METHODS FOR DIAGNOSIS AND THERAPEUTIC FOLLOW-UP OF MUSCULAR DYSTROPHIES

PROCEDES POUR LE DIAGNOSTIC ET LE SUIVI THERAPEUTIQUE DE DYSTROPHIES MUSCULAIRES

Abrégé français

L'invention concerne le diagnostic, le suivi et l'évaluation de l'efficacité d'un traitement d'une dystrophie musculaire par détection de microARN dans un liquide corporel, notamment dans l'urine.

Abrégé anglais

The invention relates to the diagnosis, the follow-up and the evaluation of the efficacy of a treatment of a muscular dystrophy by detection of microRNA in a body fluid, in particular in the urine.

Revendications

27
REVENDICATIONS
1. Procédé pour le diagnostic ou pour l'évaluation du risque de développer ou
présenter une
dystrophie musculaire chez un sujet, comprenant la mesure du niveau
d'expression d'au moins
un microARN dans un échantillon d'urine dudit sujet et la comparaison dudit
niveau
d'expression mesuré dans ledit échantillon d'urine à un niveau obtenu dans un
échantillon de
référence sain, une différence entre le niveau d"expression par rapport à
l'échantillon de
référence étant indicative d'une dystrophie chez le sujet.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le au moins un microARN est
choisi parmi les
let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-
15a,
miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-
224,
miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-
5p,
miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206,
miR-
335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-
505*, let-
7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346,
miR-155,
miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-
657,
miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p,
miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-
30d et
miR-30e-3p.
3. Procédé pour le diagnostic ou pour l'évaluation du risque de développer ou
présenter une
dystrophie musculaire chez un sujet, comprenant la mesure du niveau
d'expression dans un
échantillon de liquide corporel dudit sujet d'au moins un microARN choisi
parmi let-7f, let-
7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-
1244,
miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-
182,
miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-
216b,
miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-335, miR-33a*,
miR-
193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d,
let-7g, miR-
196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-
548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p
miR-

28
198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-
518e,
miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p.
4. Procédé de suivi de l'évolution d'une dystrophie musculaire comprenant la
mesure du
niveau d'expression d'au moins un microARN choisi parmi let-7f, let-7a, miR-
548d-5p, miR-
183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494,
miR-
668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492,
let-7c,
let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484,
miR-
23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-
34c-
5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b,
miR-942,
miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-
886-
3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220,
miR-
373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493,
miR-
151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p dans un second échantillon
de liquide
corporel d'un sujet, ce niveau dans l'échantillon du sujet étant comparé au
niveau dudit
microARN dans un premier échantillon de référence qui correspond à un
échantillon prélevé
antérieurement sur le même sujet;
l'évolution du niveau d'expression du ou des microARN choisis étant indicative
d'une
progression de la dystrophie musculaire.
5. Procédé pour déterminer l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une
dystrophie
musculaire chez un sujet, comprenant
a) la mesure du niveau d'expression dans un liquide corporel dudit sujet, d'un
ou plusieurs
microARN, moyennant quoi un niveau de référence est déterminé; puis
b) la mesure du niveau d'expression dudit au moins un microARN choisi dans
l'étape a) dans
un second échantillon de liquide biologique prélevé au même sujet à un temps
donné après
l'administration du traitement thérapeutique, moyennant quoi un niveau de test
est déterminé;
et
c) la comparaison des niveaux contrôle et de test, l'évolution du niveau
d'expression des
microARN choisis étant indicative d'un traitement efficace du sujet;
ledit ou lesdits miARN étant choisi(s) parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-
183, miR-490-
3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-
208,
miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e,
miR-15b,

29
miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-
376c,
miR-412, miR-433, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-
3p,
miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-
200b*, miR-
523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-
650, miR-
720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511,
miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-
192*,
miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, l'échantillon
étant un échantillon
d'urine.
7. Procédé pour (a) le suivi de l'évolution d'une dystrophie musculaire ou (b)
déterminer
l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une dystrophie musculaire chez un
sujet,
comprenant la mesure du niveau d'expression dans un échantillon d'urine dudit
sujet d'au
moins un microARN choisi parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-
3p, miR-
520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208,
miR-521,
miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b,
miR-
487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c,
miR-
412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p,
miR-628-
3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-
200b*,
miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-
650,
miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-
511,
miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-
192*,
miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ledit ou lesdits
microARN étant
choisi(s) parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p,
miR-590-
3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597,
miR-
874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b,
miR-410,
miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-
433,
miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-
659,
miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-
523, miR-
346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-
720, miR-

30
593, miR-657, miR-502-3p, miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-
517b,
miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g et miR-493.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ledit ou lesdits
miARN étant
choisi(s) parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p,
miR-590-
3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597,
miR-
874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b,
miR-410,
miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-
433,
miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381 et miR-34c-5p.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ledit ou lesdits
miARN étant
choisi(s) parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p,
miR-590-
3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597 et
miR-
874.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, le procédé
comprenant la
mesure de l'ensemble des miARN listés.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour le
diagnostic, l'évaluation
du risque, le suivi de l'évolution ou le suivi de l'efficacité d'un traitement
de la dystrophie
musculaire de Duchenne ou de la dystrophie musculaire de Becker, en
particulier de la
dystrophie musculaire de Duchenne.
13. Trousse comprenant des moyens de détection ou de dosage de microARN, les
moyens de
détection ou de dosage dans la trousse consistant en des moyens de détection
ou de dosage
d'un ou plusieurs miARN choisis parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183,
miR-490-3p,
miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-
208,
miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e,
miR-15b,
miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-
376c,
miR-412, miR-433, miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-
5p,
miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-
942, miR-
200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-
3p,
miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-
373,

31
miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-
5p,
miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p.
14. Trousse selon la revendication 13, chacun des miARN étant détectés ou
dosés au moyen
d'une sonde et/ou paire d'amorces spécifique.
15. Support multipuits pour PCR comprenant des paires d'amorces PCR consistant
en des
amorces spécifiques d'au moins deux miARN choisis dans le groupe constitué de
let-7f, let-
7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-
1244,
miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-
182,
miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-
216b,
miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206, miR-335,
miR-
33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-505*, let-7b,
let-7d,
let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346, miR-155, miR-
548b-
5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-657, miR-
502-
3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p, miR-
518b,
miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-30d et miR-
30e-
3p, chacune des paires d'amorce étant disposée dans un puits différent du
support.

Description

CA 02858465 2014-06-06
WO 2013/087907
PCT/EP2012/075665
1
PROCEDES POUR LE DIAGNOSTIC ET LE SUIVI THERAPEUTIQUE DE
DYSTROPHIES MUSCULAIRES
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne le diagnostic, le suivi et l'évaluation de l'efficacité
d'un traitement d'une
dystrophie musculaire par détection de microARN dans un liquide corporel,
notamment dans
l'urine.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les dystrophies musculaires de Duchenne (DMD) ou de Becker (BMD) sont causées
par des
mutations ou des délétions du gène codant la dystrophine (Muntoni, Torelli et
al. 2003). Dans
le premier cas, où le phénotype est le plus sévère, la dystrophine est
totalement absente. Le
complexe DAPC (Dystrophine Associated Protein Complex), qui permet de relier
les
filaments intracellulaires d' actine à la matrice extracellulaire (Le Rumeur,
Winder et al.), est
également manquant. Ce complexe protège habituellement la membrane des fibres
musculaires qui sont soumises aux contractions et aux relâchements. En son
absence, les
fibres ne sont plus protégées, on observe dans les muscles des cellules
musculaires en
dégénérescence et des nouvelles cellules qui témoignent d'une régénération
tendant à
contrebalancer le phénomène (Batchelor and Winder 2006). A terme, la
régénération est
insuffisante et les fibres sont remplacées par du tissus adipeux.
Sur le plan thérapeutique, de grands espoirs reposent actuellement sur la
technique du saut
d' exon (Cirak, Arechavala-Gomeza et al.; Lu, Yokota et al.). En effet, la
BMD, qui mène à un
phénotype moins grave, est également due à une ou plusieurs mutations dans le
gène codant
pour la dystrophine mais les domaines fondamentaux de la protéine sont
conservés :
- un domaine N-terminal de liaison aux filaments d' actine,
- un domaine C-terminal riche en cystéines qui se lie au complexe DAPC.
Pour les patients DMD, il est donc possible d'obtenir un phénotype Becker en
excluant les
exons porteurs de mutations non-sens au sein des ARN messagers (ARNm) et ainsi
rétablir le
cadre de lecture ouvert. La protéine produite, plus courte, est alors
partiellement
fonctionnelle. Cette stratégie est actuellement testée via plusieurs essais
cliniques.

CA 02858465 2014-06-06
WO 2013/087907
PCT/EP2012/075665
2
Une surveillance médicale régulière, pluridisciplinaire, permet d'évaluer
l'évolution de la
pathologie et de proposer une prise en charge permettant d'améliorer la vie
des patients. Il
s'agit de prévention des rétractions, d'apport d'aides techniques,
kinésithérapie, surveillance
cardiaque, orthopédie et aide respiratoire. Le suivi diagnostique est réalisé
entre autre par
l'évaluation des fonctions motrices, par des biopsies musculaires ou par le
dosage d'une
enzyme sécrétée dans la circulation, la créatine kinase (Bushby, Finkel et
al.).
L'analyse de biopsie musculaire permet d'observer les fibres lésées, des
fibres plus petites
témoignant de la régénération musculaire, ainsi que des zones de nécrose
remplacées par du
tissu adipeux. Cette méthode a pour inconvénient d'être très invasive pour le
patient.
Une autre méthode consiste à doser la créatine kinase (CK) dans le sang. Cette
enzyme est
liée au métabolisme énergétique présent dans plusieurs types de cellules.
L'augmentation de
sa concentration dans le sang témoigne de l'état de dégradation des fibres
musculaires.
Cependant, ce biomarqueur n'est pas totalement fiable car son niveau dépend
également de
stress comme l'activité physique (Nicholson, Morgan et al. 1986). Il existe
d'autres enzymes
telles que l'aldolase ou la lactate déshydrogénase mais, comme pour la CK,
leur abondance
n'est pas uniquement dépendante de l'état pathologique (Lott and Landesman
1984).
Par conséquent, il apparait nécessaire d'identifier de nouveaux biomarqueurs
plus fiables dans
le cadre de la dystrophie musculaire de Duchenne, marqueurs qui pourraient
être dosés à
partir de prélèvements non invasifs, comme le prélèvement d'urine.
Les microARN (ou miARN) sont des biomarqueurs prometteurs. Ils sont exprimés
dans tous
les tissus de l'organisme et notamment dans le muscle squelettique. On sait
également qu'ils
existent à l'état circulant dans tous les fluides biologiques (Weber,
Baxter et al.). Des
travaux récents de la littérature ont montré qu'il existait une signature
spécifique de la
myopathie de Duchenne dans le muscle (Cacchiarelli, Martone et al.; Greco, De
Simone et al.
2009) et dans le sérum (Cacchiarelli, Legnini et al.).
A ce jour, aucune étude n'a montré l'utilisation potentielle des miARN comme
marqueurs de
dystrophies musculaires dans l'urine. Les inventeurs ont étudié le profil de
présence de
miARN dans l'urine de patients atteints d'une dystrophie musculaire afin
d'identifier une
signature spécifique de ce type de pathologies.

CA 02858465 2014-06-06
WO 2013/087907
PCT/EP2012/075665
3
Par ailleurs, les inventeurs ont également recherché de nouveaux marqueurs
circulants des
dystrophie musculaires.
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont notamment étudié des échantillons d'urine de patients DMD
afin de
déterminer si des miARN spécifiques de cette pathologie pouvaient être
identifiés. Ces
travaux ont permis de mettre en évidence une signature spécifique relative à
l'abondance de
certains miARN dans l'urine de patients DMD par rapport à l'urine de donneurs
sains.
La constatation d'une telle variation de l'expression d'un ou plusieurs miARN
chez un
individu malade par rapport à un individu sain trouve une application dans le
domaine du
diagnostic. La présente invention se rapporte ainsi à l'utilisation d'au moins
un miARN choisi
parmi les miARN du tableau 1, pour la mise en oeuvre d'un procédé de
diagnostic d'une
dystrophie musculaire. Elle concerne par ailleurs l'utilisation d'un ou
plusieurs desdits miARN
pour l'évaluation du risque de développer ou présenter une dystrophie
musculaire.
Tableau 1:
miARN urinaire séquence seq id#
hsa-let-7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 1
hsa-let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 2
hsa-let-7c UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 3
hsa-let-7d AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 4
hsa-let-7e UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 5
hsa-let-7f UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 6
hsa-let-7g UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 7
hsa-miR-1244 AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGGUU 8
hsa-miR-139-5p UCUACAGUGCACGUGUCUCCAGU 9
hsa-miR-151-5p UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU 10
hsa-miR-155 UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU 11
hsa-miR-15a UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG 12
hsa-miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 13
hsa-miR-182 UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU 14
hsa-miR-183 UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU 15
hsa-miR-192* CUGCCAAUUCCAUAGGUCACAG 16
hs a-miR-193 a-3p AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU 17
hsa-miR-196b UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGGG 18
hsa-miR-198 GGUCCAGAGGGGAGAUAGGUUC 19
hsa-miR-200b* CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA 20

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hs a-miR-206 UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG 21
hs a-miR-208 AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU 22
hs a-miR-214 UGCCUGUCUACACUUGCUGUGC 23
hs a-miR-216b AAAUCUCUGCAGGCAAAUGUGA 24
hs a-miR-220 CCACACCCiUAUCUCiACACUUU 25
hs a-miR-224 CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU 26
hs a-miR-23a AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC 27
hs a-miR-23b AUCACAUUGCCAGGGAUUACC 28
hs a-miR-26b UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU 29
hsa-miR-28-5p AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG 30
hs a-miR-30d UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG 31
hs a-miR-30e-3p UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG 32
hs a-miR-328 CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU 33
hs a-miR-335 UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU 34
hs a-miR-33 a* CAAUGUUUCCACAGUGCAUCAC 35
hs a-miR-346 UGUCUGCCCGCAUGCCUGCCUCU 36
hs a-miR-34c-5p AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC 37
hs a-miR-373 ACUCAAAAUGGGGGCGCUUUCC 38
hs a-miR-376c GGUGGAUAUUCCUUCUAUGUU 39
hs a-miR-381 AGCGAGGUUGCCCUUUGUAUAU 40
hs a-miR-410 AAUAUAACACAGAUGGCCUGU 41
hs a-miR-412 ACUUCACCUGGUCCACUAGCCGU 42
hs a-miR-423 -5p UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU 43
hs a-miR-433 AUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGU 44
hs a-miR-484 UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU 45
hs a-miR-487b AAUCGUACAGGGUCAUCCACUU 46
hs a-miR-490-3p CAACCUGGAGGACUCCAUGCUG 47
hs a-miR-492 AGGACCUGCGGGACAAGAUUCUU 48
hs a-miR-493 UUGUACAUGGUAGGCUUUCAUU 49
hs a-miR-494 UGAAACAUACACGGGAAACCUC 50
hsa-miR-502-3p AAUGCACCUGGGCAAGGAUUCA 51
hs a-miR-505* GGGAGCCAGGAAGUAUUGAUGU 52
hs a-miR-511 GUGUCUUUUGCUCUGCAGUCA 53
hs a-miR-517b AUCGUGCAUCCCUUUAGAGUGU 54
hsa-miR-518a-3p GAAAGCGCUUCCCUUUGCUGGA 55
hs a-miR-518b CAAAGCGCUCCCCUUUAGAGGU 56
hsa-miR-518e AAAGCGCUUCCCUUCAGAGUG 57
hs a-miR-518f GAAAGCGCUUCUCUUUAGAGG 58
hsa-miR-520a-3p AAAGUGCUUCCCUUUGGACUGU 59
hs a-miR-520g ACAAAGUGCUUCCCUUUAGAGUGU 60
hs a-miR-521 AACGCACUUCCCUUUAGAGUGU 61
hs a-miR-523 GAACGCGCUUCCCUAUAGAGGGU 62

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PCT/EP2012/075665
hsa-miR-548b-5p AAAAGUAAUUGUGGUUUUGGCC 63
hsa-miR-548c-5p AAAAGUAAUUGCGGUUUUUGCC 64
hsa-miR-548d-5p AAAAGUAAUUGUGGUUUUUGCC 65
hsa-miR-590-3p UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU 66
hsa-miR-593 UGUCUCUGCUGGGGUUUCU 67
hsa-miR-597 UGUGUCACUCGAUGACCACUGU 68
hsa-miR-628-3p UCUAGUAAGAGUGGCAGUCGA 69
hsa-miR-650 AGGAGGCAGCGCUCUCAGGAC 70
hsa-miR-657 GGCAGGUUCUCACCCUCUCUAGG 71
hsa-miR-659 CUUGGUUCAGGGAGGGUCCCCA 72
hsa-miR-668 UGUCACUCGGCUCGGCCCACUAC 73
hsa-miR-720 UCUCGCUGGGGCCUCCA 74
hsa-miR-874 CUGCCCUGGCCCGAGGGACCGA 75
hsa-miR-886-3p CGCGGGUGCUUACUGACCCUU 76
hsa-miR-942 UCUUCUCUGUUUUGGCCAUGUG 77
L'invention concerne plus spécifiquement un procédé pour le diagnostic d'une
dystrophie
musculaire ou d'évaluation du risque de développer ou présenter une dystrophie
musculaire
chez un sujet, comprenant la mesure du niveau d'expression d'au moins un miARN
dans un
5 échantillon de liquide corporel (par exemple un échantillon d'urine)
dudit sujet. L'invention
peut notamment comprendre la comparaison dudit niveau d'expression mesuré dans
ledit
échantillon à un niveau obtenu dans un échantillon de référence sain, une
différence entre le
niveau d'expression par rapport au niveau de référence étant indicative d'une
dystrophie
musculaire chez le sujet.
L'invention concerne également un procédé pour le diagnostic d'une dystrophie
musculaire ou
pour l'évaluation du risque de développer ou présenter une dystrophie
musculaire, comprenant
la détermination dans un échantillon de liquide corporel (par exemple un
échantillon d'urine)
d'un sujet de la présence ou du niveau d'expression d'au moins un miARN choisi
dans le
groupe constitué des miARN listés dans le tableau 1.
La présente invention se rapporte notamment à un procédé de diagnostic d'une
dystrophie
musculaire, en particulier de la dystrophie musculaire de Duchenne, comprenant
la
comparaison:
a) du niveau d'expression d'au moins un miARN dans un échantillon de liquide
corporel (e.g.
d'urine) d'un sujet (échantillon test), le miARN étant choisi dans le groupe
constitué des
miARN du tableau 1, et

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b) du niveau d'expression dudit miARN dans un échantillon sain de référence,
une différence statistiquement significative entre le niveau d'expression dans
l'échantillon test
par rapport à l'échantillon de référence étant indicative d'une dystrophie
musculaire chez le
sujet.
Selon un aspect particulier, l'invention se rapporte à un procédé de
diagnostic d'une
dystrophie musculaire comprenant les étapes suivantes:
- mesure du niveau d'expression d'au moins un miARN choisi parmi les miARN
du tableau 1,
dans un échantillon de liquide corporel (en particulier d'urine) provenant
d'un sujet à tester
(par exemple un sujet suspecté de présenter une dystrophie musculaire); et
- la comparaison:
- entre le niveau d'expression d'au moins un desdits miARN dans ledit
échantillon et le
niveau d'expression dudit miARN dans un échantillon sain de référence, ou
- entre le niveau d'expression d'au moins un premier desdits miARN dans
l'échantillon
provenant d'un patient suspecté de présenter une dystrophie musculaire et le
niveau
d'expression dudit miARN dans un échantillon de référence provenant d'un
patient présentant
une dystrophie musculaire, en particulier une DMD.
Ainsi, la comparaison des niveaux d'expression des miARN peut être réalisée
entre un
échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une dystrophie
musculaire et un
échantillon sain de référence, ou un échantillon de référence provenant d'un
patient présentant
une dystrophie musculaire.
L'existence dans l'urine de miARN spécifiques d'une dystrophie musculaire, et
en particulier
de la DMD, n'a jamais été rapportée par des publications antérieures. Par
ailleurs, les miARN
suivants n'ont jamais été rapportés comme présents dans un liquide corporel et
comme
indicatifs d'une dystrophie musculaire: let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183,
miR-490-3p,
miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-
208,
miR-521, miR-597, miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e,
miR-15b,
miR-487b, miR-410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-
376c,
miR-412, miR-433, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-
3p,
miR-659, miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-
200b*, miR-
523, miR-346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-
650, miR-
720, miR-593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511,

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miR-517b, miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-
192*,
miR-28-5p, miR-30d et miR-30e-3p. Ainsi, selon un mode particulier de
réalisation, le
procédé selon l'invention comprend la mesure du niveau d'au moins un miARN
choisi dans le
groupe constitué des miARN listés dans la phrase précédente.
Selon un autre mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention
comprend la
mesure du niveau dans un échantillon d'urine d'un sujet d'au moins un miARN
choisi dans le
groupe constitué de let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-
3p, miR-
590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-
597,
miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-
487b, miR-
410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412,
miR-433,
miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-
659,
miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-
523, miR-
346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-
720, miR-
593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-
517b,
miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-
28-
5p, miR-30d et miR-30e-3p, la mesure d'une différence du niveau dudit miARN
dans
l'échantillon du sujet par rapport à l'échantillon de référence sain étant
indicative d'une
possible dystrophie musculaire.
L'invention concerne également un procédé de suivi de l'évolution d'une
dystrophie
musculaire, et un procédé pour l'évaluation de l'efficacité d'un traitement
thérapeutique d'une
dystrophie musculaire. Dans ce cas, le procédé comprend la mesure du niveau
d'expression
d'au moins l'un des miARN mentionnés ci-dessus dans un second échantillon de
liquide
corporel (notamment d'urine) d'un sujet, ce niveau dans l'échantillon du sujet
étant comparé
au niveau dudit miARN dans un premier échantillon de référence qui correspond
à un
échantillon prélevé antérieurement sur le même sujet. Dans le cas du suivi de
l'efficacité d'un
traitement, le premier échantillon pourra avoir été prélevé avant
l'administration du traitement
thérapeutique au sujet, et le second échantillon sera prélevé après
administration du traitement
thérapeutique (par exemple plusieurs jours/semaines/mois après administration
du traitement
thérapeutique). Alternativement, les premier et second échantillons peuvent
être prélevés tous
les deux après administration du traitement thérapeutique (par exemple, le
premier échantillon
est prélevé après traitement, le même jour que ce traitement, ou plusieurs
jours/semaines/mois

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après le traitement, et le second échantillon est prélevé plusieurs
jours/semaines/mois après le
premier échantillon).
L'invention concerne par ailleurs une trousse et un support multipuits utiles
pour le diagnostic
d'une dystrophie musculaire.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les "microARN" (ou miARN) sont des ARN simple brin non codants d'environ 17 à
26
nucléotides de long, qui régulent l'expression génique en réprimant la
traduction de leur
ARNm cible. Les miARN qui ont été identifiés sont enregistrés dans la base de
données
miRB ase, 14' version (http ://micro am. saner. ac.uk).
Dans le cadre de l'invention, un "échantillon de référence", lorsqu'il est
fait mention d'un
"échantillon sain", correspond à un échantillon obtenu à partir d'un ou
plusieurs sujets, de
préférence deux ou plus, qui ne souffrent pas de dystrophie musculaire.
L'échantillon de
référence peut également correspondre à un échantillon obtenu à partir d'un ou
plusieurs
patients souffrant d'une dystrophie musculaire. Les niveaux d'expression de
référence peuvent
être déterminés en mesurant le niveau d'expression des miARN à explorer dans
un ou
plusieurs sujets. Ces niveaux de référence peuvent également être ajustés en
fonction de
populations de sujets spécifiques. Dans un mode préféré de réalisation,
l'échantillon de
référence est obtenu à partir d'un pool de sujets sains. Le profil
d'expression des miARN dans
l'échantillon de référence peut, de préférence, être généré à partir d'une
population de deux ou
plus de deux sujets. Par exemple, la population peut comprendre 2, 4, 5, 10,
15, 20, 30, 40, 50
sujets, ou plus. Dans le cadre de méthodes pour le suivi d'une dystrophie
musculaire ou pour
le suivi de l'efficacité d'un traitement, l'échantillon de référence est un
échantillon prélevé sur
le sujet qui sera suivi, mais avant que le suivi ait débuté.
Par "dystrophie musculaire", on désigne notamment la dystrophie musculaire de
Duchenne, la
dystrophie musculaire de Becker, les dystrophies musculaires des ceintures
telles les alpha- et
gamma-sarcoglycanopathies. L'invention se rapporte plus particulièrement à
l'étude d'une
dystrophie musculaire de Duchenne ou d'une dystrophie musculaire de Becker,
plus
particulièrement de Duchenne.

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Le terme "liquide corporel" ou "fluide biologique" se réfère au liquide
corporel d'un sujet,
notamment d'un sujet humain, c'est-a-dire tout liquide prélevé sur un sujet,
tel que le sérum, le
plasma, le sang total, l'urine, le liquide céphalo-rachidien ou encore la
salive. Selon un mode
préféré de réalisation, le liquide corporel utilisé dans la présente invention
est un échantillon
d'urine.
On entend par "sujet" un mammifère, humain ou non humain, de préférence
humain. Le sujet
peut présenter une prédisposition pour une dystrophie musculaire (révélée par
exemple par
analyse génétique, ou une suspicion pouvant résulter d'antécédents familiaux)
ou souffrir
d'une dystrophie musculaire déclarée. L'invention peut également être
appliquée en dépistage,
le sujet ne présentant aucun symptôme ou prédisposition connue. En
particulier, la méthode
selon l'invention peut être appliquée au dépistage de masse chez les jeunes
enfants avant l'âge
classique de déclaration des symptômes (0-Sans). L'invention peut également
être appliquée
au suivi d'animaux modèles de la maladie, notamment de chiens ou de souris
modèles et plus
particulièrement aux chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), LMD
(Labrador
Muscular Dystrophy) ou CXMDj (Canine X-linked Muscular Dystrophy in Japan),
lors de la
mise au point préclinique de traitements.
Le terme "niveau d'expression" d'un miARN dans un échantillon correspond à une
valeur de
mesure propre à un miARN, mais exprimé soit en unité arbitraire, soit en unité
de masse, de
molécules ou de concentration, ou en valeur normalisée par rapport à une autre
mesure, en
particulier en valeur normalisée par rapport aux quantités du même miARN dans
un
échantillon de référence (sain ou d'un patient atteint d'une dystrophie
musculaire).
Le niveau d'expression des miARN peut être mesuré par toute méthode
conventionnelle, telle
que
- l'hybridation sur "puces à ADN",
- des méthodes de séquençage à haut débit d'un grand nombre de miARN
individualisés,
- la PCR quantitative en temps réel ou digitale,
- le Northern blot,
- ou encore par toute autre méthode spécifique des miARN.
Le niveau d'expression des miARN peut être mesuré par la technique de la "puce
à ADN". La
technique de la "puce à ADN" est bien connue de l'homme du métier. Il s'agit
de l'hybridation

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de miARN extraits sur un support solide composé d'une membrane nylon, d'une
surface de
silicium ou de verre, éventuellement de nano-billes ou particules, comportant
des
oligonucléotides de séquences connues fixés sur le support ou adhérents à
celui-ci. La
complémentarité des oligonucléotides fixés avec les séquences des microARN ou
de leurs
5
produits de conversion (produits d'amplification, cDNA, ARN ou cARN) permet de
générer
un signal (fluorescence, luminescence, radioactivité, signal électrique...)
selon les techniques
de marquage employées, au niveau des oligonucléotides immobilisés sur les
supports (puces à
ADN). Ce signal est détecté par un équipement spécifique et une valeur
d'intensité de ce
signal propre pour chaque miARN est ainsi enregistrée. Plusieurs types de
puces destinées à
10 la
détection des miARN sont déjà mis sur le marché, comme par exemple les
GeneChip(R)
miARN commercialisés par Affymetrix, miRcury arrays par Exiqon, miRXplore
microarrays
par Miltenyi.
Dans le cas de l'analyse haut débit par séquençage, les miARN sont extraits et
purifiés d'un
échantillon, isolés les uns des autres par des méthodes proposées par les
fournisseurs
d'équipements de séquençage tels que Roche, Invitrogen. Ce genre d'analyse
consiste à
individualiser les molécules des différents microARNs, de procéder à une étape
d'amplification et de séquencer les produits (" clones d'acides nucléiques ")
ainsi générés. La
réalisation de très nombreuses séquences pour identifier chacun de ces "
clones " (plusieurs
milliers) permet de générer une liste des microARNs présents dans un
échantillon et de
quantifier chacun de ces miARN en comptant tout simplement combien de fois
chaque
séquence est retrouvée dans la liste détaillée.
Dans un mode de réalisation préférée de l'invention, les dosages de miARN sont
réalisés par
PCR quantitative (PCR en temps réel ou PCR digitale). La PCR en temps réel
permet
d'obtenir des valeurs, appelées Ct, correspondant au nombre de cycles à partir
duquel la
fluorescence émise dépasse un certain seuil, le seuil étant fixé par
l'utilisateur en début de
phase exponentielle. Cette valeur de Ct est proportionnelle à la quantité de
cDNA (provenant
de la transcription inverse des miARN en cDNA par la Reverse Transcriptase)
présent
initialement dans l'échantillon. En l'absence de gamme-étalon spécifique pour
chaque cDNA,
seule une quantification relative entre échantillons est possible. Dans un
premier temps, afin
de pouvoir comparer le contingent de chaque miARN pris individuellement et
présent dans
les échantillons, les valeurs de dosage pour chaque miARN sont normalisées
avec les données
obtenues pour un ARN non-codant. Il est également possible de normaliser
l'expression d'un

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miARN par rapport au Ct moyen de tous les miARNs d'une plaque de PCR (plaques
TLDA à
384 puits, comprenant un miARN différent détecté par puits ¨ cf les exemples
pour plus de
détails). Ainsi, les résultats peuvent être normalisés par rapport à plusieurs
miARN références
dont l'abondance varie peu dans l'urine. La PCR digitale permet, à partir d'un
échantillon de
départ de déterminer le nombre exact de copies d'un miARN qu'il contient,
suite soit à une
dilution de la réaction de PCR en un nombre important de micropuits
(technologie PCR
digitale Life Technologies ou Roche) soit à une dispersion de la réaction de
PCR en
microgouttes d'huile (technologie Droplet, Bio-Rad).
La quantification relative d'un miARN entre 2 types d'échantillons est obtenue
ensuite grâce
par exemple aux logiciels SDS2.3, RQ manager (Applied Biosystems), et par la
méthode de
delta delta de Ct sur feuille de calcul Miscrosoft Excel ou tout autre
logiciel permettant un
calcul complexe.
Lorsque les niveaux d'expression des miARN sont analysés par hybridation sur
"puces à
ADN", ou par Northem blot, ou par séquençage, ils peuvent être exprimés par la
formule T:
(I) Quantité de miARNx = intensité du signal de détection pour miARNx
Où "intensité de signal" signifie quantité de fluorescence, de radioactité ou
de luminescence
enregistrée sur les "puces à ADN" par le détecteur adapté, ou nombre de
séquences identiques
détectées par l'analyse à haut débit par séquençage. Les quantités sont
exprimées en unités
arbitraires.
Les quantités de miARN peuvent être normalisées par rapport à un autre dosage,
notamment
un ARN (ARN...) dont la concentration ne varie pas dans les différents types
d'échantillons
analysés. Cette normalisation permet de garantir que l'on compare les niveaux
d'expression
des miARN détectables dans des extraits dont les concentrations en ARN sont
similaires entre
ces différents extraits purifiés. Dans ce cas, le niveau d'expression
normalisé pour un miARN
dans un échantillon est exprimé par la formule II:
(II) Quantité de miARNx normalisée = intensité du signal de détection pour
miARNx /
intensité du signal pour ARNnorm

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Lorsque les niveaux d'expression des miARN sont analysés par la PCR en temps
réel, ils
peuvent être exprimés par la formule III, qui définit la quantité de miARN
présente dans le
milieu réactionnel de dosage lorsque le nombre de cycles d'amplification est
égal à Ct
(Quantité de miARNx à Ct) :
(III) Quantité de miARNx à Ct = Quantité de miARN à tO x Efficacité-ct.
Où "Quantité de miARN à tO" désigne la quantité de miARN, ou son équivalent en
cDNA, au
moment où la réaction de dosage par amplification PCR est initiée.
L'expression "efficacité"
dans la formule (III) signifie la valeur de l'efficacité de PCR (fixée
arbitrairement à 2 dans le
cas de calculs par la méthode delta delta Ct). Cette valeur dépend de divers
paramètres
expérimentaux, et notamment de l'appareil effectuant la PCR en temps réel mis
en oeuvre. Une
fois que cette valeur est mesurée pour un protocole particulier et une machine
de PCR
configurée, il n'est plus nécessaire de mesurer cette valeur chaque fois avant
le calcul, sauf si
le protocole expérimental et/ou la condition de fonctionnement de la machine
ont été modifiés
pour l'expérience donnée.
Dans un mode particulier de réalisation, le niveau d'expression des miARN est
dosé par PCR
quantitative en temps réel.
Les tableaux 2 et 3 ci-dessous décrivent le profil d'expression de miARN dont
l'expression est
modifiée chez des patients atteints d'une DMD, par rapport au profil
d'expression observé
chez des sujets sains. Les inventeurs ayant pu mettre en évidence une
différence d'expression
entre les patients selon leur âge, les informations sont classées selon ce
critère.
Tableau 2: profil d'expression des miARN indicatifs chez des patients/sujets
de 3-8 ans
Expression chez les patients par rapport aux
miARN urinaire sujets sains
let-7a Augmentation
let-7b Augmentation
let-7c Augmentation
let-7d Augmentation
let-7e Augmentation
let-7f Augmentation
let-7g Augmentation

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13
miR-151-5p Augmentation
miR-15 a Augmentation
miR-15b Augmentation
miR-182 Augmentation
miR-183 Augmentation
miR-192* Augmentation
miR-196b Augmentation
miR-200b* Augmentation
miR-206 Augmentation
miR-224 Augmentation
miR-23b Augmentation
miR-26b Augmentation
miR-28-5p Augmentation
miR-30d Augmentation
miR-30e-3p Augmentation
miR-335 Augmentation
miR-33 a* Augmentation
miR-487b Augmentation
miR-490-3p Augmentation
miR-492 Augmentation
miR-502-3p Augmentation
miR-505* Augmentation
miR-520a-3p Augmentation
miR-548d-5p Augmentation
miR-590-3p Augmentation
miR-628-3p Augmentation
miR-659 Augmentation
miR-942 Augmentation
miR-1244 Diminution
miR-328 Diminution
miR-484 Diminution
miR-494 Diminution
miR-593 Diminution
miR-650 Diminution
miR-657 Diminution
miR-668 Diminution
miR-720 Diminution
miR-886-3p Diminution

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Tableau 3: profil d'expression des miARN indicatifs chez des patients/sujets
de 13-18 ans
Expression chez les patients par rapport aux
miARN urinaire sujets sains
miR-183 Augmentation
miR-193 a-3p Augmentation
miR-198 Augmentation
miR-208 Augmentation
miR-214 Augmentation
miR-220 Augmentation
miR-328 Augmentation
miR-346 Augmentation
miR-34c-5p Augmentation
miR-373 Augmentation
miR-381 Augmentation
miR-410 Augmentation
miR-433 Augmentation
miR-490-3p Augmentation
miR-493 Augmentation
miR-494 Augmentation
miR-511 Augmentation
miR-517b Augmentation
miR-518a-3p Augmentation
miR-518b Augmentation
miR-518e Augmentation
miR-518f Augmentation
miR-520a-3p Augmentation
miR-520g Augmentation
miR-521 Augmentation
miR-523 Augmentation
miR-548b-5p Augmentation
miR-548c-5p Augmentation
miR-548d-5p Augmentation
miR-597 Augmentation
let-7b Diminution
let-7c Diminution
let-7e Diminution
let-7f Diminution
miR-139-5p Diminution
miR-155 Diminution
miR-15 a Diminution
miR-216b Diminution

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miR-23 a Diminution
miR-376c Diminution
miR-412 Diminution
miR-423-5p Diminution
miR-492 Diminution
miR-502-3p Diminution
miR-874 Diminution
Légende des tableaux 2 et 3 augmentation: expression supérieure chez les
patients par rapport
aux sujets sains; diminution: expression inférieure chez les patients par
rapport aux sujets
sains.
5
Les miARN listés ci-dessus varient tous dans les échantillons de patients par
rapport aux
sujets sains. L'invention concerne donc un procédé (a) de diagnostic d'une
dystrophie
musculaire, (b) de suivi de l'évolution d'une dystrophie musculaire, et (c)
d'évaluation de
l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une dystrophie musculaire,
comprenant la
10 détermination d'une variation du niveau d'expression d'un ou
plusieurs de ces miARN dans un
échantillon de fluide corporel d'un sujet par rapport au niveau d'expression
dans un
échantillon de référence.
Dans un mode particulier de réalisation, une première catégorie de miARN
correspond à ceux
15 qui sont sur-représentés dans l'urine de patients DMD, (désignés par
la catégorie
"augmentation" dans les tableaux 2 et 3). Si un ou plusieurs miARN de cette
première
catégorie sont exploités dans une méthode selon l'invention:
- une expression supérieure chez le sujet testé par rapport à une référence
obtenue dans un
échantillon d'un sujet sain sera indicative d'une dystrophie musculaire
(méthode de
diagnostic);
- une expression supérieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un
temps T2 par
rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti
précédant T2
chronologiquement) sera indicative d'une progression de la maladie (méthode de
pronostic, ou
méthode pour le suivi d'une dystrophie musculaire);
- dans le cadre d'un traitement d'une dystrophie musculaire chez un patient,
une expression
inférieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par
rapport à un
échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2
chronologiquement)

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sera indicative d'un traitement efficace de la maladie (méthode de suivi de
l'efficacité d'un
traitement d'une dystrophie musculaire).
Une deuxième catégorie de miARN sont sous représentés dans l'urine de patients
DMD, par
rapport au sujets sains (désignés dans la catégorie "diminution" dans les
tableaux 2 et 3).. Si
un ou plusieurs miARN de cette deuxième catégorie sont exploités dans une
méthode selon
l'invention:
- une expression inférieure chez le sujet testé par rapport à une référence
obtenue dans un
échantillon d'un sujet sain sera indicative d'une dystrophie musculaire
(méthode de
diagnostic);
- une expression inférieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un
temps T2 par
rapport à un échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti
précédant T2
chronologiquement) sera indicative d'une progression de la maladie (méthode de
pronostic, ou
méthode pour le suivi d'une dystrophie musculaire);
- dans le cadre d'un traitement d'une dystrophie musculaire chez un patient,
une expression
supérieure dans un échantillon du sujet testé prélevé à un temps T2 par
rapport à un
échantillon du même sujet testé prélevé à un temps Ti (Ti précédant T2
chronologiquement)
sera indicative d'un traitement efficace de la maladie (méthode de suivi de
l'efficacité d'un
traitement d'une dystrophie musculaire).
Par "niveau d'expression supérieur" ou "niveau d'expression inférieur", on
entend un niveau
d'expression dont la variation est statistiquement significative, selon des
procédures bien
connues de l'homme du métier.
La description faite ci-dessus des deux catégories de miARN identifiées et
leur exploitation
dans une méthode de diagnostic selon l'invention met en oeuvre un échantillon
de référence
provenant d'un sujet sain. Bien entendu, les variations d'expression
recherchées seront
inversées lorsque l'échantillon de référence proviendra d'un patient malade
atteint d'une
dystrophie musculaire.
Les procédés selon l'invention comprennent notamment la détection d'au moins
un miARN
choisi dans le groupe constitué des miARN des tableaux 2 et 3.
Selon une première variante de réalisation, les miARN détectés sont choisis
parmi les miARN
du tableau 4.

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Tableau 4
let-7f miR-23b miR-193 a-3p miR-518f
let-7a miR-492 miR-381 miR-886-3p
miR-548d-5p let-7c miR-34c-5p miR-650
miR-183 let-7e miR-628-3p miR-720
miR-490-3p miR-15b miR-659 miR-593
miR-520a-3p miR-487b miR-505* miR-657
miR-590-3p miR-410 let-7b miR-502-3p
miR-15a miR-139-5p let-7d miR-198
miR-1244 miR-216b let-7g miR-214
miR-328 miR-423-5p miR-196b miR-220
miR-494 miR-484 miR-26b miR-373
miR-668 miR-23 a miR-942 miR-511
miR-208 miR-376c miR-200b* miR-517b
miR-521 miR-412 miR-523 miR-518a-3p
miR-597 miR-433 miR-346 miR-518b
miR-874 miR-206 miR-155 miR-518e
miR-224 miR-335 miR-548b-5p miR-520g
miR-182 miR-33 a* miR-548c-5p miR-493
Selon une seconde variante de réalisation, les miARN détectés sont choisis
parmi les miARN
du tableau 5.
Tableau 5
let-7f miR-494 let-7c miR-376c
let-7a miR-668 let-7e miR-412
miR-548d-5p miR-208 miR-15b miR-433
miR-183 miR-521 miR-487b miR-206
miR-490-3p miR-597 miR-410 miR-335
miR-520a-3p miR-874 miR-139-5p miR-33 a*
miR-590-3p miR-224 miR-216b miR-193 a-3p
miR-15a miR-182 miR-423 -5p miR-381

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miR-1244 miR-23b miR-484 miR-34c-5p 1
miR-328 miR-492 miR-23a
Selon une troisième variante de réalisation, les miARN détectés sont choisis
parmi les
miARN du tableau 6.
Tableau 6
let-7f miR-590-3p miR-208
let-7a miR-15a miR-521
miR-548d-5p miR-1244 miR-597
miR-183 miR-328 miR-874
miR-490-3p miR-494
miR-520a-3p miR-668
Selon un mode particulier de réalisation, l'échantillon de liquide corporel,
en particulier un
échantillon d'urine, provient d'un sujet humain et le ou les miARN détectés
sont choisis dans
le groupe constitué des miARN du tableau 2 et 3, ou parmi les miARN du tableau
2 ou 3 et
figurant également dans l'un des tableaux 4, 5 et 6.
Le diagnostic (ou l'évaluation du risque), le pronostic ou l'efficacité du
traitement pourra par
ailleurs être confirmé dans des procédures suivant les procédés selon
l'invention, comprenant
des étapes connues d'évaluation d'une dystrophie musculaire (par exemple,
détermination du
niveau de créatine kinase, recherche de marqueurs spécifiques dans des
biopsies musculaires,
analyse génomique, etc.) Ainsi, un mode particulier de réalisation de la
méthode de diagnostic
selon l'invention telle que décrite ci-dessus comprend en outre une étape de
confirmation du
diagnostic par utilisation d'une méthode alternative d'évaluation d'une
dystrophie musculaire.
L'invention concerne également une trousse de diagnostic d'une dystrophie
musculaire, cette
trousse comprenant des moyens de détection ou de dosage d'au moins un miARN
choisi parmi
let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-3p, miR-590-3p, miR-
15a,
miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-597, miR-874, miR-
224,
miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-487b, miR-410, miR-139-
5p,
miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412, miR-433, miR-206,
miR-
335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-659, miR-
505*, let-
7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-523, miR-346,
miR-155,
miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-720, miR-593, miR-
657,

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miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-517b, miR-518a-3p,
miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-28-5p, miR-
30d et
miR-30e-3p. Selon un mode particulier de réalisation, la trousse comprend les
moyens de
détection ou de dosage de tous les miARN de cette liste. Selon un mode
particulier de
réalisation, la trousse comprend des moyens de détection ou de dosage d'un ou
plusieurs
miARN (en particulier tous) choisis parmi les miARN listés dans le tableau 4,
le tableau 5 ou
le tableau 6. Selon un mode spécifique de réalisation, les moyens de détection
ou de dosage
dans la trousse consistent en des moyens de détection ou de dosage d'un ou
plusieurs des
miARN des tableaux 2 et 3, ou d'un ou plusieurs des miARN listés dans chacun
des tableaux
4, 5 et 6. Selon un mode particulier de réalisation, les miARN détectés ou
dosés grâce au kit
consistent en l'ensemble des miARN du tableau 4, plus particulièrement en
l'ensemble des
miARN du tableau 5, et encore plus particulièrement en l'ensemble des miARN du
tableau 6.
A titre illustratif, la trousse selon l'invention peut être une trousse pour
la réalisation d'une
PCR en temps réel et également contenir une reverse transcriptase, une ADN
polymérase, un
ou plusieurs tampon(s) adaptés aux réactions à mettre en oeuvre, des sondes
spécifiques des
régions amplifiées (par exemple sondes Taqman0), ou des marqueurs spécifiques
de l'ADN
double brin comme le SYBR Green.
L'invention concerne également un ensemble de séquences nucléotidiques, cet
ensemble
comprenant des paires d'amorces utilisables pour amplifier spécifiquement au
moins deux
miARN choisi parmi let-7f, let-7a, miR-548d-5p, miR-183, miR-490-3p, miR-520a-
3p, miR-
590-3p, miR-15a, miR-1244, miR-328, miR-494, miR-668, miR-208, miR-521, miR-
597,
miR-874, miR-224, miR-182, miR-23b, miR-492, let-7c, let-7e, miR-15b, miR-
487b, miR-
410, miR-139-5p, miR-216b, miR-423-5p, miR-484, miR-23a, miR-376c, miR-412,
miR-433,
miR-206, miR-335, miR-33a*, miR-193a-3p, miR-381, miR-34c-5p, miR-628-3p, miR-
659,
miR-505*, let-7b, let-7d, let-7g, miR-196b, miR-26b, miR-942, miR-200b*, miR-
523, miR-
346, miR-155, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-518f, miR-886-3p, miR-650, miR-
720, miR-
593, miR-657, miR-502-3p miR-198, miR-214, miR-220, miR-373, miR-511, miR-
517b,
miR-518a-3p, miR-518b, miR-518e, miR-520g, miR-493, miR-151-5p, miR-192*, miR-
28-
5p, miR-30d et miR-30e-3 dans une expérience de PCR. Selon une variante, les
séquences
nucléotidiques permettent l'amplification d'un ou plusieurs miARN de chacun
des tableaux 4,
5 et 6. Selon un mode particulier de réalisation, l'ensemble de séquences
nucléotidiques
comprend des paires d'amorces permettant l'amplification spécifique de tous
les miARN listés

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ci-avant. Selon une variante de réalisation, l'ensemble de séquences
nucléotidiques peut
également comprendre une séquence nucléotidique utilisable comme sonde marquée
pour la
détection et quantification des fragments amplifiés (par exemple une sonde
utilisable dans le
système de PCR en temps réel TaqMan).
5
L'invention concerne également un ensemble de séquences nucléotidiques
comprenant un ou
plusieurs oligonucléotides marqués utilisables pour la détection spécifique
d'au moins deux
miARN du tableau 1, par exemple dans une expérience de Northern Blot. Dans un
mode
particulier de réalisation, l'ensemble de séquences contient des
oligonucléotides spécifiques
10 de chacun des miARN du tableau 1, du tableau 2, du tableau 3, du 4,
du tableau 5 ou du
tableau 6.
L'invention concerne également un support multipuits pour PCR, comprenant au
moins deux
paires d'amorces PCR spécifiques chacune d'un miARN différent du tableau 1, du
tableau 2,
15 du tableau 3, du 4, du tableau 5 ou du tableau 6, chacune des paires
d'amorce étant disposées
dans un puits différent du support. Selon une variante spécifique, le support
contient des
paires d'amorces consistant en des amorces spécifiques d'au moins deux miARN
du tableau 1,
2, 3, 4, 5 ou 6, chacune des paires d'amorces étant disposées dans un puits
différent du
support. Selon un mode particulier de réalisation, le support multipuits
comprend des paires
20 d'amorces spécifiques de tous les miARN du tableau 1, du tableau 2,
du tableau 3, du 4, du
tableau 5 ou du tableau 6, chacune de ces paires d'amorces étant disposées
dans un puits
différent. Selon un autre mode spécifique de réalisation, le support contient
des paires
d'amorces consistant en des amorces spécifiques de tous les miARN du tableau
1, 2, 3, 4, 5 ou
6, chacune des paires d'amorces étant disposées dans un puits différent du
support.
La présente invention est illustrée par les figures et exemples suivants.
Légende des figures
Figure 1 : (haut) nombre de miARN différents détectés par catégorie
d'échantillons après
profil d'expression par cartes TLDA A et B (patients 3-8ans) ou TLDA A
(patients 13-18ans).
(bas) Ct moyen par catégorie d'échantillon. Sains 3-8ans (5 échantillons), DMD
3-8 ans (5
échantillons), sains 13-18ans (3 échantillons), DMD 13-18ans (2 échantillons).
Figure 2 : heatmaps comprenant les abondances de chaque miARN identifié pour
chaque
donneur testé, et regroupement hiérarchique des donneurs selon l'expression
des miARN

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candidats. (haut) heatmap pour les 3-8ans. (bas) heatmap pour les 13-18ans.
Les heatmaps et
les calculs de regroupement hiérarchique sont réalisés via le logiciel
CIMminer
(http://discover nci.nih.gov/cimminer/)
Figure 3 : exemple de miARN dérégulés dans l'urine de patients DMD.
L'abondance de
miARN est représentée en fonction du groupe de patients.
EXEMPLES
Matériel et Méthodes :
L'urine est collectée dans des récipients stériles. Dans la demi-heure qui
suit, elle est
centrifugée à 2000rpm pendant 5min afin d'éliminer les cellules présentes. Le
surnageant est
ensuite récupéré, aliquoté et congelé à -80 C.
L'étude sur la carte A est basée sur des échantillons d'urine de 4 patients
DMD et 6 sujets
sains âgés de 3 à 8 ans ou sur 2 patients DMD et 3 sujets sains âgés de 13 à
18 ans.
L'étude sur la carte B est basée sur des échantillons d'urine de 4 patients
DMD et 5 sujets
sains.
10m1 d'urine sont utilisés afin d'extraire les ARN totaux contenant les
microARN grâce au kit
(< Urine total RNA maxi kit, slurry format de Norgen Biotek, selon le
protocole du
fournisseur. Les ARN sont élués dans 2 élutions successives de 100 L. Ils sont
ensuite
précipités sur la nuit à -20 C en présence d'acetate de sodium, d'éthanol
absolu et
d'acrylamide linéaire (Ambion) selon le protocole d'Ambion. Les ARN sont
ensuite
resuspendus dans de l'eau sans RNAse.
Un contrôle qualité des ARN est ensuite réalisé en 3 étapes : 1) dosage par
l'absorbance à
260nm (Nanodrop 8000, Thermo Scientific) 2) électrophorèse capillaire sur puce
RNA small
et pico (Agilent Technologies) 3) amplification de 3 petits ARN urinaires
contrôles par RT-
qPCR (miR- 16, miR-377*, U6).
10Ong d'ARN total sont ensuite soumis à une transcription inverse multiplexe
(Megaplex
pools, Applied biosystems). Nous réalisons 2 transcriptions inverses à partir
de 2 pools
d'amorces différents : pools A et B. A eux deux, ils couvrent la détection de
762 microARN
différents, ce qui représente environ la moitié des 1424 miARN humains connus
(miRbase,
www.mirbase.org, release 17, avril 2011). Les ADN complémentaires obtenus
subissent

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ensuite une étape de préamplification (preAmp master mix et preAmp primer
pools, Applied
Biosystems) avant d'être déposés sur des plaques TLDA (Taqman Low Density
Array). Cette
technologie a été développée par Applied Biosystems, et consiste en la
détection simultanée
de 381 miARN sur plaque 384 puits par RT-qPCR. La quantité relative de chaque
miARN est
déterminée en normalisant par le Ct (cycle threshold) moyen de chaque
échantillon
(Mestdagh, Genome Biol 2009), et en utilisant un échantillon de donneur sain
comme
référence (méthode du ddCt). On détermine ensuite les ratios des quantités
relatives de chaque
miARN entre la population de donneurs sains et la population de patients DMD.
Les quantités relatives sont calculées selon la méthode des delta delta de Ct.
Avec dCt (miR)
= Ct miR ¨ Ct calibrateur;
ddCt (miR) = dCt (référence) ¨ dCt (miR); et
Quantité relative (miR) = 2Adelta delta Ct (miR).
La référence correspond à la valeur moyenne obtenue pour un miR donné chez les
donneurs
sains. Le calibrateur correspond au Ct moyen de toute la plaque TLDA.
Resultats :
Nous avons considéré uniquement les miARN détectés avec un Ct inférieur à 35
pour un seuil
de 0,1, selon le logiciel RQ manager (Applied Biosystems). Parmi les sujets 3-
8 ans, en
considérant uniquement le panel A des cartes TLDA utilisées, et pour chaque
échantillon
urinaire, nous avons détecté une moyenne de 172 miARN différents, le Ct moyen
de chaque
échantillon étant égal à 28,2 (figure 1). Parmi les sujets 13-18 ans, en
considérant uniquement
le panel A des cartes TLDA utilisées, et pour chaque échantillon urinaire,
nous avons détecté
une moyenne de 210 miARN différents, le Ct moyen de chaque échantillon étant
égal à 27,8
(figure 1). Le panel B a uniquement été testé pour les donneurs 3-8ans et a
permis de détecter
une moyenne de 160 miARN supplémentaires (soit environ 330 miARN différents
détectables
dans l'urine des donneurs de 3-8ans). Nous observons donc une abondance et une
variété
assez importantes de miARN dans l'urine.
Nous avons enfin déterminé la liste des miARN différemment représentés dans
l'urine des
patients DMD par rapport aux donneurs sains, en comparant les sujets d'âge
équivalent (1:
groupe 3-8 ans; 2: groupe 13-18 ans). Les miARN sont représentés dans le
tableau 7 et pour
chaque miARN est indiqué son niveau de dérégulation dans l'urine des groupes 3-
8ans et 13-
18 ans (facteur de différence), sa catégorie (augmenté, diminué chez les DMD
par rapport

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23
aux sains), et son potentiel en tant que biomarqueurs (note sur 4). Les miARN
à très haut
potentiel (potentiel=4) montrent des facteurs de modification importants et/ou
une
dérégulation dans les 2 groupes d'âge. Les miARN à bon potentiel (potentiel=1)
montrent des
facteurs de différence faibles mais significatifs. Les miARN à haut potentiel
ou à potentiel
intermédiaires ont la note de 3 ou 2. La figure 2 représente ces résultats
sous la forme de 2
heatmaps, une par groupe d'âge. A partir des données d'abondance des
différents miARN
urinaires sélectionnées dans le tableau 7, l'algorithme de regroupement
hierarchique utilisé
(http://discover.nci.nih.gov/cimminer/) permet de séparer efficacement les
donneurs en
fonction de leur statut sain ou DMD. Ainsi, ce résultat montre que
l'expression des miARN
identifiés peut être utilisée comme signature de la pathologie DMD. La figure
3 représente
des exemples de miARN dérégulés chez les patients DMD.
Tableau 7
Facteur de
différence augmente/diminue
miARN urinairepotentiel /4
(DMD / sains) chez DMD 3-8ans
3-8ans
hsa-let-7f 80000 augmente 4
hsa-let-7a 20000 augmente 4
hsa-miR-548d-5p 4000 augmente 4
hsa-miR-183 2000 augmente 4
hsa-miR-490-3p 2000 augmente 4
hsa-miR-520a-3p 1000 augmente 4
hsa-miR-590-3p 80 augmente 4
hsa-miR-15a 9 augmente 4
hsa-miR-224 8000 augmente 3
hsa-miR-182 25 augmente 3
hsa-miR-23b 8 augmente 3
hsa-miR-492 6 augmente 3
hsa-let-7c 5 augmente 3
hsa-let-7e 5 augmente 3
hsa-miR-15b 5 augmente 3
hsa-miR-206 3 augmente 3
hsa-miR-335 3 augmente 3
hsa-miR-33a* 3 augmente 3
hsa-miR-487b 3 augmente 3
hsa-miR-628-3p 12 augmente 2
hsa-miR-659 9 augmente 2
hsa-miR-505* 7 augmente 2
hsa-let-7b 5 augmente 2

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24
hsa-let-7d 5 augmente 2
hsa-let-7g 5 augmente 2
hsa-miR-196b 5 augmente 2
hsa-miR-26b 5 augmente 2
hsa-miR-942 5 augmente 2
hsa-miR-200b* 3 augmente 2
hsa-miR-502-3p 3 augmente 2
hsa-miR-151-5p 3 augmente 1
hsa-miR-192* 3 augmente 1
hsa-miR-28-5p 3 augmente 1
hsa-miR-30d 3 augmente 1
hsa-miR-30e-3p 3 augmente 1
hsa-miR-668 -100 diminue 4
hsa-miR-1244 -20 diminue 4
hsa-miR-494 -20 diminue 4
hsa-miR-328 -10 diminue 4
hsa-miR-484 -5 diminue 3
hsa-miR-657 -17 diminue 2
hsa-miR-593 -13 diminue 2
hsa-miR-650 -12 diminue 2
hsa-miR-720 -12 diminue 2
Facteur de
différence augmente / diminue chez potentiel
miARN urinaire
(DMD / sains) DMD 13-18ans /4
13-18ans
hsa-miR-521 40000 augmente 4
hsa-miR-597 30000 augmente 4
hsa-miR-208 54 augmente 4
hsa-miR-490-3p 20 augmente 4
hsa-miR-328 7 augmente 4
hsa-miR-494 7 augmente 4
hsa-miR-34c-5p 26 augmente 3
hsa-miR-433 20 augmente 3
hsa-miR-381 15 augmente 3
hsa-miR-410 14 augmente 3
hsa-miR-198 84 augmente 2
hsa-miR-511 58 augmente 2

CA 02858465 2014-06-06
WO 2013/087907
PCT/EP2012/075665
hsa-miR-373 36 augmente 2
hsa-miR-548c-5p 29 augmente 2
hsa-miR-220 26 augmente 2
hsa-miR-346 24 augmente 2
hsa-miR-518b 24 augmente 2
hsa-miR-214 22 augmente 2
hsa-miR-520g 22 augmente 2
hsa-miR-548b-5p 21 augmente 2
hsa-miR-517b 17 augmente 2
hsa-miR-518e 17 augmente 2
hsa-miR-518f 17 augmente 2
hsa-miR-493 13 augmente 2
hsa-miR-523 12 augmente 2
hsa-miR-874 -2000 diminue 4
hsa-let-7f -171 diminue 4
hsa-miR-183 -162 diminue 4
hsa-miR-15a -16 diminue 4
hsa-miR-412 -620 diminue 3
hsa-miR-216b -533 diminue 3
hsa-miR-23a -464 diminue 3
hsa-miR-139-5p -216 diminue 3
hsa-miR-376c -128 diminue 3
hsa-miR-492 -123 diminue 3
hsa-miR-423-5p -120 diminue 3
hsa-let-7e -11 diminue 3
hsa-let-7c -10 diminue 3
has-miR-155 -17 diminue 2
hsa-let-7b -10 diminue 2
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Dessin représentatif