Note : Les descriptions sont présentées dans la langue officielle dans laquelle elles ont été soumises.
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Synthétases de la colistine et cluster de gènes correspondants
La présente invention concerne des gènes et enzymes bactériennes impliqués
dans la synthèse de polymyxine E, une molécule antibiotique utilisée en
thérapie contre les
infections à bactéries Gram-négatives.
ART ANTERIEUR
Les polymyxines sont des molécules antibiotiques isolées à partir de Bacillus
species ou de Paenibacillus species. Ces molécules sont des lipopeptides,
constitués :
- d'une chaine peptidique comprenant dix acides aminés, organisés en un
heptapeptide cyclique et une chaine latérale de trois acides aminés, et
- d'un acide gras fixé à l'extrémité N-terminale du peptide.
Au moins 16 types de polymyxines ont été identifiés depuis la découverte de
la polymyxine B en 1947. Parmi elles, les polymyxines B et E ont une activité
antimicrobienne sur la plupart des souches d'Escherichia cou i et de
Pseudomonas
aeruginosa, ainsi que sur toutes les souches de Salmonelles, Shigelles, et de
nombreuses
bactéries Gram-négatives. Ces antibiotiques ont donc été utilisés comme agents
thérapeutiques dans de nombreux cas. Malheureusement, leurs effets toxiques
sont tels
qu'ils ont été peu à peu remplacés par des antibiotiques mieux tolérés.
La figure 3 montre la structure générale des polymyxines, et les deux acides
aminés spécifiques sont indiqués X et Y. Comme indiqué, la polymyxine B et E
diffèrent
par un seul acide aminé, le résidu 'X' étant une phenylalanine pour la
polymyxine B et
une leucine pour la polymyxine E, le résidu 'Y' pouvant être une leucine,
isoleucine ou
valine.
En raison de la demande croissante de nouveaux antibiotiques pour lesquels il
n'existe pas encore de résistance dans la population, de nouveaux agents
antibiotiques sont
recherchés, et les polymyxines sont de nouveau utilisées en clinique dans la
lutte contre
les bactéries Gram-négatives multi-résistantes.
La colistine ou polymyxine E, identifiée sous le numéro CAS 1264-72-8, et
telle que décrite dans la demande de brevet WO 1998/020836, est un
antibiotique de la
famille des polymyxines, permettant de traiter les infections dues aux
bactéries Gram-
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négatives multi-résistantes. Sa structure peptidique est indiquée en figure 1.
Administrée
par voie injectable, la colistine est utilisée dans la prise en charge des
infections neuro-
méningées, des infections urinaires, des infections urogénitales, des
septicémies et des
surinfections de plaies, brûlures et ulcères. Administrée par inhalation, la
colistine est
utilisée dans la prise en charge d'infections pulmonaires, notamment celles
liées à la
mucoviscidose. Enfin, en association avec de l'hydrocortisone et de la
bacitracine, la
colistine est utilisée pour traiter les infections bactériennes et
inflammatoires de l'oeil,
ainsi que les infections en chirurgie ophtalmique.
La colistine est responsable de nombreux effets indésirables, notamment des
effets néphrotoxiques et neurotoxiques. Ces effets toxiques sont imputables au
caractère
cationique de cette molécule, qui contient cinq charges positives, mais
également au faible
degré de pureté de la molécule, produite en fermenteur par culture de la
souche originelle
bactérienne la synthétisant, et purifiée à partir du milieu de fermentation.
En effet, les polymyxines sont actuellement obtenues par isolement et
purification à partir de milieux de culture de souches bactériennes produisant
ces
molécules, notamment des souches de Paenibacillus polymyxa. La purification de
la
molécule à partir des milieux de fermentation est insatisfaisante, et c'est
pourquoi de
nouvelles techniques de production sont envisagées. Notamment, des travaux
sont menés
pour identifier et cloner les gènes codant pour les polymyxines synthétases.
Les polymyxines synthétases font partie de la famille des Non-Ribosomal
Peptide Synthétases (NRPS) ; les gènes codant pour ces synthétases sont
organisés en
cluster comprenant plusieurs modules, dont l'ordre et la spécificité
déterminent la
structure du produit peptidique. Les NRPS permettent la synthèse de peptides
présentant
une variété structurale plus large que celle qui pourrait être obtenue si ces
peptides étaient
traduits à partir d'ARN messager par des ribosomes. De plus, les peptides
ainsi produits
peuvent subir des modifications notamment par la création de liaisons avec des
acides
hydroxyles, et des oxydations dans la chaine peptidique permettant d'obtenir
des
structures cycliques ainsi que des acylations, des glycosylations, et une N-
méthylation des
résidus.
De tels complexes NRPS ont été décrits chez de nombreux micro-organismes
et sont impliqués dans la production de la tyrocidine, la gramicidine, la
vancomycine, la
pénicilline, et les fusaricidines.
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Les synthétases NRPS sont constituées de différents modules. Chaque module
est capable d'activer un acide aminé, éventuellement de le modifier et de le
transférer
ensuite sur l'acide aminé activé dans le module adjacent pour constituer un
peptide.
Chaque module est composé de plusieurs domaines et permet l'incorporation d'un
acide
aminé particulier dans le peptide en cours d'élongation. Chaque module
contient au
minimum 3 domaines :
= un domaine d'adénylation (A) : domaine central dans l'action des peptides
synthétases. Il permet la fixation d'un acide aminé spécifique et son
activation grâce à une
réaction d'adénylation de ce dernier (transformation de l'acide aminé en
aminoacyl
adénylé) ;
= un domaine de thiolation (T ou PCP pour Peptidyl Carrier Protein) :
permet
au peptide en cours de synthèse de rester fixé à la synthétase tout au long du
processus
d'élongation via une liaison thioester ;
= un domaine de condensation (C) : permet la formation de la liaison
peptidique entre deux acides aminés de modules adjacents.
La libération du peptide est induite par un domaine spécifique, le domaine Te
(thioestérase). Ce domaine va couper la liaison thioester qui relie le peptide
synthétisé au
dernier domaine T. Ce domaine permet également la cyclisation de certains
peptides.
Il existe aussi des domaines secondaires facultatifs qui permettent
d'effectuer
des modifications au niveau des acides aminés comme l'épimérisation
(transformation
d'un acide aminé de la série L en isomère de la série D), la méthylation
(ajout d'un
groupement méthyle) ou encore la formylation (ajout d'un groupement formyle).
Dans le cas des polymyxines, et comme indiqué en figure 2, trois synthétases
sont essentielles à la synthèse de la chaine peptidique :
- le module PmxA possède quatre domaines d'adenylation, organisés de façon
tridimensionnelle en binding pocket ou poches de liaison spécifique qui
intègrent
chacune un acide aminé spécifique dans la molécule de polymyxine ;
- le module PmxB possède un domaine d'adenylation, et est responsable de
l'intégration d'un seul acide aminé ;
- le module PmxE possède cinq domaines d'adenylation qui intègrent les cinq
autres acides aminés composants la chaine peptidique de la polymyxine.
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L'article de Choi et al. (Jounal of Bacteriology, 2009) ainsi que le brevet
US 8,329,430 décrivent l'isolement d'un cluster (groupe) de gènes de la
souche Gram-
positive Paenibacillus polymyxa E681 sécrétant de la polymyxine A. Cinq gènes
constituent ce cluster : pmxA, pmxB, pmxC, pmxD et pmxE. Les gènes pmxC et
pmxD
codent pour des protéines de transport, alors que les trois autres gènes pmxA,
pmxB et
pmxE codent pour des synthétases. Ceci est en particulier démontré par une
souche
mutante ayant subi une mutation par insertion dans le gène pmxE: cette souche
ne produit
plus de polymyxine. Inversement, une souche de Bacillus subtilis transformée
par
l'introduction de ce cluster de gènes devient capable de produire de la
polymyxine A, mais
seulement en présence d'acide L-2,4-diaminobutyrique (Dab, résidu majoritaire
de la
chaine peptidique de la polymyxine).
Dans les polymyxines décrites dans la littérature, il est très rare d'observer
la
présence de résidus D-Dab, sauf pour les polymyxines A, C et P.
Shaheen et al. (Chemistry and Biology, 2011) ont décrit l'identification et le
séquençage d'un cluster de gènes issu de la souche Paenibacillus polymyxa
PKB1.
L'implication de ces gènes dans la biosynthèse de la polymyxine B est
démontrée par
mutation insertionnelle dans le gène pmxE: la souche mutée ne produit plus de
polymyxine. Lors de la caractérisation du cluster, Shaheen et al. ont
identifié un domaine
d'épimérisation dans le troisième module du cluster pmx. Ceci suggère
l'intégration d'un
D-Dab en position 3. Ainsi, ces gènes sont impliqués dans la biosynthèse de
variants de la
polymyxine B, comprenant en position 3 non pas un résidu D-2,4-diaminobutyrate
mais
son énantiomère le L-2,4-diaminobutyrate.
D'autres clusters de gènes issus de souches de Paenibacillus polymyxa ont été
isolés, mais leurs fonctions et spécificités sont uniquement prédictives et en
aucun cas
démontrées de manière fonctionnelle.
Par ailleurs, des molécules variantes présentant de légères différences
structurelles avec les polymyxines connues, et des effets toxiques amoindris,
ont été
rapportées. Ainsi, la demande de brevet WO 2009/098357 ainsi que l'article de
Vaara and
Vaara (Peptides, 2010) décrivent des variants de polymyxine B ne comprenant
que trois
charges positives et présentant des effets toxiques diminués. Des variants de
polymyxine
B ont également été décrits dans l'article de Shaheen et al. (2011).
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La technique actuellement utilisée pour produire la colistine, basée sur la
fermentation de souches bactériennes productrices en milieux riches n'est pas
satisfaisante, notamment en termes de pureté de la molécule, qui doit être
purifiée à partir
du milieu de fermentation.
5 L'identification des gènes impliqués dans la synthèse de la
colistine
permettrait, par des procédés de génie génétique, de produire une molécule de
polymyxine E plus pure, et également de créer des molécules synthétiques
dérivées,
présentant moins d'effets secondaires néfastes et/ou une meilleure activité.
RESU1VIE DE L'INVENTION
La présente invention décrit l'isolement d'un cluster de gènes issu d'une
souche de Paenibacillus alvei isolée de l'environnement, produisant de la
polymyxine E,
et leurs utilisations.
La présente invention est relative à une synthétase PmxA impliquée dans la
synthèse de polymyxine E, comprenant quatre domaines d' adénylation,
caractérisée en ce
que le second domaine d'adénylation comprend ou présente une séquence
peptidique
particulière représentée en SEQ ID NO 1, cette séquence formant une poche de
liaison
spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine.
La présente invention est aussi relative à une synthétase PmxE impliquée dans
la synthèse de polymyxine E, comprenant cinq domaines d' adénylation et un
domaine
d' épimérisation.
La présente demande est également relative à un groupe de gènes codant pour
des enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine E, comprenant un gène
codant
pour la synthétase PmxA, des gènes codant pour les synthétases PmxB et PmxE,
et des
gènes codant pour les protéines de transport PmxC et PmxD.
La présente invention concerne également des micro-organismes transformés
exprimant au moins les gènes pmxA, pmxB et pmxE, modifiés ou non, lesdits
micro-
organismes transformés produisant de la polymyxine E ou des molécules
variantes de cette
polymyxine.
FIGURES
Figure 1. Structure peptidique de la polymyxine E
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Figure 2. Structure du cluster NRPS impliqué dans la synthèse de
polymyxine E.
Figure 3. Structures chimiques des différentes polymyxine B et E d'après
Govaerts et collaborateurs (Govaerts et al., 2002a; Govaerts et al., 2002b).
Figure 4. Effet antimicrobien de 20 !al du surnageant de culture de la
bactérie
B-LR et du mutant 5 sur un tapis bactérien de P. aeruginosa.
Figure 5. Séquence peptidique PmxA ; en gras : séquences des domaines
d'adénylation ; en gras et souligné : motifs spécifiques des binding pockets
.
Figure 6. (A) Spectre MS/MS correspondant à la fragmentation de l'ion
précurseur dichargé (m/z 585,39). (B) Structure proposée pour le peptide
correspondant :
colistine El. AG: acide gras (C9H170) ; L-Dab : acide L-2,4 diaminobutyrique ;
Thr :
Thréonine ; Leu : Leucine. Les chiffres entourés de carrés correspondent aux
ions produits
en première série, ceux entourés de ronds correspondent aux ions produits en
seconde
série.
Figure 7. (A) Spectre MS/MS correspondant à la fragmentation de l'ion
précurseur dichargé (m/z 578,38). (B) Structure proposée pour le peptide
correspondant
colistine E2. AG: acide gras (C8H150) ; L-Dab : acide L-2,4 diaminobutyrique ;
Thr :
Thréonine ; Leu : Leucine. Les chiffres entourés de carrés correspondent aux
ions produits
en première série.
Figure 8. (A) Spectre MS/MS correspondant à la fragmentation de l'ion
précurseur dichargé (m/z 571,38). (B) Structure proposée pour le peptide
correspondant
Val-E2. AG: acide gras (C8H150) ; L-Dab : acide L-2,4 diaminobutyrique ; Thr :
Thréonine ; Ile : Isoleucine ; Leu : Leucine ; Val : Valine. Les chiffres
entourés de carrés
correspondent aux ions produits en première série, ceux entourés de ronds
correspondent
aux ions produits en seconde série.
DESCRIPTION DETAILLEE
Polypeptides et polynucléotides
L'invention est relative à l'isolement et l'identification de nouveaux gènes
codant pour des polymyxines E synthétases, en particulier d'un gène codant
pour la
synthétase PmxA présentant un site d'adénylation particulier, formant une
poche de
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liaison spécifique permettant l'intégration dans la molécule de polymyxine
d'un résidu
leucine ou isoleucine.
Tous les termes techniques employés dans la présente demande sont bien
connus de l'homme du métier et sont définis dans l'ouvrage de référence
Sambrook et al.
Molecular Cloning: a Laboratory Manual .
Le terme polynucleotide désigne une chaine de nucléotides liés par
covalence. Au sens de l'invention, ce terme désigne des acides nucléiques tels
que l'acide
ribonucléique (ARN) et l'acide désoxyribonucléique (ADN).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques, au
sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences
alignées de
manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut
comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par
rapport à la
séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de
manière à
obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions
auxquelles une base nucléique identique est observée pour les deux séquences
comparées,
puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les
deux bases
nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison,
puis en
multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en
nucléotides des
deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de
manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est
déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant
fixés
comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = full ; (3)
OUTPUT FORMAT = aln w/numbers ; (4) OUTPUT ORDER = aligned ; (5)
COLOR ALIGNMENT = no ; (6) KTUP (word size) = default ; (7) WINDOW
LENGTH = default ; (8) SCORE TYPE = percent ; (9) TOPDIAG = default
;
(10) PAIRGAP = default ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none ;
(12) MATRIX = default ; (13) GAP OPEN = default ; (14) END GAPS =
default ; (15) GAP EXTENSION = default ; (16) GAP DISTANCES =
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default ; (17) TREE TYPE = cladogram et (18) TREE GRAP DISTANCES =
hide .
Le terme polypeptide désigne une chaine d'acides aminés liés de façon
covalente.
Le terme polymyxine E synthétases désigne les enzymes capables
d'intégrer un acide aminé spécifique dans la chaine d'acides aminés formant la
polymyxine E, et le cas échéant de transformer l'acide aminé pour former une
structure
cyclique.
Le terme site d'adénylation ou domaine d'adénylation désigne, dans la
molécule de polymyxine synthétase, le domaine qui joue un rôle dans le choix
et
l'activation de l'acide aminé, tandis que le domaine de condensation
catalyse la
formation d'une liaison peptidique et que le domaine de thiolation est
responsable du
transport des composés en formation entre les modules.
Le terme site d' épimérisation désigne dans une synthétase un domaine
permettant de convertir un résidu présentant une chiralité levogyre en son
énantiomère
de chiralité dextrogyre 'D', en particulier un résidu L-acide cc,y-
diaminobutyrique (L-Dab)
en résidu D-acide cc,y-diaminobutyrique (D-Dab).
Le terme poche de liaison désigne une zone de la protéine présentant une
structure tridimensionnelle de poche , dans laquelle des interactions de
haute spécificité
avec un substrat ou, dans le cas présent, un acide aminé, permettront de
sélectionner et
d'activer cet acide aminé.
L'expression les acides aminés soulignés étant conservés signifie que,
même si de légères variations de séquences peuvent être observées entre deux
protéines
présentant la même activité catalytique, les acides aminés indiqués sont
essentiels à la
spécificité et à l'activité de cette protéine et ne peuvent donc pas être
modifiés, sous peine
de perdre ou diminuer la spécificité et/ou l'activité de cette protéine.
La présente invention concerne une synthétase PmxA impliquée dans la
synthèse de polymyxine E, comprenant quatre sites d'adénylation, caractérisée
en ce que
le second site d'adénylation présente au moins 90 % d'identité avec la
séquence
peptidique suivante :
VTEAEKADLLGRENDTTTEFPRGKTLIQLFEEQVERIPDAAAITLNEQE
LTYRELNERVNRLARTLRSHGISKGRLVAILAERSIEMVVGMLAAHKAGAAYVPI
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DPEYPEERIRFLIEDSGGQVMLTQSRLRERLAGSDPVILLDDESFYHEDGTNLNTGI
EATDLACVIYT SGTTGKPKGNPVSHRNIVRVVQNTNYIDITERDHVLQLS S Y SFDG
ATFDIFGALTNGARLVLVPYETLLEIGRLADLIQRERISVMFITTAFFNILVDVNVD
CLRDVRAILFGGERVSVGHVRKALAHIGPGRLNHVYGPTESTVYTTYLPVDFVDE
LAVTVPIGRPISNTTVYIVDSRNKLLPIGVAGELCVGGEGLVRGYNNRPELTAEKF
VDNPFVPGERMYRTGDLAKWLPDGTIEYVGRTDDQVKIRGFRIELGEIEAQLQKV
EGIRKTTVFARENASGEKQLCAYYEADCELPAAELKSVLSKELPAYMIPAYLIQLE
RLPLTTNGKVDRRSLPAPEESLQPGGG (SEQ ID NO 1),
les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant conservés et formant une
poche de liaison spécifique pour un résidu leucine, isoleucine ou valine.
Selon un aspect particulier de l'invention, le second site d' adénylation de
PmxA présente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 %
d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO 1, les acides aminés
soulignés
DGFFLGVVYK étant conservés et formant une poche de liaison spécifique pour un
résidu
leucine isoleucine ou valine.
Selon un aspect particulier de l'invention, le second site d' adénylation de
PmxA présente une séquence peptidique comprenant ou consistant en la séquence
peptidique SEQ ID NO 27, les acides aminés soulignés DGFFLGVVYK étant
conservés
et formant une poche de liaison spécifique pour un résidu leucine isoleucine
ou valine.
Selon un aspect particulier de l'invention, la synthétase PmxA comprend
quatre poches de liaison spécifiques comprenant les acides aminés suivants :
- DAWIVGAIVK (SEQ ID NO 2), spécifique pour un résidu leucine ;
- DGFFLGVVYK (SEQ ID NO 3), spécifique pour un résidu leucine
isoleucine ou valine;
- DVGEISAIDK (SEQ ID NO 4), spécifique pour un résidu acide
diaminobutyrique ;
- DVGEISAIDK (SEQ ID NO 5), spécifique pour un résidu acide
diaminobutyrique.
Il est bien entendu que ces séquences SEQ ID NO 2, 3, 4 et 5 regroupent les
acides aminés essentiels formant une poche de liaison fonctionnelle en
structure
tridimensionnelle, mais ne sont pas des acides aminés consécutifs dans une
séquence
peptidique.
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Selon un aspect particulier de l'invention, la synthétase PmxA comprend la
séquence polypeptidique présentée en SEQ ID NO 6, et montrée en figure 5, les
domaines
d'adénylation étant indiqués en gras, les acides aminés formant la poche de
liaison étant
soulignés. En particulier cette séquence pourra comprendre, en plus de la
séquence
5 présentée en SEQ ID NO 6, des acides aminés supplémentaires aux
extrémités N- et C-
terminales.
Selon un aspect particulier, la séquence polypeptidique de la synthétase PmxA
consiste en la séquence polypeptidique présentée en SEQ ID NO 6.
Selon un autre aspect de l'invention, la synthétase PmxA présente une
10 séquence qui comprend, ou consiste en, la séquence polypeptidique
présentée en SEQ ID
NO 25.
La synthétase PmxA présente quatre sites d' adénylation aux positions
suivantes :
- du résidu 234L au résidu 751Y;
- du résidu 1741V au résidu 2263G;
- du résidu 2815P au résidu 3345T;
- du résidu 3900E au résidu 4428G.
Il est entendu que ces positions sont définies en fonction d'une séquence
peptidique particulière, ici selon la SEQ ID NO 6 comprenant 4967 acides
aminés, et
peuvent être redéfinies pour des séquences de plus grande taille.
Notamment lorsque la synthétase PmxA présente une séquence consistant en
la séquence SEQ ID NO 25, les quatre sites d' adénylation se trouvent aux
positions
suivantes :
- du résidu 265L au résidu 782Y;
- du résidu 1772V au résidu 2294G;
- du résidu 2846P au résidu 3376T;
- du résidu 3931E au résidu 4459G.
La présente invention est également relative à une synthétase PmxE impliquée
dans la synthèse de polymyxine E, comprenant cinq sites d' adénylation et un
site
d'épimérisation, caractérisée en ce que le site d' épimérisation présente au
moins 90 %
d'identité avec la séquence peptidique telle que présentée en SEQ ID NO 30.
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Selon un aspect particulier de l'invention, la séquence peptidique de la
synthétase PmxE comprend ou consiste en la séquence représentée en séquence
SEQ ID
NO 14.
Cette synthétase est responsable de l'intégration des résidus n 1 à 5 (voir
figure 1 pour la numérotation) dans la chaine peptidique de la molécule de
polymyxine E.
Cette synthétase présente la caractéristique fonctionnelle de pouvoir
convertir le résidu L-
Dab en son stéréoisomère D-Dab, et d'incorporer ledit stéréoisomère à la
position 3 dans
une chaine peptidique de polymyxine E. Une telle molécule variante de
polymyxine
pourrait présenter des propriétés antimicrobiennes améliorées, comme cela a
été proposé
dans la littérature (Hong SY et al., 199 ; Lee DL et al., 2004).
La présente invention est également relative à un acide nucléique comprenant
un cadre de lecture ouvert, codant pour une synthétase impliquée dans la
synthèse de
polymyxine E, présentant au moins 90% d'identité avec la séquence
nucléotidique SEQ
ID NO 7, sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés
soulignés
DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés.
Selon un aspect particulier de l'invention, l'acide nucléique codant pour une
synthétase impliquée dans la synthèse de polymyxine E présente 91 %, 92 %, 93
%, 94 %,
95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO
7,
sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés
DGFFLGVVYK
de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés.
L'expression les nucléotides [...] sont conservés indiquent que ces
nucléotides codant pour les acides aminés DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO
1
doivent être soit identiques à ceux observés dans la même position dans la
séquence SEQ
ID NO 7, soit différents mais sous réserve que les codons formés par ces
nucléotides
codent pour les acides aminés DGFFLGVVYK soulignés dans la séquence SEQ ID NO
1.
En effet et comme indiqué ci-dessus, ces acides aminés sont essentiels à la
spécificité et à l'activité de cette synthétase et ne peuvent donc pas être
modifiés, sous
peine de perdre ou de diminuer la spécificité de cette poche de liaison.
Selon un autre aspect particulier de l'invention, l'acide nucléique codant
pour
une synthétase PmxA impliquée dans la synthèse de polymyxine E comprend une
séquence nucléotidique codant pour le second site d'adénylation de cette
synthétase
PmxA, consistant en la séquence nucléotidique présentée en SEQ ID NO 28. Cette
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séquence code pour la séquence peptidique représentée en SEQ ID NO 27 ainsi
que pour
la séquence peptidique représentée en SEQ ID NO 1 qui présente deux acides
aminés de
moins que SEQ ID NO 27 à l'extrémité C-terminale du domaine.
La présente invention concerne également un groupe de gènes codant pour des
enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine E, comprenant notamment :
- un gène codant pour la synthétase PmxA tel que défini ci-dessus, et
- des gènes codant respectivement pour les synthétases PmxB et PmxE.
Selon un aspect préféré de l'invention, ce groupe de gènes comprend le gène
pmxE codant pour une synthétase PmxE comprenant un domaine d' épimérisation
dont la
séquence peptidique comprend ou consiste en la séquence représentée en SEQ ID
NO 30.
Selon un aspect préféré de l'invention, ce groupe de gènes comprend
également des gènes codant respectivement pour les protéines de transport PmxC
et
PmxD. Les séquences des protéines PmxC et PmxD isolées de la souche de
Paenibacillus
alvei sont montrées en séquences SEQ ID NO 12 et NO 13, respectivement.
Selon un autre aspect particulier de l'invention, ce groupe de gènes impliqués
dans la synthèse de polymyxine E comprend :
- un gène pmxA présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID
NO 7,
sous réserve que les nucléotides codant pour les acides aminés soulignés
DGFFLGVVYK de la séquence SEQ ID NO 1 soient conservés,
- un gène pmxB présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO
8,
et
- un gène pmxE présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence SEQ ID
NO 9.
Selon un autre aspect de l'invention, ce groupe de gènes impliqués dans la
synthèse de polymyxine E comprend :
- un gène pmxA présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO
7,
sous réserve que la portion d'acide nucléique codant les acides aminés
soulignés
DGFFLGVVYK soit conservéeõ
- un gène pmxB présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID
NO 8,
et
- un gène pmxE présentant au moins 95 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO
9.
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Selon un autre aspect de l'invention, ce groupe de gènes impliqués dans la
synthèse de polymyxine E comprend :
- un gène pmxA comprenant une séquence nucléotidique présentant 100 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO 7, et en particulier comprenant une séquence
nucléotidique telle que présentée en SEQ ID NO 26,
- un gène pmxB comprenant une séquence nucléotidique présentant 100 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO 8, et
- un gène pmxE comprenant une séquence nucléotidique présentant 100 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO 9.
La présente invention est également relative à un acide nucléique comprenant
ou consistant en une séquence SEQ ID NO 10, ou une séquence SEQ ID NO 29,
représentant la séquence complète du cluster issu de la souche de
Paenibacillus alvei,
comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, pmxD et pmxE impliqués dans la synthèse
de
polymyxine E.
Le tableau 1 ci-dessous présente les différentes séquences d'acides nucléiques
et protéiques référencées dans la présente demande :
Numéro de Type Taille Définition
séquence
SEQ ID NO 1 Protéine 523 Séquence peptidique du second site
acides d'adénylation d'une synthétase PmxA issue
aminés d'une souche de Paenibacillus alvei
SEQ ID NO 2 Protéine 10 acides Binding pocket du l' domaine d'adenylation de
aminés PmxA, ces acides aminés formant une poche
de
liaison spécifique pour un résidu leucine
SEQ ID NO 3 Protéine 10 acides Binding pocket du 2' domaine d'adenylation
aminés de PmxA, ces acides aminés formant une
poche
de liaison spécifique pour un résidu leucine,
isoleucine ou valine
SEQ ID NO 4 Protéine 10 acides Binding pocket du 3ème domaine d'adenylation
aminés de PmxA, ces acides aminés formant une
poche
de liaison spécifique pour un résidu acide
diaminobutyrique
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SEQ ID NO 5 Protéine 10 acides Binding pocket du 4ème domaine d'adenylation
aminés de PmxA, ces acides aminés formant une poche
de liaison spécifique pour un résidu acide
diaminobutyrique
SEQ ID NO 6 Protéine 4967 Séquence peptidique complète d'une synthétase
acides PmxA issue d'une souche de Paenibacillus
aminés alvei ; voir également figure 5
SEQ ID NO 7 ADN 14901 Séquence codante pour la synthétase PmxA
paires de présentant la séquence SEQ ID NO 6
bases
SEQ ID NO 8 ADN 3306 Séquence codante pour la synthétase PmxB
paires de issue de Paenibacillus alvei
bases
SEQ ID NO 9 ADN 18876 Séquence codante pour la synthétase PmxE
paires de issue de Paenibacillus alvei, présentant la
bases séquence SEQ ID NO 31
SEQ ID NO ADN 41169 Séquence codant pour un cluster complet
paires de comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC,
bases pmxD, et pmxE issu de Paenibacillus alvei
SEQ ID NO Protéine 1102 Séquence peptidique de la synthétase PmxB
11 acides issue d'une souche de Paenibacillus alvei
aminés
SEQ ID NO Protéine 608 Séquence peptidique de la protéine PmxC issue
12 acides d'une souche de Paenibacillus alvei
aminés
SEQ ID NO Protéine 577 Séquence peptidique de la protéine PmxD issue
13 acides d'une souche de Paenibacillus alvei
aminés
SEQ ID NO Protéine 6292 Séquence peptidique de la synthétase PmxE
14 acides issue d'une souche de Paenibacillus alvei
aminés
SEQ ID NO ADN 20 paires Sequences artificielles - oligonucléotides
(voir
15-24 bases tableau 2)
SEQ ID NO Protéine 4999 Séquence peptidique complète d'une synthétase
25 acides PmxA issue d'une souche de Paenibacillus
aminés alvei ;
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SEQ ID NO ADN 14997 Séquence codante pour la synthétase PmxA
26 paires de présentant la séquence SEQ ID NO 25
bases
SEQ ID NO Protéine 525 Séquence peptidique du second site
27 acides d'adénylation d'une synthétase PmxA issue
aminés d'une souche de Paenibacillus alvei
SEQ ID NO ADN 1575 Séquence codante pour le 2' domaine
28 paires de d'adenylation de PmxA, présentant la
séquence
bases SEQ ID NO 27
SEQ ID NO ADN 41172 Séquence codant pour un cluster complet
29 paires de comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC,
bases pmxD, et pmxE issus de Paenibacillus
alvei
SEQ ID NO Protéine 461 Séquence du domaine d' épimérisation de
la
30 synthétase PmxE issue d'une souche de
Paenibacillus alvei
SEQ ID NO Protéine 431 Séquence peptidique complète de l'enzyme
31 permettant la biosynthèse de Dab, issue
d'une
souche de Paenibacillus alvei
SEQ ID NO ADN 1293 Séquence codant pour l'enzyme présentant
la
32 paires de séquence SEQ ID NO 31, issue de
bases Paenibacillus alvei
Vecteurs d'expression
La présente invention est également relative à un vecteur d'expression
comprenant un gène codant pour une synthétase PmxA tel que défini ci-dessus,
ou un
5 acide nucléique codant pour une synthétase PmxA tel que défini ci-dessus,
et/ou un gène
codant pour une synthétase PmxE tel que défini ci-dessus.
Dans le cadre de l'invention, les termes vecteur , vecteur d'expression
et
plasmide sont équivalents et sont utilisés conformément à l'acception
usuelle dans le
domaine de la biologie moléculaire, du génie génétique et de la microbiologie.
Très
10 brièvement, il s'agit d'une molécule d'ADN, non virale, hébergée par une
cellule hôte,
distincte de l'ADN chromosomique naturel de ladite cellule hôte et capable de
réplication
autonome. Un vecteur est obtenu par des techniques classiques de biologie
moléculaire
et génie génétique, et dans lequel une ou plusieurs séquences nucléotidiques
exogènes ont
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été insérées (ou clonées). La présente invention concerne un vecteur pour
l'expression, par
une cellule hôte, de séquences nucléotidiques exogènes, comprenant :
- une origine de réplication,
- des éléments permettant l'expression des gènes introduits, tels qu'un
promoteur approprié, des enhancers...
- au moins une séquence nucléotidique dont l'expression est souhaitée.
Le choix du vecteur et, plus particulièrement, de l'origine de réplication
qu'il
porte dépend de la cellule hôte qui l'hébergera. En fonction du type de
cellules hôtes,
plusieurs copies d'un vecteur et/ou plusieurs vecteurs différents peuvent être
introduits
dans la même cellule hôte, simultanément ou séquentiellement.
Le choix du vecteur dépendra également de la taille de la séquence d'acide
nucléique à exprimer. En particulier, pour des séquences supérieures à 20 kilo-
paires de
bases, les fosmides, vecteurs capables de contenir de grandes séquences
d'acides
nucléiques (jusqu'à 40 kilo-paires de bases), seront préférés. Il est
également possible
d'utiliser plusieurs vecteurs comprenant chacun une portion d'un ensemble de
gènes, et de
transférer plusieurs vecteurs dans une même cellule hôte, ceci permettant
d'exprimer tout
un ensemble de gènes dans une même souche.
D'autres vecteurs pouvant contenir des séquences de grandes tailles sont les
cosmides et les chromosomes bactériens artificiels (BAC).
Selon un aspect préféré de l'invention, le vecteur d'expression comprend
totalement ou en partie un groupe de gènes tel que défini ci-dessus.
Selon un autre aspect préféré de l'invention, le vecteur d'expression comprend
totalement ou en partie un acide nucléique tel que défini ci-dessus, notamment
comprenant
la séquence présentée en SEQ ID NO 10 ou en SEQ ID NO 29. De manière préféré,
le
vecteur d'expression est un fosmide comprenant la totalité de la séquence
d'ADN codant
pour le cluster complet comprenant les gènes pmxA, pmxB, pmxC, pmxD, et pmxE
issu de
Paenibacillus alvei, présentant la séquence SEQ ID NO 10.
Autres enzymes impliquées dans la synthèse de polymyxine
D'autres enzymes sont impliquées dans la synthèse de polymyxine,
notamment de la polymyxine E. Il s'agit des enzymes permettant la biosynthèse
du résidu
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Dab, ce résidu étant le résidu majoritairement intégré dans la chaine
peptidique de la
polymyxine E, et des enzymes permettant la liaison de l'acide gras sur la
partie peptidique.
Une enzyme de biosynthèse du résidu acide a,y-diaminobutyrique (Dab) a été
identifiée et isolée à partir de la souche bactérienne de Paenibacillus alvei
décrite dans les
exemples. En particulier, la séquence peptidique de cette enzyme comprend ou
consiste en
la séquence peptidique présentée en séquence SEQ ID NO 31. L'acide nucléique
codant
pour cette enzyme comprend ou consiste en la séquence nucléotidique présentée
en
séquence SEQ ID NO 32.
De manière préférée, cette enzyme à activité transaminase peut être exprimée
dans un micro-organisme destiné à produire de la polymyxine E, en combinaison
avec les
synthétases PmxA, PmxB et PmxE, et de préférence avec également les molécules
de
transport PmxC et PmxD.
Cette transaminase comprenant 431 résidus présente une homologie de
séquence avec des enzymes présentant des fonctions similaires, issues d'autres
microorganismes, comme cela est montré dans le tableau 2 suivant :
Numéro Longueur (AA) identité Fonction Micro-
d'accession avec séquence organisme
issue de B-LR d'origine
(SEQ ID NO
31)
CP000154.1 420 73 Diaminobutyrate- P. polymyxa
-2-oxoglutarate E681
transaminase
EJW20319.1 389 89 Diaminobutyrate- P. alvei DSM
-2-oxoglutarate 29
transaminase
EctB
Yi? 005959913.1 420 74 diaminobutyrate- P. polymyxa
2-oxoglutarate M1
transaminase
EGG38373 .1 430 50 diaminobutyrate- P. sp. HGF5
-2-oxoglutarate
transaminase [
EGL19185.1 434 65 diaminobutyrate- P. sp. HGF7
-2-oxoglutarate
transaminase
[Paenibacillus sp.
HGF7
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ABX39524. 1 429 50 diaminobutyrate- Halobacillus
2-oxoglutarate
halophilus
transaminase DSM
2266
Tableau 2
Des enzymes permettant la liaison de l'acide gras sur la chaine peptidique de
la polymyxine E, enzymes présentant donc une activité acyl-transférase, ont
également été
identifiées et isolées à partir de la souche bactérienne de Paenibacillus
alvei décrite ci-
dessus.
De manière préférée, au moins une acyl-transférase sera exprimée dans un
micro-organisme destiné à produire de la polymyxine E, en combinaison avec les
synthétases PmxA, PmxB et PmxE, et de préférence avec également les molécules
de
transport PmxC et PmxD, et de manière plus préférée avec également une enzyme
de
biosynthèse du résidu acide a,y-diaminobutyrique (Dab).
Alternativement, la liaison de l'acide gras sur la chaine peptidique de la
polymyxine E pourra également être réalisée par couplage chimique, selon l'une
des
techniques bien connues de l'Homme du métier.
Cellules hôtes
Le terme cellule hôte ou micro-organisme hôte est utilisé dans le cadre
de la présente invention pour désigner une cellule ayant été transformée,
c'est-à-dire dans
laquelle de l'ADN exogène a été introduit, cet ADN exogène étant notamment
sous la
forme d'un vecteur d'expression comprenant une séquence d'intérêt, qui sera
exprimée
grâce à la machinerie cellulaire de la cellule hôte, capable de synthétiser à
partir de l'ADN
exogène les ARNs messagers et les protéines correspondants à cet ADN.
La présente demande concerne en particulier un micro-organisme transformé
par introduction d'un gène ou groupe de gènes tel que défini ci-dessus, ou
d'un ou de
plusieurs vecteurs d'expression tel que présentés ci-dessus.
L'invention est notamment relative à un micro-organisme transformé par
introduction :
- d'un gène codant pour une synthétase PmxA telle que définie ci-dessus, ou
- d'un gène codant pour une synthétase PmxE telle que définie ci-dessus, ou
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- d'un vecteur d'expression comprenant une séquence ADN codant pour une
synthétase PmxA telle que définie ci-dessus, notamment la séquence telle que
présentée en
SEQ ID NO 7 ou en SEQ ID NO 26.
L'invention porte également sur un micro-organisme transformé par
introduction d'un groupe de gènes tel que défini ci-dessus, ou d'un acide
nucléique codant
pour tout ou partie des gènes pmxA, pmxB et pmxE, tels que définis ci-dessus,
ou d'au
moins un vecteur d'expression comprenant un gène codant pour tout ou partie
des gènes
pmxA, pmxB et pmxE, tels que définis ci-dessus.
Selon un aspect particulier de l'invention, le micro-organisme est de plus
transformé pour comprendre au moins un acide nucléique codant pour une enzyme
impliquée dans la biosynthèse du résidu Dab, et notamment un acide nucléique
comprenant une séquence comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO 32.
Selon un autre aspect de l'invention, le micro-organisme est de plus
transformé pour comprendre au moins un acide nucléique codant pour une enzyme
à
activité acyl-transférase, catalysant la liaison d'un acide gras sur la chaine
peptidique de la
polymyxine E.
La transformation de micro-organismes est une technique couramment utilisée
dans les laboratoires de biologie moléculaire, permettant d'introduire de
l'ADN exogène
dans le micro-organisme. Diverses techniques permettent la transformation d'un
micro-
organisme, et notamment d'une bactérie compétente, et sont toutes bien connues
de
l'homme du métier. On peut en particulier citer l'électroporation, et
l'utilisation de
chlorure de calcium suivi d'un choc thermique.
Dans un aspect préféré de l'invention, dans le micro-organisme transformé, le
gène ou le groupe de gènes introduit est surexprimé.
La surexpression d'un gène peut se définir par une expression augmentée de ce
gène, c'est-à-dire une plus grande production d'ARN messager et de protéine
codée par ce
gène, dans la cellule. L'expression de la protéine sera notamment augmentée de
50 %, de
100 %, de 150 %, de 200 %, voire de 300 % par rapport au taux d'expression
endogène
observé dans une bactérie exprimant ce gène de façon naturelle, avant toute
transformation.
La surexpression d'un gène peut être obtenue de plusieurs façons, toutes bien
connues de l'homme du métier. On citera en particulier : l'utilisation de
promoteurs forts
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pour contrôler le niveau d'expression des gènes et l'augmentation du nombre de
copies du
gène dans la cellule. De préférence, le vecteur utilisé comprendra un
promoteur fort sous
le contrôle duquel sera inséré le gène, et ledit vecteur sera présent en un
nombre important
de copies, notamment 10, 20, 50 ou 100 copies dans la cellule hôte.
5
L'homme du métier saura choisir le micro-organisme hôte le plus adapté pour
l'expression d'un vecteur comportant le ou les gènes selon l'invention. En
particulier, les
bactéries Gram-positives seront préférées. Un micro-organisme particulièrement
adapté
est une bactérie appartenant au genre des Bacillus ou Paenibacillus. Les
espèces B.
subtilis et Paenibacillus polymyxa sont particulièrement adaptées pour
l'expression des
10
polymyxines synthétases et à la production de polymyxine E. Les souches du
genre
Paenibacillus, et notamment de Paenibacillus alvei, et plus particulièrement
la souche
Paenibacillus alvei isolée dans l'environnement par les inventeurs, peuvent
également être
utilisées comme micro-organisme hôte pour être transformées avec le vecteur ou
l'acide
nucléique tels que définis ci-dessus. Enfin, des bactéries synthétiques
peuvent également
15 être utilisées dans le cadre de la présente invention, comme cellules
hôtes.
Méthode de production de polymyxine E
La présente demande est également relative à une méthode de production de
polymyxine E, comprenant :
20 - la
mise en culture d'un micro-organisme transformé tel que défini ci-dessus,
dans un milieu minéral approprié, et
- la purification à partir du milieu de culture de la polymyxine E produite.
Le terme milieu minéral approprié désigne un milieu de culture permettant
la croissance des micro-organismes, et comprenant notamment des sels minéraux
et des
nutriments. Un milieu préféré présente la composition spécifique suivante :
KH2PO4
anhydre 0,45 % (p/v), K2HPO4, 3H20 1,13 % (p/v), (NH4)2SO4 0,6 % (p/v),
glucose 0,6 %
(p/v), thiamine 0,001 %o (p/v), MgSO4, 7H20 0,02 % (p/v). Ce milieu peut
comprendre
également, le cas échéant, un précurseur nécessaire à la synthèse de
polymyxine, en
particulier l'acide diaminobutyrique.
Selon un aspect préféré de l'invention, la culture est effectuée à une
température de 30 C, et dure au moins 25 heures.
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De préférence, la culture a lieu dans 200 ml de milieu minéral dans des
flasques de 1 L, sous agitation, pendant 30 h à 30 C.
La présente invention concerne également une méthode de production de
variants de polymyxine E, comprenant la mise en culture d'un micro-organisme
tel que
défini ci-dessus, dans un milieu minéral approprié, et la purification à
partir du milieu de
culture du ou des variants de la polymyxine E.
La présente invention est également relative à des variants de la polymyxine E
obtenus selon la méthode de production telle que décrite ci-dessus.
Les variants de polymyxine E désignent des molécules dérivées de la
structure de la polymyxine E (voir figure 1) et qui peuvent par exemple
présenter un ou
plusieurs acides aminés différents, sans pour autant être classifiés comme
appartenant à un
autre type de polymyxine.
En particulier, les types de molécules détectées dans le milieu de culture de
la
souche de Paenibacillus alvei BL-R sont des variants de polymyxine E qui
présentent la
différence structurelle suivante : le résidu en position 3 peut être un résidu
D-Dab en lieu
et place d'un résidu L-Dab observé dans la structure classique de la
polymyxine E.
Les formes variantes peuvent être naturelles ou synthétiques. Par variants
naturels on entend des variants synthétisés par des micro-organismes non
transformés ;
par variants synthétiques on entend des formes variantes synthétisées par
des micro-
organismes transformés, qui n'ont pas été identifiées à l'état naturel.
En particulier, les polymyxines synthétases codées par les gènes pmxA, pmxB
et pmxE pourront être modifiées pour devenir spécifiques de la fixation de
certains acides
aminés entrant dans la composition de la polymyxine E, afin de synthétiser des
variants de
polymyxine E présentant moins de charges cationiques et étant donc moins
toxiques pour
l'organisme humain.
Ces variants de polymyxine E présentent des avantages et notamment une plus
faible toxicité que la polymyxine E.
Par ailleurs, l'utilisation clinique de différents variants de polymyxine E
permet de diminuer l'apparition de résistance aux antibiotiques.
Il est probable que, pour les variants comprenant des résidus D-Dab à la place
de résidus L-Dab, l'activité antimicrobienne de ces molécules soit augmentée
par rapport
aux propriétés antimicrobiennes observées avec les polymyxines classiques.
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La présente invention est relative à ces variants, ainsi qu'à leur utilisation
dans
le traitement des infections bactériennes à bactéries gram négatives.
Les exemples ci-dessous illustrent l'invention revendiquée mais ne sont pas
limitatifs.
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EXEMPLES
Exemple 1. Isolement et séquençage du système génétique de production
de la colistine.
Un micro-organisme (B-LR) producteur de colistine (polymyxines El et E2),
appartenant à l'espèce Paenibacillus alvei, a été isolé de l'environnement et
cultivé. Une
banque d'ADN génomique a été construite dans Escherichia cou en utilisant des
vecteurs
fosmidiques (900 clones). La recherche des gènes codants pour les enzymes
synthétisant
la colistine a été effectuée par PCR dégénérées. Les amorces utilisées ont été
définies dans
le but d'amplifier les domaines spécialisés dans l'intégration de l'acide
diaminobutyrique
(Dab), acide aminé le plus représenté dans la structure de la colistine (6
acides aminés/12).
Trois clones d'intérêts ont été sélectionnés et séquences (Roche GS FLX). Les
séquences
obtenues ont pu être assemblées sur 50 kb. Les cadres ouverts de lecture ont
été
recherchés. Cinq d'entre eux nommés A, B, C, D et E décrivent un cluster
d'environ 41 kb
avec A (14.9 kb), B (3.3 kb), C (1.8 kb), D (1.7 kb) et E (18.9 kb) qui est
représenté en
figure 2.
Par homologie de séquences les gènes A, B et E ont été identifiés comme
codant pour des synthétases. Une étude in silico a permis de prédire
l'implication de ces
synthétases dans l'assemblage de la colistine (http://nrps.informatik.uni-
tuebingen.de/ et
http://nrps.igs.umaryland.edu/nrps/). Les gènes C et D pourraient quant à eux
être
impliqués dans l'export et la résistance du micro-organisme producteur vis à
vis de la
colistine.
Tableau 3 : Amorces permettant d'amplifier les gènes d'intérêt du cluster
colistine de B-LR
A (F)ATGGCTTTTGAAAAAGAAAC
(R)GAACGCAAATTCGATCGTAT
B (F)ATGAAATCTTTATTTGAAAA
(R)GCTTCCATGCAGTACCCCGG
E (F)ATGGAAATTATGAATCCGGG
(R)GAAAATAATATCAATGGCCT
C (F)ATGGAAGCTGACCGACAGCC
(R)GTGTACGCCACCTCCCTGCG
D (F)ATGAAAAAGGGCGGATGGCT
(R)GCCGTACAGCCGGGCGTAAT
Ces oligonucléotides sont représentés en SEQ ID NO 15 à 24.
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Exemple 2: Comparaison des domaines d'adénylation de diverses souches
de Paenibacillus productrices de molécules appartenant à la famille des
polymyxines.
Les enzymes impliquées dans la production des polymyxines appartiennent à
la famille des synthétases non ribosomiques (NRPS). Ces synthétases sont
capables
d'élaborer un peptide particulier sans s'appuyer sur la traduction d'une
matrice d'ARNm.
La spécificité de la chaine peptidique produite dépend d'une séquence précise
d'acides
aminés de la synthétase constituant un domaine d'adénylation. Quatre domaines
d'adénylation ont été identifiés in silico pour la synthétase A de B-LR, un
pour B et cinq
pour E. Chaque domaine d'adénylation contient une signature de dix acides
aminés qui lui
confère la spécificité d'intégrer un acide aminé précis au peptide non
ribosomique en cours
d'élongation. Ces signatures ont été identifiées in silico et comparées à
celles décrites dans
la littérature (tableau 4) à l'aide du programme disponible à l'adresse
suivante :
http ://nrp s informatik.uni-tuebingen. de/.
Les souches E681 et ATCC21830 sont décrites dans le brevet US 8,329,430.
La souche PKB1 est décrite dans l'article de Shaheen et al., 2011.
La souche M-1 est décrite dans l'article de Niu et al., 2013.
Tableau 4 : Acides aminés conférant la spécificité des domaines d'adénylation
des polymyxines synthétases des souches E681, PKB1, ATCC21830, M-1 et B-LR
Pmx A, 4 domaines A
1 2 3 4
E681 DAWIVGAIVK Leu DFWNIGMVHK Thr DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab
PKB1 DAWTIAAIAK Phe D GFLLGLVYK Leu DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab
21830 DAWIVGAIVK Leu DGFLLGLVYK Leu DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab
M-1 DAWTIAAIAK Phe DFWNIGMVHK Thr DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab
B-LR DAWIVGAIVK Leu DGFFLGVVYK Leu/Ileu DVGEISAIDK Dab DVGEISAIDK Dab
/Val
Pmx B, 1 domaine A
1
E681 DFWNIGMVHK TIn-
PKB 1 DFWNIGMVHK Thr
21830 DFWNIGMVHK TIn-
M-1 DFWNIGMVHK Tlu-
B-LR DFWNIGMVHK Tlu-
Pmx E, 5 domaines A
1 2 3 4 5
E681 D VGEIS S Dab DFWNIGM Thr D VGEISS Dab D VGEIS Dab D VGEIS Dab
IDK VHK IDK AIDK AIDK
CA 02944826 2016-07-26
WO 2015/111013 PCT/1B2015/050571
PKB1 DVGEISS Dab DFWNIGM Thr DVGEISS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab
IDK VHK IDK AIDK AIDK
21830 DVGEISS Dab DFWNIGM Thr DVGEISS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab
IDK VHK IDK AIDK AIDK
M-1 DVGEISS Dab DFWNIGM Thr DVGEISS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab
IVK VHK IDK AIDK AIDK
B-LR DVGEISS Dab DFWNIGM Thr DVGELS Dab DVGEIS Dab DVGEIS Dab
IDK VHK SIDK AIDK AIDK
Les synthétases de B-LR se distinguent au niveau du deuxième domaine
d'adénylation de la synthétase PmxA et du troisième domaine de la synthétase
PmxE.
Les comparaisons avec les séquences protéiques issues de la souche BL-R
5 avec les séquences protéiques déjà connues sont présentées dans le
tableau 5 ci-dessous :
Séquences tailles % ID séquences protéiques
pb aa PKB1 E681 ATCC
21830
A 14901 4967 94 90 96
A 14997 4999 94 90 95
3306 1102 96 95 96
18876 6292 95 96 84
1824 608
D 1731 577
Tableau 5
Exemple 3: Construction d'un mutant pmxE- et analyse de sa production
10 de colistine.
Une séquence de 1 650 pb commençant à la fin de pmxD et finissant au début
de pmxE a été sélectionnée et amplifiée. Elle a la particularité de posséder
un site de
restriction unique à l'enzyme SacII. La séquence amplifiée a été clonée dans
le
plasmide pGEM 7Z. Le gène codant pour la résistance à l'apramycine a été
intégré au
15 niveau du site de restriction SacII. Cette construction a été introduite
dans B-LR par
électroporation. La sélection des mutants ayant subi un évènement de double
recombinaison a été effectuée par culture sur milieu gélose supplémenté en
apramycine.
L'activité antimicrobienne du surnageant des mutants a été comparée à celle de
B-LR. Le
surnageant de culture du mutant 5 est moins actif que celui de la bactérie B-
LR sauvage
20 sur P. aeruginosa (Figure 4).
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WO 2015/111013 PCT/1B2015/050571
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Exemple 4. Caractéristiques de la synthétase PmxE issue de Paenibacillus
La séquence peptidique de la synthétase PmxE est présentée en séquence SEQ
ID NO 14. La séquence du domaine d'épimérisation est présentée en SEQ ID NO
30, elle
comprend au moins 461 résidus compris entre et incluant les résidu Va13205 à
Leu3665 de la
séquence SEQ ID NO 14. Une des caractéristiques des peptides non-ribosomiques
est la
présence d'acides aminés de stéréoisomie (L). Habituellement, un acide aminé
(L) est
activé par le domaine A, qui ensuite l'incorpore directement. Mais parfois,
cet acide aminé
de série (L) peut être converti en sa forme (D) par un domaine
d'épimérisation, avant la
formation de la liaison peptidique. Selon les prédictions in silico, deux
domaines
d'épimérisation ont été identifiés dans les modules 3 et 6 du cluster pmx.
Ceci suggère
qu'un changement stéréochimique des acides aminés présents à ces endroits est
possible.
Ainsi les acides aminés présents en position 3 (Dab-3) et en position 6 (Leu-
6) seraient
incorporés dans la chaine peptidique sous leur forme (D). Ceci était connu
pour la Leu-6,
incorporée sous sa forme (D) dans toutes les polymyxines E, mais est
inhabituel pour le
résidu Dab-3.
La synthétase PmxE selon l'invention a donc la propriété de convertir le
résidu
L-Dab en son stéréoisomère (D), et de l'intégrer en position 3 (voir figure 1)
dans la
molécule de polymyxine E synthétisée.
Lesdites molécules de polymyxine E comprenant un résidu D-Dab en position
3 sont des variants de polymyxine E.
Exemple 5: Production de polymyxine E par un micro-organisme
exprimant la combinaison d'une PmxA, d'une PmxB et d'une PmxE caractérisées
dans les exemples précédents
Le microorganisme (B-LR) produit plusieurs types de molécules de
polymyxine E comprenant en position 7 un résidu leucine, isoleucine ou valine.
Ces différents types de molécules ont pu être détectés dans le milieu de
culture
par spectrométrie de masse, selon le protocole détaillé ci-dessous :
Une solution contrôle de colistine sulfate à 0,0002% a été préparée dans le
milieu de culture des micro-organismes (milieu M63T). Quatre fractions ont été
récupérées et analysées par UPLC-MS (Ultra Performance Liquid Chromatography -
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tandem mass spectrometer). Les deux pics correspondant aux polymyxines El et
E2
présentes dans le contrôle positif ont été trouvées dans la quatrième fraction
d'extraction.
La souche B-LR présente un niveau maximum d'activité antimicrobienne à 30
heures de culture. A ce moment, le surnageant de culture a été récupéré et
filtré (0,22 um)
avant d'être soumis à une étape d'extraction en phase solide. Les peptides de
la quatrième
fraction ont été analysés par UPLC-MS. Dix-sept pics d'élution ont été
observés dans cette
quatrième fraction. Parmi eux, les principaux pics présentant des temps de
rétention de
1,61 et 1,52 minutes, ont des masses moléculaires respectivement [M+H] de
1169,7727 et
1155,7555. Ils correspondent respectivement aux polymyxines connues El et E2,
présentant la même structure peptidique et différant par leurs acides gras,
respectivement
de formule C9H170 et C8H150.
Des analyses MS/MS ont été réalisées afin de confirmer ces structures, comme
cela avait été préalablement présenté dans les articles de Govaerts et al.,
2002; et de
DeCrescenzo et al., 2007. La spectrométrie de masse en mode tandem (MS/MS) est
utilisée pour déterminer l'enchainement des acides aminés grâce à la
fragmentation de la
liaison peptidique. Cette technique consiste à combiner deux analyseurs
séparés par une
cellule de collision. Une première étape consiste à sélectionner un ion issu
de la source
d'ionisation dans le quadripôle : c'est l'ion parent ou précurseur. Cet ion
subit une
fragmentation dans la cellule de collision sous l'effet d'un bombardement par
des atomes
d'Argon, et donne des ions 'fils' ou 'produits' qui seront analysés et
détectés par
l'analyseur à temps de vol (Time of Flight, TOF). L'analyseur TOF est basé sur
la mesure
du temps que mettent les ions à parcourir une distance donnée, ce qui permet
de détecter
les rapports m/z et donc de déterminer la masse des ions correspondants.
Au cours de ces expériences, les résidus Leucine et Isoleucine ne peuvent pas
être différenciés, en raison de leurs masses moléculaires identiques.
Trois décapeptides avec un cycle à sept acides aminés ont été purifiés à
partir
du surnageant de B-LR. Leurs poids moléculaires vont de 1140,74 Da à 1168,77
Da. La
comparaison de ces molécules montre des homologies au niveau des résidus 1 à 6
et 8 à 10
et des différences au niveau du résidu 7 ainsi qu'au niveau de l'acide gras.
Ces 3
molécules correspondent aux polymyxines (colistines) El, E2 et à la Val-
colistine E2.
Leurs formules chimiques déduites sont présentées dans le tableau 6 suivant.
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Nom Acide Gras (AG) Y Masse Formule brute
(Da)
Colistine E1 C91-1170 Leu/Ile 1168,77 C53H101N16013
Colistine E2 C8H150 Leu/Ile 1154,76 C52H99N16013
Val-Colistine E2 C8H150 Val 1140,74 C511-197N16013
Tableau 6
Les spectres de masse obtenus pour les colistine E1, E2 et val-colistine E2
présentent des valeurs de [M+2H]2+ respectives de 585,39 ; 578,38 et de
571,38. La
fragmentation des ions parents des colistines E1 et E2 donne des ions fils de
m/z 829, 728,
628, 427, 327 et 227 (Figures 6 et 7) qui sont formés par perte de fragments
d'acides
aminés. La fragmentation de l'ion parent de la val-colistine E2 donne des ions
fils de m/z
815, 714, 614, 514, 413, 313 et 213 (Figure 8) formés aussi par perte de
fragments
d'acides aminés.
Ces ions fils obtenus sont identiques à ceux décrits dans la littérature lors
de la
fragmentation des colistines E1, E2 et Val-E2 (Govaerts et al., 2002;
DeCrescenzo et al.,
2007). Les colistines E1 et E2 ont les mêmes séquences d'acides aminés avec
une
différence de masse moléculaire de 14 Da qui correspond à une perte d'un CH2
au niveau
de l'acide gras.
En conclusion, ces résultats montrent que la souche B-LR produit de la
colistine E1, de la colistine E2 et de la valine colistine E2 (Val-E2).
Exemple 6 : Expression hétérologue des gènes pmxA, B, et E issus de
Paenibacillus chez Bacillus subtilis et détection de la colistine.
Bacillus est un hôte d'expression hétérologue phylogénétiquement proche de
B-LR. Le fosmide manipulé pour héberger l'ensemble du cluster de production de
la
colistine est transféré dans la souche receveuse par électroporation. Les
souches
transformées sont sélectionnées sur milieu gélose supplémenté en antibiotique.
La
production de colistine se fait en milieu liquide supplémenté en acide
diaminobutyrique
(précurseur de synthèse). La détection de la colistine est réalisée après
séparation de la
biomasse du surnageant de culture. Des extractions permettent d'isoler la
colistine avant
sa caractérisation en spectrométrie de masse.
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WO 2015/111013 PCT/1B2015/050571
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REFERENCES
BREVETS
US 8,329,430
WO 1998/020836
WO 2009/098357
NON-BREVETS
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