQ
ID N 3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que
ledit
peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des
anticorps selon
le premier objet.
Encore un autre objet est une méthode pour réduire le taux d'anticorps selon
le
premier objet dans un échantillon de fluide biologique, tel qu'un échantillon
sanguin, ou
dans un flux de fluide biologique, tel qu'un fluide sanguin, comportant une
étape de
précipitation desdits anticorps à l'aide d'un peptide ou d'une protéine
comportant la
séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, ou avec un peptide TCSP ou un
variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine
présente une
activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet.
On peut également utiliser le peptide TCSP ou ses variants pour l'obtention
d'anticorps
ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA
(Non-
Cruzi-Related Antibody, i.e. un anticorps non induit par T. cruzi) ; cela
constitue encore
un autre objet de l'invention.
Les peptides ou protéines comportant l'une des séquences peptidiques (SEQ ID N
1,
SEQ ID N 2 et SEQ ID N 3) peuvent être utilisés pour identifier voire isoler
les
immunogènes qui induisent les anticorps NCRA. Des méthodes informatiques de
recherches d'homologies de séquences utilisant des algorithmes élaborés
peuvent
servir d'outils pour l'identification de candidats immunogènes. Lesdits
candidats
immunogènes peuvent être synthétisés puis testés pour leurs réactivités avec
des
échantillons biologiques suspectés de contenir des NCRA. L'utilisation d'un
peptide ou
d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, ou
d'un
peptide TCSP ou d'un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou
ladite
protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le
premier objet
de l'invention, pour identifier ou isoler un agent pathogène qui se lie
spécifiquement
aux NCRA ou qui est reconnu spécifiquement par NCRA, forme un autre objet de
la
présente invention. Cette interaction découle d'une homologie entre l'agent
pathogène
et le TCSP ou du variant de ce dernier.
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Encore un autre objet de l'invention est représenté par l'utilisation d'un
peptide ou
d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, ou
d'un
peptide TCSP ou d'un variant d'un peptide TCSP, pour autant que ledit peptide
ou
ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon
le premier
objet de l'invention, pour l'obtention d'anticorps ou fragments d'anticorps
ayant une
activité de liaison équivalente au NCRA.
Un dernier objet de l'invention est une préparation pharmaceutique comprenant
des
anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente
au NCRA,
une solution injectable pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un ou
plusieurs excipients (tels que du polysorbate et/ou de la saccharose) ou
additifs, lesdits
anticorps ou fragments d'anticorps ayant été obtenus soit par une utilisation
selon le
troisième objet dans un organisme vivant, conduisant à l'immunisation dudit
organisme
contre le peptide TCSP, soit par criblage en utilisant le TCSP sur une banque
de
bactériophages qui expriment des anticorps spécifiques.
Figures
La figure 1 montre la distribution de l'intensité d'un signal lié à la
présence d'anticorps
qui se lient de manière spécifique au peptide TCSP, et qui ne sont pas
nécessairement
liés à une infection par T. cruzi (ces anticorps étant appelés NCRA, Non-Cruzi-
Related
Antibodies). Ces données proviennent d'un essai épidémiologique impliquant un
nombre N de patients appartenant à quatre groupes
DS = Donneurs sains (i.e. des donneurs de sang surveillés et
sélectionnés, qui ont donc un état de santé meilleur que la
moyenne de la population générale)
VIH Afrique : Patients africains qui réagissent positifs à un dépistage du
virus
VIH.
VIH Occidentaux : Patients occidentaux qui réagissent positifs à un dépistage
du
virus VIH.
Chagas : Patients infectés par T. cruzi.
Les données contenues dans ce tableau proviennent de dosages de type ELISA.
Elles
sont représentées numériquement dans les tableaux 1 et 2.
La figure 2 montre les résultats d'une étude épidémiologique sur 79 patients,
à savoir
le taux de NRCA en fonction du temps (en années) depuis l'inclusion des
patients dans
l'étude.
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Description
1. Définitions
Dans le cadre de la présente invention, les termes suivants prennent un sens
particulier :
L'expression maladie de Chagas désigne un état pathologique causé par
l'infection
avec le parasite Trypanosoma Cruzi, par voie parentérale ou non.
L'expression maladie autre que Chagas désigne tout état pathologique non
causé
par le parasite Trypanosoma Cruzi, et qui entraîne une réactivité accrue des
anticorps
contre un antigène nouveau, appelé ici TCSP, défini ci-dessous.
Nous entendons par acide aminé les acides aminés naturels et les acides
aminés
non naturels. Les acides aminés naturels comprennent la forme L des acides
aminés qui peuvent être trouvés dans des protéines d'origine naturelle, c'est-
à-dire :
alanine (A), arginine (R), asparagine (N), acide aspartique (D), cystéine (C),
glutamine
(Q), acide glutamique (E), glycine (G), histidine, (H), isoleucine (I),
leucine (L), lysine
(K), méthionine (M), phénylalanine (F), proline (P), sérine (S), thréonine
(T),
tryptophane (W), tyrosine (Y) et valine (V).
Les acides aminés non naturels comprennent la forme D des acides aminés
naturels, les formes homo de certains acides aminés naturels (tels que :
arginine,
lysine, phénylalanine et sérine), et les formes nor de la leucine et de la
valine. Ils
comprennent aussi d'autres acides aminés synthétiques.
Les composés peptidiques comprennent notamment les. peptides et les
polypeptides, y compris des dérivés obtenus par exemple par glycosylation,
acétylation, phosphorylation, réaction avec des acides gras. Ce terme inclut
également
des protéines et peptides d'origine naturelle.
Le terme anticorps comprend les anticorps polyclonaux et monoclonaux. Le
terme
anticorps monoclonal désigne une composition d'anticorps présentant une
population homogène, quel que soit l'espèce, l'origine et le procédé
d'obtention de cet
anticorps. Par ailleurs, le terme anticorps inclut les anticorps humains
dans
lesquels au moins une partie des domaines de l'immunoglobuline est présente,
tels
que les fragments d'anticorps et les domaines dits VHVL (Variable Heavy and
Variable
Light Chains), et les mini-anticorps.
L'expression NCRA ou anticorps NCRA (Non-Cruzi-Related Antibodies)
désigne des anticorps qui se lient de manière spécifique à l'antigène TCSP, et
qui ne
sont pas induits dans un hôte suite à son infection par T. cruzi.
Les expressions TCSP (Trypanosoma Cruzi Synthetic Peptide), antigène
TCSP , peptide TCSP ou protéine TCSP signifient toutes un nouveau
peptide
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tel que défini par l'invention, qui comporte une séquence d'acides aminés que
l'on
trouve également dans les protéines TCR70 et TCR69, à savoir SEQ ID N 1,
définie
ci-dessous, qui peuvent être isolés dans T. cruzi, et qui agit comme un
antigène avec
NCRA, ainsi que toutes les variantes et équivalents fonctionnels, tels que ses
épitopes
linéaires ou non-linéaires reconnus par NCRA comme défini ci-dessus. La
structure
minimale de l'épitope correspond à la SEQ ID N 2, définie ci-dessous.
Le terme auto-antigène se réfère à un épitope présent dans une molécule
endogène de l'hôte, et qui peut être reconnu par le système immunitaire dudit
hôte,
pour éventuellement déclencher une réponse immunitaire. Ce mécanisme peut
conduire à une maladie auto-immune , définie ici comme un état pathologique
causé par une réponse immunitaire non souhaitée d'un hôte contre un auto-
antigène
(appelé aussi auto-épitope).
Le terme agent infectieux se réfère ici à tout agent, vivant ou non,
capable de
déclencher une réponse immunitaire. Plus particulièrement, il se réfère aux
agents
pathogènes, aux allergènes et haptènés. Les agents pathogènes comprennent
notamment les prions, les virus, les procaryotes, les eucaryotes, isolés ou
non. Les
allergènes comprennent toutes substances, 'ou molécules capablës de provoquer
spontanément une réponse immunitaire dans. un hôte lorsque ledit hôte est
exposé
auxdites substances ou molécules.
Le terme fluide biologique se.r"éfère au liquide corporel d'un organisme
vivant, tel
qu'un patient humain, c'est-à-dire tout liquide prélevé sur un patient, tel
que le sérum,
le plasma, le sang total, l'urine, le liquide céphalo-rachidien, la salive, ou
encore au
liquide surnageant d'une culture cellulaire.
2. Description détaillée
Selon l'invention, le problème est résolu par l'utilisation d'un nouvel
anticorps qui réagit
avec un nouvel antigène (TCSP), dérivé d'une protéine d'un parasite
unicellulaire
cause de la maladie de Chagas, le Trypanosome Cruzi (T. cruzi). La
particularité de
cette invention réside dans la reconnaissance spécifique de l'antigène TCSP
par des
anticorps non reliés au parasite T. cruzi (appelés anticorps NCRA), donc
n'ayant pas
été induits par le dit antigène. Ce phénomène de reconnaissance hétérologue
s'explique par le mimétisme structural de l'antigène TCSP avec un autre
immunogène,
endogène ou exogène, ayant immunisé l'individu et induit les NCRA.
La séquence peptidique de l'antigène TCSP est dérivée d'une protéine connue et
présente dans les bases de données Swissprot, Uniprot et TrEMBL (Accession
Q7M3W 1). Cette protéine est connue sous le nom de TCR69; elle est similaire à
la
protéine TCR70.
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Selon l'invention, la séquence peptidique de la protéine utilisée pour définir
l'anticorps
NCRA, exprimée en codes acides-aminés à trois lettres, est :
Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-Val
(SEQ ID N 1).
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Les variants immunoréactifs de ce peptide sont également retenus dans le cadre
de la
présente invention, pour autant qu'ils montrent les mêmes propriétés
antigéniques. Les
variants d'une séquence peptidique peuvent être obtenus par exemple par
substitution
d'un ou plusieurs acides aminés par d'autres entités chimiques, à condition de
10 conserver la bioactivité de la séquence d'origine ; ils peuvent être
obtenus aussi par
addition de composés chimiques tels que la biotine ou de polymères naturels ou
synthétiques, tels que la polylysine ou le polysaccharide. Tous ces variants
qui
conservent la bioactivité des séquences d'origine sont couverts par la
présente
invention.
Ces variants peuvent notamment être constitués par la séquence
Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N 2)
et de préférence la séquence
Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N 3).
Cette séquence peut être répétée une ou plusieurs fois, et lors de cette
répétition,
l'unité terminale (au sens C-terminale ) d'alanine peut être substituée par
une unité
de thréonine, comme dans SEQ ID N 1. Les peptides constitués par ces
séquences
montrent également cette même bioactivité et peuvent être utilisés dans le
cadre de la
présente invention.
Le TCSP peut être obtenu par purification à partir d'extrait de protéines du
parasite T.
cruzi, conduisant typiquement aux protéines TCR69 ou TCR70 (voir la
publication de
Hoft et al., citée ci-dessus), qui présentent les séquences SEQ ID N 1, SEQ ID
N 2 et
SEQ ID N 3. Le TCSP et ses variantes peuvent aussi être issus d'une synthèse
chimique (par exemple selon la méthode de Merrifield, bien connue de l'homme
du
métier). Ils peuvent également être obtenus par une technologie de clonage
moléculaire, tel que l'ADN recombinant, impliquant l'expression protéique dans
des
systèmes d'expression microbiens après insertion d'une séquence nucléotidique
codant pour la séquence du peptide, suivie d'une culture, extraction et
purification du
peptide d'intérêt.
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Les antigènes TCSP et ses variantes ne sont pas utilisables pour le dépistage
de la
maladie de Chagas car ils conduisent à des réactions faussement positives. Les
inventeurs ont découvert que le TCSP interagit d'une manière spécifique avec
le
NCRA. Cela veut dire que le TCSP comporte une séquence peptidique spécifique,
qui
est capable de se lier au NCRA. Cette liaison peut être détectée par toute
méthode
connue, telle que la chemiluminescence, les méthodes d'agglutination, les
méthodes
immunoenzymatiques ou radioactives.
L'anticorps biomarqueur est présent dans les fluides biologiques, et sa
présence
corrélée à des symptômes cliniques chez des patients atteints de
cardiomyopathie, par
exemple, les sujets infectés par le VIH ayant développé des complications
cardiaques.
La présente invention concerne la séquence peptidique du TCSP ainsi que tout
analogue structural capable de se lier au même anticorps biomarqueur et qui ne
sont
pas nécessairement induits par le parasite T. cruzi (NCRA). L'invention
concerne
également une méthode de dosage immunologique, pour la détection et la
surveillance
des myocardites et des cardiomyopathies chez des patients suite une infection
ou une
inflammation auto-immune.
Un mode de réalisation de l'invention est une méthode pour déterminer, de
manière
qualitative ou quantitative, le taux de NCRA dans un échantillon biologique,
comprenant les étapes suivantes :
a) Obtention d'un échantillon biologique, tel que le sérum, le plasma, le sang
total,
l'urine, le liquide céphalo-rachidien, la salive, un échantillon de biopsie,
ou
encore le liquide surnageant d'une culture cellulaire ;
b) Détermination du taux de NCRA dans cet échantillon biologique.
L'échantillon biologique peut se présenter sous une forme liquide, gel, ou
solide. Il peut
provenir d'un patient ou de cultures in vitro.
La présente invention se rapporte également à la surveillance du traitement
des
cardiomyopathies, par la détermination du taux de NCRA. En effet, la méthode
décrite
ci-dessus peut s'appliquer également `à l'estimation de la probabilité de mort
foetale
causée par un arrêt cardiaque in-utéro, en raison de la présence des NCRA chez
les
femmes enceintes. En effet, le passage trans-placentaire de ces anticorps peut
endommager les cellules cardiaques au cours de l'embryogenèse. Leurs effets
sont
d'autant plus significatifs que le tissu cardiaque est encore primitif. Dans
cette
méthode, on obtient un échantillon d'un liquide biologique du patient, qui est
une
femme enceinte, et on détermine le taux de NCRA dans cet échantillon.
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En outre, le dosage des NCRA peut conduire à une stratégie thérapeutique chez
des
patients atteints de cardiomyopathies ou au développement d'un vaccin contre
cette
maladie. A l'heure actuelle, la nature de l'immunogène induisant les anticorps
biomarqueurs n'est pas connue ; toutefois la séquence de TCSP divulguée dans
la
présente invention peut conduire à la caractérisation de l'étiologie de la
maladie, à
l'isolement d'un agent infectieux ou non infectieux induisant les dits NCRA
chez les
sujets humains n'ayant pas été en contact avec le parasite T. cruzi, et
contribuer ainsi
à l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques.
A titre d'exemple, des anticorps ou fragments d'anticorps anti-TCSP peuvent
être
conçus de façon à empêcher, par compétition, la liaison des NCRA à leur site
cible
biologique et inhiber ainsi leurs effets pathogènes. La conception de tels
anticorps
compétiteurs est rendue possible par cette découverte.
D'autre part, la mesure des NCRA de façon longitudinale (chez le même patient
au
cours du temps), peut indiquer une évolution de.la cardiomyopathie et
l'efficacité de
son éventuel traitement. La soustraction de ces mêmes NCRA à la circulation
sanguine, e.g. par des techniques d'immunoadsorption, peut réduire voire
supprimer
totalement leurs effets pathogènes.
L'invention est basée sur la découverte surprenante des propriétés
antigéniques d'une
protéine isolée à partir du parasite T. cruzi chez des sujets, qui n'ont
jamais été en
contact avec ce parasite. En effet, l'antigène TCSP montre une activité
hétérospécifique exceptionnelle avec des NCRA qui sont. répandus chez des
sujets
humains vivants en dehors des régions endémiques du parasite. Il s'agit
clairement
d'un mécanisme de mimétisme peptidique ; ces anticorps. induisent des
réactions
faussement positives lors d'un test de dépistage de la maladie de Chagas.
Ce mécanisme permet au peptide TCSP de se lier spécifiquement aux NCRA dirigés
contre des auto-antigènes ou contre des agents infectieux autres que T. cruzi.
Par
conséquent, un mode de réalisation de la présente invention a pour objet
d'employer le
polypeptide TCSP ou ses variants immunoréactifs, pour la détection de NCRA.
Ces
anticorps NCRA peuvent également se lier à des auto-antigènes, ou à des
antigènes
d'organismes infectieux avec plus ou moins d'affinité et de spécificité que
celles de la
liaison au TCSP.
Plus spécifiquement, la présente invention fournit un polypeptide comme décrit
ci-
dessus, pour l'identification ou l'isolement d'un agent infectieux ou non
infectieux
induisant des anticorps qui à leur tour peuvent causer une maladie auto-
immune. La
présente invention fournit également un polypeptide comme décrit ci-dessus, où
ledit
agent infectieux est un virus ou un microbe relativement répandu parmi les
sujets
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humains apparemment en bonne santé et largement répandu notamment chez des
sujets infectés par VIH, tels que les mycoplasmes ou d'autres agent
d'infections
opportunistes. La présente invention permet également d'employer un
polypeptide
comme décrit ci-dessus, où la dite maladie auto-immune est choisie parmi
celles
décrites dans des pathologies cardiaques telles que des cardiomyopathies et la
myocardite. En outre, la présente invention fournit une méthode pour la
détection des
anticorps contre le polypeptide TCSP, en mettant en contact le TCSP, ou un
variant,
avec les NCRA présents dans un échantillon de fluide biologique, la détection
de la
liaison des NCRA dans le dit échantillon biologique par des méthodes connues
par
l'homme du métier.
En outre, la présente invention fournit une méthode d'analyse pour la
détection des
anticorps contre le polypeptide TCSP, comportant des réactifs ou outils
permettant de
déceler la liaison antigène-anticorps à l'aide de méthodes connues par les
scientifiques
du métier de l'immunoanalyse. Dans encore un autre. mode de réalisation de la
présente invention, on emploie le polypeptide TCSP ou ses. variants, pour
autant que
ces derniers présentent une activité spécifique vis-à-vis des NCRA,.pour
améliorer la
spécificité des analyses de dépistage sérologique de la maladie de Chagas. Il
ressort
clairement des résultats montrés sur la figure 1 que les NCRA, décelés lors
des tests
de dépistage, peuvent être d'une origine autre que celle d'une infection par
le parasite
T. cruzi. Par conséquent, l'inhibition de' ces anticorps par l'antigène TCSP
peut
améliorer la spécificité des tests de diagnostic de la maladie de Chagas.
Les tests d'immunoréactivité dans la présente invention ont été réalisés par
une
technique ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), connue de l'homme du
métier ; cependant toute autre technique permettant de détecter ou mesurer la
liaison
antigène-anticorps peut également s'appliquer à la présente invention,
notamment
pour mettre en oeuvre la nouvelle méthode d'immunodiagnostic qui forme un des
objets de l'invention.
Un autre aspect de l'invention est l'utilisation thérapeutique du peptide TCSP
ou de ses
variants pour l'obtention d'anticorps ou fragments. d'anticorps ayant une
activité de
liaison équivalente au NCRA. Dans cette utilisation, on prépare d'abord des
anticorps
ou fragments d'anticorps par inmmunisation d'un organisme vivant (par exemple
d'animaux) contre le peptide TCSP. Ensuite, on prépare une préparation
pharmaceutique comprenant ces anticorps ou fragments d'anticorps, une solution
injectable pharmaceutiquement acceptable et éventuellement des adjuvants (tels
que
du polysorbate, du saccharose).
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Ensuite, cette préparation pharmaceutique est administrée (par exemple
injectée) à un
patient pour entrer en compétition avec les NCRA pathogènes. Ainsi le taux de
NCRA
pathogène est diminué, et les symptômes cliniques du patient s'améliorent.
Encore un autre aspect de l'invention est une méthode pour réduire le taux
d'anticorps
selon l'invention dans un échantillon de fluide biologique, et notamment d'un
échantillon sanguin ou dans un flux sanguin, comportant une étape de rétention
desdits anticorps à l'aide d'un peptide ou d'une protéine comportant la
séquence SEQ
ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du
peptide
TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité
spécifique
vis-à-vis des anticorps selon l'invention. Cette méthode peut être mise en
oeuvre dans
un but de diagnostic, dans un but de traitement d'une quantité de fluide
biologique ou à
des fins thérapeutiques par plasmaphérèse. Elle peut être mise en oeuvre de
manière
statique ou dans un flux dudit liquide biologique. De préférence, elle est
mise en
oeuvre comme une méthode d'immunoadsorption: Dans un mode de réalisation
typique, le fluide biologique entre en contact avec un support solide sur
lequel est fixé
ledit peptide ou ladite protéine ou ladite protéine comportant la séquence SEQ
ID N 1,
SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, ou ledit peptide TCSP ou un variant dudit peptide
TCSP.
Les anticorps, s'ils sont présents, précipitent alors sur ce support solide et
sont retirés
du fluide biologique.
Un autre aspect de l'invention est une préparation pharmaceutique comprenant
des
anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente
au NCRA,
une solution injectable pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un ou
plusieurs adjuvants (tels que du polysorbate et/ou du saccharose). Ces
anticorps ou
fragments d'anticorps peuvent être obtenus de différentes manières. Dans un
mode de
réalisation, ils peuvent être obtenus par criblage en utilisant le TCSP sur
une banque
de bactériophages qui expriment des anticorps spécifiques. Dans un autre mode
de
réalisation, ils peuvent être obtenus dans un organisme vivant, en utilisant
un peptide
ou protéine comportant la séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 3
pour
la détection des anticorps qui se lient de manière spécifique à un peptide
comportant la
séquence SEQ ID N 1 et qui ne sont pas induits dans un hôte suite à son
infection par
T. cruzi, ladite utilisation conduisant à l'immunisation dudit organisme
contre le peptide
TCSP.
Encore un autre aspect de l'invention est l'utilisation du TCSP, et notamment
du TCSP
comportant la séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 3, dans une
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composition de vaccin, permettant d'immuniser un humain au moins partiellement
contre une maladie autre que la maladie de Chagas, et notamment contre la
cardiomyopathie auto-immune, la myocardite et le lupus érythémateux
systémique.
Cette vaccination peut se faire par injection d'une dose unique ou d'une
pluralité de
5 doses. Dans ces compositions, le TCSP peut être utilisé tel quel, en tant
que peptide,
ou bien sous forme biotinylée et / ou liée à un dérivé de l'avidine, et
notamment à un
dérivé de l'avidine obtenu par modification chimique et enzymatique connu sous
le
nom NeutraLite Avidin. Ladite composition peut comporter des solvants,
additifs,
tampons et porteurs pharmacologiquement acceptables, ainsi que, le cas
échéant,
10 d'autres principes actifs.
Selon un autre aspect de l'invention, on utilise un peptide ou d'une protéine
comportant
la séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, ou un peptide TCSP ou un
variant
du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une
activité
15 spécifique vis-à-vis des anticorps selon l'invention, pour identifier w
isoler un agent
pathogène qui se lie spécifiquement aux NCRA ou qui est'reconnu spécifiquement
par
NCRA. Cette nouvelle méthode permet d'identifier les agents pathogènes
susceptibles
d'induire des maladies, autres que la maladie de Chagas, qui induisent la
formation de
NCRA.
Dans certaines des utilisations du TCSP selon l'invention, il peut être
avantageux de
marquer le TCSP, par exemple à l'aide d'un chromophore ou d'un fluophore, ou
d'une
autre entité chimique facilement détectable (enzyme, isotope radioactif,
biotine,
haptène, etc.).
Exemples :
Les exemples qui suivent illustrent certains aspects de l'invention, sans la
limiter.
1) Exemples d'études de groupe
Exemple 1 :
Ces exemples correspondent à des essais de dépistage effectué sur un nombre N
de
plusieurs populations d'humains. Les tableaux 1 et 2 ainsi que la figure 1
montrent des
résultats de ces essais de dépistage. Nous décrivons ici la technique de
diagnostique
ELISA employée pour ces essais, ainsi que les étapes successives des essais
Technique ELISA:
Le peptide TCSP, représenté par un peptide synthétique de séquence SEQ ID N
1, a
été adsorbé sur des microplaques en polystyrène à une concentration de 1
pg/mI. Les
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sites de fixations libres ont ensuite été saturés par des protéines
immunologiquement
neutres (en l'occurrence l'albumine). Les microplaques ont ensuite été rincées
par un
tampon de lavage, puis séchées pour être prêtes à l'emploi. Les échantillons à
tester
ont été incubés dans les puits après dilution au 1/20ème dans un tampon de
dilution ;
les anticorps non fixés sur la surface antigénique ont été éliminés par trois
cycles de
lavage. Les anticorps spécifiques du TCSP fixés sur les microplaques ont été
décelés
par un anticorps dirigé contre les IgG humaines et marqués par un traceur
enzymatique. Un substrat chromogène de l'enzyme employé a servi à révéler la
fixation de l'anti-TCSP par mesure de la densité optique correspondante à
l'absorption
du chromogène dans une gamme adéquate de longueurs d'ondes, et notamment à
une longueur d'onde d'environ 450 nm.
1. Réaction du peptide TCSP avec les NCRA présents dans des sérums issus de
patients infectés par le VIH :
Les échantillons sériques de patients infectés par le VIH ont été testés pour
la
présence de NCRA, pour deux populations : patients africains et patients
occidentaux
(sources européennes et américaines).
2. Réaction du peptide TCSP avec des sérums issus de donneurs de sang
sains , i.e. négatifs pour les anticorps ânti-VIH, anti-VHC, anti-VHB,
Syphilis.
Pour évaluer la prévalence des anticorps contre TCSP, sur la base de
l'hypothèse que
ces anticorps n'ont pas été induits par une infection avec T. cruzi, des
échantillons de
sérum européens ont été utilisés. Ces sérums ont été obtenus par des donneurs
de
sang sains, comme indiqué ci-dessus ; ces donneurs sont donc dans un meilleur
état
de santé que la moyenne de la population dont ils sont issus.
Afin d'être parfaitement certain quant à l'origine de ces anticorps contre
TCSP, tous les
échantillons ont été testés dans un ordre aléatoire à l'aide de kits
commercialement
disponibles permettant de détecter une infection par T. cruzi ; aucun
échantillon positif
n'a été trouvé. En revanche, et de manière totalement inattendue, il a été
trouvé qu'un
pourcentage significatif de ces échantillons contenait néanmoins des anticorps
contre
TCSP. On en déduit que T. cruzi utilise un motif hautement immunogène qui
pourrait
être utilisé également par d'autres pathogènes, et/ou qui pourrait donner lieu
à des
anticorps auto-immuns.
3. Réaction du peptide TCSP avec les NCRA présents dans des sérums de
patients : par une mise en interaction des échantillons de sérums et des
surfaces
solides sur lesquelles le TCSP a été préalablement adsorbé.
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4. Réaction du TCSP avec les sérums de patients infectés par le parasite T.
cruzi :
Etant donné que l'antigène TCSP est dérivé d'une protéine du parasite T.
cruzi, il est
difficile, par des techniques classiques, de distinguer les anticorps induits
par l'infection
par T. cruzi de ceux induits par le mécanisme d'autoimmunité (NCRA). Dans un
test
ELISA employant le TCSP comme antigène, on a trouvé que les deux catégories
d'anticorps sont confondues ; le résultat EIA n'est pas discriminant.
Les résultats sont documentés dans les Tableaux 1 et 2 ainsi que sur la figure
1. Cette
figure montre pour chaque population de N patients la distribution de la
réactivité
(exprimée en densité optique) de NCRA avec le peptide TCSP utilisé pour
l'essai. Sont
représenté pour chacune des populations la distribution des points individuels
; les
rectangles (boîtes) représentent les intervalles semi-interquartiles (en
anglais
interquartile ranges ). Les traits horizontaux pleins représentent la moyenne
arithmétique de chacune des populations, et les traits horizontaux en
pointillé
délimitent 95% de la distribution.
Tableau 1
Intervalle de
Nombre Erreur
Catégories de patients N Moyenne confiance 95% standard Ecart-type
(min/max)
Donneurs sains 576 0,2833 0,2531, 0,3134 0,01535 0,36843
Africains VIH 192 0,8167. 0,7708 0,8627 0,02330 0,32281
Occidentaux VIH 192 0,9976 0,9417 1,0535 0,02834 0,39274
Patients Chagas 96 0,8228 0,7083 0,9372 0,05766 0,56490
Tableau 2
Catégorie des Valeur 1 er Valeur Intervalle de 3eme Valeur
N confiance 95% IQR
patients mini quantile médiane (min/max) quartile maxi
Donneurs
sains 576 0,026 0,0400 0,0795 0,0640 0,0970 0,4076 1,614 0,3676
Africains VIH+ 192 0,050 0,6393 0,8575 0,8200 0,9020 0,9988 1,762 0,3595
Occidentaux
VIH+ 192 0,063 0,7808 1,0470 1,0000 1,1000 1,2193 2,150 0,4385
Patients
96 0,037 0,2873 0,7055 0,5950 0,9810 1,2640 2,111 0,9768
Chagas
IQR en anglais inter quartile range ) signifie l'intervalle semi-inter
uartile.
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Exemple 2:
Dans une autre étude de groupe de N = 79 patients infectés par le VIH, on a
constaté
(voir la figure 3) une nette relation entre l'augmentation des mesures de NCRA
et
l'évolution chronologique de ces patients sur une échelle de temps allant au-
delà de
deux ans.
Cette étude démontre que la surveillance des taux de NCRA peut permettre le
pronostic de l'évolution de l'infection par le VIH et ses conséquences en
terme de
complications cardiaques.
2) Exemples de cas individuels (essais cliniques)
Dans des études transversales, on a mesuré le taux de NCRA chez des patients
de
sexe masculin infectés par le VIH, et on a pu étudier leur condition
cardiaque. Le
tableau 3 illustre ces résultats. A titre d'exemple, on note pour le patient
PAT-001 la
présence d'un titre fort en NCRA (à savoir : 8,19 dans un échantillon de sang
prélevé
antérieurement à son évènement cardiaque.
Ces exemples montrent, d'une part, la relation entre les titres mesurés
de,NCRA et des
évènements cardiaques ultérieurs (voir PAT_001, PAT_004, PAT-005), et d'autre
part
la possibilité qu'un évènement cardiaque sub-clinique puisse induire
l'apparition de
NCRA à forte dose (voir PAT_009).
Tableau 3
VIH-1 Cellules Charge
Numéro année de CD4 Virale Données NCRA Sérum testé
patient naissance Copies/ cliniques
Stade CDC [nombre % I cardiologiques Signal / (date de
mm3] ml-] bruit prélèvement)
Infarctus du
PAT_001 1944 (20/1 005) 1110 50 myocarde 15/11/2004
le 05/03/2006 8,19
Evènement
PAT_004 1963 (03/12/2002) 512,5 50 cardiologique 03/09/2004
le 07/03/2005 2,21
Infarctus du
PAT_005 1957 (18/06/2003) 333,7 40. myocarde 09/09/2008
le 14/12/2008 2,56
Infarctus sans
PAT_009 1945 (03/051994) 488,8 50 antonde Q érieure 23/09/2004
le 03/11/2000 25,15
