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PCT/EP2021/081889
COMPOSITION SYMBIOTIQUE COMME ADDITIF D'ALIMENTATION POUR LES
PORCELETS OU LES TRUIES ET SON UTILISATION
La présente invention se rapporte à une composition symbiotique pour
le traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou
en
post-sevrage.
La dysbiose intestinale est un déséquilibre du microbiote intestinal
pouvant générer une prolifération de pathogènes (par ex E. cou) provoquant la
diarrhée. Le microbiote est, quant à lui, défini comme l'ensemble des
microorganismes présents dans un milieu déterminé (définition de l'office
québécois
de la langue française, 2008). Ce milieu déterminé est appelé microbiome. Le
déséquilibre du microbiote intestinal se traduit par une réduction de la
diversité des
populations bactériennes et par un excès des bactéries pathogènes du
microbiote.
A l'inverse un microbiote équilibré dans la répartition des espèces de
microorganismes qui le composent est dit en eubiose.
Le secteur de la production de viande grandit rapidement dans le
monde, la production de porc augmente de manière régulière et représente l'un
des plus gros consommateurs d'antibiotiques dans la production animale.
Dans les fermes porcines, le sevrage (interruption de l'allaitement et
changement vers une alimentation sèche) est une période associée à un risque
pour
les jeunes animaux. Une problématique récurrente lors du sevrage des animaux
est
le risque accru de diarrhées résultant de la transition abrupte de régime
alimentaire.
Cette transition abrupte peut engendrer une dysbiose intestinale.
Les diarrhées peuvent entraîner une perte de poids, voire la mort du
nouveau-né dans des cas graves. Le traitement de routine ainsi que les
procédures
de prophylaxie appliquées pour la diarrhée détectée juste après la naissance
du
porcelet sont souvent peu efficaces.
Cette période de transition génère par ailleurs chez l'animal, en
particulier chez le porcelet, un stress significatif au niveau comportemental,
nutritionnel et environnemental, responsable d'une forte réduction dans la
consommation de nourriture.
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Il est donc crucial de maîtriser ce risque de diarrhées car elles
occasionnent une perte considérable pour les éleveurs puisqu'elles sont
souvent
associées à un taux de mortalité élevé, une perte de poids, un retard de
croissance,
et des coûts liés aux traitements.
Actuellement ce risque de diarrhées est maîtrisé par l'ajout d'additifs
minéraux bactériostatiques (ZnO, CuSO4) dans le régime des porcelets sevrés
mais,
au-delà de la résistance déjà observée à ces composés, la pratique d'ajout
d'additifs minéraux bactériostatiques mène à des problèmes environnementaux
(contamination des eaux par les minéraux lessivés et contenus dans les
effluents
d'élevage).
L'ajout d'antibiotiques thérapeutiques dans la nourriture des animaux
autour du sevrage est également une pratique courante. Ce traitement reste
problématique car il induit la résistance des bactéries aux antibiotiques.
Chez les
animaux d'élevage, une utilisation aveugle d'antibiotiques peut également
favoriser la dysbiose intestinale. De plus, sachant que la résistance aux
antibiotiques
augmente de plus en plus et en particulier chez les animaux d'élevage, la
commission européenne a interdit depuis le ler janvier 2006 l'utilisation des
antibiotiques comme facteurs de croissance dans les aliments pour animaux.
Compte tenu de la croissance de la démographie mondiale et de la
demande croissante de viande dans le monde, il est donc crucial de trouver des
solutions alternatives à l'usage des antibiotiques et des additifs minéraux
pour réduire
l'incidence et la sévérité des problèmes digestifs chez les animaux sevrés et,
de
manière plus générale, pour soutenir une croissance durable de l'industrie de
la
viande.
Au vu de ce qui précède, des solutions alternatives aux antibiotiques
et minéraux bactériostatiques ont été développées impliquant une utilisation
optimale de probiotiques en combinaison ou non avec des prébiotiques.
Dune manière générale, une combinaison d'au moins un probiotique
avec au moins un prébiotique est appelée un symbiotique, lorsque le
prébiotique
agit comme substrat en synergie avec le probiotique pour procurer un effet
positif
sur la santé, en particulier sur la digestion.
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La digestion des protéines, des sucres et des graisses chez les individus
monogastriques, et en particulier chez les porcs et la volaille, repose
d'abord sur une
digestion s'effectuant au niveau de l'estomac qui constitue un environnement
acide entraînant une dénaturation des macromolécules pour former un digesta.
Le
digesta arrive ensuite dans l'intestin et y subit encore une hydrolyse par
action du
suc pancréatique qui contient plusieurs protéases et par action des
aminopeptidases et des dipeptidases intestinales.
L'absorption des produits de ces hydrolyses a lieu dans la partie
supérieure de l'intestin grêle et tous les produits non digérés dans
l'intestin grêle
gagnent le gros intestin où ils sont soumis à l'action des microorganismes
(microbiote
intestinal) en entraînant une fermentation.
Il existe de nombreuses publications qui confirment le rôle
indispensable du microbiote intestinal sur la santé des animaux (et des
humains). Le
microbiote intestinal interagit aussi de manière permanente avec le système
immunitaire présent dans la paroi intestinale. Certaines études ont aussi
démontré la
capacité des probiotiques et/ou des prébiotiques à rééquilibrer le microbiote
intestinal et leur utilité sur la santé intestinale par effets généralement
directs et à
court-terme.
L'Organisation mondiale de la Santé (OMS) et l'Organisation des
Nations unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) ont défini les
probiotiques
comme étant des micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés en
quantité
suffisante, exercent des effets positifs sur la santé, au-delà des effets
nutritionnels
traditionnels . Il existe des définitions plus larges qui ne font pas
référence à
l'alimentation, et où le mot ingérés peut être remplacé par administrés.
Bien que les gens pensent souvent aux bactéries et autres micro-
organismes comme des germes nocifs, beaucoup sont en fait utiles.
Cerhaines
bactéries aident à digérer les aliments, à détruire les cellules pathogènes ou
à
produire des vitamines. Beaucoup de micro-organismes dans les produits
probiotiques sont les mêmes que ou similaires aux micro-organismes qui vivent
naturellement, de manière endogène, dans notre corps.
Sans être exhaustif, les probiotiques comprennent différents
microorganismes comme les bactéries Bacillus coagulons, Bacillus
Bifidobacterium animalis lactis, Lactobacillus rhamnosus, Bacillus
licheniformis,
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Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium thermophilum, Clostridium but yricum,
Enterococcus faecium, Bifidobacterium crudilactis, Bifidobacterium
mongoliense,
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri,
Lactobacillus
solivarius, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus
pontis,
Lactobacillus johnsonii, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum,
Collinsella
tanakaei, Pediococcus acidilacticiici, Faecalibacterium prausnitzii,
Coprococcus
catus, Roseburia intestinalis, Anaerostipes but yraticus. Les bactéries
probiotiques les
plus courantes étant celles du genre Lactobacillus et Bifidobacterium. Les
probiotiques comprennent également des levures comme Saccharomyces
boulardii (Sa nders M. E., Probiotics, strains motter , Fu nctiona I foods
nutraceuticals magazine, 2007, 36-41).
Les prébiotiques, quant à eux, sont des substrats utilisés de manière
sélective par les micro-organismes de l'hôte qui stimulent sélectivement la
croissance ou l'activité de micro-organismes souhaitables (Expert consensus
document : The International Scientific Association for Probiotics and
Prebiotics
(ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics, Nature
Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2017, 14,
491-502,
https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.75).
Sans être exhaustif, les prébiotiques comprennent entre autres l'inuline,
le beta-glucane, le 2'-Fucosyllactose (2FL), des oligosaccharides comme les
galactooligosaccharides (GOS), fructooligosaccharides
(FOS),
mannanoligosaccharide (MOS), xylooligosaccharide (XOS), acides gras
polyinsaturés (polyunsaturated fatty acid: PUFA), acide linoléique conjugué
(ALC).
Une formulation combinant au moins un probiotique en association
avec au moins un prébiotique pour prévenir et traiter les infections
bactériennes
pouvant mener à la diarrhée, augmenter le poids de l'animal et promouvoir la
croissance est connue du document W02014049023. Le document W02014049023
décrit des produits et compositions pouvant être bénéfiques en élevage.
Lesdits
produits et compositions qui y sont décrits comprennent des microorganismes,
tels
que des bactéries, en particulier des bactéries probiotiques. Les souches,
ainsi que
les compositions les comprenant, peuvent être administrées à des animaux, de
préférence à des animaux d'élevage, tels que les porcs. L'administration peut
avoir
lieu dans les premiers jours de vie. Selon ce document, l'administration des
produits
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ou des compositions favorise la croissance animale et la prise de poids de
l'animal.
Les infections bactériennes peuvent également être prévenues ou traitées par
lesdits
composés ou compositions. Ce document W02014049023 mentionne qu'une
composition comprenant au moins 2 probiotiques est appropriée pour traiter la
diarrhée chez le porcelet nouveau-né (non sevré). En particulier, une
composition
comprenant Lactobacillus reuteri et Enterococcus faecium permet de réduire la
diarrhée, d'augmenter le gain quotidien moyen de prise de poids et de réduire
la
mortalité du porcelet nouveau-né.
Le document W02018002671 divulgue une composition pour le
traitement et/ou la nutrition de volailles telles que des poulets de chair
comprenant
(i) un probiotique commensal choisi parmi Bifidobacterium animalis,
Collinsella
tanakaei, Lactobacillus reuteri, Anaerostipes, Lactobacillus crispatus,
Pediococcus
acidilacticiici, Lactobacillus pontis, Faecalibacterium prausnitzii,
Coprococcus
catus, Roseburia intestinalis, Anaerostipes but yraticus, But yricicoccus,
Lactobacillus
johnsonii et Ruminococcus sp.; et (ii) un prébiotique. Ce document divulgue
également l'utilisation d'une telle composition pour le traitement des
maladies
entériques chez les volailles, telles que l'entérite nécrotique.
Le document W02006133472A1 concerne un additif alimentaire et/ou
additif pour l'eau potable animale ou humaine favorisant la santé ou la
croissance
de probiotiques. Ce document concerne en outre une utilisation de l'additif
alimentaire humain et animal et/ou de l'eau potable, notamment pour la
prévention
de l'effet néfaste d'un certain nombre de germes indésirables dans le système
digestif des animaux et/ou des oiseaux domestiques.
Finalement, le document W0201 7156548A1 concerne certains
aliments comprenant un composant nutritionnel fermentescible et un composant
probiotique, où le composant probiotique est sélectionné, sur la base de
critères
génétiques et/ou métaboliques, pour métaboliser spécifiquement tout monomère
de sucre libre (Free Sugar Monomers (FSM)) ou tout acide aminé libre (Free
Amino
Acids (FAA)) ou peptide qui s'accumulent dans l'intestin grêle et le gros
intestin en
raison de la composante nutritionnelle fermentescible, qui, sans cette
métabolisation seraient fermentés et métabolisés par des bactéries moins
adaptées
/ opportunistes, créant des efflorescences de bactéries intestinales délétères
et
déplaçant le microbiome vers un potentiel état de dysbiose.
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Malheureusement, les formulations connues sont essentiellement
utilisées comme agent thérapeutique de dysbiose ou de déséquilibre du
microbiome chez l'animal d'élevage. Les effets démontrés in vivo par ces
formulations restent très généraux comme la prise de poids ou le pourcentage
de
mortalité de l'animal. De nombreux probiotiques sont décrits en association
avec
n'importe quel prébiotique dans des buts bien divers. De plus, selon Wang et
col.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 2020, 104: 335-349, D01: 10.1007/s00253-019-10259-
6, il
est admis que des compositions symbiotiques comprenant plusieurs probiotiques
auront un effet avantageux pour lutter contre la dysbiose par rapport à des
compositions comprenant un seul probiotique. Par contre, de telles
compositions
comprenant plusieurs probiotiques présentent l'inconvénient d'être moins
simple et
plus coûteuse à produire de manière industrielle.
En outre, selon Barba-Vidal et col. Animal, 2018, 12, 2489-2498,
D01: 10.1017/S1751731118000873, il existe un manque criant de reproductibilité
au
niveau des expérimentations montrant l'effet bénéfique des probiotiques.
Les interventions à la fin de la gestation de la truie et/ou dès la
naissance du porcelet devraient permettre par le principe de la programmation
précoce d'influencer de manière optimale et durable le bon développement du
microbiote du nouveau-né. Par conséquent, les effets positifs pour la santé de
l'animal ne seraient pas observés seulement en début de vie et durant les 3-4
semaines après le sevrage mais ils resteraient aussi observables au long de la
vie
adulte.
La première colonisation intestinale du porcelet par le microbiote
maternel au moment de la mise bas est cruciale pour l'établissement d'un
microbiote intestinal favorable du nouveau-né, mais la composition du
microbiote
peut être influencée par de nombreux facteurs tels que des antibiotiques, la
nourriture, l'environnement, les agents infectieux, etc.
La présente invention entend donc pallier les inconvénients précités
en procurant une composition comprenant une quantité thérapeutiquement ou
préventivement efficace de
(i) Enterococcus faecium, ou de
(ii) Bifidobacterium animalis lac fis, ou de
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(iii) Clostridium but yricum, ou de
(iv) Bifidobacterium crudi/actis,
comme probiotique,
et un ou plusieurs prébiotiques, cette composition étant à administrer à une
truie, en
gestation ou allaitante, et/ou à un porcelet en allaitement et/ou en post-
sevrage,
pour favoriser un environnement anti-inflammatoire dans l'intestin dudit
porcelet en
allaitement et/ou en post-sevrage, dans le but d'améliorer les conditions de
santé
du nouveau-né.
La présente invention vise donc à procurer une formulation
symbiotique qui a un effet qui se maintient dans le temps en agissant
spécifiquement
sur la modulation du microbiote de manière précoce, favorisant ainsi une
eubiose
intestinale de manière fiable. De plus, la présente invention vise à procurer
une
formulation symbiotique (composition symbiotique) simple avec un probiotique
principal déterminé, ce qui facilite la production et la vérification des lots
de
production. En effet, la production industrielle d'une composition symbiotique
simple, minimale, sera plus facile, plus rapide, et sera économiquement plus
rentable
que la production d'une composition symbiotique comprenant, par exemple,
plusieurs probiotiques.
Selon la présente invention, il a ainsi été mis en évidence qu'il était
possible de mettre à disposition une formulation symbiotique simple comprenant
comme probiotique principal Enterococcus faecium, ou Bificlobacterium animalis
lac fis, ou Clostridium butyricum, ou Bifidobacterium crudilactis qui génère
de
manière démontrée et reproductible un environnement anti-inflammatoire dans le
système digestif, tant de l'animal en gestation que plus tard du nouveau-né,
lequel
se maintient dans le temps pour protéger l'animal contre des dysbioses
ultérieures.
La formulation symbiotique selon la présente invention permettant de
moduler le microbiote du foetus dans un animal en gestation ou du nouveau-né
permettra d'avoir un effet prophylactique maximal et assurera une croissance
et un
développement optimal de l'animal.
En effet, la formulation selon la présente invention favorise une flore
intestinale saine qui protège ainsi l'animal qui l'ingère, en particulier
lorsque celle-ci
est ingérée par la femelle en gestation par la génération démontrée et
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reproductible d'un environnement anti-inflammatoire dans l'estomac et/ou
l'intestin, et ce de manière systématique.
En effet, il est crucial d'analyser l'impact des probiotiques à travers 3
critères importants : la concentration en cellules viables, l'effet bénéfique
sur la
croissance de l'hôte et l'effet bénéfique sur le fonctionnement du tube
digestif
grâce notamment à un impact anti-inflammatoire (Markowiak P. et Slizewska K.,
Gut
Pathog. 2018, 10, 21, dol: 10.1186/s13099).
La formulation symbiotique selon la présente invention procure une
solution efficace contre la dysbiose et le problème de diarrhée survenant lors
du
sevrage, dont le probiotique et le ou les prébiotiques sont choisis
spécifiquement non
pas uniquement sur la viabilité cellulaire, mais pour leurs effets associés
sur la viabilité
cellulaire et sur la réponse anti-inflammatoire du microbiote de l'hôte.
Il a en effet été démontré selon la présente invention que la
formulation symbiotique contenant un probiotique et au moins un prébiotique
produit une diminution de la production d'IL-8 en test in vitro, et une
augmentation
des acides gras à courtes chaînes Short Chain Fatty Acids, SCFAs ainsi
qu'une
amélioration de la diversité et de la quantité des populations bactériennes
endogènes comme les Lactobacillus et les bifidobacteries ainsi que les
bactéries
intervenant dans les voies métaboliques de production du butyrate ou d'autres
acides gras à chaines courtes. Le probiotique et le ou les prébiotique(s),
ensemble,
forment un microbiote intestinal équilibré, conduisant de cette manière à la
génération ensemble d'un environnement anti-inflammatoire dans le système
digestif de l'animal, en particulier du mammifère, en particulier du porc, de
préférence de l'animal en gestation et du nouveau-né, en particulier de la
truie en
gestation ou non et du porcelet.
En effet, ces indicateurs sont importants car il a été montré qu'un
environnement inflammatoire du tractus gastrointestinal peut générer une
dysbiose
intestinale (Zeng et col., Mucosal Immunol., 2017, 10,18-26, doi:
10.1038/mi.2016.75).
Il a également été montré que les Short Chain Fatty Acids, SCFA peuvent
avoir
additionnellement un effet bénéfique de régulateurs immunologiques sur
l'environnement gastro-intestinal (Parada Venegas et col., Frontiers in
lmmunology,
2019, 10, doi:10.3389/fimmu.2019.00277). Les SCFAs sont des acides gras à
courtes
chaînes, produits par le processus de fermentation dans le colon. L'acétate,
le
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propionate et le butyrate sont les trois principaux SCFAs. Le butyrate est
particulièrement important pour le bon fonctionnement du colon car il est la
source
d'énergie principale des colonocytes (cellules épithéliales du colon). Les
SCFAs
peuvent également réduire la réponse pro-inflammatoire des cellules
épithéliales de
l'intestin ( Ira porda C. et
col., lmmunology, 2015 10:1161-1169.
https://doi.org/10.1016/j.imbio.2015.06.004).
Administrée à la truie en gestation ou non et au porcelet, la
formulation symbiotique selon la présente invention favorise l'établissement
d'un
microbiote intestinal équilibré de manière très précoce, protégeant le porc ou
l'animal en gestation ou encore le nouveau-né, plus particulièrement la truie
en
gestation ou le porcelet de manière soutenue dans le temps contre la dysbiose
par
le probiotique et le prébiotique qu'elle contient, lesquels génèrent ensemble
un
environnement anti-inflammatoire.
Avantageusement, la composition selon l'invention est caractérisée
en ce que la quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de
probiotique pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une
quantité de
probiotique pour
(i) diminuer la diarrhée du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage,
et/ou
(ii) augmenter la croissance du porcelet en allaitement et/ou en post-
sevrage.
Préférentiellement, dans la composition selon l'invention, la quantité
thérapeutiquement ou préventivement efficace pour diminuer la diarrhée du
porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est une quantité de probiotique
selon
laquelle la quantité de selles molles et/ou liquides produite par ledit
porcelet en
allaitement et/ou en post-sevrage est plus petite que la quantité de selles
molles
et/ou liquides produite par un porcelet contrôle au cours d'une même période
de
temps et au même stade de développement.
De manière avantageuse, la quantité thérapeutiquement ou
préventivement efficace pour augmenter la croissance du porcelet en
allaitement
et/ou en post-sevrage est une quantité de probiotique selon laquelle a) un
poids
dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus élevé par rapport
au
poids d'un porcelet contrôle au même stade de développement et pendant une
même période de temps et/ou b) une courbe de croissance non-pathologique
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dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est au-dessus, pendant au
moins deux jours, d'une courbe de croissance d'un porcelet contrôle pendant
une
même période de temps au même stade de développement.
Dans une forme de réalisation préférentielle de la présente invention,
ledit un ou plusieurs prébiotiques est choisi dans le groupe constitué de
l'inuline, du
beta-glucane, du 2' Fucosyllactose, du GOS/FOS (galacto-oligosaccharide,
fructo-
oligosaccharide), de l'amidon résistant et de leur mélange.
Selon la présente invention, Bifidobacterium thermophilum provient
de la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMG Gent)
répertoriée sous le numéro 18892, Enterococcus faecium (LMG S-28935),
Bifidobacterium animalis lactis est une souche déposée à la Belgian
Coordinated
Collections of Microorganisms (BCCM/LMG Gent) ayant le numéro de dépôt LMG
P-28149, Clostridium butyricum (LMG1217), Bifidobacterium crudilactis est une
souche déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes
(CNCM,
Institut Pasteur) ayant le numéro de dépôt (CNCM 1-3342) dans le cadre du
document W02006122850.
De préférence, dans la composition symbiotique selon l'invention, la
quantité thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est
comprise entre 1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre
1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07
et
1,00E+011 CFU/jour/animal.
Avantageusement, dans la composition symbiotique selon l'invention,
une quantité dudit un ou plusieurs prébiotiques est comprise entre 0,1 et 1000
g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière
avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
Préférentiellement, dans la composition symbiotique selon l'invention,
ledit probiotique est constitué pour au moins 80% en poids d'un seul
probiotique
choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii)
Bifidobacterium
animalis lactis, (iii) Clos tridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium
crudilactis. Plus
préférentiellement, dans la composition symbiotique, ledit probiotique est
constitué
pour au moins 85%, encore plus préférentiellement pour au moins 90%, de
manière
avantageuse pour au moins 95%, de manière favorable pour au moins 99%, 100% en
poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i)
Enterococcus
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faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et
(iv)
Bifidobacterium crudilactis.
De manière avantageuse, la composition selon l'invention est
caractérisée en ce qu'elle comprend un seul probiotique choisi dans le groupe
constitué de (i) Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis,
(iii)
Clostridium butyricum, et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
Préférentiellement, la composition selon l'invention se présente sous
forme de combinaison comprenant ledit probiotique en quantité
thérapeutiquement ou préventivement efficace et ledit un ou plusieurs
prébiotiques,
la combinaison étant choisie dans le groupe constitué de Bifidobacterium
crudilactis
et beta-glucanes, Bifidobacterium crudilactis et inuline, Bifidobacterium
crudilactis
et 2' fucosyllactose, Bifidobacterium crudilactis et GOS/FOS, Bifidobacterium
crudilactis et l'amidon résistant, Bifidobacterium animalis lactis et
2'fucosyllactose,
Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et
beta-
g luca nes, Bifidobacterium animalis lactis et GOS/FOS, Bifidobacterium
animalis lactis
et l'amidon résistant, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Clostridium butyricum
et
inuline, Clostridium butyric um et beta-glucanes,Clostridium butyricum et
2' fucosyllactose, Clostridium butyricum et l'amidon résistant, Enterococcus
faecium
et beta-glucanes, Enterococcus faecium et inuline, Enterococcus faecium et
2'fucosyllactose, Enterococcus faecium et GOS/FOS, Enterococcus faecium et
l'amidon résistant.
Avantageusement, dans la composition selon l'invention, la
combinaison est préférentiellement choisie dans le groupe constitué de
Clostridium
butyricum et inuline, Clostridium butyricum et GOS/FOS, Bifidobacterium
animalis
lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et 2'fucosyllactose,
Enterococcus
faecium et beta-glucanes, et Bifidobacterium crudilactis et beta-glucanes, de
manière à permettre un dosage journalier de probiotique compris entre 1,00E+05
et
1,00E+015 CFU/jourfanimal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013
CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011
CFU/jour/animal, et un dosage journalier de prébiotique compris entre 0,1 et
1000
g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière
avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal. En effet, selon la présente
invention, une
composition symbiotique comprenant par exemple Bifidobacterium crudilactis et
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beta-glucanes, ou comprenant Bifidobacterium animalis lactis et
2'fucosyllactose
ou comprenant Clostridium butyricum et GOS/FOS ou encore comprenant
Enterococcus faecium et beta-glucanes a montré une capacité synergique à créer
un environnement anti-inflammatoire, en réduisant la présence d'IL-8, en
augmentant la production d'acide gras à courtes chaînes et en favorisant la
croissance des populations bactérienne favorables au microbiote.
De préférence, la composition selon l'invention contient au moins un
excipient conventionnel, sous forme liquide ou solide.
Préférentiellement, la composition selon l'invention est caractérisée en
ce que ledit probiotique et/ou ledit un ou plusieurs prébiotiques et/ou ledit
au moins
un excipient conventionnel se présentent sous forme encapsulé(s) et/ou sous
forme
de poudre et/ou sous forme de granulé(s) et/ou sous forme liquide. Ledit
probiotique
et ledit un ou plusieurs prébiotiques de la composition sont administrés de
manière
simultanée, séparée ou échelonnée dans le temps.
De préférence, la quantité thérapeutiquement ou préventivement
efficace procure le traitement ou la prévention de la dysbiose pendant une
période
de temps, comptée à partir du jour de naissance dudit porcelet, supérieure à 3
jours,
préférentiellement supérieure à 5 jours, encore plus préférentiellement
supérieure à
15 jours, de manière favorable supérieure à 50 jours, de manière encore plus
favorable supérieure à 100 jours. En effet, il a été montré que la composition
suivant
la présente invention peut générer un effet de rémanence pour traiter ou
prévenir
la dysbiose du porcelet. En fonction de la composition symbiotique et du
profil
d'administration de cette composition, par exemple en fonction d'une
administration de la composition à la truie en gestation et/ou allaitante
et/ou au
porcelet en allaitement, le traitement ou la prévention de la dysbiose du
porcelet
pourra être favorisé même lorsque celui-ci est au stade de post-sevrage.
Préférentiellement, la composition selon l'invention est administrée à
une truie en gestation pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du
porcelet
en allaitement et/ou en post-sevrage. De manière alternative, la composition
selon
l'invention est administrée à une truie allaitante pour le traitement ou la
prévention
de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage. De manière
alternative, la composition selon l'invention est administrée à un porcelet en
allaitement pour le traitement ou la prévention la dysbiose du porcelet en
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allaitement et/ou en post-sevrage. De manière préférée alternative, la
composition
selon l'invention est administrée à une truie en gestation et/ou allaitante
et/ou à un
porcelet en allaitement pour le traitement ou la prévention de la dysbiose du
porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
Avantageusement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le
traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité thérapeutiquement
ou
préventivement efficace de probiotique pour augmenter la production de mucus
dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage selon
laquelle une
quantité de cellules en gobelet (cellules caliciformes) dans l'intestin dudit
porcelet
en allaitement et/ou en post-sevrage est plus grande que la quantité de
cellules en
gobelet dans l'intestin dudit porcelet contrôle au même stade de
développement.
Préférentiellement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le
traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité thérapeutiquement
ou
préventivement efficace de probiotique pour augmenter la capacité d'absorption
des villosités intestinales du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage
selon
laquelle
(i) un rapport entre la profondeur des villosités intestinales et la hauteur
des cryptes intestinales dans l'intestin dudit porcelet en allaitement et/ou
en post-
sevrage est plus grande que le rapport entre la profondeur des villosités
intestinales
et la hauteur des cryptes intestinales dans l'intestin d'un porcelet contrôle
au même
stade de développement, et/ou
(ii) une épaisseur de la lamina proprio intestinale dans l'intestin dudit
porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage est plus grande que l'épaisseur
de la
lamina proprio intestinale dans l'intestin d'un porcelet contrôle au même
stade de
développement, et/ou
Préférentiellement, la quantité thérapeutiquement efficace pour le
traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité de probiotique
selon
laquelle des concentrations en populations bactériennes endogènes favorables
au
microbiote intestinal telles que les iactobaciilus, et les bificlobacteries
sont
augmentées chez le porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage par rapport
aux
concentrations en populations bactériennes endogènes favorables au microbiote
intestinal du porcelet contrôle au même stade de développement.
Avantageusement, cette augmentation des concentrations en populations
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bactériennes génère un meilleur équilibre du microbiote intestinal de l'hôte
diminuant le risque de dysbiose intestinal.
Avantageusement, selon l'invention, la quantité thérapeutiquement
efficace pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité
thérapeutiquement efficace de probiotique selon laquelle la concentration d'IL-
8
est réduite d'au moins 10% dans l'intestin du porcelet en allaitement et/ou en
post-
sevrage par rapport à la concentration d'IL-8 dans l'intestin du porcelet
contrôle au
même stade de développement, ladite concentration réduite d'IL-8 formant ledit
environnement anti-inflammatoire. Dans le cadre de la présente invention, la
concentration d' IL-8 a été mesurée grâce à des tests in vitro sur des
cellules IPEC_J2
en présence du jus de fermentation (contenant ou non la composition
symbiotique
à tester).
Avantageusement, selon l'invention, la composition symbiotique est
caractérisée, de préférence, en ce que la quantité thérapeutiquement efficace
pour le traitement ou la prévention de la dysbiose est une quantité
thérapeutiquement efficace selon laquelle la sécrétion d'acides gras à courte
chaîne (SCFA's) par le microbiote intestinal d'un porcelet en allaitement
et/ou en
post-sevrage et/ou de cellules intestinales in vitro, est stabilisée ou
augmentée par
rapport à la sécrétion d'acides gras à courte chaîne d'un porcelet contrôle
et/ou
de cellules intestinales contrôles in vitro. Lesdits SCFAs, produits lors du
processus de
fermentation du microbiote sont un indicateur de l'équilibre et de la
croissance du
microbiote. Les SCFAs ont en effet un rôle bénéfique multiple au niveau de
l'intestin :
le butyrate, notamment, a un rôle régulateur dans le transport de fluide
transépithélial. Il améliore également l'état oxydatif et l'inhibition de
l'inflammation
de la muqueuse de l'intestin, il renforce la barrière de défense épithéliale,
il module
la sensibilité viscérale et la mobilité intestinale (Canani, R.B. et col.
World J.
Gastroenterol., 2011, 17: 1519-1528, doi: 10.3748/wjg.v17.i12.1519).
De préférence, selon l'invention, lesdits SCFAs sont choisis parmi le
butyrate, le propionate, l'acétate, le lactate ou leurs combinaisons.
Dans le cadre de la présente invention, la production desdits SCFAs
est mesurée grâce au modèle in vitro fermentation statique détaillé plus en
détails
ci-après.
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Avantageusement, selon l'invention, la composition symbiotique peut
contenir plus de 1 probiotique, par exemple 2 probiotiques, ou par exemple 3
probiotiques, ou par exemple 4 probiotiques ou par exemple 5 probiotiques.
Selon
l'invention, la composition symbiotique pourra également contenir plus de 1
prébiotique, par exemple 2 prébiotiques, ou par exemple 3 prébiotiques, ou par
exemple 4 prébiotiques. D'autres formes de réalisation de la composition
symbiotique suivant l'invention sont indiquées dans les revendications
annexées.
La présente invention se rapporte également à un complément
alimentaire administrable à la truie en gestation ou non et au porcelet pour
le
traitement préventif et/ou curatif de la dysbiose intestinale.
Ledit complément alimentaire, comprenant ladite composition, peut
être sous forme liquide par exemple dans une base lactée ou huileuse ou sous
forme
solide comme une poudre, une poudre dans une gélule, un granulé ou un comprimé
ou une autre forme quelconque.
D'autres formes de réalisation du complément alimentaire suivant
l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte en outre à un aliment complet ou
complémentaire pour animaux d'élevage comprenant ladite composition, ledit
aliment étant sous forme de farine et/ou de granulés et/ou d'alimentations
lactées
et/ou toutes autres formes de conditionnement alimentaire.
D'autres formes de réalisation de l'aliment complet ou
complémentaire pour animaux d'élevage suivant l'invention sont indiquées dans
les
revendications annexées.
La présente invention se rapporte de plus à un aliment pour nouveau-
né animal comprenant ladite composition selon la présente invention et une
base
lactée compatible avec l'alimentation du nouveau-né.
D'autres formes de réalisation de l'aliment pour nouveau-né animal
suivant l'invention sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte aussi à une utilisation de la
composition à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un
porcelet
en allaitement et/ou en post-sevrage pour le traitement ou la prévention de la
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dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage dans laquelle la
quantité
thérapeutiquement ou préventivement efficace de probiotique est comprise entre
1,00E+05 et 1,00E+015 CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et
1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011
CFU/jour/animal, la quantité de prébiotique est comprise entre 0,1 et 1000
g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100 g/jour/animal, de manière
avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal, le probiotique et le prébiotique de
la
composition étant administrés de manière simultanée, séparée ou échelonnée
dans
le temps.
La présente invention se rapporte aussi à une utilisation de la
composition symbiotique prédécrite, pour la fabrication d'un médicament pour
le
traitement ou la prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en
post-
sevrage à administrer à une truie, en gestation ou allaitante, et/ou à un
porcelet en
allaitement et/ou en post-sevrage.
D'autres formes d'utilisation de ladite composition suivant l'invention
sont indiquées dans les revendications annexées.
La présente invention se rapporte enfin à une méthode de traitement
ou de prévention de la dysbiose du porcelet en allaitement et/ou en post-
sevrage
comprenant une administration de la composition selon l'invention à une truie
en
gestation ou non, par exemple une truie allaitante, et/ou au porcelet en
allaitement
et/ou en post-sevrage.
D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention
ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en
faisant
référence aux dessins et aux exemples.
La figure 1 montre le schéma du dispositif expérimental du système
BabySPIME (Dufourny S. et col. Journal of Microbiological Methods, 2019, 167:
105735.
https://doi.org/10.1016/j.mimet.2019). Compartiment
1 :
Estomac/duodenum/jejunum, compartiment 2: iléon, compartiment 3: colon
ascendant. A: Alimentation, B: probiotique, C: prébiotique.
La figure 2 illustre le niveau de production d'IL-8 (pg/ml) par des
cellules IPEC-J2. Les cellules IPEC-J2 ont été mise en contact d'un jus de
fermentation
venant d'une fermentation avec uniquement un prébiotique: GOS/FOS (GF) ou
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Inuline (mu) ou 2'FL (2FL) ou beta-glucane (BG) ou amidon résistant (RS), ou
bien
provenant d'une fermentation pendant laquelle une composition combinant un
prébiotique et un probiotique selon l'invention a été testée. Les résultats
montrent la
moyenne du niveau de production d'IL-8 +/- l'écart-type. La ligne horizontale
correspond au niveau d'IL-8 dans la condition contrôle (blanc-mucine). La
signification statistique a été analysée par un test ANOVA unidirectionnel
avec une
comparaison multiple de type Dunnett de chaque prébiotique et symbiotique par
rapport à la condition contrôle (indiqué par *), et entre les combinaisons
symbiotiques et le prébiotique seul (indiqué par #). Lorsque p <0.05 :*, #;
lorsque p
< 0.01 :**, ##; lorsque p <0.001 :***, ###; et lorsque p <0.0001 :****, <figref></figref>.
BCO :
Bacillus coagulons, BT : Bifidobacterium thermophibm, CB: Clostridium
butyricum,
EF : Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lactis, BCU:
Bifidobacterium crudilactis, BMO: Bifidobacterium mongoliense, LP:
Lactobacillus
plan forum.
La figure 3 montre une série temporelle indiquant l'accumulation de
la production de gaz dans une fermentation in vitro en lot (fermentation
statiques in
vitro) d'un prébiotique seul ou en combinaison avec un probiotique
(symbiotique).
La fermentation in vitro en lot de la combinaison symbiotique se réalise avec
1,00E+07 CFU/ml de probiotique et 0.1g de prébiotique (même quantité dans la
condition où le prébiotique est présent seul), en présence d'un inoculat de 3%
en
fèces. Les résultats indiquent la moyenne (ml/g de substrat) +/- l'écart type
de 3
réplicats expérimentaux. Pour les prébiotiques, GF : GOS/FOS, lnu : inuline,
2FL : 2' FL,
BG : beta-glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO :
Bacillus
coagulons, BT : Bifidobacterium thermophilum, CB: Clostriclium butyricum, EF :
Enterococcus faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lactis, BCU:
Bifidobacterium
cruclilactis, BMO: Bifidobacterium mongoliense, LP: Lactobacillus plan tarum.
La figure 4 montre l'abondance relative de groupes de bactéries
bénéfiques pour l'eubiose intestinale à 24h après le démarrage de la
fermentation
in vitro en lot (fermentation statiques in vitro) en présence du prébiotique
seul ou en
présence de combinaisons symbiotiques (prébiotique + probiotique). Les groupes
de
bactéries bénéfiques sélectionnés comprennent les bifidobacteria, les
lactobacilli,
les clostridium cluster IV, les clostridium cluster XlVa et le gène butyryl-
CoA:acetyl-
CoA transférase. La méthode de mesure par qPCR 2A(-3,ACt) a été utilisée pour
établir l'abondance relative, les mesures ont été normalisées par rapport aux
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bactéries totales et un mélange d'échantillons d'ADN de tous les extraits a
été utilisé
comme calibrateur. La fermentation in vitro, en fermenteur individuel, des
combinaisons symbiotiques a été effectuée à 1,00E+07 CFU/ml de probiotique et
de 0.1 g de prébiotique (même quantité pour la condition avec le prébiotique
seul),
en présence de 3% d'un inoculat de fèces. Les résultats indiquent la moyenne
(ml/g
de substrat) +/- l'écart type de 3 réplicats expérimentaux. La signifiance
statistique
a été analysée par un test ANOVA unidirectionnel avec une comparaison multiple
de type Dunnett et où * correspond à p <0.05, ** à p <0.01, *** à p <0.01, et
**** à
p < 0.0001. Pour les prébiotiques, GF : GOS/FOS, lnu : inuline, 2FL : 2'FL, BG
: beta-
glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO : Bacillus
coagulons, BT :
Bifidobacterium thermophilum, CB: Clostridium butyricum, EF : Enterococcus
faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lochs, BCU: Bifidobacterium
crudilactis, BMO:
Bifidobacterium mon goliense, LP: Lactobacillus plan forum.
La figure 5 montre la capacité du probiotique à survivre et à s'établir
dans une communauté microbienne complexe. La figure 5 montre l'abondance
relative de chaque probiotique par rapport aux bactéries totales à 12h, 24h et
48h
après le démarrage de la fermentation pour différentes compositions
symbiotiques.
L'abondance relative de chaque probiotique est normalisée par rapport à la
quantité relative de probiotique obtenu dans l'échantillon où seul le
probiotique a
été ajouté. Pour les prébiotiques, GoF : GOS/FOS, lnu : inuline, 2FL : 2'FL,
BG : beta-
glucane, amidon résistant : RS. Pour les probiotiques, BCO : Bacillus
coagulons, BT :
Bifidobacterium thermophilum, CB: Clostriclium but yricum, EF : Enterococcus
faecium, BAL: Bifidobacterium animalis lactis, LP: Lactobacillus plan tarum.
La figure 6 montre l'évolution de la population bactérienne entre la fin
de la période de stabilisation et la fin de la semaine de traitement: Les
résultats sont
montrés avec les compositions symbiotiques suivantes Enterococcus faecium (EF)
+
beta-glucane (BG); Bifidobacterium thermophilum (BT) + inuline (Inu);
Clostridium
butyricum (CB) + GOS/FOS (G/F); Bifidobacterium animalis lactis (BAL) + 2'FL
(2FL);
Bifidobacterium cruclilactis (BC) + beta-glucane (BG); et la condition
contrôle.
Les résultats correspondent aux abondances relatives de la quantité
d'ADN de la bactérie cible par rapport à la quantité d'ADN des bactéries
totales
(méthode de mesure par qPCR 2A(-AACt)).
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La figure 7 montre l'impact d'une composition symbiotique
comprenant Bifidobacterium thermophilum et inuline sur la production des
acides
gras volatiles (AGV), SCFA, entre la fin de la période de stabilisation et la
fin de la
semaine de traitement.
La figure 8 montre l'impact d'une composition symbiotique
comprenant Bacillus animalis lactis et 2'FL sur la production des acides gras
volatiles
(AGV), SOFA, entre la fin de la période de stabilisation et la fin de la
semaine de
traitement.
La figure 9 montre l'impact d'une composition symbiotique
comprenant Bacillus crudilactis et beta-glucane sur la production des acides
gras
volatiles (AGV), SOFA, entre la fin de la période de stabilisation et la fin
de la semaine
de traitement.
La figure 10 montre l'impact d'une composition symbiotique
comprenant Enterococcus faecium et beta-glucane sur la production des acides
gras volatiles (AGV), SOFA entre la fin de la période de stabilisation et la
fin de la
semaine de traitement.
Comme indiqué précédemment, la présente invention se rapporte à
une composition symbiotique comprenant, une quantité thérapeutiquement ou
préventivement efficace de (i) Enterococcus faecium, ou de (ii)
Bifidobacterium
animalis lactis, ou de (iii) Clos tridium but yricum, ou de (iv)
Bifidobacterium crudilactis,
comme probiotique, et un ou plusieurs prébiotiques.
Préférentiellement choisis dans le groupe constitué de l'inuline, du
beta-glucane, du 2' Fucosyllactose, du GOS/FOS, de l'amidon résistant et de
leur
mélange.
Il a en effet été démontré selon la présente invention que la
formulation symbiotique contenant un probiotique et un prébiotique produit une
diminution de la production d'IL-8 en test in vitro, et une stabilisation ou
une
augmentation des Short Chain Fatty Acids, SCFAs ainsi qu'une amélioration de
la
diversité et de la quantité des populations bactériennes endogènes comme les
Lactobacillus, les bifidobactéries, les Clostridium clusters IV et XlVa ainsi
que les
bactéries intervenant dans les voies métaboliques de production du butyrate,
formant un microbiote intestinal équilibré, conduisant de cette manière à la
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génération d'un environnement anti-inflammatoire dans le système digestif du
porcelet en allaitement et/ou en post-sevrage.
Administrée à la truie en gestation et/ou au porcelet, la formulation
symbiotique selon la présente invention favorise l'établissement d'un
microbiote
intestinal équilibré de manière très précoce, protégeant l'animal en gestation
ou
encore le nouveau-né, plus particulièrement la truie en gestation ou le
porcelet de
manière durable contre la dysbiose à l'aide du probiotique et du prébiotique
qu'elle
contient, lesquels génèrent ensemble un environnement anti-inflammatoire.
Préférentiellement, la combinaison est choisie dans le groupe
constitué de Clostridium butyricum et inuline, Clostridium butyricum et
GOS/FOS,
Bifidobacterium animalis lactis et inuline, Bifidobacterium animalis lactis et
2' fucosyllactose, Enterococcus faecium et beta-glucanes, et Bifidobacterium
crudilactis et beta-glucanes, de manière à permettre un dosage journalier de
probiotique compris entre 1,00E+05 et
1,00E+015 CFU/jour/a nima I,
préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013 CFU/jour/animal, de manière
avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal, et un dosage
journalier
de prébiotique compris entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement
entre 0,5
et 100 g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
Avantageusement, selon l'invention, le probiotique est constitué pour
au moins 80% en poids d'un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de
(i)
Enterococcus faecium, (ii) Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium
but yricum,
et (iv) Bifidobacterium crudilactis.
De manière préférentielle, selon l'invention, la composition comprend
un seul probiotique choisi dans le groupe constitué de (i) Enterococcus
faecium, (ii)
Bifidobacterium animalis lactis, (iii) Clostridium butyricum, et (iv)
Bifidobacterium
crudilactis.
De manière avantageuse, la quantité thérapeutiquement ou
préventivement efficace de probiotique est comprise entre 1,00E+05 et
1,00E+015
CFU/jour/animal, préférentiellement entre 1,00E+06 et 1,00E+013
CFU/jour/animal,
de manière avantageuse entre 1,00E+07 et 1,00E+011 CFU/jour/animal.
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Préférentiellement, la quantité dudit un ou plusieurs prébiotiques est
comprise entre 0,1 et 1000 g/jour/animal, préférentiellement entre 0,5 et 100
g/jour/animal, de manière avantageuse entre 1 et 25 g/jour/animal.
Fermentation statique in vitro:
La capacité de fermentation des différentes combinaisons
symbiotiques a été testée dans un modèle statique de fermentation in vitro,
suivant
le protocole décrit par Bindelle et col. Journal of Animal Science 2010, 87,
583-93.
https://doi.org/10.2527/jas.2007-0717 et par Iran et col. FEMS Microbiology
Ecology
2016, 92, 1-13. https://doi.orq/10.1093/femsec/f1v165. En résumé, la
fermentation in
vitro a été réalisée dans des flacons contenant 15 ml d'une solution contenant
3%
de matières fécales de porcelet en pré-sevrage; trois supports recouverts de
mucine
préalablement immergés dans de la gélose à la mucine; 100 mg de prébiotique et
1,00E+07 CFU / ml de probiotique. Les flacons scellés ont été incubés à 39 oc
sous
agitation pendant 48 h dans un bain-marie. Trois répétitions ont été réalisées
par
condition de test.
Production de gaz:
La pression du gaza été mesurée 2, 5,8, 12, 16, 20, 24 et 48h après le
début de la fermentation pour la détermination de la cinétique de fermentation
en
utilisant le modèle mathématique monophasique de Groot et col. Animal Feed
Science and Technology 1996, 64, 77-89. https://doi.org/10.1016/S0377-
8401(96)01012-7. Plusieurs paramètres ont été calculés avec ce modèle: A
(volume
de gaz maximal, ml/g substrat), B (temps pour atteindre A/2, h), C comme
constante
déterminant la pente du point d'inflexion du profil, Rmax (taux de
fermentation
maximum, ml/g de substrat/heure) et Tmax (temps pour atteindre Rmax (h)).
Acides gras a chaîne courte:
Le lactate et les acides gras à chaîne courte (SCFA) ont été dosés
dans le jus de fermentation obtenu après 24h par HPLC isocratique. La courbe
standard utilisée contenait de l'acétate, du propionate, du butyrate ainsi que
des
acides gras à chaîne ramifiée (BCFA): isobutyrate, valérate et isovalérate.
La mesure de SOFA a ensuite été calculée en tenant compte de la
production basale dans les flacons témoins-mucine contenant les supports de
microcosme avec de la mucine. Les valeurs sont données en mmol par g de
substrat
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et comparées aux mesures dans le jus de fermentation ne contenant que le
prébiotique correspondant.
Détermination des modifications du microbiote par qPCR lors d'un
essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes
compositions symbiotiques.
Pour chaque essai dans le système de fermentation statique in vitro,
l'analyse des modifications du microbiote intestinal a été réalisée par qPCR
sur des
échantillons prélevés après 24 heures de fermentation. Les séquences des
amorces
sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer l'expression par qPCR des
gènes
cibles correspondant aux populations bactériennes bénéfiques pour la
communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 ci-
dessous.
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Tableau 1.- Séquences des amorces sens (F) et anti-sens (R) pour
mesurer par qPCR des gènes cibles correspondant aux populations bactériennes
bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin.
Population
Séquence des amorces 5'¨>3'
bactérienne/gèn Gènes cibles
Référence
des gènes cibles
es cibles
Unibac-F CGTGCCAGCCGCGGTAATAC
Bactéries totales GGGTTGCGCTCGTTGCGGGA Amit-Romach
Unibac-R et col. (2004)
CTTAACCCAAC
LAA-F CATCCAGTGCAAACCTAAGA
Lactobacillus
Wang et col.
LAA-R GATCCGCTTGCCTTCGC
(1996)
Bif164-F GGGTGGTAATGCCGGAT
Bifidobacterium
Langendijk et
Bif662-R CCACCGTTACACCGGGAA col.
(1995)
Clostridium Sg-Clept-F GCACAAGCAGTGGAG
Matsuki et
cluster IV Sg-Clept-R CTTCCTCCGTTTTGTCAA col.
(2004)
Clostridium g-Ccoc-F AAATGACGGTACCTGACTA
Matsuki et
cluster XlVa g-Ccoc-R CITTGAGITTCATTCTTGCG col.
(2002)
Butyryl- F TGGACAGAAAGGTTGCGGA
CoA:acetate-
Uerlings et
R GTGTGTACGCCCAGATCCT col.
(2019)
CoA transférase
Les bactéries totales sont ciblées à l'aide des amorces décrites dans Amit-
Romach
E. et col. Poult Soi 2004, 83, 1093-1098, doi: 10.3382/ps/pey394.
Les bactéries faisant partie du groupe lactobacillus sont ciblées à
l'aide des amorces décrites dans Wang R.F. et col. Appl Environ Microbiol
1996, 62,
1242-1247, doi: 10.1128/AEM.62.4.1242-1247.1996.
Les bactéries faisant partie du groupe bifidobacterium sont ciblées à
l'aide des amorces décrites dans Langendijk P.S. et col. Appl Environ
Microbiol 1995,
61, 3069-3075, doi: 10.1128/AEM.61.8.3069-3075.1995.
Les bactéries faisant partie du groupe clostridium cluster IV sont ciblées
à l'aide des amorces décrites dans Matsuki T. et col. Appl Environ Microbiol
2004, 70,
7220-7228, doi: 10.1128/AEM.70.12.7220-7228.2004.
CA 03198168 2023- 5-9
WO 2022/101511 24
PCT/EP2021/081889
Les bactéries faisant partie du groupe clostridium cluster XlVa sont
ciblées à l'aide des amorces décrites dans Matsuki T. et col. Appl Environ
Microbiol
2002, 68, 5445-5451, doi: 10.1128/aem.68.11.5445-5451.2002.
La Butyril-CoA:acetate-CoA transférase est ciblée à l'aide des
amorces décrites dans Uerlings J. et col. J Sci Food Agric 2019, 99, 5720-
5733,
doi: 10.1002/jsfa .9837.
Détermination de la capacité des probiotiques de survivre et de
s'établir dans un écosystème microbien complexe par qPCR lors d'un essai en
modèle de fermentation statique in vitro en présence de différentes
compositions
symbiotiques.
Pour chaque essai dans le modèle de fermentation statique in vitro,
l'analyse et suivi de la présence de chaque probiotique dans le jus de
fermentation
a été réalisée par qPCR sur des échantillons prélevés à 12, 24 et 48 heures
après le
début de la fermentation. Les séquences des amorces sens et des amorces anti-
sens
utilisées pour mesurer par RT-qPCR l'abondance relative des probiotiques sont
indiquées dans le Tableau 2 ci-dessous.
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Tableau 2.- Séquences des amorces sens (F) et anti-sens (R) pour
mesurer par qPCR l'abondance relative des probiotiques.
Séquence des amorces 5'¨>3' des
Probiotique
Référence
gènes cibles
Bifidobacterium F CCC TTT CCA CGG GTC CC
Veiga et col.
animalis lactis R AAG GGA AAC CGT GTC TCC AC
(2010)
F GCATGGAGGAAAAAG- GAA
Bacillus coagulons Hidaka et col.
R CCCGGCAACAGAGTTTTA
(2010)
Bifidobacterium F TTG CTT GCG GGT GAG AGI
Mathys et
thermophilum R CGC CAA CAA GCT GAI AGG AC
col. (2008)
Clos tridium F ATGGGTTAGGCAAGCAGAAA
Cremonesi et
butyricum R GCTGGATCTGCCTTCTCATC
col. (2012)
Enterococus F GAA ACG ACG GTG TCA TCA
Loquasto et
faecium R TCC AIT TTG TCG TTA ICI G
col. (2013)
TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG
Lac tobacillus F
AAT
Haarman et
plan tarum
col. (2005)
R TGT ICI CGG TTT CAT TAT GAA
AAA ATA
Bifidobacterium F TGACCGACGAGATCACCTAT
Cette
crudilactis (rpoB) R ACCATCTGACGTGGAGAGA
invention
Bifidobacterium F CCATCGAGCTTCGTCCTTT
Cette
crudilactis (rpIB) R GCCTTACCGAGCTGAAGATT
invention
Références bibliographiques du Tableau 2:
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the
United States of America 2010, 107:
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https://doi.org/10.1016/j.watres.2010.01.007.
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https://doi.org/10.1017/5002202991200026X.
Loquasto J.R. et col. Applied and Environmental Microbiology 2013, 79, 6903-
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CA 03198168 2023- 5-9
WO 2022/101511 26
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https://doi.org/10.1128/AEM.01777-13.
Haarman M. et col. Applied and Environmental Microbiology 2005, 71, 2318-24,
https://doi.org/10.1128/AEM.71.5.2318.
Détermination de la réponse immunitaire causée par incubation du jus
de fermentation obtenu lors d'un essai en modèle de fermentation statique in
vitro
en présence de différentes compositions symbiotiques.
Dans la cadre de la présente invention, la lignée IPEC-J2 (entérocytes
intestinaux isolés du jéjunum d'un porcelet nouvellement né et non allaité (ou
alimenté avec une formulation lactée) et appartenant à une lignée cellulaire
ni
transformée ni tumorigène) a été incubée dans le jus de fermentation produit
par la
combinaison symbiotique à tester ou contenant uniquement le prébiotique en
question pendant 24h. A la suite de cette période d'incubation, la réponse
immunitaire est évaluée par la production de cytokines induites (IL-8, IL-6,
IL-1b) et
TNF-alpha.
Préalablement, la cytotoxicité des jus de fermentation sur les cellules
IPEC-J2 a été évaluée car, pour pouvoir observer une réponse immunitaire, il
est
important que la lignée cellulaire reste viable. Pour chaque combinaison
sélectionnée, l'effet des différentes concentrations en jus de fermentation,
préalablement filtré à 0.8 lim, sur la viabilité des cellules IPEC-J2 a été
mesurée par
le test MTT (sel de tétrazolium MTT : bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-
2,5-
diphenyl tetrazolium), qui est un test colorimétrique de numérotation des
cellules
viables. Le contact avec les cellules IPEC-J2 a été ensuite réalisé avec un
taux
d'inoculation du jus de fermentation de 0.8% ( V/V) .
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Mesure de la concentration d'IL-8:
Dans le cadre de la présente invention, la concentration d'IL-8 a été
mesurée grâce à des tests in vitro sur des cellules IPEC-J2 en présence du jus
de
fermentation (contenant ou non la composition symbiotique à tester) (voir
Figure 2).
Pour réaliser le test, un essai a été réalisé en comparant les concentrations
de IL-8
(les autres marqueurs IL-6, IL-lb et TNF-alpha n'ont pas été détectés)
produites en
présence du jus de fermentation dans différentes conditions : témoin-mucine
(ligne
horizontale de la Figure 2), prébiotiques seules (conditions GOS/FOS (GF),
2FL, Inuline
(Inu), amidon résistant (RS) et (3-glucane (BG)), et symbiotiques (les autres
conditions
de la Figure 2). Cet essai indique que, si le niveau de IL-8 est plus faible
en présence
du jus de fermentation contenant la composition prébiotique ou symbiotique
comparé au jus de fermentation témoin-mucine, cela montre un effet anti-
inflammatoire de la présence du pré- ou symbiotique. En plus, si le niveau de
IL-8 est
plus faible en présence du jus de fermentation contenant la composition
symbiotique comparé au jus de fermentation contenant uniquement le
prébiotique,
cela montre que la combinaison spécifique dudit au moins un probiotique avec
ledit
au moins un prébiotique possède un effet anti-inflammatoire supplémentaire par
rapport au prébiotique seul. La viabilité cellulaire des symbiotiques
(résultats du test
IVITT) a été prise en compte pour ajuster les concentrations d'IL-8. Le niveau
d'expression d'IL-8 est déterminé par ELISA (Porcine IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA
kit
DY535: R&D Systems).
Modèle BabySPIME :
Le modèle BabySPIME est un modèle scientifiquement validé
(Dufourny S. et col. Journal of Microbiological Methods, 2019, 167: 105735.
https://doi.org/10.1016/j.mimet.2019) qui simule la dynamique et les
conditions
physiologiques d'un tractus gastrointestinal complet chez le porcelet dans un
environnement in vitro (équipement dérivé du modèle SHIME de ProDigest Bvba,
Gent, Belgium). Le modèle comprend 2 fois 3 réacteurs qui simulent de manière
séquentielle l'estomac (condition acide et digestion par la pepsine), l'iléon
(processus de digestion enzymatique) et le côlon proximal (processus de
fermentation par le microbiote) (voir Figure 1). Ce système permet d'obtenir
des
communautés microbiennes complexes et stables dont la fonction et la structure
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sont fortement similaires aux communautés microbiennes retrouvées dans les
différentes régions de l'intestin.
Des pompes péristaltiques permettent le transfert du milieu de culture,
du jus pancréatique, de la bile, de l'acide (HCI 0.5M), de la base (NaOH 0.5M)
et
des liquides de fermentation d'un réacteur à l'autre au cours d'un cycle
complet.
En pratique, le réacteur 1 simule les fonctions de l'estomac, du duodenum et
du
jejunum, le réacteur 2 simule les fonctions de I' ileum, le réacteur 3 simule
les fonctions
du colon proximal.
Un essai complet dans le système babySPIME dure 3 semaines : 2
semaines de stabilisation du microbiote suivie par une semaine de traitement
avec
la composition symbiotique. Une solution de 1,00E+08 CFU/ml a été préparée
pour
inoculer une dose finale de 1,00E+07 CFU/ml de contenu intestinal. La dose de
prébiotique est de 2g de prébiotique/jour pour atteindre une concentration de
1%
de l'alimentation.
Les matières fécales de 6 porcelets âgé de 27 jours en allaitement et
n'ayant pas subi de traitement antibiotique ont été utilisées pour préparer
l'inoculat
de l'étude. Les matières fécales ont été prélevées directement des porcelets
et
maintenues sur glace dans des conditions anaérobies. Pour chaque essai,
l'inoculat
a ensuite été homogénéisé pendant 10 minutes en ajoutant les matières fécales
de
chaque porcelet à une solution de tampon phosphate en condition anaérobie.
Après une filtration macroscopique pour éliminer les particules encore en
suspension,
le filtrat a été injecté de manière simultanée dans les réacteurs 2 et 3.
Avant
l'inoculation, ces deux réacteurs ont été remplis avec un milieu de culture
non-
acidifié et le pH a été ajusté de manière automatique dans chaque réacteur de
manière à simuler au mieux les conditions physiologiques.
Le milieu de culture a été préparé et validé préalablement. Les
bouteilles de milieu ont été stockées à 4 C et le pH a été ajusté à 3.0 avant
l'utilisation
dans le premier réacteur. Une solution mimant le jus pancréatique contenant du
bicarbonate de sodium (2.5 g/L, VWR Chemicals, Radnol, Pennsylvania, USA), de
la
pancréatine (0.9g/L, ProDigest) et des sels biliaires (Oxgall 4.0 g/L) a été
ajoutée au
milieu.
Le cycle d'alimentation est planifié 3 fois par jour basé sur un temps
total de rétention de 14h. Au cours de chaque cycle, le milieu de culture,
maintenu
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à 4 C, passe dans le réacteur 1 pendant 1h30. Ensuite, le mélange de jus
pancréatique/sels biliaires (60m1), aussi maintenu à 4 C, est ajouté dans le
même
réacteur pendant 1h. Après ce temps, et de manière simultanée, le contenu des
réacteurs 1, 2 et 3 est transvasé, respectivement, dans les réacteurs 2, 3
ainsi que
un conteneur biologique de déchet.
Les conditions anaérobies de tous les réacteurs sont maintenues grâce
à un flux d'azote (N2) une fois par jour pendant 10 minutes au niveau des
réacteurs.
Le contenu des réacteurs est agité de manière continue (300 rpm) et maintenu à
39.5 C. Le pH des réacteurs 2 et 3 est contrôlé en continu afin de stabiliser
le pH de
l'ileum et du colon proximal.
Des prélèvements ont été collectés dans le système babySPIME durant
la phase de stabilisation, avant le traitement avec les formulations
symbiotiques et
en fin de traitement avec le symbiotique.
Pour chaque essai dans le système babySPIME, l'analyse des
modifications du microbiote intestinal a été réalisée par qPCR sur des
échantillons
prélevés en fin de phase de stabilisation et à la fin de la semaine de
traitement par
une composition symbiotique. Les séquences des amorces sens et des amorces
anti-
sens utilisées pour mesurer par qPCR la quantité relative des gènes cibles
correspondant aux populations bactériennes bénéfiques pour la communauté
microbienne de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1 mentionné plus
haut.
Trois répétitions sur le modèle BABY-SPIME ont été réalisées pour
chacune des combinaisons symbiotiques.
Exemples.-
Exemple 1 : La capacité de fermentation de la composition
symbiotique par modélisation de la production de gaz et la production de
lactate
et SCFA dans un modèle de fermentation statique in vitro
Les courbes de la fermentation des pré- ou symbiotiques sont
montrées dans la figure 3. Dans toutes les conditions de la Figure 3, il y a
une
augmentation de la capacité de fermentation mesurée par l'augmentation de la
production de gaz. Dans toutes les conditions de la figure 3, cette production
de gaz
est plus imporhante en présence d'une composition symbiotique par rapporh à la
présence du prébiotique seul.
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Les paramètres issus de la modélisation de la production de gaz
pendant la fermentation statique des symbiotiques sont comparés par rapport
aux
paramètres des prébiotiques seules (tableau 3).
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o
o
03
03
o
,0
Tableau 3.- Pahmè'res=dé td proclition de gaz de Id ferriérikitibil
iri'Vittderi Ut- (feirriénktibh statique) 'én présent.
1µ.)
d'un préblolque seul ou en présence Jonc combinaison ente un prébiotique et un
pfcbiotlque (syr ique). (Moy : rric,yenne,
: édart-type, p-val p-valeur.
A - VoLnye ma>:
production de flc71,-.: B - Tamp$ (heures', C- Pente
Rrhax !g substrat) Trndx.fneorés'
ss,ibstrat
N.^,cy ET p-va ,Moy ET o-val M.cy ET p-val MOy E7 p-val Mo,/ ET. p-val
GOS/FOS 'GoF' 11-7,42 42,19 4,55 0,78 .3,11 0,51
124,37 3,35 3.63 0,64
;-[2oF :73713 0.03 ço,oco: 4,81 0,51 C.999:3 1,97 0,09
<0.0001 45,67 6,28 0,3011 2.T 0,14 0,3598
B7-G F 6370 4.5,40 0,9939 5,98 1,33
0,0089 3,13 0,08 >0.9323 25,92 10,61 0,0073 4,86 1,13 0,0047
CE-C,oF 263,62 7, - 0,10001.5 7. 5 0,25
<0,0001 2,02 0,10 0.0031 24,10 0,36 0,0009 4,16 0,30
0,6262:
EF-GpF 208,63 7,32 0,6858 5.19 0,19 0.6948 2,98 0,11 0:9963
33,63 0,91 0.,9993 0,21 0.7613
2Fucos'ylac-ose (21'4 203,03 1 5.43 3,64 0,34
.72,93 5.17' 5.19 0..13
BAL-2FL 207,5 é I c. 3.2 0,9983 L.:_141.34
2,32 0,11 <0.00D1 29:33 0,5227 3.37 0..22 02003
-429.53 15361 0,0044 3.44 0,39 00062 2,77 .0,32 0.0096 2µ-;,22, 9,55 0,6089
2.59 0:14 <0:9001
713,14 0.24 /,90 3,12 0,0!
22,47 346 6,31-1 1,221
BAL- nu 525,17 11,70 0,3057 6.33 0,04
<0.0001 2,47 0,13 0.0037 25,47 ,93 0,2055 4,47 0,20
<0,0001
B74n3 '66,0 7.22 0,2837 6.03 0,13 -=0:0001 3,21 0,11 09966
27,27 0;42 0,0152 4,93 0,03 0,0002
An-loct3 -éistont IRS 153,64 .8.7J 20.90 1.07 5,84
136 13,73 õ44 19,03 1,08
CE-RS 250,32 1.6.20 (0,1=100- 7,95 0,36 <1..0001 1,97 0,06
<0,01001 20:37 1,59 <0,0001 4,50 0,26 0,0001
sid
L73.
oc
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La cinétique de production de gaz et les paramètres du modèle incluent : A: la
production maximale de gaz ; B: le temps pour avoir 50% de la production
maximale
de gaz; C : la pente ; D: le taux maximal de production de gaz (Rmax) ; le
temps à
Rmax (Tmax). La fermentation statique des combinaisons symbiotiques a été
réalisée
à 1,00E+7 CFU/ml de probiotique et 0.1 g de prébiotique (même quantité de
prébiotique utilisée dans la condition où le prébiotique est seul) en présence
de 3%
d'un inoculat de fèces. Les résultats indiquent la moyenne +/- l'écart-type de
3
réplicats expérimentaux. Les p-valeurs ont été obtenues par une analyse
statistique
ANOVA unidirectionnel avec un test de comparaison multiple de type Du nnett.
Les
résultats sont considérés comme étant significatifs lorsque p <0.05.
Les SCFAs présents dans le jus de fermentation après 24h de
fermentation sont présentés dans le tableau 4. Il n'y avait pas de production
de
lactate après 24h de fermentation.
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o
o
03
03
o
Tableau 4.- Production des acides gras à courtes chdihes par fermentation en
présence d'un
prébiotique seul ou en présence des combinaisons symbiotiques analysées dans
Ic fermentation in vitra en lot. (Moy:
moyenne, ET: écart-type, p-val :
n.)
ACETATE otig PROHC:NATE BUTYRATE 'ET mol/g
BCFA rrmLçj de: SCFA TOTA.UX 'rrin-101,/g
de subir:r1) (mmoL/c de substrat)
de sub.nd,1:i su:Dstra'.; de st_ b.7`771::
ET p-val Moy ET p-val !.1.cy ET p-va] Moy ET p-val
ET p-val
GGE/FOS
2,569 0,075 2,210 0,033 0,636 0,013
0,140 G1306 5,554 0,111
(GDF)
5C G-
.2,789 0,128 0,284.5 2.L4 3,083 0,2319 0,745 0,070 0,9951 0,225 0,028
0,9631 6,185 0,.281 0,6103
Gc.:F
3f-GoF
2,374 0,061 07'595 2,67-. 3,024 0,4378 1,495 0,033 0,0001 0,435 0,032
0,0135 6,976 0,191 0,2029
CE-GoF
1.494 1,295 0,949- 4,863 1,0.40 <3..000- 2,183 0,42" <3,000" 1.104 0,231
<0,0001 9,642 3,019 0,0.00.7
EF-GoF
2.084 0,076 0.9789 2,794 3,092 .-',1,28:56 1,432 C,C72 3,0003 0.415 0:055
0,0242 6,727 3,255 0.3028
2FL 2,789 0,695 1,87" 0,53.0 0,315 0,065
0.035 0,001 5,010 1,285
BA L-2:71_ 2.682 0,090 0,9893 2,764
3,386 0,0626 1,056 C,C6.4 78i,000 r 0.373 0,041 0,0007 6,875
0,122 3:505
B.r..20-2FL 1:2,7 0,697 0,3144 2,732 3,423 0,0722 1,264 0,132 -781,000
0,484 0,098 0,0001 5,630 1,407
ECU-2FL 1.288 0,423 0,0119 2.8'] 3,354 0..052 1,210 0,113 <3,000
0.539 3,072 <0,0001 5,647 0.966 3.8099
'ne
2.956 0.087 2,38.7 0,058 0,698 0,029
0,123 2,308 6,163 0,084
flu)
L-Iriu 2,717 0,099 0,7282 2,141
0,147 0,248 1,145 0,140 0,0039 0.332 13,07 0,0046 6,341
0,392 0,9342 _
31.-Inu
2,979 0,727 0,99.69 1,866 0,274 0,0229 1,164 0,117 0,0C3-. 1174 0,048
0,4423 6,183 1,161 0,9992
Anidcri
résis7crt 2,837 0,159 1,590 0,092 0,558 0,101
0.029 0,020 5,014 0,314
;=-;
CE-=S 3,763 0,267 0,0207 3,629 3,193 <0,0001 1,461 0,103
<0,0001 0.332 0,360 0:0002 9,185. .3,618 0,0004 -
ECU-RS .2,253 0,453 0,1109 2, 22
0,326 3,0479 0,521 0,060 0,837 0.039 0,0.33 7.,'õ856 0,98311
13-
gliirxrie 0.609 0,075 2,820 3,032 0,056 0,009
0,023 0,033 1,485 0,099 -tJ
BAI-BG 1.389 0,322 0,0116 1,3.79
3,090 0,00' 6 0,045 0,039 0,9994 0,005 0,008 0,9806
2,818 2,300 0,0144 n.)
LP-.13G 1,304 35 0,78.25 1,527 0,076
3,000.?. 0,115 0,062 0,8436 C ;003 >0,9999 2,946 is.,253
0,0082 _1
EF-BG
1.723 0,049 0,00.7 1,972 0,018 <:0..02:2:' 0,231 0,011 0,1192 0,033 0.320
0,0543 3,960 :"..,379 0,0002 ree
EC.L.-EG 1.554 0,433
0,0033 2,042 3,274 <0,0001 0,346 0,190 0,01 0,022 0,024 0,2327
3,964 3,910 0,0002 111 cet
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La fermentation statique des combinaisons symbiotiques a été réalisée
à 1,00E+07 CFU/ml de probiotique et 0,1 g de prébiotique (même quantité de
prébiotique utilisée dans la condition où le prébiotique est seul) en présence
de 3%
d'un inoculat de fèces. Les résultats indiquent la moyenne +/- l'écart-type de
3
réplicats expérimentaux. Les p-valeurs ont été obtenues par une analyse
statistique
ANOVA unidirectionnel avec un test de comparaison multiple de type Dunnett.
Lorsque p <0,05 : * ; p <0,01 : ** ; p <0,001 : *** ; p < 0,0001 :
Example 2: Détermination des modifications du microbiote par qPCR
lors d'un essai en modèle de fermentation statique in vitro en présence de
différentes
compositions symbiotiques
L'abondance relative des bactéries bénéfiques après 24h de
fermentation sont présentés dans la figure 4. La méthode de delta-delta CT a
été
utilisée pour exprimer les bactéries cibles par rapport aux bactéries totales.
Les
résultats des symbiotiques sont comparés par rapport aux prébiotiques seuls.
Comme l'indique la figure 4, plusieurs compositions symbiotiques, comme BT-GF,
CB-
GF, BCO-GF, BCU-2FL, BMO-2FL, BAL-2FL, BAL-Inu, BT-Inu, CB-RS, BCU-RS, BAL-BG,
LP-
BG, ou BCU-BG, permettent d'augmenter de manière significative l'abondance
relative des bactéries bénéfiques à 24h de fermentation.
Exemple 3: Détermination de la capacité des probiotiques de survivre
et de s'établir pendant la fermentation
La figure 5 montre la présence des probiotiques dans le jus de
fermentation après 12, 24 et 48h de fermentation. Des compositions
symbiotiques,
comme BT-Inu, permettent un bon établissement et une bonne capacité de survie
du probiotique.
Exemple 4: Détermination de l'effet immunomodulateur de la
composition symbiotique par quantification de la production d'IL-8 et NO par
des
cellules IPEC-J2.
La production d'IL-8 dans les cellules IPEC-J2 a été mesurée par un test
ELISA.
Après 24h d'incubation, la réponse immunitaire a été évaluée en
mesurant la production d'IL-8 dans le milieu de culture cellulaire. Les
cellules IPEC-J2
ont été incubées avec 0,8% (V/V) de jus de fermentation préalablement
stérilisé par
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filtration. De plus, le taux de survie des cellules IPEC-J2 est supérieur ou
égal à 70%
dans toutes les conditions testées de jus de fermentation.
Pour déterminer l'impact de la composition symbiotique contenue
dans le jus de fermentation sur la production d' IL-8, le taux de production
d'IL-8 a
été mesuré dans une condition contrôle où le jus de fermentation contient un
inoculat de fèces, de la mucine (témoin-mucine), mais en absence de
probiotiques,
de prébiotiques ou de symbiotiques. Dans cette condition contrôle, un niveau
de
base d'expression d'IL-8 est de 932 pg/ml (représenté par la ligne horizontale
à la
figure 2). Les pré- et symbiotiques ont été comparés par rapport au témoin-
mucine.
En plus les symbiotiques ont été comparés par rapport au prébiotique pour
estimer
l'effet additionnel de probiotique. Le tableau 5 montre les p-valeurs de ces
comparaisons, et la figure 2 montre les concentrations d' 1L8.
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Tableau 5.- Production d'IL-8 par les cellules IPEC-J2 dans le
surnageant après 24h d'incubation avec 0,8% de jus de fermentation
préalablement
stérilisé par filtration produit par la composition symbiotique ou le
prébiotique seul.
IL-8 (pg/ml)
p-valeur
moyenne ET
(vs prébiotique) (vs blanc-
mucine)
GOS/FOS (CE) 1094,0 40,5 0,0421
BCO-GF 897,3 96,3 0,0041 0,9207
BT-GF 1089,4 89,8 0,9999 0,0497
CB-GF 849,5 59,4 0,0006 0,3954
EF-GF 927,5 40,6 0,0138 0,9997
2'FL 1041,2 52,6 0,2193
BAL-2FL 581,3 81,1 <0,0001
<0,0001
BCU-2FL 570,8 81,8 <0,0001
<0,0001
BMO-2FL 715,1 41,5 <0,0001 0,0037
INULINE (Inu) 1116,4 40,9 0,0258
BAL-Inu 1177,7 112,6 0,4075 0,004
BT-Inu 1025,9 31,4 0,1816 0,3398
Amidon résistant (RS) 753,3 50,9 0,0086
BCU-RS 1150,3 38,9 <0,0001 0,003
CB-RS 1195,6 61,3 <0,0001 0,0007
13-GLUCANE 831,7 40,5 0,1916
BAL-BG 393,6 30,0 <0,0001
<0,0001
BCU-BG 413,2 46,4 <0,0001
<0,0001
EF-BG 1128,9 60,0 <0,0001 0,0066
LP-BG 775,7 106,0 0,5405 0,0232
blanc-mucine 937,1 110,8
Les valeurs sont corrigées en fonction de la viabilité cellulaire. Les
résultats sont des moyennes avec leurs écart-types. Les comparaisons sont
réalisées
entre les compositions symbiotiques et le prébiotique seul. Les
significativités
statistiques sont analysées par une ANOVA unidirectionnel avec un test de
comparaison multiple de type Dunnett. Lorsque p<0,05 :*; p<0,01 : ** ; p<0,001
:*** ;
p<0,0001 :
Exemple 5: Détermination des modifications du microbiote par qPCR
lors d'un essai en modèle baby SPIME en présence de différentes compositions
symbiotiques.
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Les résultats globaux obtenus sur le système baby SPIME sont présentés
dans la figure 6 et le tableau 6.
Tableau 6.- Synthèse de la régulation à la hausse ou à la baisse de
groupes bactériens d'intérêt suite au traitement symbiotique dans le système
BABY-
SPIME après une semaine de traitement avec les différents symbiotiques.
Test Lactobacillus Bifidobacterium Cluster IV
Cluster XIV Acetyl
Wilcoxon CoA
Control Baisse Tendance à la Stable Stable
Stable
BABY- p<0,01 baisse
SPIME 0,05<p<0,1
EF + BG Stable Tendance à la Baisse Stable
Hausse
baisse p = 0,01
p<0,05
0,05<p<0,1
BT + INU Stable Tendance à la Hausse Baisse
Stable
hausse p<0,05 (p = 0,05)
0,05<p<0,1
CB + Baisse Stable Stable Stable
Hausse
GOS/FOS p<0,01
p<0,01
BAL + 2FL Baisse Hausse Stable Stable
Stable
p<0,01 p<0,05
BCU + BG Baisse Tendance à la Hausse
Tendance Stable
p<0,01 hausse p<0,05 à la baisse
0,05<p<0,1 0,05<p<0,1
Nous retrouvons soit une diminution de la population bactérienne, soit une
augmentation de la population bactérienne ou soit une stabilisation de la
population bactérienne. Le test statistique réalisé est un test de Wilcoxon.
Exemple 6: Composition symbiotique Cl comprenant au moins
Clostridium butyricum et au moins GOS/FOS contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition Cl en ajoutant 1E07 CFU/ml Clostridium
but yricum et 0,1 g de GOS/FOS.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g de GOS/FOS a
été ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de
fermentation. Pour le mélange GOS/FOS, le prébiotique consiste en une solution
liquide homogène de 80% (p/p) de GOS et 20% (p/p) de FOS. Au niveau du
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probiotique, une poudre lyophilisée de bactérie a été pré-mixé dans une
solution
tampon à une concentration de 1,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être
ajouté
au flacon de fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un
processus
de revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37 C sous
agitation.
Ensuite, 1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon
menant
à une concentration finale en probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique comprenant au moins Clostriciium
butyricum et au moins GOS/FOS contre la dysbiose intestinale a montré un effet
favorable sur la fermentation, en augmentant la valeur A (production maximale
de
gaz) par rapport au prébiotique seul (voir condition CB-GoF du Tableau 3, et
en
augmentant les concentrations de SCFAs totales et butyrate après 24 heures de
fermentation statique in vitro (voir condition CB-GoF du Tableau 4). En plus,
l'abondance relative des Bifidobacteries et lactobacilles a augmenté en
comparaison avec le prébiotique seul (voir condition CB-GF de la Figure 4). Le
probiotique Clostridium butyricum était encore présent dans le jus de
fermentation
après 48h de fermentation. Un effet anti-inflammatoire est montré in vitro sur
des
cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d'IL-8 par rapport
au
GOS/FOS seul, tandis que la concentration d'IL-8 n'était pas différent par
rapport au
témoin-mucine (voir condition CB-GF de la Figure 2).
De plus, la composition symbiotique Cl montre une amélioration du
microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations
bactériennes
impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate.
L'augmentation
de ces populations bactériennes a été analysée par qPCR (voir condition CB +
G/F
de la Figure 6 et Tableau 6 présentés plus haut). Les séquences des amorces
sens et
des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des
populations bactériennes bénéfiques pour la communauté microbienne de
l'intestin
sont indiquées dans le Tableau 1.
Exemple 7: Composition symbiotique C2 comprenant au moins
Bifidobacterium thermophilum et au moins l'inuline contre la dysbiose
intestinale.
On a préparé la composition C2 en ajoutant 1E07 CFU/ml de
Bifidobacterium thermophilum et 0,1 g d'inuline.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g d'inuline a été
ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de
fermentation.
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Au niveau du probiotique Bifidobacterium thermophilum, une poudre lyophilisée
de
bactérie a été pré-mixé dans une solution tampon à une concentration de 1,5E08
CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la
solution
pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en
une
incubation de 30 min, à 37 C sous agitation. Ensuite, 1 ml de la solution pré-
mixée
(solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en
probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C2 comprenant Bifidobacterium
thermophilum (BT) et de l'inuline (Inu) contre la dysbiose intestinale a
montré un effet
bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A
(production maximale de gaz), une diminution de la valeur B (le temps pour
atteindre 50% de la production maximale de gaz), une augmentation de la
vitesse
de fermentation (Rmax), et une diminution du temps pour atteindre la quantité
maximale de gaz produite (Tmax) par rapport à l'inuline seule (voir condition
BT-Inu
du Tableau 3). En plus, une augmentation de la concentration de butyrate et
l'abondance relative des bifidobactéries dans le jus de fermentation après 24h
est
démontré (voir condition BT-Inu de la Figure 4), Bifidobacterium thermophilum
était
bien présent jusqu'à la fin de la fermentation. Un effet anti-inflammatoire in
vitro sur
des cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d'IL-8 par
rapport à
l'inuline seule (pas de différence entre le symbiotique et le témoin-mucine)
selon le
protocole décrit à l'exemple 1 (voir condition BT-Inu de la Figure 2).
De plus, la composition symbiotique C2 montre une amélioration du
microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations
bactériennes
impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate et montrant
une
tendance à l'augmentation des bifidobactéries. L'augmentation de ces
populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition BT + INU de la
Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-
sens
utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations
bactériennes
bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le
Tableau 1. En parallèle, une analyse des AGV (Figure 7) a pu montrer une
tendance
à l'augmentation du valérate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants
(p =
0.066) et une tendance à l'augmentation des AGV totaux dans l'iléon (p =
0.090).
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Exemple 8: Composition symbiotique C3 comprenant au moins
Bifidobacterium animalis lactis et au moins 2'FL contre la dysbiose
intestinale.
On a préparé la composition C3 en ajoutant 1E07 CFU/ml de
Bifidobacterium animalis lactis et 0,1 g de 2'FL.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g de 2'FL a été
ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de
fermentation.
Au niveau du probiotique Bifidobacterium animais lactis, une poudre
lyophilisée de
bactérie ci été pré-mixée dans une solution tampon à une concentration de
1,5E08
CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon de fermentation, la
solution
pré-mixée de probiotique a subi un processus de revivification consistant en
une
incubation de 30 min, à 37 C sous agitation. Ensuite, 1 ml de la solution pré-
mixée
(solution stock) a été ajouté au flacon menant à une concentration finale en
probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C3 contre la dysbiose intestinale a montré
un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la
valeur
A (production maximale de gaz), une diminution de la valeur B (le temps pour
atteindre 50% de la production maximale de gaz), une augmentation de la
vitesse
de fermentation (Rmax), et une diminution du temps pour atteindre la quantité
maximale de gaz produite (Tmax) par rapport à 2'FL seule (voir condition Bal-
2FL du
Tableau 3). En plus, une augmentation de la concentration de butyrate (voir
condition BAL-2FL du Tableau 4) et l'abondance relative des Clostridium
clusters IV
dans le jus de fermentation après 24h est démontré (voir condition BAL-2FL de
la
Figure 4), Bifidobacterium animalis lactis était bien présent jusqu'à la fin
de la
fermentation. Un effet anti-inflammatoire in vitro sur des cellules IPEC-J2
générant
une diminution de la production d'IL-8 (voir condition BAL-2FL de la Figure 2)
par
rapport à 2'FL seul et par rapport au témoin-mucine selon le protocole de
l'exemple
1.
De plus, la composition symbiotique 03 montre une amélioration du
microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations
bactériennes
de bifidobactéries. L'augmentation de ces populations bactériennes a été
mesurée
par qPCR (voir condition BAL + 2FL de la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences
des
amorces sens et des amorces anti-sens utilisées pour mesurer par qPCR
l'abondance
relative des populations bactériennes bénéfiques pour la communauté
microbienne
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de l'intestin sont indiquées dans le Tableau 1. En parallèle, une analyse des
acides
gras volatiles (AGV) (Figure 8) a pu montrer une augmentation significative de
l'acétate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p = 0.034) et dans
le
fermenteur mimant l'iléon (p = 0.023). Une tendance à l'augmentation de
l'acétate
dans le fermenteur mimant le colon ascendant (p = 0.075) et une tendance à la
diminution de l'isobutyrate dans les fermenteurs iléons et colons ascendants
(p =
0.076) et colon ascendant (p = 0.095) ont également été observées.
Exemple 9 : Composition symbiotique C4 comprenant Bifidobacterium
crudilactis et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale.
On a préparé la composition C4 en ajoutant 1E07 CFU/ml de
Bifidobacterium crudilactis et 0,1 g de beta-glucane.
Plus particulièrement, au niveau du prébiotique, 0,1g de beta-glucane
a été ajouté dans chaque flacon de fermentation contenant 15m1 de jus de
fermentation. Au niveau du probiotique Bifidobacterium animalis lactis, une
poudre
lyophilisée de bactérie a été pré-mixé dans une solution tampon à une
concentration de 1,5E08 CFU/ml (solution stock). Avant d'être ajouté au flacon
de
fermentation, la solution pré-mixée de probiotique a subi un processus de
revivification consistant en une incubation de 30 min, à 37 C sous agitation.
Ensuite,
1 ml de la solution pré-mixée (solution stock) a été ajouté au flacon menant à
une
concentration finale en probiotique de 1E07 CFU/ml dans le flacon.
La composition symbiotique C4 comprenant Bifidobacterium
crudilactis et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale a montré un
effet
bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la valeur A
(production maximale de gaz) et une augmentation de la vitesse de fermentation
(Rmax) par rapport au beta-glucane seul (voir condition BCU-BG du Tableau 3).
En
plus, après 24h de fermentation, une augmentation de la concentration des
SCFAs
totales et de butyrate (voir condition BCU-BG du Tableau 4) et l'abondance
relative
des Clostridium clusters XI Va dans le jus de fermentation est démontré (voir
condition
BCU-BG de la Figure 4). Un effet anti-inflammatoire est démontré in vitro sur
des
cellules IPEC-J2 générant une diminution de la production d' IL-8 par rapport
au beta-
glucane seule et par rapport au témoin-mucine selon le protocole décrit à
l'exemple
1 (voir condition BCU-BG de la Figure 2).
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De plus, la composition symbiotique 04 montre une amélioration du
microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations
bactériennes
impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate et montrant
une
Tendance à l'augmentation des bifidobactéries. L'augmentation de ces
populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition BC + BG de la
Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-
sens
utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations
bactériennes
bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le
Tableau 1.
En parallèle, une analyse des AGV (Figure 9) a montré une diminution
significative de l'isobutyrate (p = 0.018) dans les fermenteurs iléons et
colons
ascendants tandis qu'une tendance à la baisse des AGV totaux a été observée
dans le colon ascendant (p = 0.058).
Exemple 10: Composition symbiotique C5 comprenant Enterococcus
faecium et du beta-glucane contre la dysbiose intestinale.
La composition symbiotique 05 contre la dysbiose intestinale a montré
un effet bénéfique sur la fermentation, démontré par une augmentation de la
valeur
A (production maximale de gaz) et une augmentation de la vitesse de
fermentation
(Rmax) par rapport au beta-glucane seul (voir condition EF-BG du Tableau 3).
En
plus, après 24h de fermentation, une augmentation de la concentration des
SCFAs
totales et de butyrate dans le jus de fermentation est démontré (voir
condition EF-
BG du Tableau 4).
De plus, la composition symbiotique C5 montre une amélioration du
microbiote dans le modèle BABY-SPIME en augmentant les populations
bactériennes
impliquées dans les voies métaboliques de production de butyrate.
L'augmentation
de ces populations bactériennes a été mesurée par qPCR (voir condition EF + BG
de
la Figure 6 et Tableau 6). Les séquences des amorces sens et des amorces anti-
sens
utilisées pour mesurer par qPCR l'abondance relative des populations
bactériennes
bénéfiques pour la communauté microbienne de l'intestin sont indiquées dans le
Tableau 1.
En parallèle, une analyse des AGV (Figure 10) a montré une diminution
significative du valérate dans le fermenteur mimant l'iléon (p = 0.0096). Une
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tendance à la diminution de l'isovalérate a également été observée dans
l'iléon (p
= 0.099) et dans les fermenteurs iléons et colons ascendants (p = 0.052).
Exemple 11: Compositions symbiotiques administrées in vivo à la truie
en gestation et/ou allaitante et/ou au porcelet en allaitement
Le tableau 7 ci-dessous décrit les différentes compositions
symbiotiques (SYN) donnée in vivo à la truie en gestation et/ou allaitante
et/ou aux
porcelets en allaitement.
Tableau 7.- Différentes compositions symbiotiques (SYN) testées in vivo.
Exemples Compositions Probiotique Prébiotique SYN
donné à
(SYN)
Ex. 13 SYN 1 C. butyricum Inuline Truie
Ex. 14 SYN 1 C. butyricum GOS/FOS Porcelet
en
allaitement
Ex. 15 SYN 2 B. anima lis Inuline Truie
lactis
Ex. 16 SYN 2 B. animalis 2'FL Porcelet
en
lactis
allaitement
Ex. 17 SYN 3 E. faecium Beta-glucane Truie
Ex. 18 SYN 3 E. faecium Beta-glucane
Porcelet en
allaitement
Ex. 19 SYN 4 B. crudilactis Beta-glucane
Truie
Ex. 20 SYN 4 B. crudilactis Beta-glucane
Porcelet en
allaitement
Ex. 21 SYN 5 B. Inuline Truie
thermophilum
Ex. 22 SYN 5 B. Inuline Porcelet
en
thermophilum
allaitement
Exemple 12: Protocole de supplémentation in vivo aux truies et aux
porcelets.
La supplémentation en symbiotique des truies a commencé à partir
du 80ème jour de gestation et elle a été distribuée manuellement sous forme de
portion directement ajoutée dans l'assiette de chaque truie (top feeding) une
fois
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par jour avec un repas. La supplémentation du symbiotique a continué pendant
toute la période de lactation (d'allaitement) de trois semaines. Les
symbiotiques ont
été préparés, c'est-à-dire mélangés à un aliment standard de croissance, juste
avant
le début des expériences et conservés dans un endroit frais et sec. Un groupe
de
truies non supplémentées a été utilisé comme groupe de référence/contrôle pour
la
comparaison. Les truies ont été distribuées en différents groupes selon leur
parité, afin
d'obtenir une distribution homogène et une parité moyenne égale entre les
groupes
(4). Après 80 jours de gestation, les truies ont été placées dans des enclos
individuels
avec une alimentation individuelle distribuée automatiquement deux fois par
jour.
Après 115 jours de gestation, les truies ont été transférées dans des loges de
mise-
bas individuelles. Les truies étaient nourries deux fois par jour avec une
distribution
automatique et avaient un accès illimité à l'eau en appuyant sur un bouton au-
dessus de leur assiette. La supplémentation des compositions symbiotiques
(exemples 13, 15, 17, 19,21 du tableau 7) était effectuée une fois par jour le
matin.
Le tableau 8 ci-dessous indique la dose de probiotique et de
prébiotique administrée aux truies en fonction du stade de développement
(gestation ou allaitante).
Tableau 8.- Doses de compositions symbiotiques distribuées aux truies.
Dose probiotique mono- Dose prébiotique
souche (CFU/truie/jour) (g/truie/jour)
Gestation (G80-
2,175E+10 12,325
insémination)
allaitante (semaine 1) 1,6125E+10 9,1375
allaitante (semaine 2) 3,75E+10 21,25
allaitante (semaine 3) 3,375E+10 19,125
Les combinaisons symbiotiques sélectionnées consistaient en une
seule souche de probiotique avec un seul prébiotique (voir exemples 13 (SYN
1), 15
(SYN 2), 17 (SYN 3), 19 (SYN 4) et 21 (SYN 5) du tableau 7). Les combinaisons
symbiotiques qui comprenaient un oligosaccharide du lait comme prébiotique ont
été remplacées par de l'inuline pour la supplémentation des truies.
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Les exemples 14 (SYN 1), 16 (SYN 2), 18 (SYN 3), 20 (SYN 4) et 22 (SYN 5)
du tableau 7 indiquent les compositions symbiotiques administrées aux
porcelets en
allaitement.
Pendant la phase d'allaitement, les porcelets restaient avec leur mère
dans des enclos de maternité dont le sol était recouvert d'un grillage en
plastique.
Les porcelets avaient un accès illimité à la tétée et, à partir du premier
jour après la
naissance, une assiette fixée au sol était placée dans chaque enclos. Pendant
la
première semaine suivant la naissance, les porcelets ont reçu une fois par
jour un
substitut de lacto-remplaceur. Pendant les deuxième et troisième semaines de
lactation, les porcelets ont reçu un aliment humide de transition.
La supplémentation symbiotique des porcelets a commencé le
lendemain de la naissance, chaque loge de maternité a reçu un complément de
lacto-remplaceur dans une assiette fixée au sol. La supplémentation du
symbiotique
s'est poursuivie pendant toute la période d'allaitement de trois semaines. La
supplémentation symbiotique a été interrompue au moment du sevrage. Ainsi,
aucune supplémentation symbiotique n'a été donnée aux porcelets pendant la
période post-sevrage. Les portées/porcelets qui ont reçu les symbiotiques ont
été
comparées aux portées/porcelets non supplémentés.
Les solutions prébiotiques (dissoutes dans l'eau potable) ont été
préparées une fois par semaine et conservées au réfrigérateur (+4 C). La
poudre de
probiotiques et la solution de prébiotiques étaient fraîchement mélangées
chaque
jour juste avant la distribution. Les compositions symbiotiques ont été
administrées à
une dose établie pour une portée moyenne de 15 porcelets recevant 2 ml de
symbiotique par porcelet et par jour pendant la première semaine, et 4 ml par
porcelet et par jour de la deuxième semaine jusqu'au sevrage. La composition
symbiotique a été distribuée aux porcelets en l'administrant dans l'aliment
d'allaitement qui leur a été donné pendant la première semaine et avec
l'aliment
liquide de transition humide jusqu'au sevrage.
Le tableau 9 ci-dessous indique la dose de probiotique et de
prébiotique administrée aux porcelets en fonction du stade de développement.
Tableau 9.- Doses de compositions symbiotiques distribuées aux
porcelets.
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Stade de Mélange SYN 1, 2, 5 (Exemples 14, 16,
22)
développement du symbiotique
porcelet (ml/portée)
Probiotique Prébiotique
(g/m1)
(CFU/ml)
Semaine 1 30 3E09 0,4
Semaine 2 60 3E09 0,4
Semaine 3 60 3E09 0,4
SYN 3 et 4 (Exemples 18, 20)
Probiotique Prébiotique
(g/ml)
(CFU/ml)
Semaine 1 60 1,5E09 0,1
Semaine 2 120 1,5E09 0,1
Semaine 3 120 1,5E09 0,1
Exemples 13 à 22: Différentes compositions symbiotiques administrées
in vivo aux truies et aux porcelets.
Les exemples 13 (SYN 1), 15 (SYN 2), 17 (SYN 3), 19 (SYN 4) et 21 (SYN 5)
du tableau 7 indique les compositions symbiotiques administrées à la truie en
gestation ou allaitante. Les exemples 14 (SYN 1), 16 (SYN 2), 18 (SYN 3), 20
(SYN 4) et
22 (SYN 5) du tableau 7 indique les compositions symbiotiques administrées aux
porcelets en allaitement.
Exemples 23 à 43: Impact de différents protocoles d'administration
d'une composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet en allaitement sur
différents critères zootechniques du porcelet en allaitement et/ou en post-
sevrage.
A la naissance, les porcelets ont été comptés (vivants, morts et
momifiés) et le poids total de la portée des porcelets vivants a été
enregistré. Un jour
avant le sevrage, les porcelets ont été comptés et le poids total de la portée
des
porcelets vivants a été enregistré. Les porcelets ont été sevrés trois
semaines après
la mise bas, à l'âge de 21 jours environ. Au moment du sevrage, les porcelets
ont été
transférés dans des enclos de post-sevrage en groupes par traitement,
réorganisés
selon le sexe (mâle ou femelle) et la taille (petit, moyen, grand) en groupes
d'environ
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25 porcelets par enclos. Deux semaines après le sevrage, les porcelets ont été
comptés et pesés.
Le tableau 10 ci-dessous indique les différents protocoles
d'administration de la composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet en
allaitement.
Tableau 10.- Différents protocoles/profils d'administration de la
composition symbiotique à la truie et/ou au porcelet.
Exemples SYN donné à la truie SYN donné au
porcelet
Ex. 23 Contrôle Contrôle
Ex. 24 Contrôle SYN 1
Ex. 25 SYN 1 Contrôle
Ex. 26 SYN 1 SYN 1
Ex. 27 Contrôle SYN 2
Ex. 28 SYN 2 Contrôle
Ex. 29 SYN 2 SYN 2
Ex. 30 Contrôle Contrôle
Ex. 31 Contrôle SYN 3
Ex. 32 SYN 3 Contrôle
Ex. 33 SYN 3 SYN 3
Ex. 34 Contrôle SYN 4
Ex. 35 SYN 4 Contrôle
Ex. 36 SYN 4 SYN 4
Ex. 37 Contrôle Contrôle
Ex. 38 Contrôle SYN 2 (moitié de
la dose)
Ex. 39 Contrôle SYN 2
Ex. 40 Contrôle SYN 5 (moitié de
la dose)
Ex. 41 Contrôle SYN 5
Ex. 42 SYN 5 Contrôle
Ex. 43 SYN 5 SYN 5
Le tableau 7 indique la composition en prébiotique et en probiotique
de chaque SYN indiquée au tableau 10. Les tableaux 8 et 9 reprennent les doses
administrées.
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Différents critères zootechniques ont été mesurés sur le porcelet en
allaitement et sur le porcelet en post-sevrage en fonction de différents
profils
d'administration des différentes compositions symbiotiques. Ces différents
critères
zootechniques sont :
- le poids du porcelet (kg) (voir tableau 11)
- la gain quotidien moyen, GQM (g/jour) (voir tableau 12)
- la quantité (score) de diarrhée (%) (voir tableau 13)
Les scores de diarrhées ont été mesurés en attribuant à chaque
loge/portée le score le plus élevé selon l'échelle de score de diarrhée basée
sur la
consistance des matières fécales. L'échelle de cotation utilisée comprenait
cinq
catégories : score 0 - granule dur: 1 - granule mou et sec: 2 - granule
humide/forme
molle ; 3 - granule mou et non formé ; 4 - aqueux. Seul le score 4 était
considéré
comme une diarrhée. Les observations de la diarrhée ont eu lieu deux fois
pendant
l'expérience, 3 jours avant le sevrage et 10 jours après le sevrage. Les jours
d'observation des scores de diarrhée ont été choisis pour ne pas coïncider
avec la
pesée des porcelets ni avec la collecte des matières fécales afin d'éviter
d'interférer
avec les résultats en raison du stress causé par les manipulations sur les
porcelets.
Le tableau 11 ci-dessous reprend l'impact de différents profils
d'administration du SYN sur le poids du porcelet en allaitement et en post-
sevrage.
Tableau 11.- Poids du porcelet en allaitement et en post-sevrage en
fonction de différents profils d'administration du SYN.
ALLAITEMENT POST-SEVRAGE
SYN SYN donné
donne Poids (kg) Poids (kg)
au porcelet N N
à la truie Moy. ET p-value Moy. ET p-value
Contrôle Contrôle 11 5,6 0,6 6 10,0 1,2
Contrôle Synl 12 6,0 0,7 0,9856 0,36 10,1 1,3 0,8543 0,1
Synl Contrôle 14 5,8 0,8 0,9648 0,26 10,6 0,9 0,9970 0,6
Synl Synl 13 6,0
0,7 0,6792 0,46 11,1 1,1 0,0199 1,1
Contrôle Syn2 12 6,4 0,9 0,1270 0,86 10,7 1,3 0,9716 0,7
Syn2 Contrôle 14 5,9 0,5 0,7503 0,36 10,6 1,1 0,9645 0,6
Syn2 Syn2 15 5,8 0,6 0,8317 0,26 10,0 1,3 0,0009 -
0,1
Contrôle Contrôle 12 5,6 0,8 6 8,1 1,6
Contrôle Syn3 6 5,5
1,4 1,0000 -0,2 4 7,9 1,9 0,9821 -0,3
Syn3 Contrôle 9 6,2
0,6 0,0508 0,55 8,0 1,2 0,4736 -0,1
Syn3 Syn3 12 5,9 0,8 0,7338 0,26 8,6 1,4 0,1794 0,5
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Contrôle Syn4 10 5,4 1,0 0,8969 -0,26 8,2 1,2 0,0983 0,1
Syn4 Contrôle 7 5,8
0,5 0,9773 0,1 5 8,3 1,1 0,2384 0,2
Syn4 Syn4 13 5,5 1,0 0,9975 -0,1 6 8,0 1,5 0,6675 -
0,1
Contrôle Contrôle 11 6,0 0,8 6 8,0 1,7
Contrôle Syn2 dosel :2 13 5,6 0,6 0,8171 -0,4 6 7,7 1,4 0,8340 -0,3
Contrôle Syn2 11 6,0 0,9 0,4493 0,06 7,4
1,2 0,9194 -0,6
Contrôle Syn5 dose 1:2 15 5,4 0,9 1,0000 -0,6 6 8,2 1,4 0,0974 0,2
Contrôle Syn5 13 5,8 0,9 0,9950 -0,26 8,1 1,6 0,0435 0,1
Syn5 Contrôle 14 5,6 0,6 0,9966 -0,46 7,7 1,3 0,9995 -0,3
Syn5 Syn5 13 5,5 0,7 0,8647 -0,56 7,6
1,2 0,1535 -0,4
Certains profils d'administration de compositions symbiotiques,
comme SYN 1 et SYN 2 (exemple 26 ou 29) (voir tableau 10), permettent une
augmentation significative du poids du porcelet par rapport à la condition
contrôle
en phase de post-sevrage ou en phase d'allaitement (voir par exemple SYN 3 à
l'exemple 32). Les compositions symbiotiques impliquant SYN 5 (Exemples 40 à
43)
sont des contre-exemples montrant que certaines compositions symbiotiques ne
seront pas forcément positives pour la prise de poids du porcelet en
allaitement
et/ou en post-sevrage.
Le tableau 12 ci-dessous reprend l'impact de différents profils
d'administration du SYN sur le gain quotidien moyen (GQM) du porcelet en
allaitement et en post-sevrage.
Tableau 12.- GQM du porcelet en allaitement et en post-sevrage en
fonction de différents profils d'administration du SYN.
SYN ALLAITEMENT POST-
SEVRAGE
SYN donné
donne GQM (g/jour) GQM (g/jour)
. au porcelet N N
à la truie Moy. ET p-value Moy.
ET p-value
Contrôle Contrôle 11 198 29 6 240 16
Contrôle Synl 12 206 36 0,9767 8,46
236 25 0,8573 -3,4
Synl Contrôle 14 207 39 0,9625 8,8 6 244 9 0,9975
4,7
Synl Synl 13 215 36 0,6572 16,56 268 18 0,0190 28,6
Contrôle Syn2 12 229 31 0,0979 30,96 244 15 0,9752 4,8
5yn2 Contrôle 14 213 22 0,7483 15,26 243 19 0,9684
3,8
Syn2 Syn2 15 211 27 0,8331
13,06 218 19 0,0009 -22,0
Contrôle Contrôle 12 198 28 6 144 27
Contrôle Syn3 6 190 65 1,0000 -7,34 151 22 0,6828 7,9
Syn3 Contrôle 9 226 31 0,5058 28,65 120 57 0,9973 -23,7
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Syn3 Syn3 12 209 33 0,9989 11,76 177 18 0,0028 33,4
Contrôle Syn4 10 188 47 0,9870 -9,66 179 9 0,0004 35,4
Syn4 Contrôle 7 205 26 0,9996 7,65
174 18 0,0058 31,0
Syn4 Syn4 13 194 42 0,9998 -3,46 161 24 0,0911 17,4
Contrôle Contrôle 11 219 34 6 135 50
Contrôle 5yn2 dosel :2 13 203 35 0,9194 -16,2 6 140 25 0,8417 4,8
Contrôle Syn2 11 220 38 0,8340 1,46 134 27 0,927 -
0,9
Contrôle Syn5 dose 1:2 15 200 37 0,0435 -19,3 6 162 26 0,0987 27,0
Contrôle Syn5 13 212 42 0,0974 -7,46 164 31 0,0446 28,8
5yn5 Contrôle 14 210 29 0,9995 -9,06 132 25 0,9996 -2,6
Syn5 Syn5 13 202 26 0,1535 -17,56 150 20 0,1601
15,2
Les résultats du tableau 12 montrent que les profils d'administration
impliquant SYN 1 (exemple 26), SYN 3 (exemples 32, 33) et SYN 4 (exemples 34-
36)
permettent un meilleur gain quotidien moyen du porcelet par rapport à la
condition
contrôle, en particulier pour le porcelet en post-sevrage.
Le tableau 13 ci-dessous reprend l'impact de différents profils
d'administration du SYN sur le score de diarrhée du porcelet en allaitement et
en
post-sevrage.
Tableau 13.- Diarrhée du porcelet en allaitement et en post-sevrage
en fonction de différents profils d'administration du SYN.
ALLAITEMENT POST-SEVRAGE
SYN
donne
Y S N donné Diarrhée (%)
Diarrhée (%)
au porcelet
à la truie NON OUI
N P- N
NON OUI P-
value value
Contrôle Contrôle 11 73%27% 6 100% 0%
Contrôle Synl 12 86% 14% 0,4203-13% 6 100% 0%>0,9999 0%
Synl Contrôle 14 93% 7% 0,9013 -20% 6 100% 0% >0,9999 0%
Synl Synl 13 85%15% 0,1729-12% 6 83% 17% >0,9999 17%
Contrôle Syn2 12 75%25% 0,4749 -2% 6 100% 0% 0,2963 0%
Syn2 Contrôle 14 86% 14% 0,4203 -13% 6 100% 0% >0,9999 0%
Syn2 Syn2 15 80%20% 0,6637 -7% 6 67%33% 0,1213 33%
Contrôle Contrôle 12 75%25% 6 67%33%
Contrôle Syn3 6 100% 0% 0,1797 -25% 4 75% 25% 0,7782 -8%
Syn3 Contrôle 9 67%33% 0,7805 8% 5 60%40% 0,1213 7%
Syn3 Syn3 12 58%42% 0,6757 17% 6 100% 0% 0,8190-33%
Contrôle Syn4 10 80%20% 0,3865 -5% 6 100% 0% 0,1213-33%
Syn4 Contrôle 7 75% 25% >0,9999 0% 5 80% 20% 0,6210 -13%
CA 03198168 2023- 5-9
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PCT/EP2021/081889
Syn4 Syn4 13 94% 6% 0,1414-19% 6 100% 0% 0,1213-33%
Contrôle Contrôle 11 60% 40% 6 83% 17%
Contrôle Syn2 dosel :2 13 71%29% 0,5176-11% 6 100% 0% 0,2963-17%
Contrôle Syn2 11 47% 53% 0,4642 13% 6 67% 33% 0,5050 17%
Contrôle Syn5 dose 1:215 86% 14% 0,1216 -26% 6 83% 17%>0,9999 0%
Contrôle 5yn5 13 77% 23% 0,3389 -17% 6 67% 33% 0,5050 17%
Syn5 Contrôle 14 93% 7% 0,0309 -33% 6 50% 50% 0,2207 33%
Syn5 Syn5 13 60% 40% >0,9999 0%6 83% 17% >0,9999 0%
Les profils d'administration impliquant SYN 3 et SYN 4 permettent une
réduction des diarrhées sévère (score 4) du porcelet par rapport à un porcelet
contrôle, en particulier pour le porcelet en post-sevrage.
Ces résultats montrent qu'en fonction de la composition symbiotique
et en fonction du profil d'administration, certaines compositions auront un
impact
positif direct (par rapport à la condition contrôle) sur les critères
zootechniques pour
porcelet en allaitement tandis que d'autres auront un effet de rémanence en
ayant
un impact positif plus marqué sur les critères zootechniques pour le porcelet
en post-
sevrage.
Exemple 44: Composition symbiotique SYN 6 comprenant E. faecium,
C. but yricum, du beta-glucane et de l'inuline contre la dysbiose intestinale
et doses
administrées in vivo à la truie avant mise bas et après mise bas.
Pour les probiotiques, la quantité administrée est indiquée en
CFU/truie/jour, tandis que pour les prébiotiques, la quantité administrée est
indiquée
en g/truie/jour (voir Tableau 14).
L'administration in vivo de la composition symbiotique a été réalisée à
4 stades de développement différents : avant mise bas, une semaine après mise
bas,
2 semaines après mise bas,3 semaines après mise bas et 4 semaines après mise
bas.
Au 76e jour de gestation, les truies ont été pesées. Les truies ont ensuite
été réparties dans trois groupes différents en fonction de leur parité, afin
d'obtenir
une distribution homogène et une parité moyenne égale dans tous les groupes.
Le
jour 80 après l'insémination, les truies ont été placées dans des enclos
individuels.
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Au 107e jour de gestation, les truies ont été pesées. Au 108e jour de
gestation, les truies ont été transférées dans des cases individuelles dans la
maternité.
La mise-bas a été planifiée pour le jour 115 de la gestation avec une
injection de
Pianote et l'involution utérine a été facilitée par une injection de
dinolytic après
la mise bas.
A la naissance, les porcelets ont été comptés et leur poids individuel a
été enregistré. Les porcelets étaient logés avec les truies dans des loges de
maternité
avec un accès continu à la tétée. Dès le premier jour, après que toutes les
truies
aient fini de mettre bas, la taille des portées a été équilibrée au moyen
d'adoptions
entre les portées d'un même traitement. Les porcelets ont été pesés
individuellement
chaque semaine. Dans cette expérience, les porcelets ont été sevrés quatre
semaines après la mise bas, à environ 28 jours d'âge. Au moment du sevrage,
une
sélection de 2 mâles et de 2 femelles de la même portée a été effectuée en
fonction
du poids corporel moyen dans le traitement. Lorsque cela n'était pas possible,
on a
choisi des porcelets de poids et de sexe appropriés provenant d'une autre
portée
du même groupe de traitement. Les porcelets sélectionnés ont été transférés
dans
des enclos de post-sevrage en groupes par traitement.
Pendant la période de post-sevrage, ils ont reçu une alimentation
dépourvue de tout complément alimentaire (dépourvu de toute composition
symbiotique). Les porcelets ont été contrôlés quotidiennement le matin pour
vérifier
leur état de santé général et surveiller l'apparition de diarrhées. Les
mangeoires
étaient remplies selon les besoin. Les enclos étaient nettoyés à l'eau tous
les jours.
Une fois par semaine, les porcelets étaient pesés et la consommation
d'aliments était
notée.
Tableau 14.- Composition symbiotique SYN 6 comprenant E. faecium,
C. butyricum, du beta-glucane et de l'inuline et quantité de chaque
probiotique et
prébiotique administrée par jour à 5 stades de développement.
Probiotique Prébiotique
SYN 6 E. faecium C. but yricum Beta-glucane Inuline
(CFU/truie/jour) (CFU/truie/jour) (g/truie/jour) (g/truie/jour)
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WO 2022/101511 53
PCT/EP2021/081889
G80-G107
(avant mise
bas, MB) 1,60E+09 1,60E+09 1,60 9,60
MB+1sem. 1,20E+09 1,20E+09 1,20 7,20
MB+2sem. 2,75E+09 2,75E+09 2,75 16,50
MB+3sem. 2,50E+09 2,50E+09 2,50 15,00
MB+4sem. 2,50E+09 2,50E+09 2,50 15,00
MB : mise-bas ; G : jour de gestation
Les 5 stades de développement sont G80-G107 (entre 80 jours et 107 jours de
gestation, avant mise bas), 1 semaine après mise bas, 2 semaines après mise
base,
3 semaines après mise bas et 4 semaines après mise bas.
Exemple 45 : Composition symbiotique SYN 7 comprenant E. faecium,
B. animalis lactis, B. crudilactis, du beta-glucane et de l'inuline contre la
dysbiose
intestinale et doses administrées in vivo à la truie avant mise bas et après
mise bas.
Pour les probiotiques, la quantité administrée est indiquée en
CFU/truie/jour, tandis que pour les prébiotiques, la quantité administrée est
indiquée
en g/truie/jour (voir Tableau 15).
L'administration in vivo de la composition symbiotique a été réalisée à
4 stades de développement différents : G80-G107 (entre 80 et 107 jours de
gestation,
avant mise bas, MB), une semaine après mise bas, 2 semaines après mise bas et
3
semaines après mise bas.
Tableau 15.- Composition symbiotique SYN 7 comprenant E. faecium,
B. animalis lactis, B. crudifactis, du beta-glucane et de l'inuline et
quantité de
chaque probiotique et prébiotique administrée par jour à 5 stades de
développement.
,
Pro biotiq ue Prébiotique
E. B. an imalis Beta
B. crudilactis Inuline
SYN 7 faecium lac tis
glucane
(CFU/truie/jo (g/truie/j
(CFU/truie (CFU/truie/jo (g/truie/jo
ur) our)
/jour) ur) ur)
CA 03198168 2023- 5-9
WO 2022/101511 54
PCT/EP2021/081889
G80-G107
(avant
mise bas,
MB) 1,07E+09 1,07E+09 1,07E+09 1,60 9,60
MB+1sem. 8,00E+08 8,00E+08 8,00E+08 1,20 7,20
MB+2sem. 1,83E+09 1,83E+09 1,83E+09 2,75 16,50
MB+3sem. 1,67E+09 1,67E+09 1,67E+09 2,50 15,00
MB+4sem. 1,67E+09 1,67E+09 1,67E+09 2,50 15,00
MB : mise-bas ; G : jour de gestation
Exemple 46: Composition symbiotique contre la dysbiose intestinale
et doses administrées in vivo au porcelet
Dans un essai in vivo (première expérience), le symbiotique 1 (SYN 1)
est composé de Clostridium but yricum et GOS/FOS (80/20) et le symbiotique 2
(SYN
2) est composé de B. animalis lactis et 2'FL (voir Tableau 16). La condition
contrôle
était juste de l'eau potable. De manière contrôlée, les porcelets ont ingéré
une
quantité déterminée de symbiotique, qui a augmenté avec l'âge. La composition
symbiotique a été préparé quotidiennement en mélangeant un mélange
prébiotique de 0,4 g de prébiotique par ml dans l'eau potable avec le
probiotique
correspondant (6E08 CFU/ml). Le mélange prébiotique de GOS/FOS contenait 0,32
g/ml de GOS et 0,08 g/ml de FOS selon les proportions des oligosaccharides du
lait
de truie. La solution prébiotique a été préparée chaque semaine et stockée à
+4 C
jusqu'à son utilisation. Avant l'administration, les mélanges symbiotiques ont
été
amenés à température ambiante. Les compositions symbiotiques ont été
administrées dès la naissance, à des intervalles de plus en plus rapprochés et
à des
doses croissantes avec l'âge, jusqu'au sevrage au 28e jour postnatal (voir
tableau
16). Aucune composition symbiotique n'a été administrée pendant la période de
post-sevrage. Les volumes des compositions symbiotiques administrés étaient
les
suivants :
- 1,25 ml/porcelet jusqu'au samedi compris qui suit,
- 1,75 ml/porcelet les deux jours suivants,
- 2,5 ml/porcelet jusqu'au vendredi inclus de la semaine suivante,
- 3,75 ml/porcelet la deuxième semaine dès le lundi,
- 5 ml/porcelet ensuite dès le lundi de la troisième semaine.
CA 03198168 2023- 5-9
WO 2022/101511 55
PCT/EP2021/081889
Tableau 16.- Volumes et doses de compositions symbiotiques
administrées aux porcelets durant la phase de lactation de la naissance au
sevrage
(J28).
Åge en jours Volume SYN 1 SYN 2
(i) (ml)
C. GOS FOS (0,08 B. 2'FL
(0,4
butyricum (0,32 g/m1) animalis g/m1)
(6E08 g/m1) lactis
CFU/ml) (6E08
CFU/m1)
Naissance, 1,25 7,50E08 0,49 0,1 g 7,50E08
0,59
jl, j2, j3 CFU CFU
j4, j5 1,75 1,05E09 0,56 g 0,14 g 1,05E09
0,7 g
CFU CFU
j6, Fe., j9 2,5 1,50E09 0,8 g 0,2 g 1,50E09 1 g
CFU CFU
j12, j14, j16 3,75 2,25E09 1,2 g 0,3 g 2,25E09 1,5
g
CFU CFU
jl 9, j22, j26 5 3,00E09 1,6 g 0,4 g 3,00E09 2 g
CFU CFU
On a observé que l'administration d'une composition symbiotique
comprenant plusieurs probiotiques, comme SYN 6 ou SYN 7 (exemples 44 et 45),
ne
permet pas une plus grande prise de poids du porcelet en allaitement et/ou en
post-
sevrage, ni un plus grand gain quotidien moyen du porcelet en allaitement
et/ou en
post-sevrage par rapport à une composition comprenant un seul probiotique,
comme SYN1 ou SYN 2 (exemple 46), ou par rapport à une condition contrôle
(porcelet contrôle) n'ayant pas reçu de composition symbiotique. De plus, les
compositions symbiotiques SYN 6 et SYN 7 augmentent la quantité de diarrhée
(score
4) du porcelet en allaitement de respectivement 10% et 17% par rapport à la
condition contrôle.
CA 03198168 2023- 5-9
WO 2022/101511 56
PCT/EP2021/081889
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon
limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des
modifications
peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.
CA 03198168 2023- 5-9
