Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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MODIFICATION DES EFFETS IMMUNOMODULATEURS DES CELLULES
La présente invention concerne les domaines de l'immunothérapie
cellulaire, et plus particulièrement l'utilisation de cellules de mammifère
possédant un
potentiel immunomodulateur et qui ont été génétiquement ou pharmacologiquement
modifiées comme médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur. La présente
invention concerne également de nouvelles molécules possédant un effet
immunosuppresseur ou immuno stimulateur.
La thérapie cellulaire consiste en l'injection à un sujet de cellules
vivantes autologues ou allogènes, dans le but de traiter ou prévenir une
maladie ou de
reconstruire un tissu endommagé. Ces cellules peuvent être des cellules
souches, des
cellules progénitrices ou précurseurs, ou des cellules différenciées
fonctionnelles provenant
du sang ou d'un tissu. Ces cellules peuvent aussi être génétiquement
transformées pour
exprimer dans un tissu un transgène d'intérêt thérapeutique. En outre, la
modification
génétique de ces cellules peut améliorer leur survie, leurs caractéristiques
métaboliques,
leurs capacités prolifératives ou, pour les cellules souches ou les
précurseurs, leurs
capacités de différenciation. Ces mêmes objectifs peuvent être obtenus par le
pré-
conditionnement de ces cellules à l'aide d'outils pharmacologiques.
Parmi les cellules souches on distingue :
- les cellules souches embryonnaires (ESC) qui proviennent d'un
embryon à un stade précoce (du zygote au blastomère). Ces cellules sont
totipotentes, c'est-
à-dire qu'elles sont capables de se différencier en n'importe quel tissu de
l'organisme, et
sont capables de s'auto-renouveler ;
-
les cellules souches adultes qui sont présentes dans la plupart des
tissus de l'organisme. Ces cellules sont soit pluripotentes, c'est-à-dire
qu'elles sont
capables de former tous les types cellulaires sauf les annexes embryonnaires,
telles que les
cellules souches pluripotentes induites ou les Multilineage-differentiating
Stress
Enduring Cells ; soit multipotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de
former
différents types de cellules d'un lignage cellulaire donné ; soit unipotentes,
c'est-à-dire
qu'elles ne peuvent former qu'un seul type cellulaire.
Les cellules progénitrices et précurseurs sont issues des cellules souches,
c'est-à-dire qu'elles sont plus engagées dans une voie de différenciation que
les cellules
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souches. Elles sont également capables de foimer un ou plusieurs types
cellulaires mais ne
sont pas capables de s' auto-renouveler.
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM ou MSC) - aussi appelées
cellules stromales mésenchymateuses - font actuellement l'objet de nombreuses
recherches
pour leurs applications thérapeutiques. Dans la description qui suit les
termes cellule
souche mésenchymateuse et cellule stromale mésenchymateuse sont utilisés
indifféremment. Ces cellules souches adultes ont été initialement isolées et
caractérisées à
partir des cellules mononucléées de la moelle osseuse (BM-MSC) mais peuvent
également
être isolées à partir du tissu adipeux, de la peau, de la rate ou du coeur.
Les CSM possèdent
des caractéristiques phénotypiques, par exemple CD45-, CD34+/- (selon
l'origine tissulaire
et leur stade de prolifération), CD134-, qui permettent de les distinguer des
cellules souches
hématopoïétiques qui sont CD45+, CD34+, CD13-. Elles possèdent, selon les
inducteurs
utilisés, un potentiel de différenciation ostéogénique, adipogénique,
chondrogénique,
myogénique et angiogénique par exemple. Elles possèdent aussi une activité
paracrine et
sont capables de sécréter des facteurs de croissance, des cytokines pro- ou
anti-
inflammatoires, des chémokines et des prostaglandines (voir pour revue Le
Blanc 2006,
Kode et al., 2009, Hoogduijn et al., 2010 et Dazzi et al., 2011). De ce fait,
elles présentent
aussi de grandes similarités avec les monocytes et les macrophages (Charrière
et al., 2006)
ainsi que les fibroblastes (Hannifa et al., 2007) qui possèdent des propriétés
immunomodulatrices similaires. Les CSM sont donc utilisées en thérapie
cellulaire
régénératrice pour leurs propriétés de différenciation multiple ainsi que pour
leurs
propriétés prolifératives, angiogéniques, anti-apoptotiques, trophiques et
imm.unomodulatrices. Par exemple, Le Blanc et al. (2008) ont montré chez
l'Homme que
les cellules souches mésenchymateuses combinées à une greffe de cellules
souches
hématopoïétiques peuvent réduire le risque de réaction aiguë du greffon contre
l'hôte dans
les allogreffes (graft-versus host disease, GVHD).
Les CSM isolées du tissu adipeux sont appelées ASC, ADSC (adipose
derived stem/stroma cells), ADAS (adipose tissue-derived adult stem cells) ou
AD-MSC
(adipose-derived MSC). Le tissu adipeux présente l'avantage d'être obtenu
facilement par
liposuccion sous anesthésie locale et de contenir plusieurs populations de
cellules
immatures dont une forte majorité d'ASC. Les ASC sont ensuite isolées et
purifiées après
digestion protéolytique du tissu adipeux blanc (e.g., avec la collagénase) et
sélection par
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une étape d'adhésion sur un support plastique (voir pour revue Gimble et al.,
2007) ou
peuvent être directement sélectionnées à partir de leur phénotype de surface
(par exemple,
sélection des cellules CD45-, CD34+ et CD31"). Bien que possédant des
caractéristiques
spécifiques, les ASC montrent beaucoup de caractéristiques communes avec les
cellules
souches mésenchymateuses issues de la moelle osseuse, y compris l'activité
paracrine et
les propriétés immunomodulatrices (Planat-Bénard et al., 2004, Puissant et
al., 2005,
Yailez et al., 2006, Gonzàlez et al., 2009a et 2009b, Constantin et al., 2009
et Yoo et al.,
2009). En outre, dans la mesure où leur auto-renouvellement n'a pas été
clairement établi,
il convient d'utiliser le terme cellules stromales mésenchymateuses pour
les qualifier
(Casteilla et al., 2011). Néanmoins, ces cellules peuvent servir de modèle
cellulaire pour
l'ensemble des cellules souches mésenchymateuses. Les ASC sont actuellement
étudiées
au niveau clinique dans plusieurs types d'applications (voir pour revue
Casteilla et al.,
2011), dont l'ischémie critique du membre inférieur et le traitement des
fistules associées
ou non à la maladie de Crohn (Garcia-Olmo et al., 2009).
Malgré des résultats pré-cliniques et cliniques encourageants sur
l'utilisation des CSM dans le cadre de thérapies cellulaires (voir pour revue
Uccelli et al.,
2008), le potentiel immunomodulateur des CSM est parfois trop faible pour
obtenir de
bons résultats dans le traitement de maladies ou dysfonctions impliquant
l'inflammation,
telles que les maladies inflammatoires chroniques ou maladies auto-immunes. Il
existe
donc un besoin d'améliorer le potentiel immunomodulateur des CSM, permettant
ainsi de
diminuer le nombre de cellules nécessaires au traitement et/ou d'améliorer
leur efficacité,
ce qui diminue d'autant la quantité de cellules prélevées initialement et
nécessaire pour
l'obtention des CSM greffées, ainsi que les temps de culture des cellules.
La périostine (POSTN ou PN) est une protéine d'adhésion de la matrice
extracellulaire, sécrétée notamment par les ostéoblastes et exprimée
préférentiellement
dans le périoste des os et le ligament péridontal des dents (voir pour revue
Kudo, 2011 et
Frangogianni, 2012). La périostine est également exprimée dans d'autres
tissus, tels que le
coeur, les glandes mammaires, les cellules stromales mésenchymateuses dérivées
de la
moelle osseuse (Coutu et al., 2008) et certaines cellules cancéreuses. Les
séquences
nucléotidique et peptidique des quatre isoformes connues de la périostine sont
disponibles
dans la base de données GENBANK, sous les numéros d'accès GI:209863034
(NP 001129408.1 ; isoforme 1), GI:209862911 (NP 001129406.1 ; isoforme 2),
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GI:209863011 (NP 001129407.1 ; isoforme 3) et GI:209863034 (NP 001129408.1 ;
isoforme 4). La périostine contient, de son extrémité N-terminale vers son
extrémité C-
tellninale : une séquence signal de sécrétion, un domaine riche en cystéine
(domaine EMI),
4 régions répétées homologues (domaines Fasciclin I (FAS1)) et un domaine
hydrophobe.
Les domaines FAS1 des protéines sont bien connus de l'homme du métier ; ils
sont
référencés par exemple dans la base de données EMBL-EBI sous le numéro d'accès
IPR000782 ou dans la base de données PFAM sous le numéro d'accès PF02469. Les
domaines FAS1 de la périostine ont notamment été décrits par Coutu et al.,
2008. La
périostine maintient la structure et l'intégrité des tissus de soutien (le
collagène) et
participe à la croissance osseuse. Kudo et al. (2004) ont montré chez le
poisson zèbre, que
l'inhibition de la traduction de l'ARNm de la périostine par un
oligonucléotide morpholino
antisens inhibe la formation du myoseptum dans l'embryon. Rios et al. (2005)
ont montré,
à l'aide de souris transgéniques knock-in n'exprimant pas la périostine,
que la
périostine est nécessaire pour le maintien de l'intégrité du ligament
péridontal en réponse à
un stress mécanique. Takayama et al. (2006) ont montré que l'expression de la
périostine
est induite par les cytokines TGF-I3 et/ou IL-4 et IL-13 exprimées en réponse
à
l'inflammation ou à un stress mécanique. En outre, l'augmentation de
l'expression de la
périostine dans les processus de réparation ou de remodelage tissulaire et de
fibrose peut
être due à une activation locale de TGF-(3 et de la voie de signalisation de
la protéine
morphogénétique osseuse (BMP) (voir pour revue Frangogianni, 2012). Par
ailleurs, il
semble que la périostine stimule la croissance cellulaire de plusieurs types
de cancer, tels
que le cancer du sein. Orecchia et al. (2011) ont montré in vitro que le
traitement des
cellules SKMEL-28 avec un anticorps monoclonal bloquant, dirigé contre le
motif YN
situé dans le deuxième domaine FAS1 de la périostine humaine, inhibe la
croissance
tumorale et réduit la densité vasculaire tumorale. Enfin, la Demande
Internationale
WO 2010/025555 décrit que la périostine peut être utilisée comme médicament
pour la
régénération du tissu pancréatique.
A la connaissance des inventeurs, aucune donnée ne lie la périostine à un
effet immunomodulateur des cellules exprimant cette protéine.
Les inventeurs se sont donnés pour but de modifier le potentiel
immunomodulateur des cellules possédant un potentiel immunomodulateur, et plus
particulièrement des cellules souches/stromales mésenchymateuses.
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Les inventeurs ont alors montré que l'inhibition de l'expression de la
périostine dans les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu
adipeux (ASC)
humain, non génétiquement transformées, peimet d'augmenter le potentiel
immunosuppresseur de ces cellules.
Les inventeurs ont aussi montré que le potentiel immunosuppresseur des
cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) humain,
non
génétiquement transfolinées, est inhibé lorsque la périostine est ajoutée à
ces cellules.
L'augmentation de l'expression de la périostine dans les ASC permet donc de
diminuer ou
d'inhiber le potentiel immunosuppresseur de ces cellules, c'est-à-dire de
conférer un
potentiel immunostimulateur à ces cellules.
Au regard de ces résultats obtenus avec les ASC utilisées comme cellules
modèles, les inventeurs ont donc mis en évidence, de manière inattendue, le
rôle de la
périostine dans le contrôle de l'activité paracrine des cellules possédant un
potentiel
immunomodulateur, notamment des cellules souches/stromales mésenchymateuses.
Ces
résultats montent aussi que la périostine peut être utilisée comme médicament
immunostimulateur et qu'un inhibiteur de la périostine peut être utilisé comme
médicament immunosuppresseur.
La présente invention a pour objet une cellule diploïde isolée possédant
un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de
la périostine
est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, pour son
utilisation comme
médicament.
De préférence, ledit médicament est un médicament immunosuppresseur
ou un médicament immunostimulateur.
On entend par cellule possédant un potentiel immunomodulateur une
cellule qui permet de diminuer ou augmenter les capacités naturelles du
système
immunitaire chez un organisme, c'est-à-dire de diminuer (immunosuppresssion)
les
défenses immunitaires naturelles lorsqu'elles peuvent nuire audit organisme,
ou au
contraire de les renforcer (immunostimulation) lorsqu'elles sont insuffisantes
ou
déprimées. Cette cellule se caractérise par sa capacité à agir sur les
effecteurs de
l'immunité. La détermination du potentiel immunomodulateur d'une cellule peut
être
effectuée par l'homme du métier à l'aide de techniques bien connues, telles
que
l'immunophénotypage et plus particulièrement et à titre d'exemple pour les
lymphocytes la
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réaction lymphocytaire mixte (MLR) mais aussi la réponse sous stimulation des
neutrophiles ; par exemple pour les cellules stromales mésenchymateuses, voir
Perico et
al., 2011; pour les cellules dendritiques, voir Zhao et al., 2012 ; pour les
cellules NK, voir
Abdelrazik et aL, 2011 ; pour les lymphocytes, voir Perico et al., 2011, Najar
et al., 2010,
Zhou et al., 2011 et Kronsteiner et al., 2011. Ladite cellule possédant un
potentiel
immunomodulateur (avant modulation de l'expression et/ou l'activité de la
périostine)
exprime la périostine. De préférence, ladite cellule possédant un potentiel
immunomodulateur exprime aussi au moins une molécule immunomodulatrice, telle
que
IFN-f3, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- p, galectine, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-
33,
AIRE ( autoimmune regulator ), hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAG1, bien connus de
l'homme du métier, de préférence IFN-P, IDO-1, TSG-6, HLA-G et IL-1RA. La
mesure de
l'expression de ces gènes dans une cellule peut être effectuée par RT-PCR, tel
que décrit
dans les Exemples ci-après.
De manière avantageuse, ladite cellule possédant un potentiel
immunomodulateur est choisie parmi une cellule stromale mésenchymateuse, une
cellule
progénitrice, une cellule précurseur, une cellule différenciée à partir d'une
cellule stromale
mésenchymateuse, un macrophage, un monocyte, un mastocyte, une cellule
myéloïde, un
fibroblaste, une cellule dendritique, un lymphocyte (par exemple un lymphocyte
Treg), une
cellule NK, une cellule lymphoïde et un myoblaste.
De manière avantageuse encore, ladite cellule stromale
mésenchymateuse est choisie parmi une cellule stromale mésenchymateuse dérivée
de la
moelle osseuse (BM-MSC), du tissu adipeux (ASC ou AD-MSC), d'un tissu solide,
du
placenta, du sang adulte ou du sang de cordon.
De préférence, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur
est une cellule de mammifère, de préférence encore une cellule humaine.
Bien entendu, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur
est une cellule vivante.
En outre, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur n'est
pas une cellule cancéreuse.
On entend par moduler l'expression et/ou l'activité de la périostine , la
modification de l'expression et/ou l'activité de la périostine par rapport à
une cellule
possédant un potentiel immunomodulateur, soit par inhibition totale ou
partielle de
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l'expression et/ou de l'activité de ladite périostine y compris par inhibition
de ses voies de
signalisation soit par augmentation de l'expression et/ou de l'activité de
ladite périostine
(surexpression de ladite périostine ou stimulation des voies de signalisation
de ladite
périostine).
Le choix par l'homme du métier d'inhiber ou d'augmenter l'expression
et/ou l'activité de ladite périostine comme indiqué précédemment s'effectue en
fonction du
résultat que l'on souhaite obtenir en termes d'immunomodulation, à savoir
respectivement
stimuler l'effet immunosuppresseur ou immunostimulateur de ladite cellule
possédant un
potentiel immunomodulateur. Ainsi, si l'homme du métier souhaite stimuler
l'effet
immunosuppresseur d'une cellule possédant un potentiel immunomodulateur, alors
il est
nécessaire d'inhiber l'expression et/ou l'activité de ladite périostine,
incluant l'inhibition
de ses voies de signalisation, dans ladite cellule. Si l'homme du métier
souhaite stimuler
l'effet immunostimulateur d'une cellule possédant un potentiel
immunomodulateur alors il
est nécessaire d'augmenter l'expression et/ou l'activité de ladite périostine,
incluant la
stimulation de ses voies de signalisation, dans ladite cellule.
La détermination du potentiel immunosuppresseur (ou des propriétés
immunosuppressives) ou du potentiel immunostimulateur (ou des propriétés
immunostimulatrices) d'une cellule selon la présente invention peut être
réalisée en
mesurant l'expression des ARNm des gènes impliqués dans l'immunomodulation,
tels que
les gènes codant pour les protéines IFN-fl, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- p,
galectine, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-33, AIRE, hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAG1, ou
en
mesurant le contenu de ces protéines dans cette cellule.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule isolée
possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou
l'activité de la
périostine est totalement ou partiellement inhibée, ou le surnageant de
culture de cette
cellule, est utile comme médicament immunosuppresseur destiné à la
régénération
(reconstruction) d'un tissu, la greffe d'organe (pour limiter les rejets),
telle que la
transplantation rénale, ou dans le traitement :
- de la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD),
- des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la
maladie de Crohn, la maladie c liaque et le syndrome de l'intestin irritable ;
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- des rhumatismes inflammatoires chroniques, tels que l'arthrite, la
polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante et le rhumatisme
psoriasique ;
- des maladies inflammatoires chroniques du système
nerveux central,
telles que la sclérose en plaque et la sclérose latérale amyotrophique ;
- du lupus ;
- des thyroïdites auto-immunes ;
- des fistules anales complexes ;
- des réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type
IV;
- des allergies ;
- des cicatrices inflammatoires, telles que les cicatrices
hypertrophiques ;
- des nécroses tissulaires ;
- des maladies auto-immunes, telles que l'encéphalite auto-immune, la
colite auto-immune et le lupus érythémateux systémique ;
- des ulcères ;
- du diabète ;
- des infections microbiennes, dues par exemples à une bactérie, un
parasite protozoaire ou un virus.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule
isolée, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine, incluant
ses voies de
signalisation, est augmentée, ou le surnageant de culture de cette cellule,
est utile comme
médicament immunostimulateur destiné à la vaccination, c'est-à-dire un
adjuvant vaccinal
ou destiné au traitement :
- d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire ;
- d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines ;
- d'un déficit isolé en lymphocytes T;
- d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase ;
- d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en
adénosine
désaminase ;
- de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression
variable.
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La périostine est bien connue de l'homme du métier. Les séquences
d'acides aminés des quatre isoformes de la périostine humaine sont disponibles
dans la
base de données GANBANK sous les numéros d'accès GI:209863034 (NP 001129408.1
;
isoforme 1), GI:209862911 (NP 001129406.1 ; isofonne 2), GI:209863011
(NP 001129407.1 ; isoforme 3) et GI:209863034 (NP 001129408.1 ; isoforme 4).
Au sens de la présente invention, on entend par périostine , ces quatre
isoformes et leurs variants (ou mutants) fonctionnels.
La fonction d'un variant (ou mutant) de la périostine peut être déterminée
selon des méthodes connues de l'homme du métier (voir pour revue Kudo et al.,
2011).
L'inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de la
périostine peut être obtenue de diverses manières, par des méthodes connues en
elles
mêmes.
Cette inhibition peut être obtenue en intervenant en amont de la
production de la périostine, par mutagenèse du gène codant pour cette
protéine, ou bien par
inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de la
périostine.
La mutagenèse du gène codant pour la périostine peut intervenir au
niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression,
notamment
du promoteur. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie
dudit gène
et/ou à l'insertion d'une séquence exogène (voir par exemple Rios et al.,
2005).
On peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles
avec des agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Ces mutations
ont pour
conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop
dans la
séquence et/ou de modifier le niveau de la transcription et/ou de la
traduction du gène et/ou
de rendre la périostine moins active que la périostine sauvage. Les allèles
mutés du gène
codant pour la périostine peuvent être identifiés par exemple par PCR à l'aide
d'amorces
spécifiques dudit gène (voir par exemple Rios et al., 2005).
On peut aussi effectuer une mutagenèse dirigée, ciblant un gène codant
pour ladite périostine. L'inhibition ou la modification de la transcription
et/ou de la
traduction peuvent être obtenues par l'expression d'ARNs sens, antisens ou
double-brin
dérivés du gène de ladite périostine, ou de l'ADNc de cette protéine, ou bien
par
l'utilisation d'ARNs interférents.
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Les techniques de modifications génétiques des cellules sont connues de
l'homme du métier. A titre d'exemple, Casteilla et al., 2008, décrit une
méthode de
transfert de gène dans les cellules dérivées du tissu adipeux à l'aide de
vecteurs viraux.
Selon ce mode de mise en oeuvre de la présente invention, on peut utiliser
une construction d'ADN recombinant, comprenant un ou plusieurs polynucléotides
capables d'inhiber l'expression de la périostine. A titre d'exemples non
limitatifs, lesdits
polynucléotides peuvent coder pour des ARN antisens, tels que des
oligonucléotides
antisens morpholino, des ARN en épingle à cheveux, des ARN interférents (ARN
double
brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides), des shRNA, des
micro-
ARN (ARN simple brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25
nucléotides), des
aptamères, ou des ribozymes ciblant un gène codant pour la périostine.
De préférence, ledit polynucléotide capable d'inhiber l'expression de la
périostine est un ARN interférent (ARNi ou siRNA ).
Selon une disposition avantageuse, on peut utiliser l'ARNi de séquence
SEQ ID NO : 1.
L'homme du métier dispose d'un très large choix d'éléments utilisables
pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant conformes à ce mode de
mise en
oeuvre de l'invention.
On peut également utiliser des anticorps bloquant dirigés contre la
périostine ou des inhibiteurs de la périostine. De tels anticorps sont décrit
par Zhu et al.,
2011 et Orecchia et al., 2011.
L'augmentation de l'expression (i.e., surexpression) et/ou de l'activité de
la périostine dans une cellule possédant un potentiel immunomodulateur telle
que définie
ci-dessus, peut être effectuée par la modification du génome de ladite
cellule, par
stimulation des voies de signalisation de la périostine dans ladite cellule ou
par l'utilisation
de médiateurs induisant l'expression de la périostine.
Cette modification du génome peut notamment s'effectuer par
transformation génétique de ladite cellule par une ou plusieurs copies d'un
polynucléotide
codant pour ladite périostine, associé à des séquences de régulation en cis de
son
expression. La surexpression de ladite périostine peut également être obtenue
par
modification des séquences de régulation en cis de l'expression de ladite
périostine, par
exemple en remplaçant son promoteur endogène par un promoteur plus fort,
permettant un
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niveau de transcription plus élevé, ou bien en adjoignant au promoteur
endogène des
séquences activatrices de la transcription, de type amplificateur , ou de
la traduction.
Selon une modalité de ce mode de mise en oeuvre de la présente
invention, on utilise une cassette d'expression, comprenant un polynucléotide
codant pour
une périostine telle que définie ci-dessus, placé sous le contrôle
transcriptionnel d'un
promoteur approprié. Ledit promoteur peut être un promoteur hétérologue. Dans
ce cas, on
peut utiliser par exemple un promoteur constitutif, tel que les promoteurs
CMV, f3-actine,
EF1-a, PGK et de l'Ubiquitine C, un promoteur spécifique d'un tissu donné ou
un
promoteur localement inductible.
On peut également utiliser des vecteurs recombinants, résultant de
l'insertion d'une cassette d'expression telle que décrite ci-dessus dans un
vecteur hôte.
Les cassettes d'expression et vecteurs recombinants tels que décrits ci-
dessus peuvent, bien entendu, comprendre en outre d'autres séquences,
usuellement
employées dans ce type de constructions. Le choix de ces autres séquences sera
effectué,
de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères
tels que les
cellules-hôtes choisies, les protocoles de transformation envisagés, etc.
On citera, à titre d'exemples non limitatifs, les terminateurs de
transcription et les séquences de tête (séquences leader ). Ces séquences
peuvent être
celles qui sont naturellement associées au gène codant la périostine telle que
définie ci-
dessus, ou bien peuvent être des séquences hétérologues. Ces séquences
n'interviennent
pas sur les propriétés spécifiques du promoteur ou du gène auxquelles elles
sont associées,
mais peuvent améliorer globalement qualitativement ou quantitativement, la
transcription,
et le cas échéant, la traduction. On peut également, dans le but d'augmenter
le niveau
d'expression, utiliser des séquences amplificatrices (séquences enhancer )
de la
transcription et de la traduction.
Panni les autres séquences couramment employées dans la construction
de cassettes d'expression et vecteurs recombinants, on citera également les
séquences
permettant le suivi de la transformation, et l'identification et/ou la
sélection des cellules
transformées.
La stimulation de la voie de signalisation de la périostine peut être
effectuée en stimulant la voie de signalisation de TGF-13 ou la voie de
signalisation de la
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protéine morphogénétique osseuse (BMP) dans ladite cellule immunomodulatrice
(voir
pour revue Frangogiannis, 2012).
A titre d'exemples de médiateurs induisant l'expression de périostine, on
peut citer l'angiotensine II, les cytokines IL-4 et IL-13 (voir pour revue
Frangogiannis,
2012).
Le surnageant de culture d'une cellule isolée possédant un potentiel
immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine
est modulée,
telle que définie ci-dessus, peut être obtenu par culture de ladite cellule
dans un milieu de
culture approprié, et récupération et filtration du surnageant de culture.
La présente invention a également pour objet une composition
pharmaceutique comprenant une cellule isolée possédant un potentiel
immunomodulateur
dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou
le surnageant de
culture de ladite cellule, tels que définis ci-dessus et au moins un véhicule
pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, ledit
véhicule pharmaceutiquement acceptable est adapté à la thérapie cellulaire. La
préparation
de cellules stromales pour leurs utilisations en thérapie cellulaire est bien
connue de
l'homme du métier (Le Blanc et al., 2008, Constantin et al., 2009, Garcia-Olmo
et al.,
2009, Gonzàlez et al., 2009a et 2009b et Karussis et al., 2010).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une cellule
isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression
et/ou l'activité
de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule,
ou d'une
composition pharmaceutique, tels que définis ci-dessus, pour la fabrication
d'un
médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une méthode pour la
régénération d'un tissu, la greffe d'organe ou pour traiter ou prévenir une
maladie telles
que définie ci-dessus, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité
thérapeutiquement efficace d'une cellule isolée possédant un potentiel
immunomodulateur
dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou
le surnageant de
culture de ladite cellule, ou d'une composition pharmaceutique tels que
définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation in vitro d'une
cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle
l'expression et/ou
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l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, pour
identifier (ou
cribler) un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
La présente invention a également pour objet un modèle in vitro pour
réaliser des tests pharmacologiques ou toxicologiques, comprenant une cellule
isolée
possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou
l'activité de la
périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, pour identifier (ou
cribler) un produit
modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
La présente invention a également pour objet
-
une protéine choisie parmi la périostine et une protéine comprenant
le premier, deuxième, troisième et/ou quatrième domaine FAS1,
préférentiellement le
deuxième domaine FAS1, de la périostine, de préférence la périostine,
-
une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codant
pour ladite protéine ou
- une composition pharmaceutique comprenant ladite protéine ou
ladite molécule d'acide nucléique, et au moins un véhicule pharmaceutiquement
acceptable, pour son utilisation comme médicament immunostimulateur destiné à
la
vaccination, c'est-à-dire un adjuvant vaccinal ou dans le traitement d'un
cancer ou d'une
infection liés à un déficit immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en
immunoglobulines, d'un déficit isolé en lymphocytes T, d'un déficit en purine
nucléoside
phosphorylase, d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en
adénosine
désaminase, ou de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
L'invention englobe la périostine naturelle, recombinante ou synthétique.
Par périostine recombinante on entend la périostine produite par
génie génétique, par exemple par clonage et amplification génique.
Par périostine synthétique on entend la périostine produite par
synthèse enzymatique et/ou chimique.
Ladite périostine peut être d'origine humaine telle que décrite ci-dessus,
ou d'origine animale.
La molécule d'acide nucléique codant pour ladite protéine est obtenue par
des méthodes classiques, connues en elles-mêmes de l'homme du métier, en
suivant les
protocoles standards (voir par exemple la Demande Internationale WO
2010/025555).
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Ladite molécule d'acide nucléique peut se présenter sous la foime d'un
vecteur recombinant eucaryote ou procaryote, comprenant un insert constitué
par un
polynucléotide codant pour la périostine. De nombreux vecteurs dans lesquels
on peut
insérer un polynucléotide d'intérêt afin de l'introduire et de le maintenir
dans une cellule
hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur
approprié
dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple expression de
cette
séquence ou intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que
de la nature
de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des vecteurs viraux ou non-
viraux comme
des plasmides.
De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans
lequel ledit polynucléotide est placé sous le contrôle d'éléments régulateurs
de la
transcription et de la traduction appropriés.
La présente invention a également pour objet un inhibiteur de la
périostine sélectionné dans le groupe constitué par un anticorps bloquant anti-
périostine, un
ARN antisens, un oligonucléotide antisens morpholino, un ARN en épingle à
cheveux, un
ARN interférent (ARNi), un aptamère dirigés contre la périostine, ou une
composition
pharmaceutique comprenant ledit inhibiteur et au moins un véhicule
pharmaceutiquement
acceptable, pour son utilisation comme médicament immunosuppresseur destiné à
la
régénération d'un tissu, à la greffe d'organe ou dans le traitement d'une
maladie choisie
dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies
inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires
chroniques, les
maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les
thyroïdites
auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de
type
hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les
allergies, les
nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et
les infections
microbiennes.
La préparation d'anticorps anti-périostine est connue de l'homme du
métier (voir Demande EP 2168599 Al). A titre d'exemple, d'anticorps bloquant
anti-
périostine humaine ont peut cités ceux décrits par Orecchia et al., 2011 et
Zhu et al., 2011.
Selon une disposition avantageuse, on peut utiliser l'ARNi de séquence
SEQ ID NO : 1.
A titre d'exemples non limitatifs de véhicule pharmaceutiquement
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acceptable, on peut citer les dispersants, solubilisants, stabilisants,
conservateurs, etc. Des
véhicules pharmaceutiquement acceptables utilisables dans des formulations
(liquides et/ou
injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose,
l'hydroxyméthylcellulose, la
carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la
gélatine, le
lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc.
Ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique peut se
présenter sous la forme d'une solution saline, physiologique, isotonique et
tamponnée,
compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier.
La quantité de ladite protéine ou dudit inhibiteur de la périostine utilisée
à titre de médicament selon l'invention ou présente dans la composition
pharmaceutique
selon l'invention peut être modulée de façon à obtenir un taux circulant de
principe actif
(dans un liquide physiologique tel que le sang) nécessaire à l'obtention de
l'effet
thérapeutique désiré pour un sujet particulier. La quantité choisie dépendra
de multiples
facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée
d'administration, du
moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du composé, du ou des
différents
produits utilisés en combinaison avec ledit médicament ou ladite composition
pharmaceutique, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient,
ainsi que de son
histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine.
Le médicament ou la composition pharmaceutique selon la présente
invention peut être utilisé seul ou en association avec au moins un autre
composé
thérapeutiquement actif, tel que par exemple un antigène ou un second composé
immunostimulateur ou immunosuppresseur selon l'utilisation désirée du
médicament.
L'utilisation dudit médicament ou de ladite composition pharmaceutique, et
dudit composé
thérapeutiquement actif peut être simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement
ou de prévention, chez un sujet, d'un cancer ou d'une infection liés à un
déficit
immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, d'un
déficit isolé en
lymphocytes T, d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, d'un déficit
immunitaire
combiné sévère par déficit en adénosine désaminase ou de
l'hypogammaglobulinémie
commune d'expression variable, comprenant l'administration audit sujet d'une
quantité
thérapeutiquement efficace de ladite composition pharmaceutique comprenant
ladite
protéine (la périostine ou une protéine comprenant 1, 2, 3 ou 4 domaines FAS1
de la
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périostine) ou une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codant
pour ladite
protéine, telle que définie ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une méthode de
régénération d'un tissu, de greffe d'un organe ou de traitement ou de
prévention d'une
maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre
l'hôte, les
maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes
inflammatoires
chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central,
le lupus,
les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions
asthmatiques de
type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les
allergies, les
nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et
les infections
microbiennes, chez un sujet, comprenant l'administration audit sujet d'une
quantité
thérapeutiquement efficace de ladite composition pharmaceutique comprenant un
anticorps
bloquant anti-périostine, un ARN antisens, un oligonucléotide antisense
morpholino, un
ARN en épingle à cheveux, un ARN interférent (ARNi), un aptamère dirigés
contre la
périostine, telle que définie ci-dessus
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend d'autres
dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère
à des exemples
montrant in vitro l'effet de la modulation de l'expression de la périostine
dans les cellules
stromales mésenchyrnateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) sur le potentiel
immunomodulateur de ces cellules, ainsi qu'aux figures annexées, dans lesquels
:
- la Figure 1 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la
quantité
d'ARNm codant pour PUM1 (utilisé comme contrôle) dans les ASC traitées. A. La
moyenne écart type à la moyenne (sem) après normalisation des valeurs est
représentée
sur le graphique. B. Le tableau représente les valeurs individuelles mesurées.
- la Figure 2 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la
quantité
d'ARNm codant pour la périostine dans les ASC traitées. A. La moyenne écart
type à la
moyenne (sem) est représentée après noimalisation des valeurs sur le
graphique. B. Le
tableau représente les valeurs individuelles mesurées.
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- la Figure 3 représente l'effet in vitro du traitement des ASC avec le
ligand TLR3 Poly(I:C) seul ou en combinaison avec la périostine (POSTN) à une
dose de
1, 2, 4, ou 10 kig/ml, sur l'expression de l'ARNm POSTN (A) et IDO1 (B).
- la Figure 4 représente le dosage de l'IDO-1 dans le surnagent de
culture d'ASC traitées avec unARNi dirigé contre POSTN (siRNA POSTN) ou un
ARNi
non spécifique contrôle (siRNA scramble).
-
la Figure 5 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la
quantité
d'ARNm codant pour POSTN, IDO1 (IDO) et IFN-13 (IFNB) dans les BM-MSC
traitées.
- la Figure 6 représente (A) l'effet in vitro du traitement des ASC
avec l'IFNy (A) à une dose de 4, 20, 100 ou 500 Ul/ml sur l'expression de
PARNm
POSTN et (B) l'effet in vitro du traitement des ASC avec l'IFNy à une dose de
100 Ul/ml
en combinaison avec la périostine (POSTN) à une dose de 1, 2, 4, ou 10 tg/ml,
sur
l'expression de l'ARNm IDO1.
EXEMPLE 1: EFFET IN VITRO DE L'INHIBITION DE L'EXPRESSION DE LA
PERIOSTINE DANS LES CELLULES STROMALES MESENCHYMATEUSES
DERIVEES DU TISSU ADIPEUX (ASC)
1) Matériels et méthodes
Isolement des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu
adipeux humain (ASC)
La fraction stroma vasculaire (SVF) a été isolée à partir de tissu adipeux
sous-cutané humain par digestion avec la collagénase NB4 (0,4 U/m1 final dans
le milieu
a-MEM + Ciprofloxacine 10 pg/rnl final [= milieu a-MEM OK]) pendant 45 min à
37 C
sous agitation. La digestion a été arrêtée en utilisant le milieu a-MEM OK
froid. La
suspension cellulaire a ensuite été filtrée à travers une membrane de nylon
100 m. Après
centrifugation pendant 10 min à 1600 rpm, les cellules ont été reprises dans
le milieu de
culture CPM (a-MEM OK + Héparine 1 U/ml + 2% de plasma enrichi en facteur de
croissance plaquettaire) et comptées sur un automate Countesse, selon les
informations du
fabricant (LifeTechnologies).
Les cellules de la SVF ont été étalées à une densité de 4000 cellules/cm2
dans le milieu CPM. Après 12h de culture à 37 C et 5% de CO2, les cellules non
adhérentes ont été retirées par lavage au PBS (phosphate-buffered saline). La
fraction
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adhérente a ensuite été mise en culture in vitro dans le même milieu de
culture CPM ; le
milieu étant renouvellé trois fois par semaine. Après 8 jours de culture, les
ASC (passage
0) ont été récoltées avec de la trypsine-EDTA (LifeTechnologies). Le nombre de
cellules
viables a été déterminé par l'exclusion du Trypan bleu sur un automate
Countesse. Les
cellules ont ensuite été étalées à une densité de 2000 cellules/cm2 et
cultivées pendant 2
jours supplémentaires (passage 1). Le traitement avec l'ARNi (siRNA) a ensuite
été
effectué.
Isolement des cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle
osseuse (BM-MSC)
Des cellules de moelle osseuse nucléées humaines ont d'abord été
ensemencées à raison de 5x104 cellules/cm2 dans un milieu de culture
consistant en le
milieu essentiel minimum alpha (aMEM) supplémenté par 10% de sérum filtré de
veau
foetal (SVF ; Hyclone), 1 ng/ml de facteur de croissance fibroblastique 2
(FGF2, R&D
Système, Lille, France), et 10 p,g/mL de la ciprofloxacine. Tout le milieu a
été renouvelé
deux fois par semaine jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence
(fin de PO).
Ensuite, les cellules ont été détachées à l'aide de la trypsine. Les cellules
viables ont été
numérotées et réensemencés à 500 cellules/cm2 (passage Pl).
Traitement avec l'ARNi
L'ARNi dirigé contre la périostine (POSTN) a été fourni par SIGMA
(MISSION esiRNA Human POSTN, EHU069741). Cet ARNi est dirigé contre les 4
isfoimes de la périostine humaine. L'ARNi non spécifique AF488 a été fourni
par
QIAGEN (siARN AllStarNeg AF488).
Après 2 jours de culture, le milieu de culture des ASC ou des BM-MSC a
été remplacé par le milieu de culture pour le traitement avec l'ARNi, préparé
comme décrit
ci-dessous.
Brièvement, 2 1 d'ARNi à 28 p,M ont été dilués dans 100 pl de milieu
a-MEM OK, mélangés au vortex pendant 10 secondes et ensuite mélangés avec 12
p,1 de
réactif HiPerfect (QIAGEN). Après mélange à nouveau au vortex, la suspension
obtenue a
été laissée 10 min à température ambiante avant d'être mélangée à 2 ml de
milieu CPM.
Les cellules ASC ont alors été ajoutées à ce milieu. Les cellules ont ensuite
été cultivées 4
jours dans ce milieu à 37 C et 5% de CO2.
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Extraction des ARN
Après 4 jours de culture, le milieu de culture des a été retiré et les
cellules ont été congelées à -80 C. L'extraction des ARNs a été effectuée
selon les
instructions du fabricant (RNeasy minikit, QIAGEN). Les ARN ont été quantifiés
à l'aide
de l'automate Nanodrop (ThermoScientific) et 1 tig dARN a été rétro-transcrit
en utilisant
le kit SuperScript One Step RT selon les recommandations du fabricant
(LifeTechnologies).
RT-PCR quantitative (RT-qPCR)
La quantification des ADNc a été réalisée en utilisant la technologie
StepOnePlus et le Mix SybrGreen selon les instructions du fabricant
(LifeTechnologies).
Amorces
Les amorces utilisées pour la quantification des ARN sont les suivantes:
Tableau 1 :
Gène Amorce sens 5'-3' Amorce antisens 5'-3'
PUMI AGTGGGGGACTAGGCGTTAG GTTTTCATCACTGTCTGCATCC
(SEQ ID NO : 2) (SEQ ID NO : 3)
IFN-fl CCTGTGGCAATTGAATGGG GGCGTCCTCCTTCTGGAAC
(SEQ BD NO :4) (SEQ ID NO: 5)
IDO1 GCCTGATCTCATAGAGTCTGGC TGCATCCCAGAACTAGACGTGC
(SEQ ID NO :6) (SEQ ID NO: 7)
TSG6 TCACCTACGCAGAAGCTAAGGC TCCAACTCTGCCCTTAGCCATC
(SEQ LD NO : 8) (SEQ ID NO : 9)
HLA-G GAAGAGGAGACACGGAACACCA TCGCAGCCAATCATCCACTGGA
(SEQ ID NO : 10) (SEQ ID NO : 11)
IL-1RA ATGGAGGGAAGATGTGCCTGTC GTCCTGCT FI CTGTTCTCGCTC
(SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13)
AIRE CAGACCATGTCAGCTTCAGTCC ACCTGGATGCACTTCTTGGAGC
(SEQ II) NO: 14) (SEQ ID NO: 15)
POSTN CAGCAAACCACCTTCACGGATC TTAAGGAGGCGCTGAACCATGC
(SEQ ID NO : 16) (SEQ ID NO : 17)
Pumillo-1 (PUM1) est utilisé en tant que gène de référence.
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Analyses statistiques
Les résultats des RT-PCR quantitatives sont exprimés en valeurs
moyennes écart type à la moyenne (sem). L'analyse de la significativité a
été effectuée en
utilisant le test de Mann 84 Whitney ou le test t de Student (Prism 5
logiciels). (* P <0,05,
** P <0,01).
Activité de l'ID dans le surnageant de culture d'ASC traitées avec
l'ARNi dirigé contre POSTN
L'activité de 1'IDO-1 (indoleamine 2,3-dioxygénase 1) a été déterminée
par chromatographie en phase liquide à haute performance en mesurant la
concentration en
kynurénine dans le surnageant de culture des ASC traitées avec l'ARNi dirigé
contre
POSTN ou un ARNi non spécifique, et en utilisant la 3-nitro-L-tyrosine comme
étalon
interne. La kynurénine et la 3-nitro-L-tyrosine ont été détectées par
absorption UV à 360
nm.
2) Résultats
Le traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN n'induit pas de
modification significative de l'expression de PUM1 par rapport au traitement
avec l'ARNi
non spécifique (voir Figure 1). L'ARNi non spécifique peut donc être utilisé
comme ARNi
contrôle.
La quantité d'ARNm codant pour la périostine a ensuite été déterminée
par RT-qPCR après le traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN ou
l'ARNi
non spécifique. Les résultats sont représentés à la Figure 2. Ces résultats
montrent que le
traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN est efficace pour inhiber
l'expression de POSTN dans ces cellules.
La quantité d'ARNm codant pour différentes protéines
immunosuppressives a ensuite été déterminée par RT-qPCR après le traitement
des ASC
avec l'ARNi dirigé contre POSTN ou l'ARNi non spécifique. Les résultats sont
représentés
au Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : effet de l'ARNi dirigé contre POSTN et de l'ARNi non spécifique
contrôle sur
la quantité d'ARNm codant pour la périostine (POSTN) et différentes protéines
immunosuppressives dans les ASC traitées. Les moyennes écart type après
normalisation
des valeurs mesurées sont représentées.
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ARNi non spécifique ARNi POSTN
Protéine Moyenne sem Moyenne sem
POSTN 1,00 0,00 0,08 0,03
IFN-P 1,00 0,00 289,38 120,77
IDO-1 1,00 0,00 92,74 72,18
TSG-6 1,00 0,00 1,89 0,59
HLA-G 1,00 0,00 3,70 1,64
IL-1RA 1,00 0,00 4,00 1,81
AIRE 1,00 0,00 2,15 0,48
Ces résultats montrent que l'inhibition de l'expression de POSTN par
une stratégie d'ARN interférent induit une très forte augmentation de
l'expression de
1'IFN-13 (Interféron béta) et de l'IDO-1 (Indoléamine- 2,3-dioxygénase 1) et
une
augmentation de l'expression de TSG-6 ( Tumor necrosis factor-inducible gene
6
protein ), HLA-G (Antigène du complexe majeur d'histocompatibilité, Classe I,
G), IL-
1RA (Antagoniste au récepteur de l'Interleukine-1) et AIRE ( Autoimmune
regulator ).
Ces résultats suggèrent que la périostine contrôle l'expression des gènes
codant IFN-f3 et l'IDO-1, qui possèdent des propriétés immunosuppressives. Ces
résultats
suggèrent également que la périostine contrôle l'activité immunomodulatrice
des ASC.
En outre, l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN
interférent induit une très forte augmentation de l'activité de 1'IDO-1 dans
le surnageant de
culture des ASC traitées avec l'ARNi dirigé contre POSTN (voir Figure 4).
Dans la mesure où les ASC possèdent des caractéristiques similaires aux
autres cellules souches/stromales mésenchymateuses, et aux cellules
progénitrices, cellules
précurseurs, cellules différenciées à partir d'une cellule stromale
mésenchyrnateuse,
macrophages, monocytes, mastocytes, cellules myéloïdes, fibroblastes, cellules
dendritiques, lymphocytes (par exemple lymphocytes Treg), cellules NK,
cellules
lymphoïdes et myoblastes, il est probable que la périostine joue également un
rôle dans la
modulation des propriétés immunosuppressives de ces cellules.
Des résultats similaires ont d'ailleurs été obtenus avec des cellules
stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC) : l'inhibition
de
l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN interférent a induit une très
forte
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augmentation de l'expression de l'IDO-1 et de l'IFN-P par les BM-MSC (voir
Figure 5).
L'effet de la modulation de l'expression de la périostine sur le potentiel
immunomodulateur des cellules n'est donc pas spécifique aux cellules stromales
mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC), mais s'exerce aussi
notamment sur
les cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC).
Par ailleurs, il a été montré que les cellules stromales mésenchymateuses
humaines présentent des fonctions d'effecteurs antimicrobiens induites par
l'indoléamine-
2,3-dioxygénase (IDO), contre différents pathogènes, tels que les bactéries,
les parasites
protozoaires et les virus (Meisel et al., 2011 et Krampera, 2011).
Les résultats obtenus ci-dessus suggèrent par conséquent qu'une cellule
isolée possédant un potentiel immunomodulateur, de préférence une ASC, dans
laquelle
l'expression et/ou l'activité de la périostine est inhibée présente des
propriétés anti-
microbiennes, dans la mesure où l'expression d'IDO-1 est significativement
augmentée
dans ladite cellule.
EXEMPLE 2: EFFET IN VITRO DE L'AJOUT DE LA PERIOSTINE DANS LES
ASC TRAITES AVEC LE LIGANG TLR3
I) Matériels et méthodes
L'isolement des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu
adipeux humain (ASC) a été effectué comme précédemment décrit à l'Exemple 1-1
ci-
dessus, à l'exception que les cellules de la SVF ont été étalées à une densité
de 2000
cellules/cm2 et cultivées pendant 5 jours supplémentaires (passage 1) avec un
changement
de milieu de culture au bout de 2 jours.
Après les 5 jours de culture en passage 1, les cellules ont été traitées avec
du Poly(I:C) qui est un ligand de TLR3 (InvivoGen, Poly(I:C)-LMW) et/ou la
périostine
(POSTN ; R&D SYSTEMS, Reconbinant Human Periostin/OSF-2). Le milieu utilisé
pour
le traitement est le milieu CPM additionné de Poly(I:C) à une concentration de
500 g/mi
et/ou de la périostine (POSTN) à une concentration de 1, 2, 4 ou 10 ltg/m1.
Après 24 heures de traitement le milieu a été retiré et les cellules ont été
congelées à -80 C. L'extraction des ARNs IDO1 et la RT-qPCR ont été effectuées
comme
précédemment (voir Exemple 1-1 ci-dessus).
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2) Résultats
Les résultats sont représentés à la Figure 3.
Les propriétés immunosuppressives des ASC ont été stimulées par l'ajout
de Poly(I:C).
L'ajout de doses croissantes de périostine inhibe l'effet de Poly(I:C) sur
l'expression d' ID01.
Ces résultats montrent que lorsque l'on stimule l'effet
immunosuppresseur, l'ajout de POSTN inhibe cet effet.
Des résultats similaires ont été obtenus en remplaçant le Poly(I:C) par
l'IFNy (R&D SYSTEMS), qui est un stimulus capable d'induire aussi la
production de
l'IDO-1. En effet, l'ajout d'IFN7 a induit une diminution de l'expression de
POSTN par les
ASC (mesurée par RT-qPCR) de manière dose-dépendante et l'ajout de POSTN dans
le
surnagent de culture des ASC a inhibé l'expression de l'IDO-1 induite par
l'IFNy (voir
Figure 6). Ces résultats montrent que l'effet de POSTN n'est pas spécifique à
TLR3.
L'augmentation de l'expression de la périostine dans les cellules
stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) peiinet donc de
diminuer le
potentiel immunosuppresseur de ces cellules.
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